UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
RAQUEL ORTEGA FERREIRA
USO COMBINADO DE CRISTALOGRAFIA DE
PROTEÍNAS E ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA A
SELEÇÃO ANTECIPADA DE PRODUTOS NATURAIS
BIOATIVOS
CAMPINAS
2018
RAQUEL ORTEGA FERREIRA
USO COMBINADO DE CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS E
ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA A SELEÇÃO ANTECIPADA DE
PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisites exigidos para a obtenção de Título de Mestra em Ciências, na Área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientadora: Dra. Daniela Barretto Barbosa Trivella
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA RAQUEL ORTEGA FERREIRA, E ORIENTADA PELA DRA. DANIELA BARRETTO BARBOSA TRIVELLA.
CAMPINAS 2018
Comissão examinadora
Dra. Daniela Barretto Barbosa Trivella Profa. Dra. Paula Christine Jimenez Dr. Artur Torres Cordeiro
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima.” Louis Pasteur
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela imerecida graça, pelo incondicional amor e pela capacidade concedida para a realização dessa obra. “Porque dele e por ele, e para ele, são todas as coisas; glória, pois, a ele eternamente. Amém.” Romanos 11:36.
Ao meu amado marido Victor, por todo amor, lealdade e companheirismo.
À minha amada mãe Violeta, por todo amor, ensinamento e suporte.
À Dra. Daniela, por todo aprendizado e crescimento.
Aos meus familiares e amigos, por todo apoio e incentivo.
Aos colegas de laboratório, por todo conhecimento e ajuda.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, pelo apoio financeiro. Registro aqui que as opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não necessariamente refletem a visão da CAPES.
Resumo
Produtos naturais são a principal fonte de novos fármacos e estes representam 75% dos fármacos atualmente disponíveis. Porém, a descoberta de fármacos a partir de fontes naturais é muito desafiadora devido à diversos fatores, como a identificação do composto de interesse nas primeiras etapas do processo e a obtenção de miligramas do produto bioativo puro, principalmente quando o composto-alvo é produzido em quantidades minoritárias pelo organismo-fonte. Com isto, nosso grupo vem trabalhando em abordagens alternativas para obtenção de duas informações essenciais na fase inicial da descoberta de PNs bioativos: estrutura química do composto natural e modo de ação da substância química no alvo. Esta estratégia se baseia na aplicação da pescaria cristalográfica e de redes moleculares, técnicas ortogonais baseadas em cristalografia de proteínas e espectrometria de massas que são conduzidas em escala miniaturizada, sendo passíveis de automação e de processamento integrado de dados. Neste trabalho, a abordagem foi aplicada para avaliar extratos de bactérias marinhas e frações cromatográficas derivadas, frente à inibição da atividade tipo quimiotripsina da partícula 20S do proteassomo – alvo este validado contra câncer. Dentre os extratos bioativos, selecionamos a amostra BRA346, proveniente de uma bactéria marinha do gênero Streptomyces, para aplicar as metodologias supracitadas como prova de conceito de nossa abordagem. Com apenas 5 mg do extrato bruto, em apenas duas semanas e procedimentos miniaturizados, foi possível propor a estrutura química do composto bioativo, o inibidor TMC-86A, além do sítio e do mecanismo de interação deste com o proteassomo. Foi verificado também que esse composto era minoritário e representava apenas 0,03% do extrato bruto, sendo assim, seu isolamento era um limitante para a descoberta e caracterização do inibidor. Abordagens tradicionais de isolamento de PNs foram aplicadas para prova de conceito, obtendo-se frações purificadas do composto alvo a partir de dois novos cultivos da bactéria marinha em escala ampliada, permitindo validar o PN responsável pela atividade biológica observada. No entanto, foi observada diminuição da produção do composto-alvo e também a variação de isômeros produzidos pela bactéria nos diferentes cultivos, alguns dos principais gargalos na área de PNs. Assim, as abordagens alternativas aqui aplicadas se mostraram eficazes e essenciais para a identificação do PN bioativo e seu modo de ação. Para a conclusão deste trabalho, selecionamos um análogo do inibidor para tentar confirmar a estrutura química proposta, por RMN. Este produto natural mostrou-se 67% semelhante ao TMC-86A por meio das análises do espectro de fragmentação de massas, sendo inativo frente a inibição do proteassomo e produzido em maior quantidade pela bactéria. Ainda assim, ao final dos três ciclos de purificação, não obteve-se massa suficiente para sua elucidação estrutural por RMN, provando na prática como é desafiadora a pesquisa com PNs pela abordagem tradicional. Isto ressalta a necessidade do desenvolvimento da abordagem aqui apresentada para a identificação antecipada de novos compostos bioativos. Portanto, espera-se que as novas metodologias aqui empregadas sejam usadas rotineiramente pela comunidade científica, auxiliando a tomada de decisão no processo de descoberta de produtos naturais bioativos e auxiliando na identificação antecipada de compostos naturais de interesse farmacêutico.
Palavras-chave: Proteassomo, câncer, produtos naturais marinhos, High Throughput Screening, redes moleculares, cristalografia de proteínas, descoberta de fármacos.
Abstract
Natural products are the main source of new drugs and they represent 75% of all the currently available drugs. However, the discovery of new drugs from natural sources is challenging due to several factors, such as identifying the interest compound in the first steps of the process and obtaining pure bioactive product, especially when the target compound is produced in minority quantities by the source organism. Our group has been working on alternative approaches to obtain two essential information in the initial process of bioative NP discovery: the natural compound chemical structure and its mode of action in the target protein. This strategy is based on crystallographic fisheing and molecular networking methods, orthogonal techniques based on protein crystallography and mass spectrometry, which are conducted on a miniaturized scale and are capable of automation and integrated data processing. In this work, the techniques were applied to evaluate marine bacteria extracts and derived chromatographic fractions against the inhibition of the chymotrypsin-like activity of the 20S proteasme particle – a validated target against cancer. Among the bioactive extracts, we selected the sample BRA346 from a marine bacterium of the genus Streptomyces, to apply the aforementioned methodologies as proof of concept of our approach. With only 5 mg of the crude extract, in only two weeks and miniaturized procedures, it was possible to propose the chemical structure of the bioactive compound, inhibitor TMC-86A, besides its site and the mechanism of interaction with proteasome. It was also found that this compound was minor and represented only 0.03% of the crude extract; thus, its isolation was a limiting factor for the characterization of the inhibitor. Traditional NP isolation approaches were applied for proof of concept, obtaining purified fractions of the target compound from two new cultures of the marine bacterium in large scale, allowing to validate the NP responsible for the biological activity observed. However, it was observed a decrease in the target compound production and a variation of isomers produced by the bacterium in different cultures, some of the main problems related to NPs. Thus, the alternative approaches applied here proved effective and essential for the identification of bioactive NP and its mode of action. To conclude this work, we selected an inhibitor analogue to try to confirm its proposed chemical structure by NMR. This natural product was 67% similar to TMC-86A, based on their fragmentation MS spectra, being inactive against the inhibition of the proteasome and produced in greater quantity by the bacterium. Even so, at the end of three purification cycles, sufficient mass was not obtained for its structural elucidation by NMR, showing in practice how challenging is NP research by the traditional approach. As a perspective, our group is working on the automation of mass spectrometry and crystallography data processing, aiming to make feasible the use of these methodologies in the routine search of new bioactive compounds by the scientific community, assisting on decision making in the proecss of NP Discovery and helping in the early identification of natural compounds of pharmaceutical interest.
Key words: proteasome, cancer, natural marine products, High Throughput Screening, molecular networks, protein crystallography, drug discovery.
