EXTRAÇÃO AQUOSA ASSISTIDA POR ENZIMAS E CARACTERIZAÇÃO DAS FRAÇÕES SÓLIDA, AQUOSA E OLEOSA DE NOZ PECÃ [Carya illinoinensis (Wangenh) C Koch]
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação de Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Ciência dos Alimentos Orientadora:
Profa. Dra. Maria Manuela Camino Feltes
FLORIANÓPOLIS 2019
Dedico este trabalho aos meus pais, amo vocês.
Agradeço a Deus, por iluminar meu caminho e se mostrar sempre presente na minha vida.
Em especial à minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Maria Manuela Camino Feltes, pela oportunidade concedida, pelo apoio, dedicação e paciência durante a realização deste projeto.
Ao Programa de Pós-Graduação de Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina e aos professores que fazem parte do corpo docente e que de certo modo contribuíram para a minha formação profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudos concedida.
À Profa. Dra. Jane Mara Block, por todas as contribuições neste trabalho
e por ter disponibilizado seu laboratório e sua equipe de trabalho. Ao Laboratório de Óleos e Gorduras (LOG) do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UFSC, e a toda equipe, que ofereceram totais condições e suporte para a realização deste trabalho.
À Divinut Indústria de Nozes, pelo fornecimento das amostras de noz pecã.
À LFN Latino Americano, pelo fornecimento das enzimas.
Ao Laboratório de Bromatologia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UFSC, pela disponibilização dos equipamentos para a realização das análises de composição nutricional das amostras.
À Profa. Dra. Elisandra Rigo, pelas contribuições na elaboração do
planejamento experimental.
À Profa. Dra. Edna Regina Amante, obrigado por sempre estar disponível
para responder minhas dúvidas, sua ajuda foi fundamental para realização deste trabalho.
Ao Laboratório de Forragicultura do Departamento de Zootecnia e Desenvolvimento Rural da UFSC, pelas análises de fibra detergente neutro e detergente ácido.
À Profa. Dra. Daniele Cristina da Silva Kazama, pelas contribuições nas
análises de fibra detergente neutro e detergente ácido.
Ao Laboratório de Cereais do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UFSC, pela realização das análises de fibra alimentar. À Profa. Dra. Alicia de Francisco de Casas, pelas contribuições nas
análises de microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura.
eletroforese em gel, e disponibilização do equipamento shaker, utilizado para a extração de óleo.
À Profa. Dra. Ana Carolina Maisonnave Arisi, pela contribuição na análise
de eletroforese em gel.
À Gabriela Barbosa Rossi, pelo auxílio nas análises de eletroforese em gel.
Ao Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB) do Centro de Ciências Biológicas da UFSC, pela disponibilização do microscópio e auxílio na análise de microscopia de fluorescência, especialmente à técnica Chirle.
Ao Laboratório de Análises (LABCAL), do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UFSC, pela análise de cromatografia em fase gasosa, especialmente à técnica Morgana.
Ao Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME), pelo auxílio na análise de microscopia eletrônica de varredura.
Ao Sidnei Emilio Bordignon, Jr., do LIEB, do Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, no auxílio para a determinação da atividade enzimática.
Aos meus pais, Almir e Lurdete, por todo amor e carinho que me transmitiram durante toda minha vida, e por sempre me apoiarem e me incentivarem nas minhas escolhas.
Ao meu irmão Rafael pela amizade, incentivo e preocupação. À minha vó Laura, por todo amor e por sempre acreditar em mim. Ao meu amor, Vinicius, por ser uma pessoa maravilhosa que faz minha vida muito mais feliz, além de todo apoio, incentivo, compreensão durante a realização deste trabalho.
Aos meus amigos, por terem sido fundamentais nestes anos de convívio e amizade sincera.
Não importa se a estação do ano muda, se o século vira e se o milênio é outro, se a idade aumenta; conserve a vontade de viver, não se chega à parte alguma sem ela. Abra todas as janelas que encontrar e as portas também. Persiga um sonho, mas não deixe ele viver sozinho. Alimente sua alma com amor, cure suas feridas com carinho.
Descubra-se todos os dias, deixe-se levar pelas vontades, mas não enlouqueça por elas.
Procure, sempre procure o fim de uma história, seja ela qual for.
Dê um sorriso para quem esqueceu como se faz isso. Acelere seus pensamentos, mas não permita que eles te consumam.
Olhe para o lado, alguém precisa de você.
A extração aquosa assistida por enzimas (EAE) é um processo alternativo para a obtenção de óleo comestível. Esta tecnologia merece destaque, pois permite a valorização da matéria-prima e o aumento do rendimento do óleo, priorizando a sustentabilidade do processo. O objetivo deste estudo foi realizar a extração de óleo de noz pecã em meio aquoso, assistida por enzimas, e caracterizar o óleo e as frações paralelas obtidas neste processo. Inicialmente, foram selecionadas as condições de extração, utilizando as enzimas comerciais Alcalase® e Celluclast®, adicionadas ao
meio reacional isoladas ou simultaneamente. A Alcalase® foi selecionada
para os ensaios subsequentes. Por meio de uma metodologia de planejamentos experimentais sequenciais, foi aplicado inicialmente um delineamento de Plackett-Burman (variáveis dependentes: temperatura, concentração de substrato, pH, concentração de enzima e agitação, e variável dependente: rendimento de óleo). Após, foi aplicado um Delineamento Composto Central Rotacional (variáveis dependentes: temperatura, concentração de substrato, concentração de enzima; e variável dependente: rendimento de óleo), em que foi possível maximizar a extração de óleo de noz pecã. O produto obtido nesta condição foi caracterizado e comparado com o óleo obtido por prensagem mecânica a frio (PMF), quanto aos índices de acidez, peróxidos e p-anisidina, à estabilidade oxidativa, ao perfil de ácidos graxos e ao teor de tocoferóis. A fração aquosa foi caracterizada em relação ao grau de hidrólise, perfil eletroforético, composição fitoquímica e atividade antioxidante. Em relação à fração sólida, foi feita a avaliação de sua composição nutricional e modificações estruturais após a extração. Observou-se que a concentração de substrato apresentou efeito significativo positivo no processo de extração. A condição de maximização de rendimento de óleo de noz pecã (65,25%) foi obtido na extração aquosa assistida pela Alcalase®, em um tempo de incubação de 4 horas, com uma concentração
de substrato (noz pecã) de 0,40 g.mL-1, uma concentração de enzima de
1,50 g de enzima por 100 g de substrato, em solução tampão fosfato pH 8,0, à temperatura de 52 °C e 120 rpm de agitação. Os resultados de índice de peróxido referentes ao óleo obtido por EAE e por PMF foram de 1,91 e 1,90 mEq O2.kg-1 de óleo, respectivamente; o índice de acidez foi de
0,26 mg de KOH.g-1 para as amostras obtidas pelos dois métodos de
extração; o índice de p-anisidina apresentou níveis não detectáveis para ambas amostras. A estabilidade oxidativa foi de aproximadamente 12 horas para os dois métodos de extração. O óleo obtido pelos dois processos apresentou elevadas concentrações de ácido oleico (acima de
de hidrólise de 3,94%. No perfil eletroforético, verificou-se que os peptídeos apresentaram uma massa molecular menor do que 15 kDa para as frações aquosas hidrolisadas enzimaticamente, enquanto as amostras sem a adição da enzima apresentaram uma massa molecular entre 10 e 37 kDa. Quanto à composição fitoquímica, a fração aquosa obtida no tratamento enzimático apresentou concentrações de fenólicos totais (726,33 mg GAE.(100 g)-1) e taninos condensados (122,31 mg CE.(100
g)-1) maiores do que na fração aquosa sem tratamento enzimático, bem
como uma maior atividade antioxidante nos três ensaios realizados (Azul da Prússia, DPPH e peroxidação lipídica). Os resultados em relação à fração sólida indicaram que houve modificação na composição nutricional e na estrutura microscópica da noz pecã após o processo enzimático, comparado com a matéria-prima in natura. Os resultados obtidos na presente pesquisa indicam que a EAE tem potencialidades tecnológicas para substituir o processo de PMF, visando a obtenção de óleo de noz pecã, pois é atrativa em termos de quantidade e de qualidade do produto obtido. Além disso, o processo enzimático permite a obtenção de frações aquosa e sólida, que são hidrolisados que apresentam uma composição interessante para aplicação na formulação de alimentos. Palavras-chave: Hidrólise enzimática. Tecnologia limpa. Protease. Carboidrase. Óleo vegetal.
