The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis Turmas P9, P10, P11 e P12
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As células do nosso sistema imunitário para efectuarem uma resposta eficaz contra as ameaças ao nosso organismo necessitam de comunicar entre si e esta comunicação é realizada através de sinapses imunológicas.
Estas sinapses imunológicas são controladas pela actividade centrossomal e servem como pontos especializados para a realização da endocitose e exocitose.
Verifica-se que a formação das sinapses imunológicas apresenta largas semelhanças com a os mecanismos de citocinese e a formação de cilios.
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A comunicação entre as células do nosso sistema imunitário é realizada ou directamente através de receptores membranares, que reconhecem células-alvo, e que são muito específicos, ou através de mediadores químicos (ex. citocinas), que são pouco específicos. O problema da não especificidade dos mediadores químicos foi ultrapassado pela existência de sinapses imunológicas entre os linfócitos B e T, com as respectivas células apresentadoras de antigénios (APC’s). As sinapses em ambos os linfócitos são caracterizadas por uma reorganização dos receptores envolvidos no reconhecimento e adesão.
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As sinapses imunológicas realizam-se entre os linfócitos B e T, com as respectivas células apresentadoras de antigénios (APC’s). As sinapses em ambos os linfócitos são caracterizadas por uma reorganização dos receptores envolvidos no reconhecimento e adesão.
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A reorganização dos receptores envolvidos no reconhecimento e adesão vai originar zonas denominadas complexos supramoleculares de activação (SMACs). Um central (cSMAC) e outro periférico (pSMAC).
O cSMAC caracteriza-se pela formação de um agregado de TCR e as proteínas sinalizadoras associadas no local de sinapse. O pSMAC caracteriza-se pela formação de ligações moleculares que criam uma forte adesão entre as células.
Existem muitas especulações em relação ao preciso papel de cada um destes complexos. Slide 7
O que é isto da sinapse imunológica ? É a secreção de mediadores químicos para um domínio secretor que contacta com ambas as células e se encontra isolado do meio externo devido a uma forte adesão das membranas plasmáticas.
Nesta perspectiva da sinapse através da membrana plasmática, podemos identificar que na zona central da sinapse onde se localiza o cSMAC e consequentemente onde vão estar concentrados os receptores TCR (associados aos pMHC da células apresentadora de antigénio ou célula-alvo) e as proteínas de sinalização. Neste local o centrossoma vai associar-se à membrana plasmática, polarizando consigo os endossomas necessários à reciclagem de receptores e os lisossomas secretores. Estas vesículas têm como destino o domínio secretor, uma fenda para onde são secretados
os mediadores químicos em direcção à célula-alvo. Na periferia vamos encontrar pSMAC, formado pela interacção existente entre proteínas membranares como ICAM/LFA-1 que criam uma forte adesão entre as duas células e isolam o domínio secretor, restringindo a zona de sinapse (desenvolvido no tema „Exocitose‟). Por último, a circundar o pSMAC identificamos outra zona o dSMAC que vai ser falado mais tarde, formado pela reorganização do citoesqueleto de actina.
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Para concluir, a activação dos receptores de células T, induz uma activação celular que leva a uma reorganização molecular de forma a permitir uma exocitose e endocitose focalizadas no local de sinapse.
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As cinases de tirosina activas são um marcador da actividade de TCR‟s. Foram verificados eventos sinalizadores primordiais em pequenos agregados periféricos presentes no pSMAC que se propagaram até ao cSMAC. Contudo as cinases de tirosinas foram somente encontradas activas em estadios iniciais na formação de sinapses de células T CD4.
Estas descobertas levantaram umas questão: O cSMAC mantém a sinalização do TCR ou finaliza-a através da degradação dos receptores?
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Estudos mais recentes mostram que com doses baixas de antigénio o aparecimento das cinases de tirosina activas é tardio. Isto sugere que é a qualidade da ligação dos complexos histocompatíveis do péptido principal (pMHC) que pode determinar se a sinalização é reforçada no cSMAC ou se é inibida pela internalização do receptor. Slide 11
Usando linfócitos citotóxicos T, nos quais a força do sinal TCR é facilmente ajustável, e usando variados péptidos, verificou-se que a sinalização ocorre dentro do cSMAC seja a força de ligação pMHC forte ou fraca. No entanto se o sinal for fraco, este é rapidamente inibido por acção de fosfatases que conduzem à internalização do TCR. Slide 12
Desta forma conclui-se que o cSMAC é uma plataforma de sinalização sendo determinante para a resposta celular a qualidade de ligação pMHC. Quando esta é forte o sinal é reforçado no cSMAC, quando este é fraco o sinal é inibido ocorrendo internalização do receptor.