Lista de figuras
Figura 1. Estrutura química do marizomib, inibidor natural do proteassomo. O marizomib é uma
salinosporamida com potencial antineoplásico, a qual se liga irreversivelmente à unidade catalítica 20S do proteassomo, modificando covalentemente os resíduos do sítio ativo. ... 19
Figura 2. Esquema simplificado do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS). A proteína alvo é marcada com
um polímero de ubiquitina por meio da ação das enzimas E1, E2 e E3. O proteassomo reconhece a proteína e a degrada em oligopeptídeos que, rapidamente, são clivados em aminoácidos (imagem modificada de Kisselev & Goldberg, 2001). ... 21
Figura 3. Representação do proteassomo eucariótico 26S e de sua partícula catalítica 20S. (a) Esquema
tridimensional do proteassomo 26S eucariótico, com duas unidades reguladores 19S representadas em vermelho e a unidade catalítica central em verde. A proteína a ser degradada é marcada com ubiquitina e reconhecida pela subunidade 19S, desubiquitinada pela mesma e direcionada à câmara catalítica, onde é clivada em peptídeos (imagem modificada de Carmo-Fonseca et al., 2010). (b) Organização estrutural da unidade catalítica do proteassomo de eucarionte, destacando os anéis heptaméricos alfa e beta e as subunidades catalíticas β1, β2 e β5 (imagem modificada de Dick & Fleming, 2010)... 22
Figura 4. Mecanismo catalítico do proteassomo. Em azul, os resíduos proteassomo. O substrato está em
preto, exceto pela ligação a ser clivada, a qual está destacada em vermelho. As três subunidades beta de cada anel interior contém resíduos de treonina (na posição 1 – Thr 1) cataliticamente ativos em suas cadeias N-terminal, as quais clivam ligações peptídicas nas cadeias C-terminal de seus substratos. Mais detalhadamente, em cada subunidade ocorre a desprotonação de Thr1OH, tornando este resíduo ativo (Thr1O-). O alcóxido gerado realiza então o ataque nucleofílico ao substrato proteico, iniciando assim o
processo de catálise (Tanaka, 2009; Kisselev et al., 2012). ... 23
Figura 5. Estrutura química de dois inibidores sintéticos do proteassomo disponíveis para uso clínico. (a)
O bortezomib é um análogo dipeptídico do ácido borônico com atividade antineoplásica, o qual inibe de forma covalente e reversível a subunidade ChTL do proteassomo. (b) Já o carfilzomib é um derivado da epoxomicina que também exibe atividade antineoplásica, ligando-se irreversivelmente à subunidade ChTL do mesmo (imagens extraídas e adaptadas de Kisselev et al., 2012). ... 25
Figura 6. Eletroforese desnaturante do proteassomo de S. cerevisae. (a) Foi feito um gel SDS-PAGE (15%)
do proteassomo de levedura utilizado posteriormente para cristalização e ensaios de atividade, a fim de verificar a pureza da proteína. No gel acima é possível observar apenas as bandas provenientes da unidade catalítica 20S, mostrando que o proteassomo foi completamente separado das demais proteínas intracelulares. (b) Perfil de eletroforese de proteassomo 20S (SDS-PAGE 12,5%) descrito na literatura por Finley et al., 2002. ... 44
Figura 7. Análise por DLS do proteassomo purificado. Para este experimento, a proteína estava em uma
concentração de 1 mg/mL em tampão MES com glicerol 15%. A análise de polidispersividade mostra que a amostra purificada é monodispersa. ... 45
Figura 8. Cristais do complexo 20S do proteassomo. Para a cristalização, utilizou-se uma placa hanging
drop de 48 poços e foi adicionado 200 µL da condição de cristalização no poço. Para a obtenção do cristal,
colocou-se 0,7 µL de solução de cristalização e 0,7 µL da solução da proteína a uma lamínula. A placa foi armazenada à 18°C, sendo os primeiros cristais formados a partir de 12 horas nas condições de cristalização. Os cristais apresentaram tamanho entre 200 e 600 µm no maior eixo e 25 e 100 µm no menor eixo. ... 45
Figura 9. Ensaio de atividade de inibição do proteassomo frente ao lote de extratos BRA e BRB, nas placas concentradas (500 µg/mL). Para este ensaio, a concentração final de enzima solubilizada em tampão e de
substrato LLVY-AMC foram respectivamente 0,76 µg/mL e 40 µM, e os extratos estavam à 500 µg/mL, exceto BRA346* (50 µg/mL) – destacado em preto. As amostras químicas foram incubadas com a enzima por 1 ou 24 horas anteriormente à adição do substrato. ... 46
Figura 10. Ensaio de atividade de inibição do proteassomo frente ao lote de extratos BRAs e BRBs, diluídos (50 µg/mL). Para este ensaio, a concentração final de enzima solubilizada em tampão e de substrato
LLVY-AMC foram respectivamente 0,76 µg/mL e 40 µM, e os extratos estavam à 50 µg/mL, exceto BRA346* (5
µg/mL) – destacado em preto. As amostras químicas foram incubadas com a enzima por 1 ou 24 horas
anteriormente à adição do substrato. ... 47
Figura 11. Curva concentração-resposta do extrato inibidor BRA346. Para este ensaio, a enzima foi
adicionada a uma concentração final de 0,76 µg/mL, o substrato LLVY-AMC à 40 µM e o a concentração do extrato no ensaio variada de 0 à 50 µg/mL. O tempo de incubação foi de duas horas e o Z’ da placa foi de 0,83. O valor de IC50 obtido para o composto inibidor do extrato BRA346 foi de 0,4175 µg/mL com valor de R2 de 0,9808. ... 49
Figura 12. Fluxograma utilizado para o isolamento bio-quimio guiado do extrato BRA346. No total, foram
feitos três cultivos, cinco fracionamentos e três procedimentos de soaking com cristais do proteassomo para análise por cristalografia de proteínas. ... 52
Figura 13. Cromatograma do fracionamento do extrato BRA346 – cultivo 1. Os intervalos entre as linhas
pontilhadas representam as frações cromatográficas geradas, e a linha preta contínua indica a absorção de luz pelos compostos eluídos da cromatografia (UV, PDA Max Plot). O extrato foi fracionado em coluna C18 semi-preparativa e os retângulos em vermelho indicam as frações que apresentaram atividade inibitória frente à subunidade ChTL do proteassomo. ... 53
Figura 14. Ensaio de atividade de inibição do proteassomo das frações advindas do extrato BRA346 – cultivo 1. Para este ensaio, cada fração foi seca e ressuspendida em 25 µL de DMSO. Como partiu-se de 5
mg do extrato bruto, as frações continham menos de 1 mg de massa seca, sendo inviável sua pesagem com precisão e ressuspensão em concentração conhecida. A enzima foi adicionada a uma concentração final 0,76 µg/mL e o substrato LLVY-AMC à 40 µM. O retângulo em vermelho destaca as frações de maior interesse que inibiram mais fortemente o proteassomo. O ensaio foi realizado em triplicatas, sendo os valores mostrados as médias e SEM das replicatas. O TMC-95A, inibidor conhecido do proteassomo, foi utilizado como inibidor referência a concentração de 30 µM. Os grupos denominados “DMSO” representam os controles negativos de inibição (reação conduzida na ausência de inibidores). O Z’ desta placa foi de 0,79. ... 53
Figura 15. Mapa da densidade eletrônica da estrutura cristalográfica do proteassomo 20S de levedura, incubado com a fração 58 – cultivo 1. Os dados foram coletados na linha de difração de raio X MX2 do LNLS,
CNPEM, Campinas-SP, sendo os dados processados a 2.8 Å de resolução. Em azul é mostrado o mapa de densidade eletrônica 2mFobs-DFcalc com nível de contorno igual à 1 (1 σ), sendo o mapa de diferença mFobs-DFcalc mostrado em verde (positivo) e vermelho (negativo) com nível de contorno igual à 3 (3 σ). A densidade eletrônica extra, evidenciada no mapa de diferença, é apontada (círculo pontilhado). O resíduo catalítico Thr1 é anotado. Os átomos de oxigênio são mostrados em vermelho, de nitrogênio em azul e os de carbonos em amarelo (proteína). A figura foi gerada com o programa PyMOL. ... 55
Figura 16. Mapa de densidade eletrônica da estrutura cristalográfica do proteassomo após incubação com a amostra concentrada das frações 57 e 58 – cultivo 1. Os dados foram coletados na linha de difração de
raio X MX2 do LNLS, CNPEM, Campinas-SP, sendo os dados processados a 2.5 Å de resolução. Em azul é mostrado o mapa de densidade eletrônica 2mFobs-DFcalc com nível de contorno igual à 1 (1 σ), sendo o mapa de diferença mFobs-DFcalc mostrado em verde (positivo) e vermelho (negativo) com nível de contorno igual à 3 (3 σ). A densidade eletrônica extra, evidenciada no mapa de diferença, é apontada. O posicionamento do resíduo catalítico Thr1 é destacado. Os átomos de oxigênio são mostrados em vermelho, de nitrogênio em azul e os de carbonos em amarelo (proteína). A figura foi gerada com o programa PyMOL. ... 58
Figura 17. Ajuste do aduto duplo-covalente derivado da ligação de carmaficina A à Thr1 do proteassomo de levedura, na densidade eletrônica da estrutura cristalográfica do proteassomo em complexo com inibidor capturado a partir das frações 57 e 58 (concentradas 10x) do extrato BRA346 – cultivo 1.