Enzyme-assisted aqueous extraction (EAE) is an alternative process for obtaining edible oil. This technology deserves prominence because it allows the valuation of the raw material and the increase in oil yield, prioritizing the sustainability of the process. The aim of this study was to perform the extraction of pecan nut oil in an aqueous medium, assisted by enzymes, and to characterize the oil and the side fractions obtained in this process. First, the extraction conditions were selected using the commercial enzymes Alcalase® and Celluclast®, added to the reactional
medium isolated or simultaneously. Alcalase® was selected for
subsequent assays. Through a methodology of a sequential experimental planning, a Plackett-Burman design was first applied (dependent variables: temperature, substrate concentration, pH, enzyme concentration and stirring, and dependent variable: oil yield). Then, a rotational Central Composite Design (dependent variables: temperature, substrate concentration, enzyme concentration; and dependent variable: oil yield) was performed, and it was possible to maximize the extraction of pecan nut oil. The product obtained in the chosen reaction condition was therefore characterized and compared to the oil obtained by Cold Mechanical Pressing (CMP), for the acid, peroxides and p-anisidine values, the oxidative stability, fatty acids profile and tocopherols content. The aqueous fraction was characterized in relation to the degree of hydrolysis, electrophoretic profile, phytochemical composition and antioxidant activity. The nutritional composition and structural modifications of the solid fraction were evaluated. The substrate concentration had a significant effect on the process. The condition of maximization of pecan oil yield (65.25%) was obtained by the assisted aqueous extraction with Alcalase®, in an incubation time of 4 hours, with
a substrate load (pecan) of 0.40 g.mL-1, an enzyme load of 1.50 g of
enzyme per 100 g of substrate, in phosphate buffer solution pH 8.0, at a temperature of 52 °C and 120 rpm of stirring. The results for the peroxide value for the oil obtained by EAE and by CMP were 1.91 and 1.90 mEq O2.kg-1 of oil, respectively; the acid value was 0.26 mg of KOH. g-1 for
the samples obtained by both extraction methods; the p-anisidine value showed undetectable levels for both samples. Oxidative stability was approximately 12 hours for the two extraction methods. The oil obtained by both processes showed high concentrations of oleic acid (above 70%), and a total tocopherols content above 26 mg. (100 g)-1. The results
referred to the aqueous fraction indicated that the proteins suffered a degree of hydrolysis of 3.94%. In the electrophoretic profile, it was found
the addition of the enzyme presented a molecular mass between 10 and 37 kDa. In relation to the phytochemical composition, the aqueous fraction obtained in the enzymatic treatment showed concentrations of total phenolics (726.33 mg GAE.(100 g)-1) and condensate tannins
(122.31 mg CE.(100 g)-1) higher than in the aqueous fraction without
enzymatic treatment, as well as a higher antioxidant activity for the three performed assays (Prussian Blue, DPPH and lipid peroxidation). The results related to the solid fraction indicated that there was a change in the nutritional composition and microscopic structure of the pecan after the enzymatic process, compared to the in natura pecan nut. The results obtained in the present research indicate that EAE has technological potential to replace the CMP process, aiming to obtain pecan nut oil, since it is attractive in terms of quantity and quality of the product obtained. In addition, the enzymatic process allows obtaining aqueous and solid fractions, which are hydrolyzed which have an interesting composition for application in food formulation.
Keywords: Enzymatic hydrolysis. Clean technology. Protease. Carbohydrase. Vegetable oil.
Figura 1 – Noz pecã: A) Nogueira pecã; B) Cachos agrupados dos frutos verdes; C) Frutos maduros; D) A noz pecã com e sem casca. ... 34 Figura 2 – Produção mundial de noz pecã, em toneladas métricas, A)
produção total nas safras de 2007 a 2018 e B) produção por país produtor na safra 2017/18. ... 35 Figura 3 – Ilustração da estrutura microscópica da noz pecã, onde a)
esperoderma, b) estômatos, c) subepiderme, d) parênquima, e) epiderme inferior, f) endosperma, g) cotilédone. ... 36 Figura 4 – Estruturas químicas dos tocoferóis e tocotrienóis. ... 40 Figura 5 – Fluxograma da extração de óleo de noz pecã por prensagem
mecânica para comercialização. ... 47 Figura 6 – Frasco Schott de 100 mL, contendo 25 mL do meio reacional
com a noz pecã hidrolisada (a) e amostras após a centrifugação, para a separação das frações oleosa, sólida e aquosa (b)... 57 Figura 7 - Fluxograma da extração aquosa de óleo de noz pecã assistida
por enzimas, com diferentes parâmetros e diferentes biocatalisadores. ... 59 Figura 8 – Monitoramento do rendimento da extração aquosa de óleo de
noz pecã durante 24 horas, utilizando-se a Alcalase®.
Condições da reação: 60 °C, concentração de enzima 1,00% (m/m, em relação ao total de substrato), concentração de substrato 0,20 g.mL-1 em tampão fosfato pH 8,00, 120 rpm
de agitação. ... 79 Figura 9 – Monitoramento do pH na extração aquosa de óleo de noz pecã
durante 24 horas, utilizando-se a Alcalase®. Condições da
reação: 60 °C, concentração de enzima 1,00% (m/m, em relação ao total de substrato), concentração de substrato 0,20 g.mL-1 em tampão fosfato pH 8,00, 120 rpm de
agitação. ... 80 Figura 10 – Gráfico de Pareto do delineamento de Plackett & Burman,
para o rendimento de óleo de noz pecã obtido por extração aquosa com a Alcalase®, para as variáveis concentração de
substrato, concentração de enzima, temperatura, agitação e pH (α = 0,90). ... 82 Figura 11 – Gráfico de Pareto do Delineamento Composto Central
Rotacional, para o rendimento de óleo de noz pecã obtido por extração aquosa com a Alcalase®, para as variáveis
Figura 12 – SDS-PAGE da duplicata da fração aquosa obtida na extração de óleo de noz pecã assistida por Alcalase®, com hidrólise
enzimática (E) e sem enzima (S), diluição 1:1 (v/v), apresentando a massa (µg) de proteína solúvel de cada amostra em 20 µL. ... 96 Figura 13 – Microscopia eletrônica de varredura da noz pecã in natura
(A) e da noz pecã hidrolisada com a Alcalase® (B). ... 104
Figura 14 – Micrografias de fluorescência primária da noz pecã in natura (A) e frações sólidas de noz pecã obtidas por extração aquosa com Alcalase® (B), utilizando o filtro azul
(excitação de 330 a 385 nm e emissão de 420 nm), com aumento de 20X. ... 105 Figura 15 – Micrografias de fluorescência de amostras de noz pecã in
natura (A) e das frações sólidas obtidas por extração aquosa
com Alcalase® (B) confirmam a presença de lipídios, com o
fluorocromo azul de nilo, utilizando o filtro verde (excitação de 460 a 490 nm e emissão de 520 nm), com aumento de 20X. ... 106 Figura 16 – Micrografia de fluorescência da proteína nas amostras in
natura de noz pecã (A) e na fração sólida obtida por
extração aquosa com Alcalase® (B), com o fluorocromo
fucsina ácida, utilizando o filtro azul (excitação de 330 a 385 nm e emissão de 420 nm), com aumento de 20X. .. 107 Figura 17 – Micrografia obtida por microscopia de fluorescência das
amostras de noz pecã in natura (A) e da fração sólida obtida por extração aquosa com Alcalase® (B), com o fluorocromo
primulina, utilizando o filtro azul (excitação de 330 a 385 nm e emissão de 420nm), com aumento de 20 X. ... 108
Tabela 1 – Composição nutricional de diferentes variedades de noz pecã (resultados expressos em base úmida, em g.(100 g)-1)... 38
Tabela 2 – Composição em tocoferóis de óleos de diferentes castanhas e nozes. ... 40 Tabela 3 – Classes de compostos fenólicos presentes em plantas e suas
estruturas. ... 42 Tabela 4 – Composição em compostos fenólicos totais e flavonoides
