MYLENA SPINA CRUZ
DEGRADAÇÃO DA DOXICICLINA POR
PROCESSOS OXIDATIVOS AVANÇADOS
Campinas
2016
DEGRADAÇÃO DA DOXICICLINA POR
PROCESSOS OXIDATIVOS AVANÇADOS
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Guimarães
Campinas
2016
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE A VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DEFENDIDA PELA ALUNA MYLENA SPINA CRUZ E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ ROBERTO GUIMARÃES
ASSINATURA DO ORIENTADOR
______________________________________
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo da Universidade Estadual Campinas, como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Engenharia Civil, na área de Saneamento e Ambiente.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA CIVIL, ARQUITETURA E
URBANISMO
DEGRADAÇÃO DA DOXICICLINA POR
PROCESSOS OXIDATIVOS AVANÇADOS
Mylena Spina Cruz
Dissertação de Mestrado aprovada pela Banca Examinadora, constituída por:
Prof. Dr. José Roberto Guimarães
Presidente e Orientador/ Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo - UNICAMP
Prof. Dr. Adriano Luiz Tonetti
Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo - UNICAMP
Prof. Dr. Renato Falcão Dantas
Faculdade de Tecnologia - UNICAMP
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
À memória de meu avô Carmino e meu tio Osias, os quais devo muito pelo o que sou hoje. À minha mãe Selma e minha avó e segunda mãe Maria Dulce, que sempre estiveram ao meu lado em todos os momentos. Ao meu padrinho, Carlos e à minha querida tia e amiga Rosicler.
Durante o desenvolver deste trabalho, passei por momentos muito turbulentos na minha vida pessoal e sou grata a muitas pessoas que me apoiaram e incentivaram a nunca desistir e seguir em frente buscando a realização dos meus objetivos.
Primeiramente, agradeço a Deus que me sustentou durante toda a minha vida, e que por intermédio da minha fé me deu forças para traçar meu caminho.
À minha família, que sempre me apoiou e me amparou sem medir esforços e amor para eu poder alcançar meus objetivos. À (vó) Laura e Lilane, que considero parte da família, pelo apoio nos momentos alegres e tristes ao longo dessa amizade duradoura.
Ao professor Dr. José Roberto Guimarães pela oportunidade de ser sua aluna de mestrado, pelos ensinamentos, compreensão e por ter me dado todas as condições necessárias para desenvolver a pesquisa.
À Dra. Milena Guedes Maniero, que é pra mim uma referência como pesquisadora e pessoa, meu muito obrigado pela dedicação, paciência e amizade.
Aos professores Dr. Renato Falcão e Dr. Adriano Luiz Tonetti pelas valiosas contribuições tanto na banca de qualificação quanto na banca de defesa de meu mestrado.
Aos docentes da FEC – Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo que auxiliaram no meu processo de aprendizagem.
Ao grupo de pesquisa de processos oxidativos avançados, em especial ao Dr. Caio, Vanessa e Wilson pelas ajudas e momentos de descontração.
Aos colegas de pós-graduação, em especial, Mariana, Raul, Fabrício e Mara pela amizade e companheirismo no decorrer do mestrado.
À minha amiga desde a época de colégio, Mariana e às minhas amigas da faculdade, Carla, Nayara, Débora, Letícia, Thaíse, em especial Laura e Marina, que acompanharam esse trabalho de perto, muito obrigada pela amizade e carinho de sempre.
pour tout!
Ao Manuel, por estar do meu lado desde o início, sempre me incentivando com muito amor e carinho.
Agradeço também à Márcia e Nilson Mascia, por terem plantado em mim a ideia de fazer uma pós-graduação e por todo apoio.
“Se soubesse que o mundo se desintegraria amanhã, ainda assim plantaria a minha macieira. O que me assusta não é a violência de poucos, mas a omissão de muitos. Temos aprendido a voar como os pássaros, a nadar como os peixes, mas não aprendemos a sensível arte de viver como irmãos.”
Contaminantes emergentes, como fármacos de uso veterinário, são considerados compostos persistentes e sua presença no meio ambiente podem causar reações aos seres humanos e também contribuir para o desenvolvimento de bactérias resistentes, causando entre outros problemas, o desequilíbrio do meio em que se encontra. Neste estudo foi avaliada a degradação da doxiciclina (DOX), antimicrobiano pertencente à família das tetraciclinas, pelos processos de fotólise (UV – λmáx = 254 nm), peroxidação (H2O2), peroxidação assistida
por radiação ultravioleta (UV/H2O2) e ozonização em diferentes valores de pH. O processo
combinado UV/H2O2 e ozonização em meio básico são considerados processos oxidativos
avançados (POA). Para detectar e quantificar os níveis do fármaco durantes a degradação, foi determinado um método analítico utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência associada ao detector de arranjo de diodos (HPLC/DAD) e espectrometria de massas (SPE-UHPLC-MS/MS), podendo assim quantificar a DOX em níveis de 2 g L-1, após concentração
da amostra por extração em fase sólida (SPE off-line), utilizando o HPLC, e níveis a partir de 1 g L-1 utilizando o SPE-UHPLC-MS/MS. Os resultados obtidos indicaram uma alta eficiência
na degradação do fármaco quando utilizado os processos oxidativos avançados; porém, além de avaliar a degradação, foi necessário avaliar se o fármaco perdeu sua capacidade de inibir o crescimento de bactérias. Para isso, foram realizados ensaios de atividade antimicrobiana utilizando as bactérias Escherichia coli (Gram negativa) e Bacillus subtillis (Gram positiva), ambas inclusas dentro do espectro de atuação da DOX. Outro importante parâmetro avaliado, para concluir se a degradação da doxiciclina por esses processos foi ou não eficiente, foi a toxicidade aguda das amostras, uma vez que não é desejável que a toxicidade após a degradação seja maior que a toxicidade inicial do antimicrobiano. O teste foi realizado por meio de ensaios Microtox®, utilizando a bactéria marinha luminescente
Vibrio fischeri.
Palavras-chave: contaminantes emergentes; fármacos veterinários; fotólise; fotoperoxidação; ozonização; POA.
Emerging contaminants, such as antimicrobial for veterinary use, are persistent compounds and their presence in the environment may cause adverse reactions to human beings and contribute to development of resistant bacteria, causing an imbalance in aquatic life. This work evaluated the efficiency of photolysis (UV), peroxidation (H2O2), peroxidation assisted
by ultraviolet radiation (UV/H2O2) and ozonation in different values of pH to degrade
doxycycline in aqueous solution. UV/H2O2 and ozonation in basic medium are considered
advanced oxidation processes (AOPs). An analytical method for doxycycline detection and quantification was studied using high-performance liquid chromatography associated with diode array detector (HPLC/DAD) and mass spectrometry (SPE-UHPLC-MS/MS). The developed method was able to quantify DOX in 2 µg L-1 levels, after sample concentration by
SPE off-line, using HPLC and levels as low as 1 g L-1 when applied UHPLC-MS/MS. Results
showed that high rates of DOX degradation were achieved when the combined process (UV/H2O2) and ozonation were used. In addition, to evaluate the degradation, it was
assessed the drug’s ability to inhibit the growth of bacteria along the degradation time. Antimicrobial activity assays were conducted using Escherichia coli (Gram negative) and
Bacillus subtilis (Gram positive); both bacteria belong to DOX spectrum of uses. Acute
toxicity test using the luminescent marine bacteria Vibrio fischeri (Microtox®) was also carried out.