Modelagem do inibidor na densidade eletrônica não refinada. Em azul é mostrado o mapa de densidade eletrônica 2mFobs-DFcalc com nível de contorno igual à 1 (1 σ), sendo o mapa de diferença mFobs-DFcalc mostrado em verde (positivo) e vermelho (negativo) com nível de contorno igual à 3 (3 σ). Os átomos de oxigênio são mostrados em vermelho, de nitrogênio em azul, os de carbonos em amarelo (proteína) e rosa o aduto carmaficina-Thr1, formando o anel morfolino. A figura foi gerada com o programa Pymol... 62
Figura 18. Redes moleculares construídas a partir de amostras químicas ativas e inativas selecionadas do cultivo 1 de BRA346. (a) Rede molecular construída com as amostras: extrato bruto BRA346 e frações do
pico de atividade 57-58 (ativas), 56 e 59 (parcialmente ativas) e 55 e 60 (inativas), totalizando 434 nodos.
(b) Rede molecular filtrada pelo cut-off de m/z>= 300 Da, contendo 364 nodos. (c) Rede molecular filtrada
para os 159 nodos presentes apenas nas frações ativas. Os nodos em azul representam os íons encontrados apenas no extrato bruto. Os nodos em verde escuro correspondem aos íons encontrados em pelo menos duas frações ativas, enquanto os nodos verde claro representam íons detectados em pelo menos três frações ativas. Os nodos em cinza escuro representam íons encontrados em pelo menos uma fração ativa e uma inativa, enquanto os nodos em cinza claro representam íons presentes apenas nas frações inativas. A seta em vermelho mostra a m/z 343,186. ... 66
Figura 19. Cromatogramas das amostras BRA346 (extrato bruto, cultivo 1) e frações ativas derivadas do fracionamento 1 de BRA346 (F57 e F58). O cromatograma analisado por massas (BPC) é mostrado para a
amostra BRA346 (preto) e frações ativas 57 e 58 (vermelho). A m/z 343,186±0,001 foi filtrada, sendo o cromatograma filtrado mostrado no inset dos gráficos, na faixa do tempo de retenção da m/z alvo de 4 à
4,5 min. Notar que a escala de intensidade (eixo “y”) foi ajustada para facilitar a visualização da m/z candidata nos insets. ... 69
Figura 20. Espectro de fragmentação experimental da m/z 343,186 e sua comparação com o espectro teórico do TMC-86A. Em azul é mostrado o espectro experimental da m/z 343,186 e em vermelho o
espectro teórico gerado pelo programa CFM ID. Para gerar o espectro teórico, foi usado o programa CFM ID e foi inserido o SMILES do TMC-86A disponível no PubChem. Os picos referentes a m/z inferiores a 100 gerados no CFM ID foram omitidos nesta análise experimental. No canto inferior direito é mostrada a estrutura do TMC-86A utilizada para a comparação teórica. ... 71
Figura 21. Cromatograma do primeiro fracionamento do extrato BRA346 – cultivo 2. Os intervalos entre
as linhas pontilhadas representam as frações cromatográficas e a linha preta contínua indica a absorção de luz pelos compostos eluídos da cromatografia (UV, PDA Max Plot). O extrato foi fracionado em coluna C18 preparativa e os retângulos em vermelho indicam as frações que apresentaram atividade inibitória frente à subunidade ChTL do proteassomo. ... 72
Figura 22. Ensaio de atividade de inibição do proteassomo frente às frações do segundo cultivo do extrato BRA346 na placa concentrada (500 µg/mL) – cultivo 2. Para este ensaio, a enzima foi adicionada a uma
concentração final 1 µg/mL, o substrato LLVY-AMC à 40 µM e os extratos estavam à 50 µg/mL. O retângulo indica as frações (39 e 40) que inibiram mais potentemente o proteassomo e que contém a m/z 343,186. O Z´ do ensaio foi de 0,82. ... 73
Figura 23. Ensaio de atividade de inibição do proteassomo frente às frações do segundo cultivo do extrato BRA346 na placa diluída (50 µg/mL) – cultivo 2. Para este ensaio, a enzima foi adicionada a uma
concentração final 1 µg/mL, o substrato LLVY-AMC à 40 µM e os extratos estavam à 50 µg/mL. O retângulo indica as frações (39 e 40) que inibiram mais potentemente o proteassomo e que contém a m/z 343,186. O Z´ do ensaio foi de 0,82. ... 73
Figura 24 Ajuste do aduto TMC-86A-Thr1 na densidade eletrônica da estrutura cristalográfica do proteassomo eucarionte em complexo com inibidor capturado a partir da fração 40 do extrato BRA346 – cultivo 2. Modelagem do inibidor na densidade eletrônica não refinada. (a) Estrutura após ciclos de
refinamento com phenix.refine. (b) Em azul é mostrado o mapa de densidade eletrônica 2mFobs-DFcalc com nível de contorno igual à 1 (1 σ), sendo o mapa de diferença mFobs-DFcalc mostrado em verde (positivo) e vermelho (negativo) com nível de contorno igual à 3 (3 σ). Os átomos de oxigênio são mostrados em vermelho, de nitrogênio em azul, os de carbonos em amarelo (proteína) e cinza claro o aduto TMC-86A-Thr1-Thr2. A figura foi gerada com o programa PyMOL. ... 76
Figura 25. Cromatograma do fracionamento da fração 40 proveniente do extrato BRA346 – Cultivo 2. Os
intervalos entre as linhas pontilhadas representam as frações cromatográficas e a linha preta contínua indica a absorção de luz pelos compostos eluídos da cromatografia (UV, PDA Max Plot). O extrato foi fracionado em coluna C18 semi-preparativa e os retângulos em vermelho indicam as frações que apresentaram atividade inibitória frente à subunidade ChTL do proteassomo. ... 79
Figura 26. Ensaio de atividade de inibição do proteassomo das frações advindas do segundo fracionamento (fracionamento da fração 40) do extrato BRA346 – cultivo 2. Para este ensaio, a enzima foi
adicionada a uma concentração final 1 µg/mL e o substrato LLVY-AMC à 40 µM. Já as frações foram secas e ressuspendidas em 25 µL de DMSO, não sendo possível saber a concentração final do inibidor. O retângulo em preto destaca as frações que continha a m/z 343,186 (frações 31 e 32). O Z´ desta placa foi de 0,89. 79
Figura 27. Cromatogramas das amostras BRA346 (extrato bruto, cultivo 2) e frações ativas derivadas dos fracionamento 1 e 2 de BRA346 (F40 e F31, respectivamente). O cromatograma analisado por massas (BPC)
é mostrado para a amostra BRA346 (preto) e frações ativas do fracionamento 1 (fração 40 - vermelho) e fracionamento 2 (fração 31 - verde). A m/z 343,186±0,001 foi filtrada, sendo o cromatograma filtrado mostrado no inset dos gráficos, na faixa do tempo de retenção da m/z alvo de 4,5 a 6 minutos. Notar que a escala de intensidade (eixo “y”) foi ajustada para facilitar a visualização da m/z candidata nos insets. ... 80
Figura 28. Rede molecular construída a partir de frações ativas e inativas provenientes dos extratos BRA346 dos cultivos 1 e 2. Em azul está destacada a m/z 343,186, única m/z consistentemente presente
nas frações ativas e circulado está o cluster no qual essa m/z está inserida. ... 82
Figura 29. Estrutura química do TMC-86A. A fórmula química deste íon é C16H27N206+ e sua m/z exata é
343,1864. ... 84
Figura 30. Mecanismo reacional inibitório da epoxicetona. Mecanismo de reação envolvendo o resíduo
Thr1 do sítio ativo do proteassomo reagindo com o grupo epoxicetona da molécula inibidora epoxomicina (Trivella et al., 2014). ... 85
Figura 31. Cromatogramas do extrato bruto BRA346 do terceiro cultivo com a m/z 343,186 filtrada. O
343,186±0,001 foi filtrada, sendo o cromatograma filtrado mostrado no inset dos gráficos, na faixa do tempo de retenção da m/z alvo de 4,5 a 6 minutos. Notar que a escala de intensidade (eixo “y”) foi ajustada para facilitar a visualização da m/z candidata no inset. ... 86
Figura 32. Análise da m/z 343,186 nos extratos brutos e frações ativas dos cultivos 1, 2 e 3. A m/z 343,186
foi filtrada com um erro de 0,01. As amostras foram propositalmente deixadas em diferentes escalas para não comprometer a visualização dos picos de menor intensidade. Vale ressaltar que houveram alterações nos métodos analíticos das diferentes amostras químicas. Por isso, foi realizada uma análise dos picos relativos à m/z 343,186, assinalando-se as identidades A-D para isômeros equivalentes. Os números sob cada pico representam seus respectivos tempos de retenção. ... 88
Figura 33. Espectros de fragmentação da m/z 343,186 do pico A das frações 58 (cultivo 1), 40 e 32 (cultivo 2) e 32 e 33 (cultivo 3). Os espectros de fragmentação dos picos majoritários (pico A) dos três cultivos foram
comparados entre si. Para isso, foi obtida a lista de picos dos espectros de fragmentação MS2 da m/z 343,186. ... 92
Figura 34. Cluster da m/z 343,186. Neste cluster estão agrupadas as m/z que são quimicamente
semelhantes e em azul está destacada a m/z 343,186. Em vermelho estão outras três massas de interesse para o isolamento e elucidação estrutural para prova de conceito. ... 93
Figura 35. BPC das frações provenientes do primeiro fracionamento do cultivo 3. Os BPCs foram filtrados
em um range de 200 à 1000. Para ter uma visão mais global da composição das frações, as escalas da intensidade (eixo “y”) foram ajustadas para cada amostra, não sendo padronizadas entre elas. Com estes cromatogramas, é possível observar padrões nos perfis de eluição, mostrando que o fracionamento em cartucho C18 foi eficiente para a separação de compostos de polaridades distintas. ... 94