totais de sementes e nozes comestíveis. ... 43 Tabela 5 – Necessidade de ingestão diária de aminoácidos essenciais por
crianças e adultos, e a composição em aminoácidos essenciais da noz pecã... 45 Tabela 6 – Estudos com extração aquosa assistida por enzimas com
diferentes matérias-primas, teor de lipídios totais da matriz, biocatalisador utilizado e rendimento de óleo obtido no processo. ... 52 Tabela 7 – Valores experimentais e níveis codificados das variáveis
independentes (pH, temperatura, concentração de substrato, agitação e concentração de enzima), utilizadas no delineamento de Plackett & Burman para a seleção das condições de extração aquosa de óleo de noz pecã assistida pela Alcalase®. ... 61
Tabela 8 – Valores experimentais e níveis codificados das variáveis independentes (temperatura, concentração de substrato e concentração de enzima), usadas no DCCR para determinar a condição de maximização do rendimento de óleo de noz pecã, obtido na extração aquosa assistida pela Alcalase®.61
Tabela 9 – Amostras da fração aquosa, com hidrólise enzimática (E) e sem adição de enzimas (S), em duplicata, com as respectivas diluições, concentrações e massas de proteínas totais solúveis (PTS) aplicadas no gel de SDS-PAGE para cada diluição. ... 67 Tabela 10 – Composição nutricional da noz pecã (média ± desvio padrão). ... 73 Tabela 11 – Fibra detergente neutro (FDN) e fibra detergente ácido (FDA)
de noz pecã (base úmida), utilizando-se diferentes métodos para desengordurar previamente a amostra (média ± desvio padrão; n = 3). ... 75 Tabela 12 – Rendimento de óleo de noz pecã (média ± desvio padrão; n
Tabela 13 – Matriz do Plackett & Burman, com três repetições no ponto central, avaliando-se o pH, a temperatura em (°C), a concentração de substrato (g.mL-1), a agitação (rpm), a
concentração de enzima (% m/m, em relação à massa total de substrato) (valores codificados e reais), sendo a variável dependente o rendimento de óleo de noz pecã (RE) obtido por extração aquosa com a Alcalase® durante 4 horas de
incubação. ... 81 Tabela 14 – Análise dos efeitos do delineamento de Plackett & Burman,
para o rendimento de óleo por extração aquosa com Alcalase®, apresentando os fatores, o coeficiente de
regressão, o erro padrão, o t calculado e o p-valor (α = 0,90). ... 83 Tabela 15 – Matriz do Delineamento Composto Central Rotacional
(DCCR) 23, com três repetições no ponto central,
avaliando-se a temperatura (°C), a concentração de substrato (g.mL-1),
e a concentração de enzima (%, m/m, em relação à massa total de substrato), sendo a variável dependente o rendimento de óleo de noz pecã (RE) obtido por extração aquosa com a Alcalase® após 4 horas de incubação a pH
8,00 e 120 rpm. ... 85 Tabela 16 – Análise dos efeitos do Delineamento Composto Central
Rotacional, para o rendimento de óleo por extração aquosa com Alcalase®, apresentando os fatores, o coeficiente de
regressão, erro padrão, t calculado e p-valor (α = 0,95). . 86 Tabela 17 – Índices de acidez, peróxido e p-anisidina, e estabilidade
oxidativa (média ± desvio padrão; n=3) de amostras de óleo de noz pecã obtidas por extração aquosa utilizando Alcalase® (EAE) e por prensagem mecânica a frio (PMF).
... 89 Tabela 18 – Composição em ácidos graxos (média ± desvio padrão; n=3)
das amostras de óleo de noz pecã obtidas por extração aquosa com Alcalase® (EAE) e por prensagem mecânica a
frio (PMF). ... 91 Tabela 19 – Teor de tocoferóis (média ± desvio padrão; n=3) das amostras
de óleo obtidas por extração aquosa com Alcalase® (EAE) e
por prensagem mecânica a frio (PMF). ... 93 Tabela 20 - Fenólicos totais (método de Folin-Ciocalteu) e de taninos
pecã obtida com tratamento enzimático (E), utilizando-se a Alcalase®, e sem tratamento enzimático (S). ... 98
Tabela 21 – Composição nutricional da fração sólida liofilizada de noz pecã (média ± desvio padrão) obtida como subproduto na extração aquosa com Alcalase®. ... 102
Sigla Descrição Unidade
A Agitação rpm
𝐴𝑎 Absorbância da amostra -
𝐴𝑐 Absorbância da amostra controle -
AAA Fenilalanina + Tirosina, aminoácidos
aromáticos -
𝐴𝑏 Absorbância do branco -
𝐴𝑏𝑎 Absorbância da solução com a amostra - 𝐴𝑏𝑑 Absorbância da solução com p-anisidina -
𝐴𝑓 Absorbância da amostra -
AOAC Association of Official Analytical
Chemists -
Arg Arginina -
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência - 𝐶𝑁𝑎𝑂𝐻 Concentração da solução padronizada de hidróxido de sódio mmol.mL-1
𝐶𝑡𝑠 Concentração da solução de tiossulfato de sódio mmol.mL-1
CE Concentração de enzima g.(100 g)-1
CG Cromatografia em fase gasosa -
Cn Número de carbonos -
COVs Compostos orgânicos voláteis -
CS Concentração de substrato g.mL-1
DCCR Delineamento Composto Central
Rotacional -
DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil -
E Fração aquosa com tratamento enzimático - EAE Extração aquosa assistida por enzimas -
𝐹𝑑 Fator de diluição mL.mL-1
FDA Fibra detergente ácido g.(100 g)-1
FDN Fibra detergente neutro g.(100 g)-1
His Histidina -
𝐼𝐴 Índice de acidez g KOH.kg-1
Ile Isoleucina -
𝐼𝑃 Índice de peroxido mEq O2.kg-1
𝐼𝑃𝐴 Índice de p-anisidina -
𝐼𝑃𝐿 Inibição da lipoperoxidação %
𝐼𝑅 Inibição do radical DPPH %
Lys Lisina -
𝑚𝑎 Massa da amostra analisada mg
Met Metionina -
MEV Microscopia eletrônica de varredura -
𝑀𝑀𝐴𝑂 Massa molar do ácido oleico mg.mol-1
nsLTPs Non-specific lipid transfer proteins - 𝑂𝑇𝑆 Teor de óleo total presente na amostra g.(100 g)-1
PB Delineamento experimental Plackett–
Burman -
𝑃𝑒 Proteínas presentes na enzima mg.g-1
PMF Prensagem mecânica a frio -
𝑃𝑠 Proteínas solúveis em TCA a 6,25% mg.g-1
𝑃𝑡 Proteínas totais na noz pecã mg.g-1
𝑅𝐸 Rendimento de óleo extraído % (g/g)
S Fração aquosa sem tratamento enzimático - SAA Metionina + Cisteina, aminoácidos
sulfurados -
SDS-PAGE
Eletroforese desnaturante em gel de
poliacrilamida -
T Temperatura °C
TCA Ácido tricloroacético -
Thr Treonina -
𝑇𝑂 Teor de óleo extraído g.(100 g)-1
Trp Triptofano -
𝑉𝑎
Volume de solução tiossulfato de sódio
gasto na titulação da amostra mL
1 INTRODUÇÃO ... 27 2 OBJETIVO ... 31 2.1OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 31 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 33 3.1 CULTIVO E PRODUÇÃO DE NOZ PECÃ ... 33 3.2 ESTRUTURA MICROSCÓPICA DA NOZ PECÃ ... 36 3.3 COMPOSIÇÃO DA NOZ PECÃ... 37 3.3.1 Composição nutricional ... 37 3.3.2 Composição em ácidos graxos ... 38 3.3.3 Teor de tocoferóis ... 39 3.3.4 Compostos fenólicos ... 41 3.3.5 Proteínas e aminoácidos ... 44 3.4 MÉTODOS PARA A EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE NOZ PECÃ ... 46 3.5 EXTRAÇÃO AQUOSA ASSISTIDA POR ENZIMAS ... 48 3.5.1 Vantagens e desvantagens da extração aquosa assistida por enzimas ... 50 3.5.2 Extração aquosa de óleo de noz pecã assistida por enzimas ... 52 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 55 4.1 MATERIAL ... 55 4.2 MÉTODOS ... 55 4.2.1 Composição nutricional da noz pecã ... 55 4.2.2 Atividade enzimática ... 56 4.2.3 Extração de óleo de noz pecã por prensagem mecânica a frio 56 4.2.4 Seleção da enzima e cinética da extração aquosa de óleo de noz pecã assistida por enzimas ... 56 4.2.5 Estratégia sequencial de planejamentos experimentais para a maximização da extração aquosa de óleo de noz pecã utilizando a Alcalase®... 59
4.2.6 Análise estatística ... 61 4.2.7 Análises do óleo de noz pecã ... 62 4.2.7.1 Índice de acidez ... 62 4.2.7.2 Índice de peróxido ... 63 4.2.7.3 Índice de p-anisidina ... 63 4.2.7.4 Estabilidade oxidativa ... 64 4.2.7.5 Composição em ácidos graxos ... 64 4.2.7.6 Teor de tocoferóis ... 65 4.2.8 Análises da fração aquosa ... 65 4.2.8.1 Grau de hidrólise ... 65
4.2.8.3 Composição fitoquímica e atividade antioxidante ... 67
4.2.8.3.1 Fenólicos totais ... 67 4.2.8.3.2 Taninos condensados ... 68 4.2.8.3.3 Atividade antioxidante pelo potencial de redução dos compostos fenólicos hidrofílicos ... 68 4.2.8.3.4 Atividade antioxidante frente ao radical DPPH ... 68 4.2.8.3.5 Inibição da peroxidação lipídica induzida em sistema biológico ... 69