Key words: AOPs; emerging contaminants; ozonation; photolysis; photoperoxidation; veterinary drugs.
Figura 3.1: Estrutura molecular das tetraciclinas... 23
Figura 3.2: Estrutura molecular da doxiciclina. ... 24
Figura 3.3: Variação da concentração das espécies da doxicilina conforme a variação do valor do pH do meio. ... 26
Figura 3.4: Possível rota de contaminação no meio ambiente por fármacos de uso veterinário. ... 29
Figura 4.1: (a) Sistema utilizado na degradação da doxiciclina pelos processos UV, H2O2 e UV/H2O2 contendo a bomba peristáltica e o agitador magnético e (b) representação das dimensões do reator. ... 40
Figura 4.2: Sistema de ozonização utilizado para a degradação da doxiciclina, onde (a) representa o reator de contato contendo 1 L da solução de DOX e (b) o reator contendo 200 mL da solução de iodeto de potássio (KI). ... 41
Figura 4.3: Representação do método de descarga corona para produção de ozônio. ... 42
Figura 4.4: Representação da diluição serial feita nos ensaios de AAM. ... 48
Figura 5.1: Curva analítica da doxiciclina no HPLC. ... 52
Figura 5.2: Recuperação do analito em dois cartuchos (Oasis e C18) e em meio ácido e neutro. ... 54
Figura 5.3: Recuperação da doxiciclina do cartucho Oasis em diferentes concentrações em pH 3. ... 55
Figura 5.4: Curva analítica da razão das áreas dos picos da DOX/OXI em função da concentração da DOX. ... 57
Figura 5.5: Degradação da doxiciclina em função do tempo de ensaio pelos processos de fotólise, peroxidação e UV/H2O2. ... 59
Figura 5.8: Consumo de ozônio ao longo do tempo de reação nos pH 3, 7 e 11. ... 63 Figura 5.9: Comparação das curvas dose resposta da atividade antimicrobiana das soluções
de doxiciclina com concentração variando de 2500,0 a 29,0 µL-1 utilizando as bactérias
B. subtillis e a E. coli. ... 65
Figura 5.10: Curvas dose resposta da atividade antimicrobiana das soluções de DOX
utilizando a bactéria B. subtillis como organismo teste nos processos de: (a) Peroxidação (H2O2 = 0,63 mmol L-1); (b) Peroxidação (H2O2 = 6,93 mmol L-1); (c) UV/H2O2
(H2O2 = 0,63 mmol L-1);(d) UV/H2O2 (H2O2 = 2,52 mmol L-1) e (e) UV/H2O2
(H2O2 = 6,93 mmol L-1). ... 69
Figura 5.11: Curvas dose resposta da atividade antimicrobiana das soluções de DOX
utilizando a bactéria E.coli como organismo teste nos processos de: (a) Fotólise;
(b) Peroxidação (H2O2 = 0,63 mmol L-1); (b) Peroxidação (H2O2 = 6,93 mmol L-1); (c) UV/H2O2
(H2O2=0,63 mmol L-1); (d) UV/H2O2 (H2O2 = 2,52 mmol L-1) e (e) UV/H2O2
(H2O2 = 6,93 mmol L-1). ... 70
Figura 5.12: Curvas dose resposta da atividade antimicrobiana das soluções de doxiciclina
utilizando a bactéria B. subtillis como organismo teste nos processos de: (a) Ozonização em pH 3; (b) Ozonização em pH 7 e (c) Ozonização em pH 11. ... 71
Figura 5.13: Curvas dose resposta da atividade antimicrobiana das soluções de doxiciclina
utilizando a bactéria E. coli como organismo teste nos processos de: (a) Ozonização em pH 3; (b) Ozonização em pH 7 e (c) Ozonização em pH 11. ... 72
Figura 5.14: Toxicidade da amostra submetida ao processo de fotólise e peroxidação nas
concentrações de H2O2: 0,63 e 6,93 mmol L-1, utilizando a bactéria marinha Vibrio fischeri
como organismo teste. ... 74
Figura 5.15 Toxicidade das amostras submetidas ao processo de degradação por
fotoperoxidação nas nas concentrações de H2O2: 0,63; 2,52 e 6,93 mmol L-1, utilizando a
Tabela 3.1: Constantes de dissociação de diferentes fármacos da família das tetraciclinas ... 24
Tabela 3.2: Principais características físico-químicas da doxiciclina... 25
Tabela 3.3: Uso do hiclato de doxiciclina em países pertencentes à União Européia. ... 27
Tabela 3.4: Ocorrência da doxiciclina no ambiente. ... 30
Tabela 3.5: Principais processos oxidativos avançados ... 32
Tabela 4.1: Proporções entre a doxiciclina e o peróxido de hidrogênio que foram testadas nos ensaios de peroxidação e peroxidação assistida por radiação ultravioleta. ... 43
Tabela 5.1: Parâmetros estabelecidos na validação do método cromatográfico. ... 51
Tabela 5.2: Parâmetros adotados para avaliar o método analítico. ... 52
Tabela 5.3: Parâmetros estabelecidos na validação do método. ... 56
Tabela 5.4: Energia emitida pela lâmpada UV-C utilizada para a degradação da DOX ... 57
Tabela 5.5: Dose de ozônio aplicada no processo de ozonização em diferentes pH ao longo do tempo. ... 62
Tabela 5.6: Comparação da degradação e da redução da atividade antimicrobiana da fotólise peroxidação e fotoperoxidação. ... 67
Tabela 5.7: Comparação da degradação e da redução da atividade antimicrobiana da ozonização em diferentes valores de pH (3, 7 e 11). ... 68
1 Introdução ... 17
2 Objetivos ... 19
2.1 Objetivos gerais ... 19
2.2 Objetivos específicos ... 19
3 Revisão da literatura ... 20
3.1 Fármacos de uso veterinário: antimicrobianos ... 20
3.2 Antimicrobianos: família das tetraciclinas (TC) ... 21
3.2.1 Propriedades gerais das tetraciclinas ... 22
3.2.2 Doxiciclina (DOX) ... 25
3.3 Rota e ocorrência no meio ambiente ... 28
3.4 Remoção de Contaminantes do ambiente: processos oxidativos convencionais. .... 31
3.5 Remoção de contaminantes do ambiente: processos oxidativos avançados (POA) . 31 3.5.1 UV/H2O2 e Ozonização ... 33
4 Métodos ... 36
4.1 Reagentes... 36
4.2 4.2- Preparo das soluções estoque e de trabalho ... 36
4.3 Metodologia analítica ... 37
4.3.1 Cromatografia líquida de alta eficiência ... 37
4.3.2 Extração em fase sólida (SPE) ... 37
4.3.3 Espectrometria de massas ... 38
4.4 Ensaios de degradação ... 39
4.4.1 Reator fotoquímico em batelada ... 39
4.5.1 Condições experimentais usadas nos processos UV, H2O2 e UV/H2O2 ... 42
4.5.2 Condições experimentais para o processo de ozonização ... 43
4.5.3 Quantificação do peróxido de hidrogênio residual nas amostras submetidas aos processos de degradação ... 44
4.5.4 Destruição do peróxido de hidrogênio residual utilizando a enzima catalase, proveniente de fígado bovino ... 45
4.6 Avaliação da atividade antimicrobiana e toxicidade aguda ... 45
4.6.1 Atividade antimicrobiana (AAM) utilizando as bactérias Escherichia coli e Bacillus subtillis ... 46
4.6.2 Ensaios de toxicidade utilizando a bactéria marinha Vibrio fischeri ... 49
5 Resultados ... 50
5.1 Validação da metodologia analítica: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ...50
5.1.1 Curva Analítica ... 50
5.2 Recuperação no cartucho de extração em fase sólida ... 53
5.3 Validação da metodologia analítica: SPE-UHPLC-MS/MS ... 55
5.4 Avaliação da degradação da doxiciclina ... 57
5.4.1 Degradação por fotólise (UV), peroxidação (H2O2) e peroxidação assistida por radiação ultravioleta (UV/H2O2) ... 57
5.4.2 Degradação por ozônio ... 61
5.5 Avaliação da atividade antimicrobiana e toxicidade ... 64
5.5.1 Atividade antimicrobiana ... 64
5.5.2 Avaliação da toxicidade aguda ... 73
6 Conclusões ... 77
1 Introdução
Contaminantes emergentes (CE), ou de preocupação emergente (CPE), são uma ampla classe de compostos que incluem desde medicamentos, hormônios sintéticos e produtos de higiene pessoal até drogas ilícitas e aditivos. Geralmente, não são regulamentados e muitos são caracterizados de forma insuficiente quanto a sua presença e seu potencial de poluição no meio ambiente. Alguns destes compostos já se mostraram ser prejudicial a peixes e até ao ser humano. Agências ambientais internacionais, como a agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (United States Environmental Protection Agency – U.S EPA), gastam milhões de dólares e dedicam esforços para monitorar mínimas concentrações de compostos presentes em águas superficiais e sedimentos. Porém, apesar de muitos desses compostos já estarem sendo monitorados, há algumas divergências quanto a definição atual dos CPE. Algumas agências consideram compostos que já são regulamentados como sendo de preocupação emergente devido aos efeitos não reportados que eles podem causar, outras consideram contaminantes de preocupação emergente aqueles que não são regulamentados (DIAMOND et al., 2011).