Figura 36. Cromatografias realizadas em HPLC utilizando coluna C18 semipreparativa. São mostrados os
cromatogramas das seis corridas da amostra composta pelas frações 3 e 4 da cromatografia em cartucho C18 do extrato BRA346-cultivo 3. A eluição dos compostos químicos foi monitorada utilizando PDA. ... 97
Figura 37. BPC das frações provenientes do segundo fracionamento do cultivo 3 com as m/z de interesse filtradas. Os BPCs das frações 3 e 4 foram filtrados em um range de 200 à 1000 e as massas foram filtradas
com erro de 0.001. Para ter uma visão mais global da composição das frações, as escalas da intensidade (eixo “y”) foram ajustadas para cada amostra, não sendo padronizadas entre elas. Com estes cromatogramas, é possível observar que a m/z 379,161 é a mais abundante dentre as quatro massas de interesse. ... 98
Figura 38. Gráfico de eluição da massa alvo e da m/z 343,186. A m/z 379,161 apresentam uma intensidade
10 vezes maior à m/z 343,186, indicando estar presente em uma abundancia muito superior na amostra. Embora ambas massas coeluam, estas têm seus extremos de eluição em frações diferentes. ... 98
Figura 39. Ensaio de atividade de inibição da subunidade ChTL do proteassomo pelas frações cromatográficas relativas ao pico de eluição da m/z 379 e m/z 343 da fração 3-4, fracionamento 2, cultivo 3. Para este ensaio, a concentração final de cada fração foi de 0,1 mg/mL. A enzima foi adicionada a uma
concentração final 0,76 µg/mL e o substrato LLVY-AMC à 40 µM. ... 99
Figura 40. Cromatogramas dos ciclos de fracionamento da m/z 379,161 a partir do extrato bruto BRA346.
O cromatograma analisado por massas (BPC) é mostrado em cinza a m/z 343,186±0,001 foi filtrada em vermelho, sendo esta destacada nos inset dos gráficos. ... 101
Lista de tabelas
Tabela 1. Descrição das diferentes técnicas cromatográficas utilizadas para a purificação do complexo 20S
do proteassomo. ... 28
Tabela 2. Descrição das variáveis e suas respectivas condições ideais para os ensaios HTS com o
proteassomo... 30
Tabela 3. Parâmetros utilizados na plataforma GNPS para construção da rede molecular. ... 36 Tabela 4. Estatísticas de coleta e processamento de dados da estrutura cristalográfica proteassomo
incubado com a fração 58 do cultivo 1. Os dados em parênteses indicam a faixa de maior resolução. ... 56
Tabela 5. Estatísticas de coleta e processamento de dados da estrutura cristalográfica proteassomo
incubado com as frações 57 e 58 do cultivo 1. Os dados em parênteses indicam a faixa de maior resolução. ... 59
Tabela 6. Estatísticas de coleta e processamento de dados da estrutura cristalográfica proteassomo
incubado com as frações 57 e 58 do cultivo 1. Na estrutura foi ajustado o inibidor carmaficina. Os dados em parênteses indicam a faixa de maior resolução. ... 63
Tabela 7. Tabela sintetizada da análise de correlação entre número de espectros e atividade biológica das
m/z detectadas na rede molecular construída a partir do conjunto de frações (57-58, 56-59 e 55-60) obtidas de BRA346, filtrada com o cut-off de >= 300 Da. ... 67
Tabela 8. As das 10 m/z que apresentaram maior coeficiente de correlação nesta análise. ... 68 Tabela 9. Estruturas de maior score retornadas pelo MetFrag. ... 74 Tabela 10. Estatísticas de coleta e processamento de dados da estrutura cristalográfica proteassomo
incubado com a fração 40 do cultivo 2. O inibidor TMC-86A foi ajutado na estrutura. Os dados em parênteses indicam a faixa de maior resolução. ... 77
Tabela 11. Tabela resumo das massas alvo presentes no cluster da m/z 343,186 e o número de espectros
detectados para cada uma delas nas diferentes frações geradas da cromatografia em cartucho C18. Em vermelho está a m/z 343,186 que não teve nenhum espectro detectado em nenhuma das frações, mostrando quão minoritária esta massa é no terceiro cultivo. Em amarelo estão as outras três massas presentes nas frações selecionadas (frações 3 e 4). ... 95
Tabela 12. Cálculo teórico da quantidade de massa da m/z 379,161 presente no extrato bruto BRA346 e
Sumário
1. Introdução e justificativa ... 16
1.1. Produtos naturais e a descoberta de fármacos... 16
1.2. Produtos naturais marinhos na inovação em fármacos ... 18
1.3. O complexo proteassomo como alvo para o desenvolvimento de fármacos contra câncer ... 20
1.4. Metodologias integradas para a identificação precoce de produtos naturais bioativos ... 25
3. Material e Métodos ... 28
3.1. Bibliotecas químicas de produtos naturais marinhos acessadas ... 28
3.2. Purificação do proteassomo ... 28
3.3. Triagem da biblioteca de produtos naturais marinhos ... 29
3.3.1. Ensaio High Throughput Screening – HTS ... 29
3.3.2. Confirmação e seleção de hits ... 32
3.4. Isolamento bio e quimioguiado ... 33
3.5. Fracionamento em sistema HPLC ... 33
3.6. Análises de espectrometria de massas, redes moleculares e proposição de estruturas químicas a partir do padrão de fragmentação MS/MS ... 34
3.6.1. Redes moleculares MS-MS/MS ... 35
As redes moleculares deste trabalho foram gentilmente processadas e analisadas pelo Dr. Rafael de Felício do LQPN, LNBio-CNPEM. ... 35
A ferramenta de redes moleculares (ou molecular networking) foi utilizada com o objetivo de analisar o perfil químico das amostras buscando-se a desreplicação de resultados e o enfoque de moléculas ainda não conhecidas. ... 35
3.6.2. Proposta de estruturas químicas a partir do espectro de fragmentação MS/MS 37 3.6.3. Correlação de dados bioquímicos com dados de espectrometria de massas para a seleção de m/z candidatas ... 38
3.7. Caracterização bioquímica e estrutural dos hits identificados com o proteassomo ... 39
3.7.1. Caracterização bioquímica ... 39
3.7.2. Caracterização estrutural ... 39
4. Resultados e Discussão ... 42
4.1. Purificação e Cristalização do Complexo do Proteassomo 20S ... 43
4.2. Triagem bioquímica dos produtos naturais marinhos ... 46
4.3. Extrato BRA346 ... 49
4.3.1. Isolamento bio e quimioguiado do produto natural responsável pela atividade biológica de BRA346 e sua proposta estrutural ... 50
Cultivo 1 ... 52
Primeiro Fracionamento do extrato bruto BRA346 – Cultivo 1 ... 52
Seleção da fração hit prioritária – Cultivo 1 ... 53
Captura cristalográfica – Cultivo 1... 55
Análises de massas, redes moleculares MS/MS e seleção de m/z candidatas – cultivo 1 ... 64
Proposição da estrutura química do inibidor a partir de dados de massas e cristalografia – cultivo 1 ... 70
Cultivo 2 ... 71
Primeiro fracionamento do extrato bruto BRA346 – cultivo 2 ... 72
Segundo fracionamento do extrato bruto BRA346 – cultivo 2 ... 78
Redes Moleculares – cultivos 1 e 2 ... 81
TMC-86A é o inibidor identificado na fração bioativa de polaridade intermediária de BRA346 ... 83
Cultivo 3 ... 86
O extrato bruto era quimicamente muito complexo e a massa alvo era minoritária na amostra (0,56%). Com os ciclos de purificação, contaminantes foram sendo excluídos e as frações selecionadas foram enriquecendo a quantidade relativa da m/z 379,161 (de 0,56 para 10,78% BPC). Contudo, a partir do cálculo relativo desta m/z BPC, a m/z 379,161 presente no extrato e nas frações subsequentes (Tabela 11), era improvável obter massa suficiente do composto puro para sua elucidação estrutural por RMN. ... 102
5. Conclusão e perspectivas ... 104
1. Introdução e justificativa
1.1. Produtos naturais e a descoberta de fármacos
Produtos naturais – ou PNs – são compostos orgânicos derivados de fontes naturais, como plantas, invertebrados e microrganismos (Koehn & Carter, 2005). Os PNs, também chamados de metabólitos secundários (Harvey, 1999), são considerados a principal fonte de diversidade química para a descoberta de fármacos (Demain & Zhang, 2005; Harvey, 2008; Newman & Cragg 2016). Nesse contexto, estes são utilizados no tratamento de doenças em quase todas as áreas terapêuticas e aproximadamente 75% de todas as pequenas moléculas aprovadas como fármacos são provenientes de produtos naturais ou derivados de produtos naturais sinteticamente modificados (Newman & Cragg 2016). Entretanto, nas últimas décadas, as companhias farmacêuticas têm diminuído significativamente os investimentos nessa área devido à fatores limitantes, como a longa duração e o alto custo do processo de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos a partir de PNs (Lam, 2007; Singh & Barrett, 2006; Rishton, 2008). Portanto, embora os produtos naturais continuem sendo fonte de uma grande variedade e novidade estrutural, a descoberta de fármacos a partir destes apresenta vários desafios a serem superados, sendo os principais: a quantidade de amostra biológica necessária; o reabastecimento da mesma; e a identificação do produto natural bioativo logo nas primeiras etapas do processo de descoberta (Lam, 2007; Singh & Barrett, 2006; Rishton 2008; Beutler, 2009).