4.2.9 Análises da fração sólida ... 70 4.2.9.1 Composição nutricional da fração sólida ... 70 4.2.9.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 70 4.2.9.3 Microscopia de fluorescência ... 70 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 73 5.1 COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL DA NOZ PECÃ ... 73 5.2 FIBRA DETERGENTE NEUTRO E FIBRA DETERGENTE ÁCIDO NA NOZ PECÃ ... 74 5.3 SELEÇÃO DO BIOCATALISADOR E CINÉTICA DA EXTRAÇÃO AQUOSA DE ÓLEO DE NOZ PECÃ ASSISTIDA POR ENZIMAS ... 76 5.4 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PARA A MAXIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO AQUOSA DE ÓLEO DE NOZ PECÃ ASSISTIDA POR ENZIMAS ... 80 5.5 CARACTERIZAÇÃO DO ÓLEO DE NOZ PECÃ ... 88 5.5.1 Características físico-químicas do óleo de noz pecã ... 88 5.5.2 Perfil de ácidos graxos do óleo de noz pecã ... 90 5.5.3 Teor de tocoferóis do óleo de noz pecã ... 92 5.6 CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO AQUOSA DE NOZ PECÃ 94 5.6.1 Grau de hidrólise ... 94 5.6.2 Perfil eletroforético ... 95 5.6.3 Composição fitoquímica e atividade antioxidante da fração aquosa de noz pecã ... 98 5.7 CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO SÓLIDA ... 101 5.7.1 Composição nutricional da fração sólida ... 101 5.7.2 Estrutura da fração sólida de noz pecã por MEV ... 103 5.7.3 Caracterização de compostos da fração sólida da noz pecã por microscopia de fluorescência ... 105 6 CONCLUSÃO ... 109 7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 111 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 113
1 INTRODUÇÃO
A noz pecã é uma importante fonte de ácidos graxos insaturados e de substâncias com atividade antioxidante, além de ser considerada uma rica fonte de energia na alimentação. Devido à sua composição, apresenta efeitos benéficos à saúde, quando inserida em quantidades adequadas em uma dieta balanceada (KENDALL et al., 2011; VENKATACHALAM, 2004; ZHOU et al., 2014). É uma matéria-prima amplamente utilizada in
natura, mas também é aplicada na panificação, na confeitaria e para a
obtenção de óleo, o qual é extraído comercialmente por prensagem mecânica a frio.
Este óleo apresenta um sabor único e é apreciado em molhos para saladas e na culinária, sendo também utilizado na formulação de cosméticos. Na composição do óleo, componentes interessantes são mantidos, tais como ácidos graxos monoinsaturados (ácido oleico, cujo teor é superior a 50 %), tocoferóis (α e γ-tocoferol) e compostos fenólicos (ácidos fenólicos, flavonoides e taninos condensados) (ORO et al., 2009; PRADO et al., 2013; SALVADOR et al., 2016; YANG, 2009; ZHAO et al., 2011).
Atualmente, há uma preocupação com a sustentabilidade dos processos industriais em geral, inclusive na área de alimentos, o que exige estudos sobre métodos alternativos aos sistemas convencionais, como ocorre na extração de óleos vegetais. Estes processos devem priorizar a minimização de danos ambientais, sem a utilização de produtos químicos, e sem a exploração de matérias-primas não renováveis; devem permitir a operação sob condições amenas, que não prejudiquem a composição da matéria-prima, assegurando, assim, a obtenção de produtos com a qualidade nutricional e sensorial desejadas (CHEMAT et al., 2017). Além disso, devem permitir o aproveitamento integral da matéria-prima, o que é de interesse econômico e ambiental, e proporcionar um alto rendimento do produto (IVANOVS; BLUMBERGA, 2017; KNORR, 2018; NADAR; RAO; RATHOD, 2018).
Um método alternativo para a extração de óleo comestível é denominado extração aquosa enzimática ou extração aquosa assistida por enzimas, que envolve a aplicação de biocatalisadores em meio aquoso, promovendo a modificação da matriz alimentar (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996; ROSENTHAL et al., 2001). As enzimas frequentemente relatadas na literatura para esta finalidade pertencem à classe das hidrolases, sendo que as proteases e as carboidrases são as mais comumente aplicadas (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996).
As proteases auxiliam na extração do óleo devido à sua ação catalítica em reações de hidrólise das ligações peptídicas das proteínas. São enzimas que podem apresentar ainda atividade sobre ligações éster e amida, ocorrendo a hidrólise também das proteínas das membranas celulares (YUSOFF; GORDON; NIRANJAN, 2015). Assim, afetam a rede citoplasmática e tornam sua estrutura menos compacta, permitindo a exposição de peptídeos e lipídios da célula (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996). Em estudos com amendoim (JIANG et al., 2010; LI et al., 2011), foi obtida uma maior recuperação de óleo utilizando-se Alcalase®, comparado a outras enzimas testadas. Este catalisador é uma
protease alcalina produzida comercialmente por fermentação submersa de uma espécie selecionada de Bacillus licheniformis (SCHMIDT; SALAS-MELLADO, 2009).
As carboidrases, por sua vez, são enzimas que hidrolisam as ligações glicosídicas entre monossacarídeos formadores de oligossacarídeos e/ou polissacarídeos, apresentando também capacidade de catalisar a reação inversa de hidrólise, bem como reações transglicosídicas. Através dos estudos de Santos et al. (2005) e Rovaris et al. (2013), sobre extração enzimática em meio aquoso de amendoim e soja, respectivamente, utilizando a Celluclast®, foi possível obter uma boa
recuperação de óleo, quando comparado a outras carboidrases testadas nos trabalhos citados. Esta celulase comercial, produzida por fermentação submersa de cepas selecionadas do fungo Trichoderma reesei, hidrolisa ligações (1,4)-β-D-glicosídicas em celulose e outras β-D-glucanas (WIKIERA et al., 2015).
A escolha do catalisador adequado para o processo de extração aquosa assistida por enzimas deve envolver o conhecimento sobre a composição da matéria-prima a ser modificada. Estudos aprofundados sobre os parâmetros do processo são necessários para determinar a melhor condição para a obtenção de óleo (SHARMA; GUPTA, 2006; YUSOFF et al., 2016).
O método de extração de óleo assistido por enzimas, em meio aquoso, apresenta vantagens econômicas, ambientais e de segurança industrial em relação às técnicas convencionais aplicadas para esta finalidade. Ocorre sob condições brandas, preservando compostos sensíveis a altas temperaturas e a pH extremos; não há a utilização de solventes orgânicos, não havendo, portanto, a emissão de compostos orgânicos voláteis (COVs); além disso, as condições aplicadas permitem a redução do consumo de energia do processo (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996). Um aspecto importante desta tecnologia é o fato de que a catálise enzimática proporciona a geração não só da fração oleosa,
como também de outras duas frações (aquosa e sólida), que podem apresentar uma composição nutricional interessante para aplicação na formulação de alimentos (ROVARIS et al., 2012; ROVARIS et al., 2013; ZHANG et al., 2011).
Para o presente trabalho, realizou-se uma busca de publicações sobre a extração aquosa de óleo de noz pecã assistida por enzimas, nas bases de dados do Science Direct, Web of Science e Scopus, utilizando-se as palavras-chave a seguir: pecan nut (Carya illinoinensis), extraction of
vegetable oil with enzymes e enzymatic aqueous extraction. Não foram
encontrados, na literatura consultada e disponível até o momento, estudos com a matéria-prima empregada no presente estudo. O método de extração aquosa assistida por enzimas, portanto, pode ser considerado uma alternativa inédita para a obtenção de óleo de noz pecã. Além disso, permite a obtenção de uma fração contendo hidrolisados proteicos, cuja provável composição e propriedades, pode ser desejável para aplicação em alimentos, agregando, assim, valor para os subprodutos resultantes do processo enzimático.