Fármacos de uso veterinário se encaixam na categoria de contaminantes emergentes e/ou de preocupação emergente. Uma vez administrados, a maioria desses medicamentos não é totalmente metabolizada devido à baixa taxa de absorção no trato digestivo dos animais. Dessa forma, esses fármacos podem atingir o solo e rios receptores, uma vez que há a possibilidade de serem excretados in natura pelas fezes e urina na sua forma não metabolizada ou por meio de seus metabólitos ativos (JJEMBA, 2006).
A preocupação com a presença de medicamentos veterinários no ambiente tem despertado grande preocupação na comunidade científica da Europa (TAMTAM et al., 2008; KEMPER, 2008) e certamente deveria receber a devida atenção no Brasil, onde a criação extensiva de animais é uma das atividades mais expressivas no agronegócio brasileiro (REGITANO; LEAL, 2010). Porém, apenas recentemente esse assunto tem despertado interesse, a fim de avaliar os riscos ao meio ambiente (KÜMMERER, 2009). Nos anos 80, foi estimado que pelo menos 60% dos animais criados para corte foram expostos a antibióticos
em algum momento de sua vida (HAYS, 1986). Desta forma, estes contaminantes emergentes estão sendo lançados continuamente no meio ambiente, seja como resultados de processos de produção animal ou disposição irregular.
O comportamento destes contaminantes no meio ambiente pode ser alterar dependendo de uma variedade de fatores, como as propriedades físico-químicas do composto e do meio em que se encontra (SARMAH; MEYER; BOXALL, 2006) e, ainda, sabe-se muito pouco sobre o efeito que esses CPE podem exercer nos diferentes organismos presentes no meio exposto, quanto a exposição crônica, a longo prazo, a baixas concentrações (BOXALL et al., 2003).
Trabalhos envolvendo estimativas de produção e consumo, da dissipação desses compostos no ambiente, bem como da utilização de processos alternativos, ou não convencionais, para a remoção/degradação de fármacos do ambiente (ar, água e solo) são de extrema importância. Um composto bastante utilizado na medicina veterinária é a doxiciclina, um fármaco pertencente à família das tetraciclinas e muito pouco explorado em estudos científicos e deveria ser melhor estudado em relação a seu comportamento quando presente no ambiente. Assim, este trabalho tem como objetivo o estudo da degradação de um composto considerado de preocupação emergente, a doxiciclina, por processos alternativos de degradação, como os processos oxidativos avançados, aliado aos estudos de atividade antimicrobiana e testes de toxicidade, para elucidação do comportamento dessa classe de composto no ambiente.
2 Objetivos
2.1 Objetivos gerais
O estudo tem como objetivo principal avaliar a degradação do antimicrobiano doxiciclina em solução aquosa por processos físico, oxidativos convencionais (PO) e oxidativos avançados (POA), tais como: fotólise (UV), peroxidação (H2O2), peroxidação
assistida por radiação UV (H2O2/UV) e ozonização em diferentes valores pH.
2.2 Objetivos específicos
Como objetivos específicos têm-se:
Avaliar a eficiência dos processos de degradação fotólise (UV), peroxidação (H2O2),
peroxidação assistida por radiação UV (UV/H2O2) e ozonização.
Avaliar a influência da concentração do peróxido de hidrogênio nos processos que envolvem a adição do peróxido.
Avaliar a influência do pH na degradação por ozonização.
Avaliar a inibição da atividade antimicrobiana das soluções submetidas aos processos de degradação avaliados.
3 Revisão da literatura
3.1 Fármacos de uso veterinário: antimicrobianos
No Brasil o órgão responsável pela regulação e fiscalização dos produtos de uso veterinário é o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2016). O MAPA descreve que produtos de uso veterinários são toda substância química, biológica, biotecnológica ou de preparação manufaturada, sendo que sua administração pode ser aplicada de forma individual ou coletiva, direta ou misturada com os alimentos, com o objetivo de prevenir, diagnosticar, curar ou tratar doenças causadas aos animais. Pode-se incluir os aditivos, suprimentos promotores, melhoradores da produção animal, medicamentos, vacinas, antissépticos, desinfetantes de uso ambiental ou equipamentos, pesticidas e todos os produtos que, utilizados nos animais ou no seu habitat, protejam, restaurem ou modifiquem suas funções orgânicas e fisiológicas.
Os antimicrobianos destinados a uso veterinário se enquadram na descrição de produtos veterinários e devem receber especial atenção, devido aos riscos que estes contaminantes podem causar ao meio ambiente. Porém, é recente a investigação detalhada sobre esse tipo de fármaco com a intenção de permitir uma avaliação dos riscos à natureza (KÜMMERER, 2009).
Segundo Gaskins et al (2006), o método atual de reprodução e engorda de gado requer o consumo de antimicrobianos a fim de prevenir e tratar doenças, assim como promover o crescimento animal. A maioria dos fármacos destinados ao uso animal são minimamente absorvidos em seu organismo podendo ser até 90% ou mais excretado em sua forma natural ou metabolizada via urina e fezes (TOLLS, 2001). Segundo Kemper (2008), esse índice pode variar de acordo com o tipo de substância, a dosagem, a espécie e a idade animal, entre outros fatores.
