Análises de espectrometria de massas, redes moleculares e proposição de

Antes e depois dos fracionamentos, utilizou-se de cromatografia líquida em escala analítica acoplada à espectrômetro de massas para analisar o perfil químico e desreplicação das amostras de produtos naturais. Para tanto, foi usado o cromatógrafo líquido de ultra-eficiência UPLC (Acquity HClass, Waters) acoplado ao detector de ultra- alta resolução com fonte de electrospray e analisador híbrido quadrupolo/tempo-de-vôo (ESI-QqTOF) Impact II (Bruker).

Mais detalhadamente, foi utilizada a coluna analítica BEH C18 (1,7 µm, 2,1 x 100 mm, Acquity, Waters) e os detectores foram PDA, na faixa de comprimento de onda de 190 à 600 nm. Todas as análises foram feitas em modo positivo, com fluxo de 0,5 mL/min, temperatura da coluna à 40 °C, temperatura das amostras à 20 °C, fonte electrospray na faixa de 30 à 2000 Da, velocidade de detecção de 8 Hz, end plate offset de 500 V, capilar de 4500 V, nebulizador à 4,0 bar e fluxo de gás de secagem (nitrogênio) à 10 L/min com temperatura de secagem de 200 °C. Já para o MS/MS, a célula de colisão foi de 5,0 eV, com energia de colisão na faixa de 20 à 70 V e cut-off absoluto de fragmentação de 1000. Como regra de fragmentação, íons com m/z abaixo de 200 Da foram excluídas e a função “exclusão ativa” estava habilitada (íons precursores com mais de 3 espectros tinham sua fragmentação bloqueada por 0,3 min ou até a razão “intensidade atual/intensidade prévia” ser maior ou igual a 1,8). Em cada eluição, formiato de sódio 10 mM foi utilizado para calibração externa e interna. Vale ressaltar que os métodos cromatográficos variaram entre diferentes amostras.

3.6.1. Redes moleculares MS-MS/MS

As redes moleculares deste trabalho foram gentilmente processadas e analisadas pelo Dr. Rafael de Felício do LQPN, LNBio-CNPEM.

A ferramenta de redes moleculares (ou molecular networking) foi utilizada com o objetivo de analisar o perfil químico das amostras buscando-se a desreplicação de resultados e o enfoque de moléculas ainda não conhecidas.

A análise e o processamento in silico dos dados cromatográficos de LC-MS foram feitas com o software Bruker Data Analysis versão 4.3, sendo os dados obtidos convertidos para o formato .mzXML, tipo de arquivo compatível com a plataforma GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking – Wang et al., 2016). A obtenção da rede molecular foi idealizada e executada baseando-se nos tutoriais apresentados na própria plataforma (GNPS) e pela literatura científica sobre o tema (Yang et al., 2013; Kleigweire et al., 2015; Wang et al., 2016; Allard et al., 2016; Nothias et al., 2018).

Resumidamente, os dados .mzXML foram transferidos ao servidor da plataforma GNPS (gnps.ucsd.edu), utilizando o software Fillezilla. Na plataforma, os arquivos foram agrupados utilizando tabelas descritas e os parâmetros usados para a construção da rede foram fornecidos (Tabela 3). Então o conjunto de dados e descritores foi processado (via servidor GNPS) e uma lista de arquivos foi obtida como resultado. Esses arquivos foram usados para montagem da rede molecular no software Cytoscape (v. 3.5), e então a rede pode ser visualizada e analisada.

Tabela 3. Parâmetros utilizados na plataforma GNPS para construção da rede molecular. Parâmetro GNPS Valor Pairs_min_Cosine 0,5 Tolerance.PM_tolerance 0,02 Tolerance.PM_tolerance 0,02 MIN_MATCHED_PEAKS 4 TOPK 10 Cluster_MIN_SIZE 1 Maximum_component_size 100 Min_peak_int 0 Run_MSCluster On Filter_precursor_window 1 Filter_library 1 Window_Filter 1 Score_Threshold 0,5 Min_matched_peaks_search 4