2 OBJETIVO
Realizar a extração de óleo de noz pecã em meio aquoso, assistida por enzimas, e caracterizar o óleo e as frações obtidas neste processo.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Selecionar uma enzima comercial (Alcalase® e/ou Celluclast®)
para a extração aquosa de óleo de noz pecã, em relação ao rendimento do processo;
• Determinar a condição de maior rendimento de óleo, utilizando uma estratégia sequencial de planejamento experimental, mediante a aplicação da enzima previamente selecionada (Alcalase®);
• Comparar os resultados do rendimento em óleo obtido por extração aquosa assistida por enzimas, com o óleo obtido por prensagem mecânica a frio;
• Caracterizar os óleos obtidos pelos dois métodos de extração (prensagem mecânica e melhor condição da extração aquosa assistida por enzimas) através da determinação dos índices de acidez, de peróxido e de p-anisidina; do perfil de ácidos graxos por cromatografia em fase gasosa (CG); da estabilidade oxidativa em Rancimat; e do teor de tocoferóis por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
• Avaliar as frações aquosas obtidas na melhor condição da extração aquosa, com e sem a utilização da enzima, quanto ao grau de hidrólise por espectrofotometria; à massa molecular das proteínas por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE); ao teor de compostos fenólicos totais; e à atividade antioxidante por espectrofotometria;
• Determinar as características da fração sólida obtida na melhor condição da extração aquosa assistida por enzimas, referente à sua composição nutricional; às modificações estruturais dos componentes por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e por microscopia de fluorescência.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 CULTIVO E PRODUÇÃO DE NOZ PECÃ
A noz pecã (Carya illinoinensis), membro do gênero e família
Carya spp., Juglandaceae, é uma árvore nativa da América do Norte. O
nome pecã é originário da palavra indígena pacaan, que também inclui nozes, que é utilizado para descrever "todas as nozes que requerem uma pedra para quebrar" (VENKATACHALAM et al., 2007). É conhecida como noz americana e classificada também como Juglans pecan Marsh e
Hicoria pecan Brit (WINTON, 1932). Tem como sinônimos botânicos: Juglans illinoensis Wagenheim, J. angustifolia Aiton, J. cylindrica
Poiret, J. olivaeformis Michaux e Carya olivaeformis Nuttal (MENEZES JUNIOR, 1958), Carya illinoinensis (Wangenh.) C. Koch. Aproximadamente 1.000 variedades de nozes já foram nomeadas (SANTERRE, 1994).
A noz pecã, inicialmente produzida na América do Norte e Central, em países como Estados Unidos e México, tolera variações ambientais, tendo sido introduzida em muitos outros países, incluindo a África do Sul, Brasil, Austrália, Argentina e China (MCEACHERN, 2014; SAGARAM et al., 2007; SPARKS, 2005). A noz pecã foi introduzida no Brasil por imigrantes norte-americanos no início do século XX (ORTIZ, 2000). As primeiras mudas de nogueira pecã, para cultivo em solo brasileiro, chegaram em 1929, procedentes da Flórida. Após, foram introduzidas outras variedades de maior produtividade (“Frotscher” e “Mahan”), que adaptaram-se melhor ao clima e ao solo do país, e que foram adquiridas na Califórnia (MENEZES JUNIOR, 1958).
A nogueira pecã tem uma longevidade que pode superar 200 anos. É uma árvore de grande porte, apresentando entre 20 e 40 metros de altura (Figura 1A). O tamanho das nozes é variável de acordo com a cultivar, sendo necessárias de 60 a 160 nozes para se atingir 1 kg (ORO, 2007). As nogueiras começam a produzir o fruto geralmente 36 meses após o plantio, atingindo sua alta produtividade após 60 meses (ZHANG; PENG; LI, 2015).
A nogueira pecã produz frutos que são considerados drupa, os quais crescem agrupados em cachos que contêm normalmente de três a oito unidades (Figura 1B). Apresentam, quando maduras, casca de coloração marrom escura com manchas negras (Figura 1D), de espessura variada (Figura 1C) (POLETTO et al., 2012). A maturação ocorre nos meses de março a maio, podendo variar em função das condições
genéticas das plantas (COSTA-SINGH; JORGE, 2015; POLETTO et al., 2012).
Figura 1 – Noz pecã: A) Nogueira pecã; B) Cachos agrupados dos frutos verdes; C) Frutos maduros; D) A noz pecã com e sem casca.
Fonte: Salvador (2014); Silva (2017).
As cultivares mais importantes de nogueira pecã produzidas no Brasil são: Mahan, Frotscher, Schley, Success e Moneymaker Barton, Shawnee, Cape Fear, Chickasaw, Choktaw, Desirable, Imperial, Importada, Burkett, Chpecear, Shoshone (POLETTO et al., 2012). As indústrias processadoras costumam dar preferência às cultivares Barton e Shawnee, que possuem menor quantidade de casca, proporcionando maior rendimento da parte comestível (MENEZES JÚNIOR, 1958). Deve-se ressaltar que as características físicas não devem ser o único parâmetro para a escolha de cultivares de nogueira pecã.
O cultivo desta árvore apresenta um bom desenvolvimento sem muita vegetação ao redor e tem uma boa produção em condições de clima frio a ameno, em solos profundos com boa drenagem, ricos em matéria orgânica e nutrientes, com disponibilidade de água na fase de desenvolvimento vegetativo (ORTIZ, 2000).
A produção mundial de noz pecã de 2007 a 2018 (Figura 2A) demonstrou uma tendência crescente, tendo totalizado mais de 124.000 toneladas métricas na safra de 2017/2018. Na Figura 2B, é apresentada a produção mundial de noz pecã dos principais países produtores na safra do período supracitado, sendo que, na América do Norte, foram produzidas 92% das nozes pecã no mundo, sua grande maioria no Estados
Unidos, que representaram 51% do total, seguido pelo México, com 41 % da produção mundial (INC, 2018).
Figura 2 – Produção mundial de noz pecã, em toneladas métricas, A) produção total nas safras de 2007 a 2018 e B) produção por país produtor na safra 2017/18.
Fonte: Adaptado de INC (2018).
O último registro de exportação apresentado para esta matéria-prima foi no ano de 2016, e este comércio seguiu uma tendência crescente, sendo que o México e os EUA representaram 62% e 36%, respectivamente, das exportações mundiais em 2016. Os principais importadores foram o Canadá (25%), os Países Baixos (18%), o Reino Unido (11%) e a China (10%) (INC, 2018). Estes dados estatísticos indicam que os mercados produtor e consumidor de noz pecã estão em ascensão.
A produção de noz pecã no Brasil concentra-se no sul do país, tendo destaque para o Estado do Rio Grande do Sul, seguido por Santa Catarina, Paraná e São Paulo. No Rio Grande do Sul, no ano de 2017, órgãos governamentais criaram o Programa Estadual de Desenvolvimento da Pecanicultura (Pró-Pecã), tendo como objetivo aumentar a área cultivada e a produção de frutos de noz pecã. Neste Estado, existem cerca de mil produtores que cultivam 3.500 hectares, sendo que a safra 2017/2018 foi estimada em 150 toneladas de noz pecã (EMBRAPA, 2017).
Em Santa Catarina, o cultivo desta noz é realizado em 75 hectares por 35 produtores, distribuídos em 11 municípios. Grande parte do plantio, neste Estado, foi realizada a partir de 2011, quando a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI) e o Instituto Federal Catarinense (IFC, Câmpus Rio do Sul) passaram a assessorar os grupos por meio da pesquisa e extensão rural (SANTA CATARINA, 2016).
3.2 ESTRUTURA MICROSCÓPICA DA NOZ PECÃ
Segundo Menezes Junior (1958), a estrutura microscópica da noz pecã (Figura 3) é dividida em: a) esperoderma (epiderme superior), que é a casca do fruto, constituída de células de paredes retilíneas, tangencialmente alongadas; b) estômatos: grandes, salientes, de cor parda, apresentando abertura (ostíolo) maior e células estomáticas mais estreitas; c) subepiderme: de células semelhantes às da epiderme superior, porém menores; d) camada média: parênquima formado de pequenas células achatadas, ligeiramente alongadas e desordenadas, dando a impressão de estarem comprimidas, entre as quais correm feixes de vasos espiraloides de pequena espessura; e) epiderme inferior: de textura irregular, sem detalhes característicos, com aparência de massa heterogênea de cor parda; f) endosperma: de células isodiamétricas, contendo granulações de aleurona e gotas oleosas; não contêm amido; g) cotilédone: formado por células isodiamétricas semelhantes, porém maiores do que as do endosperma e mais ricas em lipídios e proteínas. Nesta descrição, as letras “f” e “g” representam as partes comestíveis da noz.