Atualmente, a administração de fármacos veterinários como promotor de crescimento animal é estritamente regulamentada em vários países e quase totalmente vetada na União Europeia, desde 2006, e nos Estados Unidos. Porém, na China, um dos maiores produtores e exportadores de produtos animais do mundo, esta prática continua
sendo regular segundo Wei et al. (2016). No Brasil, o Ministério da Agricultura proíbe o uso de alguns antimicrobianos para promoção do crescimento animal e uso terapêutico, porém, em um levantamento feito por Regitano e Leal (2010), foi constatado irregularidades quanto ao uso de determinados antimicrobianos.
No Brasil, onde nas últimas três décadas a avicultura vem apresentando grande crescimento, passando a ser o terceiro maior produtor mundial e líder de exportação (MAPA, 2016) e onde a população de bovinos ultrapassa o número de habitantes (IBGE, 2016), sendo um fator motriz para o agronegócio, ainda é insignificante o monitoramento sobre a administração de antimicrobianos a esses animais e o número pesquisas na área ainda é muito baixo. Há carência de levantamentos sobre a ocorrência de resíduos dos principais antimicrobianos de uso veterinário no ambiente, seus possíveis efeitos sobre o ecossistema e, ou, tampouco qualquer estudo a respeito da dinâmica desses compostos em nossos solos, que apresentam altas taxas de intemperismo (REGITANO; LEAL, 2010). Porém, sabe-se de modo geral que a ocorrência desses compostos no ambiente altera negativamente o comportamento dos organismos presentes no meio exposto a contaminação, e podem também influenciar o aumento da resistência de microrganismos aos agentes antimicrobianos (KEMPER, 2008).
Esse desconhecimento não é exclusivo do Brasil. Kümmerer (2009) constatou que dados internacionais sobre o consumo de antimicrobianos são apenas estimados. A maioria dos países não disponibilizam esses valores ou apenas divulgam uma estimativa do volume de antimicrobiano usado no setor agrícola.
3.2 Antimicrobianos: família das tetraciclinas (TC)
Os antimicrobianos são capazes de combater microrganismos ou de inibir sua multiplicação ou crescimento. Atualmente pode-se classificar os antimicrobianos em dois tipos: Antibióticos, que são originados de microrganismos como bactérias e fungos, como exemplo a penicilina e os quimioterápicos que são produzidos sinteticamente em laboratório, como o exemplo das sulfonamidas, quinolonas e alguns fármacos da família das tetraciclinas (ANVISA, 2001).
Os antimicrobianos podem ser classificados segundo suas estruturas químicas em diferentes sub-grupos como: β-lactâmicos, quinolonas, macrolídeos, sulfonamidas, tetraciclinas e outros. Geralmente são moléculas com estrutura complexa, pois podem possuir diferentes funcionalidades em uma mesma molécula (KÜMMERER, 2009).
Desde a descoberta das tetraciclinas, em meados do século XX, os antimicrobianos desta família vêm desempenhando um papel fundamental no campo da saúde humana e veterinária, principalmente desta última. Dentre essas utilidades, pode-se salientar o tratamento de doenças em rebanho bovino leiteiro e nutrição animal.
O percursor das tetraciclinas é a clortetraciclina, obtida a partir da bactéria
Streptomyces aureofaciens. As TC agem efetivamente contra diversos tipos de bactérias,
desde as Gram positivas às Gram negativas, como: Staphylococcus, Streptococcus,
Pneumococcus, Gonococcus, Cholera, Dysentery bacillis, Pertussis, Rickettsia, Chlamydia e Mycoplasma. Seu meio de transporte no organismo é através das células de bactérias
susceptíveis e exercem um efeito bacteriostático, inibindo a biossíntese de proteína após a ligação com a subpartícula ribossomal 30s (OKA; ITO; MATSUMOTO, 2000). Os sítios relacionados à atividade antimicrobiana nas moléculas de tetraciclina ainda são desconhecidos (MERCK, 2015).
Os primeiros relatos de fármacos utilizados como aditivos nutricionais iniciaram-se por volta de 1950, com antibióticos que pertenciam à família das tetraciclinas (oxitetraciclina e clortetraciclina) (GUSTAFSON, 1986). Desde então, os antibióticos da família das tetraciclinas vem desempenhando um papel fundamental no campo da saúde humana e principalmente da veterinária, pois existe grande interesses no seu uso em animais produtores de alimentos devido a sua vasta gama de utilidades e baixo valor econômico (ANDERSON; RUPP; WU, 2005).
3.2.1 Propriedades gerais das tetraciclinas
Os fármacos que pertencem à família das tetraciclinas podem se comportar como substâncias ácidas ou básicas, dependendo do meio em que se encontram. Compostos desta família caracterizam-se pela estrutura formada por quatro anéis condensados. Representam uma das mais importantes famílias farmacológicas e possuem amplo espectro de ação
(RUFINO, 2009). Os principais fármacos são: oxitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina e a doxiciclina. Suas estruturas e propriedades estão representadas na Figura 3.1.
R1 R2 R3
OXITETRACICLINA H OH OH
TETRACICLINA H OH H
CLORTETRACICLINA Cl OH H
DOXICICLINA H H OH
Fonte: Anderson e Rupp e Wu (2005) Figura 3.1: Estrutura molecular das tetraciclinas.
Muitas vezes, as tetraciclinas formam sais hidrossolúveis com ácidos e bases fortes. A protonação do grupo dimetilamino forma sais ácidos estáveis, enquanto os sais básicos são formados por reações com hidróxidos de cálcio, sódio ou potássio e são instáveis em soluções aquosas (KOROLKOVAS & BURCKHALTER, 1988).
As tetraciclinas possuem três diferentes constantes de dissociação (Ka), apresentadas na Tabela 3.1, e são capazes de assumir várias formas, dependendo do meio em que se encontram (JEZOWSKA-BOJCZUK et al., 1993). Os valores exatos das constantes de dissociação das moléculas das TC ainda são controversos. Para Anderson, Rupp e Wu (2005), a primeira constante de equilíbrio, Ka1, está associada com a desprotonação da hidroxila
na posição 12 (C12) e do grupo dimetil amina (N(CH3)2) referem-se às Ka2 e Ka3,
respectivamente. Porém, Stephens et al. (1956) associam o pKa1 ao grupo tricarbonilas, pKa2
ao grupo dimetil amina e pKa3 ao grupo β-dicetona. Finalmente, Leeson, Krueger e Nash,
(1963) associam pKa1 e pKa2 aos grupos β-dicetona e dimetil amina, respectivamente.
Tabela 3.1: Constantes de dissociação de diferentes fármacos da família das tetraciclinas
COMPOSTO pKa,1 pKa,2 pKa,3
OXITETRACICLINA TETRACICLINA CLORTETRACICLINA DOXICICLINA 3,2 3,3 3,3 3,0 7,5 7,8 7,6 8,0 8,9 9,6 9,3 9,2
Fonte: Anderson; Rupp; Wu, 2005
Ácidos e bases fortes podem inativar as tetraciclinas, que possuem um grupo hidroxila na posição 6. Para evitar tal inativação, foram produzidos através de processos semissintéticos, produtos derivados das tetraciclinas, porém mais estáveis e com propriedades melhoradas. A doxiciclina (Figura 3.2) é um desses produtos, além da metaciclina e sanciclina.