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O cSMAC não só desempenha a função da sinalização como também realiza a reciclagem de receptores. Os endossomas, durante a formaçao da sinapse, polarizam imediatamente para o local subjacente ao cSMAC da sinapse imunológica.
Vai existir uma reciclagem continua de TCR da superficie da célula para os endossomas onde se ligam ao receptor de transferrina, retornando de seguida à membrana celular, no local do cSMAC.
Durante a ligação o grau de endocitose de receptores é igual, mas se a sinalização for inibida os receptores vão directamente para os lisossomas onde são degradados.
A sinalização do TCR é iniciada pela Lck, que está associada a cadeias CD4 ou CD8 de complexos de TCR. A migração para a membrana celular da Lck é controlada pela activação do Rab 11 nos endossomas.
Rab35 associa-se com o TCR-ζ no endossoma e concentra-se na sinapse.
O Rab35 na forma inactivada bloqueia a migração dos receptores de transferrina até à membrana plasmática, o que baixa necessariamente a quantidade de TCR‟s na membrana.
Desta maneira, a exocitose e a endocitose controlam cuidadosamente o nível de TCR disponível no cSMAC e, consequentemente, a força dos sinais a ser gerados.
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Como é que os endossomas vão para baixo do cSMAC???
Durante a sinapse existe uma polarização dos citoesqueletos de actina e dos microtúbulos, que são dependentes de antigénios. A activação do receptor vai iniciar uma acumulação da actina ao longo da sinapse, formando um anel exterior à volta da sinapse, denominado como SMAC distal (dSMAC), que vai ocupar a zona exterior ao pSMAC.
O afastamento das actinas é coordenado com o movimento do MTOC (centrossoma) que polariza para o local da sinapse. Devido à associação do Golgi e dos endossomas com o MTOC, por ligações entre proteínas motoras, os endossomas movem-se juntamente com o MTOC até à sinapse imunológica.
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- Endocitose e regulação da concentração de TCR na membrana
Através da activação do Rab11 nos endossomas, regula-se a presença, e por conseguinte, a disponibilidade de Lck na membrana para, através da associação desta com CD4/CD8, iniciar-se a sinalização do TCR.
Após a sinalização, endossomas presentes no citosol armazenam TCR endocitados da periferia celular e transportam-nos novamente para a membrana – cSMAC - da sinapse imunológica – retorno este controlado pela actividade de Rab35. Regula-se assim a concentração de TCR presentes na membrana – factor do qual depende a força do sinal. A fim de cessar a sinalização, endossomas polarizados recolhem TCR endocitados da zona de sinapse, sendo estes receptores desviados para degradação lisossómica.
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Concluindo, o cSMAC, como plataforma de sinalização vai activar a reciclagem de receptores, sinalizando a polarização dos endossomas para o local de sinapse.
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O estudo da polarização e secreção nas sinapses imunológicas foi estudado nas células CD8. Nestas células o centrossoma, que é o único MTOC das células T, polariza no local de sinapse. Lisossomas secretores migram para um dominio secretor movendo-se ao longo dos microtubulos na direcção do centrossoma.
O movimento do centrossoma é iniciado pela sinalização TCR que por sua vez activa uma reorganização dos filamentos de actina que se concentram no local de sinapse e formam o dSMAC, um anel periférico à zona sináptica. A proteína IQGAP1 (actin-biding protein liga e estabiliza os microtúbulos ao citoesqueleto de actina. A dineína, também localizada no dSMAC, é capaz de se ligar ao citoesqueleto de actina gerando tensões nos microtúbulos e propelindo o centrossoma para o local da sinapse.
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A polarização inicial do centrossoma é influenciada pela acumulação de DAG no centro da sinapse.
A DAG trata-se de um lípido segundo mensageiro produzido durante a activação do TCR.
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A sinalização controla a recruta de proteínas de polarização como as Par. Slide 21
Activação dos TCR desencadeia processos de reorganização do citoesqueleto e de sinalização que conduzem à polarização do centrossoma.
Recentemente foi descoberto que a proteína Par1b que desempenha um papel muito importante. Em células T inactivas esta proteína está associada à membrana. Com a activação de TCRs, PKC-ζ fosforila a Par1b, dissociando-a da membrana. No citoplasma liga-se a proteínas 14-3-3 que provocam a remoção de proteínas Par1b da membrana. Este processo permite a acumulação da Par3 no local da sinapse que vai estimular a polarização do centrossoma.