Figura 3 – Ilustração da estrutura microscópica da noz pecã, onde a) esperoderma, b) estômatos, c) subepiderme, d) parênquima, e) epiderme inferior, f) endosperma, g) cotilédone.
A noz pecã apresenta uma película (espermoderma) que é intensamente aderida à semente, da qual dificilmente se desprende. Esta película apresenta quatro camadas, incluindo a subepiderme (representada na Figura 3 como c), enquanto a noz europeia (Juglans
regia L.) apresenta somente três camadas e não possui subepiderme; os
estômatos da noz pecã são de cor parda, os ostículos são maiores e as paredes das células estomáticas são mais estreitas e irregulares do que as da noz europeia (WINTON, 1932).
3.3 COMPOSIÇÃO DA NOZ PECÃ 3.3.1 Composição nutricional
A noz pecã possui uma composição nutricional que estimula o seu consumo, pois é fonte de ácidos graxos monoinsaturados, proteínas, fibras e vitaminas (VENKATACHALAM; SATHE, 2006). O consumo diário de nozes e castanhas, dentro de uma dieta com as necessidades calóricas adequadas, apresenta benefícios à saúde (ASGHARI et al., 2017; DAMASCENO et al., 2013; MATSUZAWA et al., 2015; RAJARAM et al., 2001; VIGUILIOUK et al., 2014).
A noz pecã é uma ótima fonte de energia, oferecendo entre 691 e 726,7 kcal.(100 g)-1 de porção comestível, e apresenta aproximadamente
entre 65 e 75 g.(100 g)-1 de lipídios (VILLARREAL-LOZOYA;
LOMBARDINI; CISNEROS-ZEVALLOS, 2007; ZHANG; PENG; LI, 2015). A composição da noz pecã sofre variações dependendo da espécie, do local de cultivo, do ano de produção, da composição do fertilizante, do tempo de colheita, entre outros fatores. Como sua composição é majoritariamente lipídica, o teor especialmente desta classe de substâncias sofre variações (SANTERRE, 1994). Nozes da mesma espécie de planta podem apresentar diferenças de colheita, de acordo com as condições e os tratamentos pós-colheita, e com a idade
(VENKATACHALAM, 2004; VILLARREAL-LOZOYA;
LOMBARDINI; CISNEROS-ZEVALLOS, 2007). Na Tabela 1, está apresentada a composição nutricional de distintas variedades de noz pecã.
Tabela 1 – Composição nutricional de diferentes variedades de noz pecã (resultados expressos em base úmida, em g.(100 g)-1).
Composição Nutricional (g.(100 g)-1)
Variedades de noz pecã
Diversas a Schley b Mahan b Diversas c
Umidade 3,70 4,17 4,54 7,40 Cinzas 1,40 1,45 1,41 1,88 Proteína 9,90 7,46 7,50 7,91 Lipídios totais 69,4 74,08 70,67 66,18 Carboidratos 7,80 - - 13,82 Fibra alimentar 7,80 - - 7,20 Valor calórico (kcal.(100 g)-1) 726,70 691,00 - 673,58
-: não avaliado. Fonte: aOro et al (2008); bVenkatachalam (2004); cVenkatachalam e Sathe (2006).
As castanhas e nozes, de modo geral, são ricas em minerais, os quais são fundamentais para uma variedade de funções no organismo, atuando como cofatores em processos enzimáticos, na regulação do balanço ácido-base, no impulso nervoso, na atividade muscular e como elementos estruturais do corpo (DAMASCENO et al., 2013). Dentre os minerais encontrados na noz pecã, estão presentes potássio (410 mg.(100 g)-1), fósforo (277 mg.(100 g)-1), magnésio (121 mg.(100 g)-1), cálcio
(aproximadamente 70 mg.(100 g)-1), selênio (6,00 mg.(100 g)-1), zinco
(4,53 mg.(100 g)-1), manganês (4,50 mg.(100 g)-1), ferro (2,53 mg.(100
g)-1) e cobre (1,20 mg.(100 g)-1) (VENKATACHALAM, 2004).
3.3.2 Composição em ácidos graxos
A composição em ácidos graxos da noz pecã é de aproximadamente 54,26% de ácidos graxos monoinsaturados, 37,95% de ácido graxos poli-insaturados e 7,33% de ácidos graxos saturados (FREITAS; NAVES, 2010). Os ácidos graxos predominantes são o oleico (48,7 a 77,8%), o linoleico (15,8 a 40%), o palmítico (3,3 a 11,3%), o esteárico (0,9 a 6%) e o linolênico (0 a 3%) (FIRESTONE, 1999). Ressalta-se, que, nesta matéria-prima, estão presentes ácidos graxos essenciais, principalmente o ácido linoleico (C18:2 9c, 12c), e, em quantidades menores, o linolênico (C18:3 9c, 12c, 15c).
Alimentos ricos em ácidos graxos mono e poli-insaturados, como nozes e castanhas, apresentam benefícios à saúde, uma vez que os
mesmos contribuem para a redução das frações de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e de muito baixa densidade (VLDL), responsáveis, em parte, pelo aumento do colesterol sérico (DAMASCENO et al., 2013). Além disso, devido a sua composição lipídica, o consumo de nozes e castanhas também está associado à prevenção de doenças como aterosclerose, diabetes tipo II, doenças cardiovasculares e obesidade (DAMASCENO et al., 2013; DAMASCENO; PÉREZ-HERAS; SERRA, 2011; FRASER et al., 1992; MORGAN; CLAYSHULTE, 2000; O'NEIL; FULGONI; NICKLAS, 2015; O'NEIL; NICKLAS, 2015; VENKATACHALAM; SATHE, 2006; VIGUILIOUK et al., 2014). Assim, reforça-se a importância de estudos sobre nozes e castanhas comestíveis com perfil adequado de ácidos graxos, que apresentem efeitos positivos sobre a nutrição e saúde humana (FREITAS; NAVES, 2010; JENKINS et al., 2008).
É evidente que a escolha dos alimentos inseridos em uma dieta são um fator crucial em relação à saúde e, em especial, para a prevenção de doenças. Deve-se ressaltar, entretanto, que a população sofre, recentemente, com algumas modificações relacionadas à dieta, tais como o consumo excessivo de gorduras saturadas, ácidos graxos trans e um grande desequilíbrio no consumo de ω-6/ω-3 (BLOCK; BARRERA-ARELLANO, 2012). Os ácidos graxos essenciais, assim como vitaminas e minerais, são fundamentais em uma dieta saudável, porém, o consumo excessivo de qualquer tipo de gordura (incluindo ácidos graxos mono e poli-insaturados), pode trazer efeitos negativos à saúde (ATANASOV et al., 2018; BLOCK; BARRERA-ARELLANO, 2012). O consumo de lipídios, portanto, deve ser feito de forma adequada na dieta, para promover os efeitos desejáveis no organismo.
3.3.3 Teor de tocoferóis
Os tocoferóis, amplamente encontrados em tecidos vegetais, fazem parte do grupo da vitamina E, e apresentam atividade antioxidante. Dividem-se em duas classes, derivadas de um anel de 6-cromanol: os tocoferóis e os tocotrienóis, que apresentam uma estrutura química básica (Figura 4). Os tocoferóis têm uma cadeia lateral saturada, enquanto os tocotrienóis possuem uma cadeia lateral não saturada contendo três ligações duplas nas posições 3’, 7’ e 11’ (SHAHIDI; ZHONG, 2005). Dentro de cada classe, os compostos diferem somente na quantidade e na posição de grupos metil (-CH3) na estrutura anelar. Conforme a
α-, β-, γ- e δ-tocoferol, e os tocotrienóis, como α-, β-, γ- e δ-tocotrienóis (ADHIKARI et al., 2008).
Figura 4 – Estruturas químicas dos tocoferóis e tocotrienóis.
Fonte: Adaptado de Shahidi e Zhong (2005).
Na Tabela 2, é apresentada a composição em tocoferóis do óleo de noz pecã, e de outras castanhas e nozes. Observa-se que a noz pecã apresenta altos teores de γ-tocoferol (168,5 µg. g-1) e α-tocoferol (87,9 µg.
g-1), enquanto que de β e δ-tocoferol não estão presentes em níveis
detectáveis.