A quantidade de amostra requerida para o isolamento e a elucidação estrutural de compostos bioativos é um dos maiores desafios na descoberta de fármacos a partir de produtos naturais. Isto ocorre porque um extrato bruto produzido a partir de uma
amostra biológica pode conter até milhares de compostos estruturalmente diversos. Além disso, estes compostos estão presentes em diferentes concentrações, sendo que normalmente os metabólitos secundários são minoritários em relação aos metabólitos primários (Molinski, 2014; Drew & Demain, 1977). Outro fator limitante da pesquisa com PNs é o reabastecimento dessa amostra biológica. Frequentemente o composto bioativo só é produzido pelo organismo sob certas condições ambientais ou ecológicas, o que torna difícil a reprodução e controle das mesmas. No caso de micro-organismos cultiváveis em laboratório, estes fatores podem ser parcialmente controlados; no entanto, os fatores que induzem a produção da molécula podem não ser completamente compreendidos e o microrganismo pode simplesmente parar de produzir o composto-alvo. Fora a não reprodutibilidade e a baixa produção do metabólito secundário de interesse, há também o problema associado à perda da quantidade do composto bioativo ao longo do processo de purificação. Deste modo, a obtenção e o reabastecimento do composto-alvo em proporções suficientes para sua elucidação estrutural são dois dos grandes desafios relacionados à descoberta de fármacos de fontes naturais (Sunkel, 2008; Selvin et al., 2010; Beutler, 2009, Yan et al., 2003).
Buscando contornar esses problemas, as atuais plataformas e programas de High Throughput Screening (HTS) visam utilizar pouca quantidade de amostra biológica e reduzir o período de testes, escolha e priorização de hits de anos à alguns meses. Porém, uma vez que um hit tenha sido confirmado na triagem biológica, o extrato deve ser fracionado para isolar o composto ativo e a cada etapa de purificação devem ser feitos bioensaios para que seja feita a identificação das frações bioativas (Beutler, 2009). Adicionalmente à toda dificuldade do processo de purificação do PN-alvo, já são conhecidas cerca de 230.000 estruturas químicas provenientes de fontes naturais e
milhares de novas moléculas são incluídas a esse universo anualmente (Zani & Carroll, 2017). Consequentemente, ao final do isolamento e caracterização de produtos naturais, frequentemente são re-isolados compostos já descritos, desperdiçando-se assim tempo e recursos (Gu et al., 2013, Beutler, 2009; Zani & Carroll, 2017).
Portanto, isolar e elucidar a estrutura de um novo produto natural através das técnicas convencionais é um processo demorado, trabalhoso, bastante complexo e suscetível ao fracasso (Zani & Carroll, 2017). Dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de novas estratégias e tecnologias capazes de otimizar a busca e descoberta por produtos naturais bioativos, viabilizando o uso desta rica fonte de diversidade química em biomedicina (Beutler, 2009).
1.2. Produtos naturais marinhos na inovação em fármacos
Os oceanos ocupam mais de dois terços da superfície da Terra e abrigam quase todos os grupos de organismos vivos. Sendo assim, os ecossistemas marinhos podem ser considerados os detentores da maior biodiversidade filética. Consequentemente, os metabolitos secundários marinhos são muito importantes para o nicho da descoberta e design de fármacos, pois atuam tanto como inibidores quanto reguladores de diversos processos celulares (Costa-Lotufo et al., 2009; Arrieta et al., 2010; Simmons et al., 2005; Jensen et al., 2015). Dentre os organismos marinhos de maior interesse farmacêutico estão os invertebrados, fungos e bactérias. Esses três grupos de organismos são adaptados para sobreviver em condições extremas de temperatura, pressão, salinidade e pH, fazendo com que estes produzam moléculas quimicamente únicas (Blunt et al., 2006; Bhadury et al., 2006; Sarker et al., 2006).
Em particular, estudos mostram que grupos selecionados de actinomicetos são fonte de novos produtos naturais bioativos (Fenical & Jensen, 2006). Membros do gênero Salinispora tem provado ser uma fonte especialmente rica de novas estruturas químicas, incluindo o potente inibidor de proteassomo salinosporamida A – SalA (Figura 1). SalA (ou marizomib) é um PN marinho que se encontra em testes clínicos para o tratamento de mieloma múltiplo (MM) e outros tumores sólidos (Jensen et al., 2015; Ma & Diao, 2015; Kale & Moore, 2012). Portanto, o ambiente marinho abriga um vasto número de espécies que são a fonte de uma ampla gama de metabólitos secundários bioativos estruturalmente diversos (Ruiz-Torres et al., 2017).
Marizomib
Figura 1. Estrutura química do marizomib, inibidor natural do proteassomo. O marizomib é uma
salinosporamida com potencial antineoplásico, a qual se liga irreversivelmente à unidade catalítica 20S do proteassomo, modificando covalentemente os resíduos do sítio ativo.
Além do marizomib, metabolitos secundários marinhos originaram e inspiraram a formulação de diversos outros fármacos anticâncer. Alguns destes já estão disponíveis para uso clínico, como por exemplo: Citarabina Ara-C (Citosar – U®), Trabectedina (Yondelis®), Mesilato de Eribulina (Halaven®) e Brentuximab Vedotin (Adcetris®), dentre outros (Chen et al., 2015; Gerwick & Fenner, 2013; Kale & Moore, 2012; Costa-Lotufo et al., 2012; Gerwick & Moore, 2012; Pinto et al, 2002). Portanto, embora o uso de PNs tenham trazido um grande avanço biotecnológico na descoberta de fármacos, esse
processo ainda é desafiador e pode ser considerado um “gargalo” por ser muito longo e custoso (Demain, 2014; Trivella & de Felicio, 2018).
1.3. O complexo proteassomo como alvo para o desenvolvimento de fármacos contra câncer
Câncer é um conjunto complexo de doenças que surgem devido às alterações genéticas e epigenéticas que interferem no crescimento e morte celular (Hoeijmakers, 2009). De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o câncer é a segunda principal causa de morte no mundo e esta doença foi responsável por 8,8 milhões de mortes no ano de 2015. Globalmente, quase 1 em 6 mortes ocorrem devido ao câncer (OMS, 2018). Para compreender estas altas taxas de mortalidade ocasionadas pelo câncer, é preciso conhecer como o espectro de alterações causadas por esta doença podem afetar desde a atividade molecular dentro de uma célula, até a comunicação entre células e tecidos (Quail & Joyce, 2013). Portanto, faz-se necessário saber sobre as influências moleculares e celulares causadas por perturbações oncogênicas e, a partir disto, descobrir como reverte-las efetivamente fazendo uso de terapias direcionadas, potentes agentes farmacológicos e novos alvos moleculares.