3.2.2 Doxiciclina (DOX)
A doxiciclina é um antimicroniano que pertence à família das tetraciclinas e possui um amplo espectro de atuação contra bactérias Gram positivas e negativas, além de micoplasmas, espiroquetas, clamídias e riquétsias. Compartilha algumas de suas propriedades com outros fármacos de sua família, porém é mais eficiente e com farmacocinética mais vantajosa, por ser mais lipofílica, facilitando sua distribuição pelos tecidos corporais, atingindo concentrações efetivas na maioria dos tecidos, se diferenciando dos demais fármacos da sua família. Possui também maior capacidade de ligações às proteínas plasmáticas, o que prolonga sua meia vida. Na Tabela 3.2 estão descritas algumas das propriedades físico-químicas da doxiciclina.
Tabela 3.2: Principais características físico-químicas da doxiciclina. Grupo terapêutico
Fórmula molecular Massa molar (g mol-1)
Tetraciclinas C22H24N2O8
444,438
Constantes de dissociação (pKa)
3,4 7,7 9,7
Número CAS 564-25-0
Fonte: Scholar, 2007
Na molécula de doxiciclina há grupos capazes de formar pontes de hidrogênio intermoleculares, que possuem propriedades quelantes e podem formar complexos insolúveis com ferro, cálcio, magnésio e alumínio (RUFINO, 2009). Deste modo, é recomendado que sua administração não seja feita com produtos ricos nesses sais, como leite, pois podem diminuir sua eficiência no organismo.
As tetraciclinas são fármacos anfóteros, em sua molécula há sítios com diferentes constantes de dissociação, que podem ser observadas na Figura 3.3, e podem interferir diretamente na interação do analito com outros compostos presentes no meio.
Fonte: Adaptado de ChemSpider (2016) Figura 3.3: Variação da concentração das espécies da doxicilina conforme a variação do valor
A doxiciclina pode ser encontrada na forma de cloridrato (C22H24N2O8. HCl) e na
forma de hiclato (C22H24N2O8. HCl. ½ H2O. ½ C2H6O), sendo que esta última é a forma do
antimicrobiano após o processo de solvatação em meio alcoólico do cloridrato de doxiciclina. O resultado são duas moléculas de cloridrato ligadas a uma molécula de álcool. Uma vez administrado, essa ligação se rompe, liberando a porção necessária de DOX para absorção no organismo, diminuindo o processo de quelação do fármaco que acontece na presença de sais de cálcio e magnésio presentes no organismo, aumentando, consequentemente, sua eficácia.
A doxiciclina na forma de hiclato é melhor absorvida pelo organismo após a administração oral em comparação com outras formas de DOX e, até mesmo, outros fármacos da família das TC desenvolvidos anteriormente, além de possuir maior capacidade de ligação às proteínas plasmáticas, devido a sua lipossolubilidade, que garante a sua meia vida prolongada (15 a 22 horas) e, consequentemente, propriedades antimicrobianas melhores.
No Brasil, a doxiciclina é indicada para o tratamento de doenças respiratórias, entéricas e outras infecções de suínos e frangos de corte, causados pelos organismos sensíveis à DOX. Já na Europa, o comitê de medicamentos de uso veterinário fez um levantamento sobre o uso do hiclato de doxiciclina em alguns países membro da união, bem como as espécies alvo, conforme colocados na Tabela 3.3 (EUROPEAN MEDICINES AGENCY, 2010).
Tabela 3.3: Uso do hiclato de doxiciclina em países pertencentes à União Européia.
Estado Membro UE Espécie Alvo
Bélgica Bezerros, pré-ruminantes, suínos, aves de capoeira não poedeiras Bulgária Bezerros, suínos e aves de capoeira
Dinamarca Suínos
Grécia Galinhas (frangos), bezerro e suínos Hungria Bezerros, suínos e galinhas Lituânia Bezerros, suínos e aves de capoeira Países Baixos Frangos não produtores de ovos
Polônia Bezerros, galinhas e suínos Portugal Bovino (vitelos), suínos e aves Romênia Aves de capoeira não poedeiras,
bezerros e suínos
3.3 Rota e ocorrência no meio ambiente
Medicamentos de uso veterinário têm sido detectados em solos, águas superficiais e subterrâneas no mundo todo, mesmo que em baixas concentrações (KOLPIN et al., 2002).
Existem várias formas de entrada destes compostos no ambiente, mas segundo Boxall et al. (2003), o uso de fármacos veterinários na aquicultura e na criação intensiva de animais como bovinos, suínos e aves, representam a principal via de acesso destes contaminantes ao meio ambiente, podendo ocasionar alterações tanto no meio aquático quanto terrestre. Outra forma de contaminação, não tão expressiva, é a disposição irregular de medicamentos fora do prazo de validade ou inutilizados. As principais rotas de contaminação estão representadas na Figura 3.4.
Antimicrobiano de uso veterinário
Excreção via urina ou fezes
Aplicação do esterco no solo Lodo e/ou efluente de
esgoto
Lixiviação Escoamento Superficial Lixiviação
Água Subterrânea Água Superficial Influência em organismos aquáticos Influência em organismos terrestres Água Subterrânea
Fonte: Adaptado de Sarmah; Meyer; Boxall (2006) Figura 3.4: Possível rota de contaminação no meio ambiente por fármacos de uso
veterinário.
Uma vez administrado o fármaco ao animal, sua excreção se dá via urina e/ou fezes. Ao entrar em contato no solo, a lixiviação, o escoamento superficial e a erosão podem carregar esse composto (HIRSCH et al., 1999). Resíduos de tetraciclinas têm sido detectados em diversas amostras de solo, águas superficiais e efluentes de estações de tratamento de esgoto. Informação sobre a presença de alguns fármacos da família das tetraciclinas encontra-se na Tabela 3.4.
Tabela 3.4: Ocorrência da doxiciclina no ambiente.
Fármaco Matriz Local Concentração média
µg L-1 ou µg kg-1 Referência
Doxiciciclina
Afluente
China 5,4 x 10 -3 (JIA et al., 2009)
USA 10 (KARTHIKEYAN;
MEYER, 2006)
Efluente
China 4,1 x 10 -3 (JIA et al., 2009)
USA 10,9 (KARTHIKEYAN;
MEYER, 2006) Água Superficial China 2,3 x 10 -3 (JIA et al., 2009)
Lodo Espanha 317,48 (PAMREDDY et al.,
2013) Efluente Hospitalar Austrália 0,130 (WATKINSON et al., 2009) Afluente 0,020 Efluente 0,01
Solo China 13,8 (WEI et al., 2016)
Água Superficial Hong Kong 17,0 (DENG et al., 2016)
Na China, um dos maiores produtores de produtos animais do mundo, o uso predominantemente de fármacos da família das tetraciclinas é nas operações de produção de aves e suínos. A doxiciclina é utilizada preferencialmente na produção de gado, porém sua ocorrência é menor que de outras TC, por conta do seu alto custo em comparação com as demais tetraciclinas (WEI et al., 2016). Deng (2015) constatou que as zonas onde a doxiciclina foram detectadas são mais poluídas, sugerindo uma maior atividade humana.
Em contra partida, na Alemanha, resíduos de antibióticos do grupo das tetraciclinas foram detectados em poucas ou mesmo nenhuma das amostras de água analisadas, devido à forte adsorção que as tetraciclinas apresentam às partículas orgânicas e/ou minerais do solo/sedimento (REGITANO; LEAL, 2010).
3.4 Remoção de Contaminantes do ambiente: processos oxidativos
convencionais.
A oxidação convencional de poluentes baseia-se na mineralização do poluente por processos físicos, químicos ou biológicos, podendo-se destacar a incineração e o tratamento biológico.