Tabela 2 – Composição em tocoferóis de óleos de diferentes castanhas e nozes.
Óleo
Tocoferóis (µg. g -1 de óleo)
α-tocoferol β-tocoferol γ-tocoferol δ-tocoferol
Amêndoa 439,5 0,8 12,5 4,8 Avelã 310,1 1,2 61,2 0,9 Castanha de caju 3,6 - 57,2 - Castanha do Brasil 82,8 - 116,2 - Macadâmia 122,3 - - - Noz pecã 87,9 - 168,5 - Pinhão manso 124,3 - 105,2 - Pistache 15,6 0,3 275,4 0,8
Fonte: Adaptado de Yang (2009).
De acordo com Firestone (1999), no óleo de noz pecã, pode-se encontrar de 88 a 420 mg.kg-1 de tocoferóis totais. Em estudo de Oro et
bruto de noz pecã, obteve-se um resultado de 30,0 mg.(100 g)-1 de
γ-tocoferol, sendo que não foram observados os homólogos α-, β- e δ-tocoferóis. Em estudo de Prado et al. (2013), foi observada uma quantidade entre 24,9 mg.(100 g)-1 e 39,2 mg.(100 g)-1 de tocoferóis totais
em óleo de noz pecã, sendo que o maior teor observado foi de γ-tocoferol. As variações encontradas estão relacionadas a fatores como diferentes cultivares de nozes utilizadas nos estudos citados. Kornsteiner et al. (2006) encontraram 14,8 mg.(100 g)-1 de γ-tocoferóis e 0,2 mg.(100 g)-1
de δ-tocoferol na noz pecã.
Os tocoferóis apresentam ação antioxidante, devido à sua capacidade de doar hidrogênio para radicais livres e retardar o processo de peroxidação lipídica. Contribuem para a estabilização das membranas celulares, e têm influência nas respostas celulares ao estresse oxidativo (SHAHIDI; ZHONG, 2005). A ordem da atividade de vitamina E dos tocoferóis é α > β > γ > δ-tocoferol, com a atividade total normalmente expressa em α-tocoferol equivalente. Porém, a atividade antioxidante dos tocoferóis decresce do composto δ para o α-tocoferol; assim, o δ-tocoferol é o mais efetivo antioxidante, o β e γ-tocoferol têm atividade intermediária, e o α-tocoferol apresenta a mais baixa atividade antioxidante (BRAMLEY et al., 2000; SALDEEN; SALDEEN, 2005).
A inibição da produção de peróxidos e a eficiência dos tocoferóis homólogos dependem, entre diversos fatores, do sistema lipídico testado, da temperatura, da luz, do tipo de substrato, do solvente utilizado, bem como da presença de sinergistas e de espécies químicas que possam agir como pró-oxidantes. Além disso, a atividade antioxidante de tocoferóis é dependente da concentração utilizada (BRAMLEY et al., 2000). Estudos já relataram que tocoferóis e tocotrienóis apresentam potencial terapêutico, principalmente na prevenção de doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas (AHSAN; SIDDIQUI, 2015; SYLVESTER, 2005).
3.3.4 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são caracterizados pela presença de um anel benzênico (C6), um grupamento carboxílico, e um ou mais
grupamentos hidroxila e/ou metoxila na molécula. Suas diferenças de ligações com Cn, cadeia substituinte (n número de átomos de carbono) e o número de anéis presentes na estrutura, resultam em uma ampla gama de compostos fenólicos, podendo, assim, ser divididos em várias classes (Tabela 3) (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006; GULÇIN, 2012). Os compostos fenólicos englobam desde moléculas
simples até moléculas com alto grau de polimerização. A maioria está presente nos vegetais, na forma livre, ou conjugados a mono- ou polissacarídeos, e a proteínas (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
Tabela 3 – Classes de compostos fenólicos presentes em plantas e suas estruturas.
Classes Estruturas
Fenólicos simples, benzoquinonas C6
Ácidos hidroxilbenzoicos C6-C1
Acetofenonas, ácidos fenilacéticos C6-C2 Ácidos hidroxicinamicos,
fenilpropanoisides (cumarinas, isocumarinas, cromonas, cromenes)
C6-C3 Naftoquinonas C6-C4 Xantonas C6-C1-C6 Estilbenos, antraquinonas C6-C2-C6 Flavonoides, isoflavonoides C6-C3-C6 Lignanas, neolignanas (C6-C3)2 Diflavonoides (C6-C3-C6)2 Ligninas (C6-C3)n
Taninos condensados (proantocianidinas) (C6-C3-C6)n
Fonte: Adaptado de Balasundram, Sundram, Samman (2006).
São considerados compostos bioativos presentes em vegetais, metabólitos secundários sintetizados por plantas, sendo essenciais para o desenvolvimento e a reprodução vegetal. Em alimentos, os compostos fenólicos estão relacionados com a qualidade sensorial e nutricional, pois contribuem para o amargor, a adstringência, a cor, o sabor, o odor e a estabilidade oxidativa (NACZK; SHAHIDI, 2004).
O maior grupo de fenóis encontrado em plantas são os flavonoides, representando mais de metade dos oito mil compostos fenólicos naturais já identificados. São compostos com baixa massa molecular, constituídos por um núcleo flavan, que consiste de 15 átomos de carbono dispostos em três anéis (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
Os ácidos fenólicos consistem em dois subgrupos, isto é, os ácidos hidroxibenzoicos e hidroxicinâmicos. Os ácidos hidroxibenzoicos possuem sete átomos de carbono (C6-C1) (Tabela 3) e incluem os ácidos
gálico, hidroxibenzoico, vanílico, siríngico, elágico. Já no subgrupo dos ácidos hidroxicinâmicos, que apresentam em sua estrutura nove átomos de carbono (C6-C3) (Tabela 3), os mais comuns, que ocorrem
naturalmente na sua forma livre, são os ácidos cafeico, ferúlico, ρ-cumárico e clorogênico (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006; BRAVO, 1998; GULÇIN, 2012).
As nozes se destacam por apresentarem altas concentrações de flavonoides e ácidos fenólicos, incluindo os ácidos cafeico, gálico, vanílico, ferúlico, p-cumárico, protocateico, p-hidroxibenzoico, sinápico, gentísico e p-hidroxifenilacético (YANG et al. 2009). Os compostos fenólicos e flavonoides totais são destaque na noz pecã e noz comum (família Juglandacea), seguidos pelo amendoim (Tabela 4).
Tabela 4 – Composição em compostos fenólicos totais e flavonoides totais de sementes e nozes comestíveis.
Sementes e nozes comestíveis Compostos Fenólicos Totais (mg.(100 g)-1) Flavonoides Totais (mg.(100 g)-1) Amêndoa 212,9 93,5 Amendoim 645,9 189,8 Avelã 314,8 113,7 Castanha de caju 316,4 63,7 Castanha do Brasil 169,2 107,8 Macadâmia 497,8 137,9 Noz comum 1325,1 744,8 Noz pecã 1463,9 704,7 Pinhão Manso 152,9 45,0 Pistache 571,8 143,3
Fonte: Adaptado de Yang et al. (2009).
Os flavonoides e ácidos fenólicos presentes na noz pecã são principalmente o ácido gálico e a catequina e, em menores concentrações, os ácidos gentísico, vanílico, protocatequico, hidroxibenzoico, p-hidroxifenilacético, e pequenas quantidades dos ácidos cumárico e siríngico (PRADO et al, 2013; PRADO et al., 2014; ROBBINS et al, 2015; VENKATACHALAM, 2004).
A noz pecã apresenta concentrações interessantes de flavonoides, em que o ácido gálico representa 78% do teor de compostos fenólicos totais nesta matéria-prima (138 µg.g-1 da noz desengordurada)
(VILLARREAL-LOZOYA; LOMBARDINI; CISNEROS-ZEVALLOS, 2007). No estudo de Robbins et al. (2015), com 18 variedades de noz pecã, o teor de compostos fenólicos totais ficou entre 1,82 e 2,62 g equivalente de ácido elágico por 100 g de noz pecã.
Os taninos também são importantes compostos fenólicos e podem ser classificados em taninos hidrolisáveis e condensados, apesar de ambos possuírem uma molécula de poli-hidroxi-fenóis ou seus derivados (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006). A classificação dos taninos inclui os taninos hidrolisáveis, polímeros derivados dos ácidos gálico e elágico. Outro grupo encontrado em maior quantidade e importância em alimentos é o dos taninos condensados, relacionados à estrutura da catequina (GULÇIN, 2012).