Detalhadamente, os íons precursores e seus respectivos espectros de fragmentação detectados experimentalmente (análises LC-MS) foram anotados em um arquivo no formato mzXML, o qual contém informações como número de scans, m/z do íon precursor, m/z do íon fragmento e intensidade do íon fragmento. Os espectros foram então agrupados usando a plataforma GNPS (Wang et al., 2016), a qual é baseada nos algoritmos MS-Cluster e o sistema Spectral Network. A plataforma GNPS compara os diferentes espectros de fragmentação fornecidos, atribuindo uma pontuação referente à similaridade entre os diferentes espectros de fragmentação. Além disto, compara também os espectros fornecidos com um banco de dados de espectros experimentais disponíveis no GNPS. As informações geradas são a base para a construção e visualização de redes moleculares MS-MS/MS.

A rede molecular foi visualizada com o programa Cytoscape (Shannon et al., 2003), sendo a rede composta por nós e linhas. Cada nó da rede molecular representa um íon precursor detectado (ex.: composto químico), caracterizado por um espectro de fragmentação. O espectro de fragmentação por sua vez representa a impressão digital de um dado composto químico ou aduto molecular formado por este. As linhas conectam os nós, onde a espessura da linha representa o score de similaridade entre dois nós. Quanto mais espessa a linha, maior a similaridade entre dois nós (ou seja, entre dois espectros de fragmentação).

3.6.2. Proposta de estruturas químicas a partir do espectro de fragmentação MS/MS

Além da comparação de similaridade entre compostos químicos detectados em amostras de produtos naturais (construção de redes moleculares), o espectro de fragmentação permite também a comparação dos espectros detectados na amostra desconhecida com espectros de fragmentação de compostos químicos conhecidos. Bancos de espectros de fragmentação MS/MS estão disponíveis. Espectros de fragmentação experimentais estão disponíveis no próprio GNPS; e espectros de fragmentação teóricos (gerados por métodos preditivos de fragmentação in silico) também podem ser acessados. A plataforma MetFrag (Ruttkies et al., 2016), por exemplo, gera espectros de fragmentação in silico de compostos químicos depositados no PubChem e outros bancos de dados públicos. Outro método, CFM-ID, usa aprendizado de máquina para a predição in silico do espectro de fragmentação de moléculas baseado no modelo de fragmentação competitiva (Allen et al., 2014). Além disto, mais recentemente, foi disponibilizada também uma biblioteca de fragmentos in silico de todos os compostos

químicos depositados no dicionário de produtos naturais (Buckingham, 1997), estando esta também acessível via a plataforma GNPS.

Todos estes métodos disponibilizados pela comunidade científica foram utilizados neste trabalho.

3.6.3. Correlação de dados bioquímicos com dados de espectrometria de massas para a seleção de m/z candidatas

As redes moleculares construídas foram também utilizadas para comparar frações cromatográficas ativas, inativas e parcialmente ativas produzidas a partir do cultivo de uma mesma bactéria. Isto foi realizado visando a seleção de íons moleculares (nós nas redes moleculares) candidatos responsáveis pela atividade biológica investigada. Para isto, além da inspeção gráfica das redes foram exportadas tabelas contendo a informação de cada nó: seu código, grupo de amostras contendo aquele íon, número de vezes em que aquele íon foi detectado (número de espectros), além de outras informações. Vale comentar que o número de espectros é uma quantificação relativa da presença do íon nas amostras. Assim, a presença do íon foi correlacionada com a atividade biológica em um grupo de amostras químicas.

A correlação de Pearson foi aplicada à tabela gerada, a qual continha o número de espectros para cada m/z da rede, em cada amostra analisada, e o valor da atividade biológica de cada uma destas amostras químicas. O procedimento foi realizado com o auxílio do programa Microsoft Excel®, utilizando a função de correlação implementada neste. Ao final foi gerada uma tabela contendo todas m/z, ranqueadas pelo coeficiente de correlação (CC). Os grupos de m/z com CCs superiores foram selecionados para inspeção mais aprofundada do espectro de fragmentação e proposta da estrutura química correspondente à m/z e ao espectro de fragmentação selecionado.