Um dos mecanismos de ação com alto potencial de aplicação farmacológica contra o câncer é a inibição do proteassomo. O proteassomo é um complexo proteico multi-subunidades encontrado no núcleo e no citoplasma de todas as células eucarióticas, constituindo mais de 3% do conteúdo celular proteico. Participante do sistema extralisossomal da ubiquitina-proteassomo (UPS), como mostrado na Figura 2, o proteassomo degrada a maioria das proteínas intracelulares (cerca de 80% destas), sendo, portanto, essencial para funções celulares como proliferação, diferenciação, transdução
de sinal, expressão gênica, regulação metabólica e apoptose (Ravid, 2008; Dahlmann, 2007; Demo et al., 2007).
Figura 2. Esquema simplificado do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS). A proteína alvo é marcada com
um polímero de ubiquitina por meio da ação das enzimas E1, E2 e E3. O proteassomo reconhece a proteína e a degrada em oligopeptídeos que, rapidamente, são clivados em aminoácidos (imagem modificada de Kisselev & Goldberg, 2001).
O proteassomo 26S eucariótico (Figura 3-a) possui uma estrutura cilíndrica formada por uma unidade catalítica central denominada de 20S, a qual é simetricamente ligada aos complexos regulatórios 19S (Jung et al., 2009). Os complexos regulatórios 19S são compostos por 19 subunidades entre 10 e 110kDa e são responsáveis pelo reconhecimento de substratos poli-ubiquitinados, desubiquitinação dos mesmos, desdobramento de proteínas-alvo e seu direcionamento para o interior da câmara catalítica, onde são hidrolisados (Navon & Goldberg; Glickman et al., 1998). Já a unidade catalítica 20S (Figura 3-b), cujo peso molecular é de aproximadamente 750 kDa, é composta por quatro anéis: dois anéis exteriores que possuem sete subunidades α, sendo
estas responsáveis pela abertura e fechamento da câmara catalítica, além de dois anéis internos com sete subunidades β, onde estão situados os sítios catalíticos (Adams, 2004). Uma vez que estes sítios são altamente conservados, o proteassomo 20S desempenha essencialmente os mesmos papéis proteolíticos em todos os eucariotos (Tanaka, 2009).
a) Proteassomo 26S b) Unidade catalítica 20S
Figura 3. Representação do proteassomo eucariótico 26S e de sua partícula catalítica 20S. (a) Esquema
tridimensional do proteassomo 26S eucariótico, com duas unidades reguladores 19S representadas em vermelho e a unidade catalítica central em verde. A proteína a ser degradada é marcada com ubiquitina e reconhecida pela subunidade 19S, desubiquitinada pela mesma e direcionada à câmara catalítica, onde é clivada em peptídeos (imagem modificada de Carmo-Fonseca et al., 2010). (b) Organização estrutural da unidade catalítica do proteassomo de eucarionte, destacando os anéis heptaméricos alfa e beta e as subunidades catalíticas β1, β2 e β5 (imagem modificada de Dick & Fleming, 2010).
Por ser uma protease multicatalítica, cada subunidade do 20S apresenta preferência por diferentes sítios de clivagem no substrato. Os sítios ativos do proteassomo estão localizados nas subunidades catalíticas β1, β2 e β5, sendo que a subunidade β1 cliva após
resíduos ácidos (caspase-like, CL), a subunidade β2 clivaapós resíduos básicos
(tripsina-like, TL) e a subunidade β5 cliva após resíduos hidrofóbicos (quimotripsina-like, ChTL).
Como mecanismo catalítico (Figura 4), estas subunidades utilizam o grupo hidroxila da cadeia lateral da Thr1 – ou alcóxido gerado no microambiente do sítio catalítico (Thr1-Oγ)
– como nucleófilo para o ataque à ligação peptídica de seus substratos. A posição N-terminal de Thr1 caracteriza este complexo enzimático como uma hidrolase aminoterminal, distinguindo o proteassomo da maioria das outras proteases celulares (Blackburn et al., 2010; Crawford et al., 2011; Adams, 2004; Almond & Cohen, 2002).
Mecanismo catalítico do proteassomo
Figura 4. Mecanismo catalítico do proteassomo. Em azul, os resíduos proteassomo. O substrato está em
preto, exceto pela ligação a ser clivada, a qual está destacada em vermelho. As três subunidades beta de cada anel interior contém resíduos de treonina (na posição 1 – Thr 1) cataliticamente ativos em suas cadeias N-terminal, as quais clivam ligações peptídicas nas cadeias C-terminal de seus substratos. Mais detalhadamente, em cada subunidade ocorre a desprotonação de Thr1OH, tornando este resíduo ativo (Thr1O-). O alcóxido gerado realiza então o ataque nucleofílico ao substrato proteico, iniciando assim o
processo de catálise (Tanaka, 2009; Kisselev et al., 2012).
A inibição do proteassomo através de moléculas responsáveis pela regulação da atividade proteolítica do mesmo, vem sendo usados de forma terapêutica. Devido à importância vital dos proteassomos para as células, a inibição total e contínua destes resultaria na morte celular. Contudo, uma inibição parcial por um curto intervalo de
tempo tem sido utilizada como uma alternativa quimioterápica para tratamento do câncer (Lodish et al., 2014). Isso ocorre porque a maioria das células cancerígenas são altamente proliferativas e apresentam uma maior demanda para a síntese e degradação de proteínas, fazendo com que a atividade do proteassomo seja 90% mais alta nessas células do que em células normais (Chauhan et al., 2008; Correia da Silva, et al., 2017). Logo, como estas são mais vulneráveis à inibição proteassômica, é possível obter uma janela terapêutica para a morte seletiva de células tumorais (Georgakis et al., 2005; Crawford et al., 2009).
Desde a descoberta dos inibidores de proteassomo, inúmeros compostos (naturais e sintéticos) têm sido identificados com diferentes atividades proteolíticas, sendo a grande maioria destes compostos peptídeos de 3-4 aminoácidos contendo um grupo eletrofílico. O bortezomib – Velcade® (Figura 5-a) foi o primeiro inibidor do proteassomo a ser aprovado pela FDA (US Food and Drug Administration), em 2003, como agente para o tratamento de mieloma múltiplo (MM). Apesar de seu sucesso clínico evidente, o tratamento com este fármaco está associado a graves efeitos adversos devido à sua baixa seletividade ao proteassomo em relação a outras proteases (Almond & Cohen, 2002). Em 2012, outro fármaco com o mesmo mecanismo de ação também foi aprovado como antineoplásico, o carfilzomib – Kyprolis® (Figura 5-b). Este, por sua vez, apresentou uma melhora significativa em sua capacidade seletiva, porém exibiu maior toxicidade que bortezomib, sendo utilizado como terceira linha terapêutica. A toxicidade observada por carfilzomib é decorrente da inibição irreversível do proteassomo (Kuhn et al., 2007). Assim, existem alguns problemas associados ao uso de inibidores de proteassomo como agentes terapêuticos dos quais há necessidade de melhorias.
a) Bortezomib b) Carfilzomib
Figura 5. Estrutura química de dois inibidores sintéticos do proteassomo disponíveis para uso clínico. (a)
O bortezomib é um análogo dipeptídico do ácido borônico com atividade antineoplásica, o qual inibe de forma covalente e reversível a subunidade ChTL do proteassomo. (b) Já o carfilzomib é um derivado da epoxomicina que também exibe atividade antineoplásica, ligando-se irreversivelmente à subunidade ChTL do mesmo (imagens extraídas e adaptadas de Kisselev et al., 2012).
Dentre os problemas causados pelos atuais inibidores do proteassomo, destacam-se (i) citotoxicidade, (ii) baixa permeabilidade em tecidos e (iii) resistência ao fármaco. (i) A inibição irreversível do proteassomo em células sadias causa, à médio prazo, toxicidade e reduz a janela terapêutica do fármaco. (ii) Outro fator limitante nos tratamentos com uso desses inibidores é a baixa permeabilidade das moléculas em tecidos, o que limita o tratamento de tumores sólidos (Vij et al., 2011). (iii) Além disso, observou-se mutações nos resíduos de aminoácidos Ala49 e Met45 localizados na subunidade ChTL, o que está relacionado à resistência adquirida ao fármaco (Ruschak et al., 2011; Kale & Moore, 2012; Groll et al., 2009). Portanto, idealmente, o inibidor do proteassomo deve ser potente, porém seletivo e reversível.