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Estudos recentes mostraram que a força do sinal do TCR influencia a polarização do centrossoma e que este tanto polariza em resposta a sinais fracos e a fortes, mas apenas os fortes causam a polarização de grânulos e secreção.
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- Polarização dos filamentos de actina, microtúbulos e centrossoma
Durante a formação da sinapse imunológica, inúmeros organelos e estruturas existentes no interior da célula polarizam. Os filamentos de actina e os microtúbulos sofrem uma reorganização dependente da activação do TCR pelo antigénio. No primeiro caso, dá-se uma acumulação inicial de actina ao longo da sinapse, que posteriormente se dispersa para formar um anel em torno da mesma, denominando-se essa região por dSMAC (distal SMAC).
- Movimento do centrossoma com auxílio das proteínas IQGAP1 e dineína
A polarização do centrossoma e microtúbulos está por sua vez coordenada com o movimento da actina, sobretudo devido a proteínas de nome IQGAP1 e dineína. A IQGAP1 estabiliza as extremidades positivas dos microtúbulos e liga-os ao citoesqueleto de actina. Por outro lado, a dineína permite gerar tensão nos microtúbulos. Assim, entende-se que o movimento destas últimas estruturas referidas esteja em sintonia com a organização dos filamentos de actina.
- Polarização do centrossoma e gradiente de DAG
A polarização do centrossoma está também relacionada com a acumulação de DAG no centro da sinapse. O DAG (diacilglicerol) é um segundo mensageiro responsável por diversos processos de transdução nas células. Em linfócitos T não estimulados, a sua distribuição na membrana plasmática é uniforme. No entanto, quando ocorre a activação do TCR, um gradiente de DAG é gerado em direcção ao cSMAC, onde passa a existir
em maior concentração. Este gradiente vai interferir na polarização do centrossoma, possibilitando a sua deslocação para o centro da sinapse imunológica.
- Polarização dos grânulos líticos
No caso dos CTL, também os seus grânulos líticos sofrem polarização em direcção à sinapse em formação.
- Experiência Relação da força do sinal com polarização do centrossoma
Um estudo recente, realizado em CTLs de ratos transgénicos com TCR OT-1, permitiu demonstrar que independentemente da força do sinal gerado ocorre sempre a polarização do centrossoma no cSMAC. Contudo, apenas sinais fortes permitiam a polarização dos grânulos líticos das células T CD8+ e a sua secreção na sinapse.
- Polarização do complexo de Golgi e endossoma
Outros dois organelos que sofrem polarização durante este processo são o complexo de Golgi e o endossoma de reciclagem dos TCR. Ambos os compartimentos estão associados ao centrossoma por meio de proteínas de ancoragem, de modo que o movimento do primeiro permite o deslocamento dos últimos em direcção ao cSMAC. Slide 24
Concluindo, a activação dos TCR induz mecanismos celulares de reorganização molecular e sinalização que levam a polarização do centrossoma e por associação dos lisossomas secretores, direccionando assim a secreção para o local da sinapse.
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A exocitose requer a fusão de vesículas secretoras nas sinapses imunológicas e implica a participação das proteínas SNARE. Para ocorrer a fusão das vesículas com a membrana plasmática, é necessário um complexo SNARE funcional. Para tal é necessária a formação de um feixe de 4 hélices com a proteína VAMP, associadas a sintaxina e a SNAP, proteínas estas que se encontram ligadas ao local da membrana plasmática onde vai ocorrer a exocitose. Estudos feitos com a inibição do gene VAMP7 e a disrupção do VAMP8 mostraram que havia uma diminuição da capacidade de eliminação das células alvo por linfócitos T citotóxicos indicando que não há exocitose dos produtos de secreção.
A sintaxina 11 é uma componente do SNARE e é uma mediadora da fusão de grânulos estando, portanto, envolvida na via de secreção. Uma deficiência de sintaxina 11 causa FHL4 (linfohistiocitose hemofagocitica familiar tipo 4) que é caracterizada por uma perda das funções citotóxicas. Esta situação pode ser revertida através da incubação das células com IL2, uma vez que promove o aumento da síntese do conteúdo granular. Slide 26
As Synaptobrevins são importantes na fusão de vesículas, mas sem elas pode ocorrer secreção reduzida. Uma explicação para este fenómeno é a redundância funcional em que as proteínas dos grânulos líticos (perforina, granzymes A e B e Fas ligand) podem ser secretadas directamente do Aparelho De Golgi.