Os taninos condensados ou proantocianidinas compreendem um grupo de oligômeros e polímeros formados pela policondensação de duas ou mais unidades flavan-3-ol e flavan-3,4-diol (SIMÕES et al., 2003). Os múltiplos grupos de compostos hidroxi-fenólicos propiciam a formação de complexos com proteínas, íons metálicos e macromoléculas como polissacarídeos (GULÇIN, 2012). Os taninos são potencialmente quelantes de íons metálicos, agentes precipitantes de proteínas e antioxidantes biológicos, e apresentam efeitos sobre sistemas biológicos (IGNAT et al., 2011).
Em estudo de Venkatachalam (2004), com as variedades de noz pecã Schley, Mahan e diversas, foram encontrados teores de 1,02, 1,60 e 0,88 g de taninos por 100 g de noz pecã, respectivamente.
Os compostos fenólicos presentes na noz pecã, tais como os flavonoides, os ácidos fenólicos e os taninos, são responsáveis por características como a cor e o sabor adstringente característicos da noz. Além disso, apresentam atividade antioxidante, e podem inibir a ação de enzimas, como as lipoxigenases, responsáveis por alterações oxidativas (SHAHIDI; ZHONG, 2005).
3.3.5 Proteínas e aminoácidos
As castanhas e nozes em geral têm uma grande aceitação por parte dos consumidores, tendo potencial para aumentar sua utilização em alimentos. Além de apresentarem alto teor de lipídios em sua composição, a qualidade proteica das castanhas e nozes deve ser investigada, pois se trata de aspecto relevante para a nutrição humana, incluindo a avaliação da biodisponibilidade de seus aminoácidos essenciais (SATHE, 1994).
A noz pecã possui em sua composição de 7,0 a 10,0 g.(100 g)-1 de
nitrogênio total (ORO et al., 2009). Com base na solubilidade, as proteínas são classificadas em quatro grupos principais: albuminas (solúveis em água), globulinas (solúveis em sal diluído), prolaminas (solúveis em álcool aquoso a 70%) e glutelinas (solúveis em ácido/alcalino). No estudo de Venkatachalam, Roux, Sathe (2008) sobre
as proteínas de noz pecã, a fração de glutelina solúvel em álcalis (60,1%) foi responsável por uma grande porção de proteínas da noz pecã, seguida por globulina (31,5%), prolamina (3,4%) e albumina (1,5%), respectivamente. A maioria das proteínas e polipeptídeos da noz pecã apresenta-se na faixa de massa molecular de 12-66 kDa e na faixa de pI de 4,0-8,3 (VENKATACHALAM; ROUX; SATHE, 2008).
Os aminoácidos apresentam funções que estão relacionadas à regeneração de novos tecidos (músculos, órgãos), à regulação da síntese hormonal, aos processos metabólicos, e envolvem fonte de energia, através da manutenção de funções corporais básicas (XIAO et al., 2017). Os aminoácidos considerados essenciais são arginina (Arg), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Fen), treonina (Thr), triptofano (Trp) e valina (Val) (FREITAS; NAVES, 2010). Geralmente, nas nozes e sementes comestíveis, as proteínas presentes atendem parte das necessidades de aminoácidos essenciais de crianças e de indivíduos adultos (Tabela 5), segundo os padrões estipulados pela FAO/WHO/UNU (2007).
Tabela 5 – Necessidade de ingestão diária de aminoácidos essenciais por crianças e adultos, e a composição em aminoácidos essenciais da noz pecã.
Aminoácidos Essenciais Crianças 1 (mg.(kg pc)-1.d-1) 3 Adultos 2 (mg.(kg pc)-1.d-1) 3 Noz pecã 6 (mg.(100 g)-1) 7 His 12 10 26 Ile 22 20 34 Leu 44 39 60 Lys 35 30 29 SAA4 17 15 33 AAA5 30 25 65 Thr 18 15 31 Trp 4,8 4 9 Val 29 26 41
1 Crianças de 3 a 10 anos de idade; 2 Adultos maiores de 18 anos de idade;
3 Miligramas por quilogramas de peso corporal por dia; 4 Metionina + cisteína, aminoácidos sulfurados; 5 Fenilalanina + tirosina, aminoácidos aromáticos; 6 Aminoácidos essenciais presentes na noz pecã;
7 Miligrama por 100 gramas da parte comestível da noz pecã. Fonte: Adaptado de FAO/WHO/UNU (2007); Venkatachalam (2004).
Na composição em aminoácidos da noz pecã (Tabela 5), há principalmente aminoácidos neutros, mas os teores de aminoácidos
essenciais apresentam-se adequados para uma dieta saudável, ressaltando-se que deve haver consumo de outros alimentos que são fonte de aminoácidos essenciais (VENKATACHALAM; SATHE, 2006).
Muitas propriedades fisiológicas e funcionais das proteínas são atribuídas a peptídeos biologicamente ativos (RIZZELLO et al., 2016). Peptídeos biogênicos ou bioativos podem ser produzidos a partir da hidrólise das proteínas por enzimas digestivas (digestão gastrointestinal), durante o processamento ou armazenamento de alimentos (amadurecimento, fermentação, cozimento), ou por hidrólise in vitro por enzimas proteolíticas. Existem peptídeos bioativos que podem apresentar ação antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória, efeitos hipocolesterolêmicos, atividade anticancerígena, ou anti-hipertensiva (DIA; BRINGE; MEJIA, 2014; HWANG et al., 2011; KANNAN et al., 2010; MARCZAK et al., 2003; RIZZELLO et al., 2016; SATO et al., 2013; WANG; ZHANG, 2013; ZHANG et al., 2010).
Outro ponto a ser mencionadoé o fato de que as propriedades funcionais das proteínas apresentam influência sobre os atributos sensoriais e sobre a composição dos alimentos. As propriedades funcionais estão relacionadas a aspectos como solubilidade, viscosidade, gelificação, elasticidade, emulsão, formação de espuma, fixação de lipídios e aromas (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). 3.4 MÉTODOS PARA A EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE NOZ PECÃ
Os processos de extração de óleos comestíveis mais utilizados comercialmente são a prensagem mecânica e a extração com solventes orgânicos. Estes métodos normalmente são utilizados em matérias-primas com concentração de óleo acima de 35%, como linhaça, girassol, nozes, castanhas, sementes de algodão e gérmen de trigo (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996). No caso da noz pecã, o método de obtenção de óleo utilizado industrialmente é a prensagem mecânica.
Este método é um dos mais antigos, porém seu uso está diminuindo consideravelmente, devido ao baixo rendimento de óleo obtido em algumas matérias-primas, embora apresente benefícios frente a outros tipos de extração (CHENG; DIEN; SINGH, 2019). A sua principal vantagem é o fato de ser um método simples, que pode ser associado a outros métodos de extração (uso de solventes, por exemplo), além de não exigir o emprego de altas temperaturas (KARTIRA; PONTALIER; RIGAL, 2010).
Um fluxograma simplificado da extração de óleo de noz pecã por prensagem mecânica é indicado na Figura 5. A noz é recebida sem casca
e já higienizada. Em seguida, realiza-se a moagem da noz com adição de vitamina E, que é adicionada no momento da moagem, podendo permanecer na noz mesmo após a obtenção do óleo. A extração é realizada somente por prensagem a frio, resultando no óleo e na torta. O óleo segue para filtração e envase, enquanto a torta torna-se um resíduo do processo (SALVADOR, 2014).
Na extração por prensagem mecânica, obtêm-se duas frações: uma de óleo e outra de torta. Esta muitas vezes é submetida a uma posterior extração com solventes, procedimento que depende da matéria-prima utilizada e das especificações da prensa (KARTIRA; PONTALIER; RIGAL, 2010). No caso da noz pecã, a torta, apesar de ter potencialidade para aplicação como ingrediente na formulação de alimentos (produtos de confeitaria, panificação, em barras de cereais e na indústria láctea) (MARCHETTI; CALIFANO; ANDRÉS, 2018; SALVADOR et al., 2016), geralmente é destinada, em sua maioria, para ração animal. Figura 5 – Fluxograma da extração de óleo de noz pecã por prensagem mecânica para comercialização.
Fonte: Adaptado de Salvador (2014).
Os métodos convencionais para a obtenção de óleos vegetais, como já citado anteriormente, são extração por prensagem mecânica e com solventes orgânicos. A extração por prensagem mecânica, apesar de amplamente difundida, é um processo que tem certos inconvenientes, como um custo inicial elevado, difícil instalação e manutenção dos