Os processos químicos baseiam-se na oxidação dos contaminantes pela reação com oxidantes, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), cloro (Cl2) e dióxido de cloro (ClO2). Já faz
um certo tempo que fortes oxidantes são empregados para o tratamento e desinfecção de matrizes aquosas. Segundo relatos, o primeiro trabalho utilizando ozônio como desinfetante foi realizado em 1886 por De Meritens (POLI DE ALMEIDA et al., 2004). No entanto, na maioria dos casos, a utilização deste tipo de tratamento não promove a mineralização completa dos contaminantes a CO2 e H2O, havendo a formação de uma variedade de
produtos de degradação, como, ácidos orgânicos.
Os processos biológicos permitem o tratamento de grandes volumes, conseguindo diminuir o teor de matéria orgânica de forma satisfatória e os custos são relativamente baixos. No entanto, alguns compostos são recalcitrantes e podem, inclusive, ser tóxicos aos microrganismos. E os processos físicos podem ser decantação, flotação, filtração ou adsorção e são caracterizados pela transferência de fase do contaminante, sem que este seja de fato degradado (MELO et al., 2009).
3.5 Remoção de contaminantes do ambiente: processos oxidativos
avançados (POA)
Atualmente há uma vasta gama de tecnologias voltadas para o tratamento de matrizes ambientais disponíveis, dentre elas, os processos oxidativos avançados (POA) vêm se destacando. Os POA possuem a capacidade de gerar altas concentrações de radicais hidroxila (HO•), estão inseridos na de classe de forte oxidante, são capazes de mineralizar
completamente a maioria de compostos orgânicos em dióxido de carbono (CO2), água e
radicais livres, porém o HO• possuí maior eficiência da degradação de poluentes (SIEVERS,
2011).
Os processos oxidativos avançados têm demonstrado serem eficientes na remoção de medicamentos veterinários recalcitrantes presentes em efluentes aquosos, como tratamento terciário em estações de tratamento de esgoto (KIM; YAMASHITA; TANAKA, 2009; PALOMINOS et al., 2008).
Os POA podem ser classificados em processos heterogêneos, para aqueles que contam com a presença de catalisadores no meio, e processos homogêneos. Na Tabela 3.5 podem ser observados alguns dos principais processos:
Tabela 3.5: Principais processos oxidativos avançados.
Com Irradiação Sem Irradiação
Sistemas Homogêneos
O3/UV O3/H2O2
H2O2/UV O3/OH
-Feixe de elétrons H2O2/Fe
+2 (Fenton) Ultrassom (US) H2O2/US Eletro-Fenton Foto-Fenton Sistemas Heterogêneos TiO2/O2/UV TiO2/H2O2/UV
No Laboratório de Processos Oxidativos (LABPOX) da Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo (FEC – UNICAMP) da UNICAMP, diversos trabalhos utilizando processos oxidativos avançados já foram realizados para a degradação/remoção de contaminantes emergentes presentes em soluções aquosas. Por exemplo, Rodrigues-Silva (2013) avaliou a eficiência dos processos de fotoperoxidação, fotocatálise utilizando TiO2,
reagente de Fenton e foto-Fenton para a degradação de flumequina, um antimicrobiano da família das fluoroquinolonas, de matriz aquosa. Peres (2014) concluiu que UV/H2O2 é o
das fluoroquinolonas, quando comparado com os processos de fotocatálise utilizando TiO2 e
outros processos oxidativos convencionais. De Oliveira (2015) verificou alta eficiência dos processos de ozonização e fotoperoxidação para a degradação da lomefloxacina no meio aquoso. Caianelo et al. (2016), constatou a eficiência na degradação da gatifloxacina utilizando o processo de fotoperoxidação, atingindo uma remoção de 97% do fármaco.
3.5.1 UV/H
2O
2e Ozonização
Dentre todos os processos oxidativos avançados, pode-se destacar a fotoperoxidação ou peroxidação assistida por radiação ultravioleta (UV/H2O2) e a ozonização em meio básico.
No caso da fotoperoxidação, radicais hidroxila (HO•) são gerados quando dois
processos muito conhecidos são combinados: a fotólise e a peroxidação. Os radicais hidroxila se destacam dentre outros oxidantes visto a sua capacidade de promover desinfecção (PALEOLOGOU et al., 2007), remover cor (SOUTSAS et al., 2010) e principalmente de mineralizar compostos orgânicos recalcitrantes presentes em meio aquoso (KIM; YAMASHITA; TANAKA, 2009). Na Equação 1 é apresentado o mecanismo de geração de radicais hidroxila pelo processo UV/H2O2.
Equação 1
A degradação de compostos farmacêuticos por peroxidação, fotólise e pelo POA UV/H2O2 foi avaliada por Lopez et al. (2003), que verificaram a eficiência superior do POA,
registrando a degradação desses compostos em menos tempo do que quando submetidos somente à radiação (fotólise). Por outro lado, nenhuma modificação na concentração inicial dos compostos foi observada quando aplicado o processo peroxidação.
Os processos oxidativos avançados que envolvem a adição do peróxido de hidrogênio têm como objetivo avaliar a contribuição deste forte oxidante na degradação de composto orgânicos presentes em matrizes aquosas quando aliado com uma fonte de radiação UV e combinado com outros processos oxidativos.
Segundo Legrini, Oliveros, Braum (1993) o POA peroxidação assistida por radiação UV apresenta algumas vantagens quando comparado a outros processos físico-químicos convencionais de tratamento de água. Entre elas, pode-se citar a alta geração de radicais hidroxila pela fotólise do oxidante, baixo custo de operação e manutenção, alta solubilidade do peróxido de hidrogênio em água e sua fácil comercialização.
Kim, Yamashita e Tanaka (2009), investigaram a decomposição por fotólise direta e fotoperoxidação de uma série de fármacos detectados em efluente secundário de estação de tratamento de esgoto no Japão. Alguns fármacos da família das tetraciclinas se encontram nesse estudo como a tetraciclina, clortetraciclina e oxitetraciclina. Os autores verificaram a diminuição da concentração destes compostos para menos que o limite de detecção do método (6,18 µg L-1 para a clortetraciclina, 0,41 µg L-1 para a tetraciclina e
0,23 µg L-1 para a oxitetraciclina) durante o processo de fotólise em 5 minutos. Considerando
o processo combinado UV/H2O2 foi atingido mais de 90% de remoção da maioria dos
compostos estudados, incluindo os fármacos da família das tetraciclinas.
Outro forte oxidante, também utilizado no tratamento de água para reduzir cor e odor, na desinfecção, bem como para oxidar compostos recalcitrantes é o ozônio (PANTELIC
et al. 2013). O ozônio pode agir como oxidante de formas diferentes dependendo do pH do
meio. Em condições ácidas, a oxidação acontece direta e predominantemente via ozônio molecular. Em condições básicas, a geração de radicais hidroxila é favorecida e a forma indireta de oxidação é predominante, pois o ozônio se decompõe em radicais hidroxila (EPA, 1999), como pode-se observar nas Equações 2, 3 e 4. Isso significa que a ozonização em meio básico é considerada um POA.
Equação 2 Equação 3 Equação 4
Segundo EPA (1999), os radicais hidroxila se formam como um dos produtos intermediários e podem reagir diretamente com os compostos presentes na água. A
decomposição do ozônio em meio aquoso ocorre com os radicais produzidos como produtos intermediários da decomposição do ozônio, resultando na produção de 1,5 mol de radical hidroxila por mol de ozônio. O processo possui limitações devido à transferência de massa do ozônio da fase gasosa para a fase líquida, onde ocorre o ataque das moléculas orgânicas.