Por outro lado, pensa-se que a Syntaxin 11 deve fazer parte do complexo SNARE porque o deficit desta proteína dá origem à FHL4 (Linfohistiocitose Hemofagocítica Familiar do tipo 4) – doença genética caracterizada pela perda da função citotóxica. Contudo, existem células que mesmo sem a presença de syntaxin fazem a exocitose (Natural Killer Cells e CTL‟s) quando são incubadas com IL2 (Interleucina 2 – um tipo de citocina).
A FHL4 é uma doença rara autossómica recessiva, caracterizada pela fagocitose descontrolada de eritrócitos, plaquetas e linfócitos, como é visível na 1ª imagem [macrófago ao centro, “cheio” de erittócitos], e apresenta como principais sintomas espleno e hepatomegália e caracteriza-se também pelo aparecimento de icterícia.
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A libertação de grânulos não esta só associada com a libertação do seu conteúdo mas também com o aparecimento de proteínas de membrana lisossomais na membrana plasmática (LAMP1 – 2).
Estas proteínas são rapidamente endocitadas após a degranulação. Este fluxo bidireccional das LAMP-1 é controlado por integrinas (LFA-1). Na presença de ICAM, aquando da sua ligação com LAF-1 as LAMP ficam retidas na membrana plasmática na zona secretora. Na ausência de ICAM as LAMP distribuem-se em pequenos agregados na superfície celular.
Desta forma a ligação LFA-1/ICAM-1 no pSMAC vai actuar de forma a restringir e focalizar a endocitose e exocitose para o centro da sinapse.
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Conclui-se assim que o pSMAC restringe e focaliza a exocitose para o local de sinapse, permitindo uma eficaz reciclagem dos TCR.
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Semelhanças: todos os processos ocorrem no local em que o centrossoma se liga à membrana Ocorrem processos de endocitose e exocitose na fase final da citocinese, dirigidos pelo movimento do centrossoma (centrolina transporta “exocyst e SNARE proteins” que estão envolvidas na secreção durante a citocinese; outras proteínas e organelos relacionados com estes processos também se dirigem ao local). Algumas imagens mostram que as ligações entre o centríolo e a memb.plasmática, na S.Imunológica são semelhantes às da formação de cílios, formando inclusivamente uma pequena saliência. Pensa-se que como os linfócitos são incapazes de formar cílios, esta semelhança no processo na S.I pode corresponder a um ”frustrated cilium”. Quanto às proteínas IFT (intraflasellar transport), sabe-se que são expressas nos linfócitos e que se reúnem nos mesmos complexos que nos cílios/flagelos; localizam-se igualmente junto do C.Golgi e dos endossomas de reciclagem.
Diferenças: na F.Cílios e citocinese, ocorre apenas a actividade do centríolo-mãe, enquanto que na S.Imunológica é indiferente qual dos centríolos contacta com a membrana. Na F.Cílios, é necessária uma ligação física entre a membrana plasmática e o centríolo mãe. Na citocinese, so ocorre a “ruptura final” das células após a migração do centríolo mãe para o centro da célula. Relativamente, às membranas: nos cílios, actuam como sensores do ambiente externo, despoletando a sinalização intracelular através de receptores; na S.I, sinal é mediado pelo TCR que controlam a polarização do centrossoma bem como a secreção e endocitose.
Sabe-se ainda que quando se inactiva a expressão do complexo IFT, inibe-se a formação da sinapse. Porque o complexo associa-se ao TCR após a sua activação e regula a reciclagem de TCR. Logo, interfere directamente com formação da sinapse. O que é de todo semelhante ao que acontece nos cílios, visto que uma mutação nestas proteínas, impede a formação de cílios.
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Concluindo, as semelhanças nos mecanismos moleculares que conduzem à sinapse imunológica, à formação de cílios e à citocinese destacam a importância do centrossoma como elemento organizador da estrutura molecular da célula.
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Resumindo, a activação de células T pela ligação dos TCR ao pMHC activa mecanismos de sinalização celular que conduzem a uma reorganização molecular e do citoesqueleto de forma a tornar a membrana plasmática um local especializado na endocitose e exocitose focalizadas.
Este processo requer a actividade do centrossoma como centro organizador. As semelhanças entre o processo de formação da sinapse imunológica e os mecanismos de formação de cílios, de citocinese e até com mecanismos descobertos em protozoários sugerem que este mecanismo terá sido conservado ao longo da evolução sendo eficaz na especialização da membrana plasmática.