1.4. Metodologias integradas para a identificação precoce de produtos naturais bioativos
As aplicações biotecnológicas derivadas da bioprospecção de organismos marinhos estão em constante expansão e o desenvolvimento de agentes terapêuticos a partir destas engloba um mercado farmacêutico de futuro promissor. A partir disto,
alinhando-se esalinhando-ses conhecimentos com o potencial terapêutico e sucesso clínico dos inibidores do proteassomo no tratamento do câncer e com a demanda para a busca de novas estruturas químicas com ação sobre este alvo, o proteassomo foi selecionado como o alvo biológico neste projeto. Da mesma forma, devido ao potencial para inovação em fármacos dos produtos naturais marinhos, esta fonte química foi selecionada. Visando superar alguns dos desafios do processo de descoberta de fármacos a partir de produtos naturais (como o tempo e quantidade necessária para o isolamento e elucidação do composto, o re-isolamento de estruturas conhecidas e as dificuldades de reabastecimento do PN), este trabalho apresenta uma nova abordagem para a identificação de compostos bioativos a partir de bibliotecas químicas de produtos naturais não purificadas. Sabendo-se que a maneira mais eficaz de solucionar os problemas acima citados é combinar métodos biológicos, físicos e químicos, nós utilizamos duas técnicas ortogonais: i) captura cristalográfica, baseada em cristalografia de proteínas e ii) redes moleculares MS/MS, baseada em análises de espectrometria de massas; as quais são aplicadas diretamente em amostras de produtos naturais não purificadas. A abordagem e sua validação foi o tema central desta dissertação de mestrado e será descrita em detalhes neste documento.
2. Objetivos
O objetivo geral deste trabalho foi, por meio da bioprospecção de bactérias marinhas, triar, identificar e caracterizar produtos naturais inibidores do proteassomo a partir de uma nova abordagem para a descoberta antecipada de produtos naturais bioativos. Os objetivos específicos deste trabalho foram:
I. Purificar e cristalizar a partícula 20S do proteassomo eucarionte;
II. Realizar a triagem de inibidores do proteassomo, utilizando o ensaio High Troughput Screening (HTS), a partir de bibliotecas químicas de produtos naturais marinhos;
III. Desreplicar as amostras químicas bioativas pela abordagem de redes moleculares. IV. Filtrar os produtos naturais candidatos utilizando correlação da atividade biológica
com sua detecção por massas em amostras químicas ativas e inativas;
V. Realizar o procedimento de soaking de cristais do alvo biológico com amostras químicas bioativas selecionadas, a fim de capturar o produto natural bioativo em seu sítio de ligação no proteassomo;
VI. Propor a estrutura química do produto natural bioativo e seu modo de interação com o proteassomo;
VII. Co-validar os achados com base nas 3 técnicas experimentais empregadas (atividade biológica, estrutura cristalográfica e espectrometria de massas);
VIII. Aplicar abordagens tradicionais para a validação da proposta e metodologias alternativas empregadas.
3. Material e Métodos
3.1. Bibliotecas químicas de produtos naturais marinhos acessadas
A biblioteca química de produtos naturais marinhos utilizada no contexto deste trabalho foi composta por extratos de bactérias marinhas, os quais foram fornecidos pelo grupo da Prof. Dra. Leticia Costa-Lotufo (USP, São Paulo).
3.2. Purificação do proteassomo
A purificação do complexo 20S do proteassomo foi realizada de acordo com o protocolo implementado em nosso grupo, durante a execução do Projeto Regular 2014/10753-9 e desenvolvimento do trabalho de mestrado do aluno Arthur Z. Fernandes (BTPB-IB, UNICAMP). Em resumo, o proteassomo eucarionte foi extraído a partir do preparado lisado de S. cereviseae utilizando três diferentes técnicas cromatográficas: afinidade, troca iônica e exclusão molecular (Tabela 1).
Tabela 1. Descrição das diferentes técnicas cromatográficas utilizadas para a purificação do complexo 20S do proteassomo.
Técnica cromatográfica Coluna/Resina Tampões
Afinidade DEAE Affi-Gel Blue Gel (Bio-Rad)
Tris-HCl 25 mM, MgCl2 10 mM e DTT1 mM e pH
7,4 (gradiente crescente de NaCl: 0, 50, 150, 250 e 350 mM)
Troca iônica Hitrap-Q HP
(GE Healthcare)
Tampão A (Tris-HCl 25 mM, MgCl2 10 mM, NaCl
100 mM e pH 7,4)
Tampão B (Tris-HCl 25 mM, MgCl2 10 mM, NaCl
500 mM e pH 7,4)
Hidrofóbica Hitrap Phenyl HP
(GE Lifesciences) Tampão A (Tris-HCl 100 mM, (NH4)2SO4 1,2 M, pH 5) Tampão B (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5) Exclusão molecular HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR (GE Healthcare) Tris-HCl25 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,4
A etapa de afinidade foi realizada em bancada e as demais no Laboratório de Purificação de Proteínas LPP do LNBio, utilizando os sistemas Äkta FPLC e Purifier (GE Healthcare), à 4 °C. Todas as etapas de purificação foram acompanhadas por monitoramento da atividade proteolítica do proteassomo com o substrato fluorogênico suc-LLVY-AMC, em microplacas pretas de 96 poços ½ área (Greiner Bio-One) nos comprimentos de onda 360 nm de excitação e 480 nm de emissão (Trivella et al., 2014).
A concentração de proteínas foi determinada por medida de absorbância à 280 nm, em equipamento NanoDrop 2000/2000c (Thermo Fisher Scientific) utilizando o coeficiente de extinção molar teórico da subunidade 20S, 707355 M-1cm-1. O grau de
pureza da amostra foi verificado por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE) em gel 15% de acrilamida.
Após as etapas cromatográficas, a proteína de interesse foi concentrada para 40 mg/ml e avaliada por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Uma alíquota de 30 µl da enzima foi adicionada em um cubeta de quartzo Zen2112 e termalizada à 25 °C no equipamento ZetaSizer Nano ZS90 (Malvern Instruments). As medidas de intensidade foram adquiridas e a distribuição dos resultados de raio hidrodinâmico e grau de polidispersividade foram analisadas para cada pico utilizando o software ZetaSizer (Malvern Instruments).
3.3. Triagem da biblioteca de produtos naturais marinhos
3.3.1. Ensaio High Throughput Screening – HTS
Os ensaios HTS foram realizados partindo de protocolos já padronizados em nosso grupo de pesquisa. Para tanto, o inibidor, a enzima e o substrato foram pipetados por
meio do equipamento Versette Automated Liquid Handler (Thermo Fisher Scientific) do LBE (LNBio-CNPEM) e as leituras de fluorescência foram feitas através do equipamento CLARIOstar (BMG LABTECH) também do LBE (LNBio-CNPEM). As condições detalhadas do ensaio bioquímico são descritas na Tabela 2.
Tabela 2. Descrição das variáveis e suas respectivas condições ideais para os ensaios HTS com o proteassomo.
Variável Condição ideal Variável Condição ideal
Concentração de enzima 1 μg/mL Concentração de substrato 40 μM
Tempo de incubação
com inibidores 1 h/24 h Volume de reação 25 μL
Concentração de SDS 0,01% Tempo de reação 1 hora
Faixa de excitação
380±8 nm (CLARIOstar, BMG
LABTECH)
Faixa de emissão 460±8 nm (CLARIOstar, BMG LABTECH)
Dispensa de inibidor Versette (Thermo
Fisher Scientific) Dispensa de substrato
Versette (Thermo Fisher Scientific) Número máximo de placas simultâneas 4 Minimização de fluorescência intrínseca de amostras Realização de leitura de fluorescência natural no tempo zero da reação
As amostras testadas em mais de uma concentração foram diluídas em DMSO. Além disso, foi utilizada a enzima (complexo proteassomo 20S) purificada (vide item anterior) e o substrato fluorogênico comercial suc-LLVY-AMC comercial (Viva Life Sciences). Resumidamente, primeiro foram pipetados 19 µL da enzima em tampão Tris 0.1 M, pH 7,5 e SDS 0,01% à uma concentração de 1 µg/mL, seguido da adição de 1 µL do inibidor em DMSO. Após o período de incubação da enzima com o inibidor, 5 µL do substrato suc-LLVY-AMC comercial (Viva Life Sciences) à concentração de 200 µM foram adicionados, sendo a geração do produto hidrolisado acompanhada por uma hora. O substrato, uma vez hidrolisado pela subunidade ChTL do proteassomo, fluoresce quando
excitado em um comprimento de onda de 380 nm, com pico de emissão em 460 nm. Desta forma, a atividade catalítica da subunidade ChTL do proteassomo foi monitorada por fluorescência. Esta análise foi realizada na presença ou ausência dos inibidores em teste (bibliotecas químicas de extratos produtos naturais), onde foi analisado quais amostras químicas inibem a catálise enzimática. Os ensaios de inibição foram realizados em microplacas pretas de 384 poços em formato de V (Greiner Bio-One). O parâmetro Z’ (Zhang et al., 1999) - equação 1 - foi utilizado como parâmetro de qualidade do ensaio.