4 Métodos
4.1 Reagentes
Hiclato de doxiciclina (>98%, C22H24N2O8.HCl.0,5H2O.0,5 C2H6O, 512,94 g mol-1) foi
adquirido da Sigma-Aldrich, enquanto que peróxido de hidrogênio (30% m/m, H2O2) e ácido
sulfúrico concentrado (97%, H2SO4) da Synth. Acetonitrila CHROMASOL® grau HPLC (99,9%
ACN), ácido acético glacial (99,7% CH3COOH) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, hidróxido
de sódio (97%, NaOH) da Ecibra, metanol grau HPLC (CH3OH) da J.T. Baker, metavanadato de
amônio (99%, NH4VO3) da Honeywell Riedel-de Haën e permanganato de potássio (99,5%,
KMnO4) da Carlo Erba. A água ultrapura foi obtida do sistema de purificação Milli-Q da
Millipore. Os meios de cultura Mueller-Hinton Broth e Mueller-Hinton Agar foram adquiridos da Himidia (Mumbai, Índia). Cepas de Escherichia coli ATCC® 23716 foram adquiridas da ATCC (Manassas, Estados Unidos); cepas de Bacillus subtilis ATCC® 168 foram obtidas no CPQBA (Campinas, Brasil); cepas da bactéria marinha Vibrio fischeri, a solução diluente (2% em NaCl) e a solução de ajuste osmótico (22% em NaCl) foram adquiridas da Unwelt (Blumenau, Brasil), enquanto que a enzima catalase, obtida a partir do fígado bovino (pó liofilizado, 2-5x103 unidades mg-1 proteína), foi da Sigma Aldrich.
4.2 4.2- Preparo das soluções estoque e de trabalho
A solução estoque foi preparada dissolvendo o padrão analítico de doxiciclina em metanol filtrado, a uma concentração de 500 mg L-1, e armazenada sob temperatura de 4°C
em frasco âmbar.
A solução de trabalho foi preparada no momento de cada ensaio, a uma concentração de 500 μg L-1, por meio de diluição da solução estoque em água ultra pura,
4.3 Metodologia analítica
Foram utilizadas duas técnicas de identificação da doxiciclina em solução aquosa: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês “high performance liquid
chromatography”) com detecção por arranjo de diodos e espectrometria de massas
(SPE-UHPLC MS-MS) com SPE on-line. Após análise das condições ideais, o método foi validado de forma a estabelecer um padrão para a detecção e quantificação do fármaco. Somente após estes quesitos estabelecidos, foram iniciados os processos de degradação.
4.3.1 Cromatografia líquida de alta eficiência
Para detectar e quantificar a doxiciclina em soluções aquosas, durante a aplicação dos processos de degradação utilizando radiação UV e peróxido de hidrogênio, foi utilizada a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência. O equipamento era composto por uma bomba binária, modelo 1525, um injetor automático modelo 2707 e um detector DAD (do inglês “diode array detector”) modelo 2996, da marca Waters. O volume de amostra injetado foi de 10 μL. A separação do analito da fase móvel foi feita por uma coluna Zorbax XDB C18
(4,6 x 150 mm, 5 μm) da marca Agilent em um comprimento de onda de 355 nm. A aquisição de dados foi realizada pelo programa EmpowerTM3. O método cromatográfico foi avaliado
segundo os seguintes parâmetros analíticos: linearidade, intervalo linear, limite de detecção e limite de quantificação, segundo Collins et al. (2006).
4.3.2 Extração em fase sólida (SPE)
A extração em fase sólida (SPE, do inglês “solid phase extraction”) foi a técnica utilizada para concentrar a amostra, uma vez que a concentração do analito presente na solução podia ser muito baixa após os processos de degradação, abaixo do limite de quantificação/detecção do HPLC. Durante o processo de extração, um litro da solução percolava pelo recheio do cartucho, a uma vazão de 10 mL/min e o analito presente na
solução ficava retido no cartucho. Para recuperá-lo, fazia-se uma eluição com pequeno volume de solvente.
A eficiência deste processo foi avaliada em dois cartuchos: um com adsorvente de fase reversa Octadecil C18 (500 mg/6 mL) da marca Varian e outro com adsorvente
polimérico Oasis HLB (500mg/6 mL), da marca Waters. Foram avaliadas soluções de 500, 100 e 10 μg L-1 de doxiciclina preparadas em água deionizada em dois valores de pH: 3 e 7, uma
vez que o pH pode influenciar a eficiência da técnica de EFS, principalmente quando a molécula é ionizável (RODRIGUES-SILVA et al., 2013a). Para o ajuste do pH com ácido, foi utilizada uma solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 10% (v/v) e para o ajuste do valor de pH
próximo ao neutro foi utilizada uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,2 mol L-1. O
condicionamento do cartucho foi feito com 6 mL de metanol filtrado e posteriormente 6 mL de água deionizada. Após a extração, a eluição dos analitos do cartucho foi realizada com 4 mL de metanol filtrado. Dessa forma, o analito que estava presente em 1000 mL da amostra foi concentrado em apenas 4 mL de solvente, ou seja, foi concentrado 250 vezes. As amostras foram diluídas em metanol, injetadas no HPLC e a recuperação foi avaliada. Assim que foi determinado qual o cartucho que apresentou maior eficiência de recuperação do analito, novos testes com soluções contendo 500, 250, 100, 50, 25 e 10 μg L1 de doxiciclina
foram realizados.
4.3.3 Espectrometria de massas
O método utilizado para detectar e quantificar a doxiciclina durante a aplicação do processo de ozonização foi a espectroscopia de massas (SPE-UHPLC-MS/MS). Para tal, foi utilizado um cromatógrafo a líquido de ultraeficiência ACQUITY (Waters, EUA) acoplado a um espectrômetro de massas (MS/MS) triplo quadrupolo Xevo TQD (Waters, EUA), com ionização por eletronebulização (ESI). O sistema possuia um injetor automático e apresentava um sistema de extração em fase sólida (SPE) on-line, o qual consistia de um sistema de bombeamento quaternário (QSM, do inglês “quaternary solvent manager”) para carregamento do analito na coluna de SPE e bombeamento binário (BSM, do inglês “binary
solvent manager “) para a eluíção do analito e carregamento para a coluna cromatográfica. A
Foram definidas as melhores condições de fragmentação da molécula da doxiciclina, como energia de colisão (v) e voltagem do cone e, com isso, foram obtidos os íons de quantificação e identificação utilizados para monitoramento da doxiciclina no modo SRM
(“selected reaction monitoring “).
4.4 Ensaios de degradação
4.4.1 Reator fotoquímico em batelada
Os ensaios de degradação utilizando radiação UV-C e peróxido de hidrogênio foram realizados em um reator fotoquímico composto por duas partes. A parte interna era composta por um tubo de quartzo de 2,5 cm de diâmetro e 35 cm de comprimento. Dentro desse tubo fechado em uma das extremidades posicionou-se uma lâmpada germicida ultravioleta de 16 W (λmax = 254 nm). O fluxo de fótons emitidos pela lâmpada foi medido
por Caianelo et al. (2016) utilizando actinometria química, e apresentou um valor de 130 J s-1.