𝑍′ = 1 −3 (𝜎𝑝 + 𝜎𝑛)
|𝜇𝑝 − 𝜇𝑛|
Equação 1: Cálculo do parâmetro de qualidade do ensaio, Z’ (Z score). Valores de fator Z’ acima de 0,5 são considerados aceitáveis (Zhang et al., 1999).
Para este cálculo, controles positivos (enzima na ausência de inibidores) e negativos (reação sem enzima ou na presença de um inibidor conhecido) foram realizados para cada placa, ambos em 32 repetições. Os controles positivos e negativos continham DMSO nas mesmas concentrações que as amostras em teste.
A porcentagem de atividade da enzima em cada uma das amostras teste é calculada, normalizando os valores de fluorescência em cada uma das amostras teste pela média dos controles positivos e negativos (equação 2).
%Atividade = (Amostra − 𝜇𝑛
𝜇𝑝 − 𝜇𝑛 ) ∗ 100
Equação 2: Cálculo da porcentagem de atividade nas amostras teste em relação aos controles positivos (𝜇𝑝) e negativos (𝜇𝑛).
Em casos em que o ensaio foi realizado em replicatas (3 a 4 replicatas) os dados foram expressos como média e erro padrão da média (desvio padrão dividido pela raiz quadrada do número amostral “n”, o qual é denominado “SEM”).
A partir da realização das triagens das amostras químicas de produtos naturais, identificou-se amostras químicas que apresentaram atividade de inibição do proteassomo. Estas foram denominadas amostras hit.
3.3.2. Confirmação e seleção de hits
As amostras hit identificadas nas campanhas de triagem HTS foram confirmadas por meio de realização de curvas concentração vs resposta e, também, pelo monitoramento da atividade ChTL do proteassomo. O mesmo ensaio biológico foi utilizado, porém apenas com as amostras ativas (capazes de inibir o proteassomo) e em diferentes concentrações. Foi realizada uma curva concentração vs respostas com pelo menos 8 pontos, em 4 replicatas. A maior concentração foi a concentração mais alta disponível na biblioteca química seguida de diluição seriada de 1 a 0,5 log. Os dados foram normalizados (equação 2) e o gráfico foi construído utilizando o programa Graph Pad Prism versão 7 (Graph Pad Software, San Diego, CA), em função da porcentagem remanescente de atividade enzimática e concentração (log) da amostra química. Os dados experimentais foram ajustados com a equação dose-response-variable slope-normalized (log 4 parâmetros) (equação 3) para extrair os valores de IC50, também utilizando o programa Graph Pad.
Equação 3: Ajuste dos dados experimentais (equação log 4 parâmetros) para análise das curvas concentração vs resposta dos hits identificados e extração dos valores de IC50.
3.4. Isolamento bio e quimioguiado
As substâncias bioativas encontradas nas triagens dos extratos e frações foram primeiramente avaliadas quanto à sua relevância química através da desreplicação de dados por redes moleculares MS/MS e correlacionadas com a atividade biológica. Desta forma, algumas amostras de produtos naturais (misturas químicas complexas) foram priorizadas e, então, selecionadas para ciclos de purificação e isolamento bioguiado. As novas frações/substâncias isoladas foram reanalisadas no bioensaio.
3.5. Fracionamento em sistema HPLC
Os extratos brutos e frações geradas foram fracionados por cromatografia em fase reversa em diferentes gradientes de metanol e água. Para tanto, foi utilizado o equipamento Autopurification HPLC-PDA (Waters) do LQPN (LNBio-CNPEM). Além disto, foram usadas duas colunas: uma preparativa (Sunfire 30 x 100 mm, 10 um, Waters) e outra semi-preparativa (Gemini, 5 µm, C18, 110 Å, 150 x 10 mm, Phenomenex) em diferentes ciclos de isolamento bioguiado. As frações provenientes dos fracionamentos foram secas em sistema speedvac (Speed Vac Mivac DUO, Genevac ou Thermo Savant SC 110, The Lab World Group), pesadas e ressuspensas em dimetilsulfóxido (DMSO).
3.6. Análises de espectrometria de massas, redes moleculares e proposição de estruturas químicas a partir do padrão de fragmentação MS/MS
Antes e depois dos fracionamentos, utilizou-se de cromatografia líquida em escala analítica acoplada à espectrômetro de massas para analisar o perfil químico e desreplicação das amostras de produtos naturais. Para tanto, foi usado o cromatógrafo líquido de eficiência UPLC (Acquity HClass, Waters) acoplado ao detector de ultra-alta resolução com fonte de electrospray e analisador híbrido quadrupolo/tempo-de-vôo (ESI-QqTOF) Impact II (Bruker).
Mais detalhadamente, foi utilizada a coluna analítica BEH C18 (1,7 µm, 2,1 x 100 mm, Acquity, Waters) e os detectores foram PDA, na faixa de comprimento de onda de 190 à 600 nm. Todas as análises foram feitas em modo positivo, com fluxo de 0,5 mL/min, temperatura da coluna à 40 °C, temperatura das amostras à 20 °C, fonte electrospray na faixa de 30 à 2000 Da, velocidade de detecção de 8 Hz, end plate offset de 500 V, capilar de 4500 V, nebulizador à 4,0 bar e fluxo de gás de secagem (nitrogênio) à 10 L/min com temperatura de secagem de 200 °C. Já para o MS/MS, a célula de colisão foi de 5,0 eV, com energia de colisão na faixa de 20 à 70 V e cut-off absoluto de fragmentação de 1000. Como regra de fragmentação, íons com m/z abaixo de 200 Da foram excluídas e a função “exclusão ativa” estava habilitada (íons precursores com mais de 3 espectros tinham sua fragmentação bloqueada por 0,3 min ou até a razão “intensidade atual/intensidade prévia” ser maior ou igual a 1,8). Em cada eluição, formiato de sódio 10 mM foi utilizado para calibração externa e interna. Vale ressaltar que os métodos cromatográficos variaram entre diferentes amostras.
3.6.1. Redes moleculares MS-MS/MS
As redes moleculares deste trabalho foram gentilmente processadas e analisadas pelo Dr. Rafael de Felício do LQPN, LNBio-CNPEM.
A ferramenta de redes moleculares (ou molecular networking) foi utilizada com o objetivo de analisar o perfil químico das amostras buscando-se a desreplicação de resultados e o enfoque de moléculas ainda não conhecidas.
A análise e o processamento in silico dos dados cromatográficos de LC-MS foram feitas com o software Bruker Data Analysis versão 4.3, sendo os dados obtidos convertidos para o formato .mzXML, tipo de arquivo compatível com a plataforma GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking – Wang et al., 2016). A obtenção da rede molecular foi idealizada e executada baseando-se nos tutoriais apresentados na própria plataforma (GNPS) e pela literatura científica sobre o tema (Yang et al., 2013; Kleigweire et al., 2015; Wang et al., 2016; Allard et al., 2016; Nothias et al., 2018).
Resumidamente, os dados .mzXML foram transferidos ao servidor da plataforma GNPS (gnps.ucsd.edu), utilizando o software Fillezilla. Na plataforma, os arquivos foram agrupados utilizando tabelas descritas e os parâmetros usados para a construção da rede foram fornecidos (Tabela 3). Então o conjunto de dados e descritores foi processado (via servidor GNPS) e uma lista de arquivos foi obtida como resultado. Esses arquivos foram usados para montagem da rede molecular no software Cytoscape (v. 3.5), e então a rede pode ser visualizada e analisada.
![Referências técnicas para atuação de psicólogas(os) em Programas de Atenção à Mulher em situação de Violência [2013] - CREPOP CREPOP](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)