A parte externa do reator, era composta por um tubo de borossilicato com parede dupla contendo uma entrada e saída para recirculação de água no sistema, permitindo o controle da temperatura quando a lâmpada UV estava ligada. O volume útil deste reator era de 1 L e o mesmo está apresentado na Figura 4.1.
10 cm 7 cm 2,5 cm 7 cm 10 cm 38 c m 40 c m
Fonte: Arquivo pessoal. Figura 4.1: (a) Sistema utilizado na degradação da doxiciclina pelos processos UV, H2O2 e
UV/H2O2 contendo a bomba peristáltica e o agitador magnético e (b) representação das
dimensões do reator.
4.4.2 Reator para ensaios de ozonização
Os ensaios de ozonização foram realizados em um reator de formato tubular com 50 cm de altura e 7 cm de diâmetro, operado em batelada. Um difusor de vidro sinterizado era responsável pela difusão do ozônio no reator. O ozônio foi gerado pelo gerador O3R (Philozon). O gerador foi alimentado com ar ambiente, pois o mesmo possuía uma unidade de concentração de oxigênio. A concentração de ozônio na fase gasosa foi medida na entrada e saída da coluna de contato conforme metodologia descrita por APHA (2012). O ozônio gerado e o gás de saída do reator de contato foram borbulhados em 200 mL de solução de iodeto de potássio (KI) 2% (m/v) contida em um reator de vidro borossilicato, com volume útil de aproximadamente 1900 mL, permitindo determinar a quantidade de ozônio produzida e a quantidade que reagiu com a solução, ou seja, a quantidade de ozônio que foi consumida durante a reação de degradação da DOX. Os ensaios de ozonização foram realizados utilizando 1 L da solução de DOX (500 µg L-1). O sistema de ozonização está
representado na Figura 4.2.
(a)
(b)
Transferência de O3
Figura 4.2: Sistema de ozonização utilizado para a degradação da doxiciclina, onde (a)
representa o reator de contato contendo 1 L da solução de DOX e (b) o reator contendo 200 mL da solução de iodeto de potássio (KI).
O ozônio pode ser gerado de várias maneiras diferentes, mas o método de descarga corona, que também é conhecido como descarga elétrica silenciosa, é o mais usual e o que foi empregado neste trabalho. Este método consiste na passagem de um gás contendo oxigênio entre dois eletrodos separados por um campo descarregado. Uma voltagem é aplicada aos eletrodos gerando um fluxo de elétrons no campo. Esses elétrons fornecem energia suficiente para dissociação das moléculas de oxigênio, formando o ozônio (EPA, 1999). Na Figura 4.3 é mostrado o esquema da geração do ozônio pelo método de descarga corona.
Figura 4.3: Representação do método de descarga corona para produção de ozônio.
4.5 Condições experimentais para os processos de degradação UV, H
2O
2,
UV/H
2O
2e ozonização
4.5.1 Condições experimentais usadas nos processos UV, H2O2 e UV/H2O2
Os processos de fotólise, peroxidação (H2O2) e peroxidação assistida por radiação
ultravioleta (UV/H2O2) foram realizados no reator descrito no item 4.4.1, em pH original da
solução de doxiciclina, que era em torno de 5,4. Os ensaios foram realizados em batelada e o tempo de reação variou de 0 a 20 minutos.
O peróxido de hidrogênio utilizado nas degradações foi padronizado, para confirmar a concentração informada pelo fabricante e assegurar que não ocorreu sua decomposição. A quantidade utilizada nas degradações obedeceu a estequiometria ideal da reação, para mineralização do analito, conforme apresentada na Equação 5.
𝐶22𝐻24𝑁2𝑂8 + 53 𝐻2𝑂2 ↔22 𝐶𝑂2 + 64 𝐻2𝑂 + 2 𝐻𝑁𝑂3 Equação 5
Seguindo a estequiometria da reação, são necessários 53 mol de peróxido de hidrogênio para reagir com 1 mol de doxiciclina para mineralização da molécula. A partir da
concentração de 500 μg L-1 da solução de trabalho, constatou-se que havia 1,125x10-3 mmol
de doxiciclina presente na solução; logo, foram necessários 6,30x10-2 mmol (2,14 mg) de
peróxido para reagir estequiometricamente com 1,125x10-3 mmol de doxiciclina. Para não
correr riscos de adicionar uma quantidade menor que a necessária para a reação ser completa, adicionou-se uma quantidade de H2O2 maior do que a mínima necessária,
conforme Tabela 4.1. Os cálculos da concentração de peróxido foram realizados levando-se em consideração o metanol presente no meio.
Tabela 4.1: Proporções entre a doxiciclina e o peróxido de hidrogênio que foram testadas
nos ensaios de peroxidação e peroxidação assistida por radiação ultravioleta.
Proporção DOX: H2O2 Relação estequiométrica (mol:mol) Concentração H2O2 (mmol L-1) Concentração H2O2 (mg L-1) 10x 1:530 0,63 21,42 20x 1:1060 1,26 42,85 40x 1:2120 2,52 85,70 80x 1:4240 5,04 171,41 110x 1:5830 6,93 235,68
4.5.2 Condições experimentais para o processo de ozonização
Antes de iniciar os ensaios de degradação, foi preciso determinar experimentalmente a quantidade de ozônio produzida (PO3) pelo equipamento em g O3 h-1, utilizando
titulometria, segundo APHA (2012). O cálculo utilizado para obter a concentração do ozônio em mg min-1 na fase gasosa está descrito na Equação 6.
Sendo, A é o volume (em mL) gasto de titulante; N é a concentração molar da solução padrão de tiossulfato de sódio (em mol L-1) e t é o tempo de borbulhamento do gás O
3 (em
min).
Os ensaios foram realizados em três diferentes valores de pH: 3, 7 e 11. Dependendo do pH, diferentes oxidantes podem estar atuando. A degradação do fármaco em meio ácido acontece majoritariamente via ozônio molecular, em meio básico majoritariamente via radical hidroxila e no pH próximo ao neutro ambos oxidantes podem estar agindo na degradação. Variou-se também o tempo de contato do ozônio com a solução de DOX. Com isso, foi possível calcular a dose de ozônio (mg L-1) em diferentes tempos de ozonização,
conforme Equação 7.
Equação 7
Sendo que, é a concentração (mg min-1) de ozônio obtida pela Equação 04, t é
tempo de contato do ozônio na solução (min) e V é o volume da solução (L).
4.5.3 Quantificação do peróxido de hidrogênio residual nas amostras
submetidas aos processos de degradação
Utilizou-se um método analítico colorimétrico segundo Nogueira; Oliveira; Paterlini, (2005) para acompanhar o consumo de peróxido de hidrogênio nos ensaios de degradação. O método baseia-se na reação de óxido-redução entre uma solução do íon metavanadato, que possui coloração amarela e o H2O2 presente na solução, resultando em solução de cor
vermelha, devido à formação do cátion peroxivanádio, que apresenta máximo de absorbância em 450 nm, podendo ser determinado por espectrofotometria UV-visível.
A partir da quantificação do peróxido residual é possível determinar a quantidade de peróxido consumida para degradar o analito e verificar se ele está em excesso ou não no meio, o que pode interferir na reação, acarretando em reações competitivas. A quantificação também é importante, uma vez que resíduos de peróxido de hidrogênio nas
soluções submetidas aos processos de degradação podem interferir nos resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana e de toxicidade.
4.5.4 Destruição do peróxido de hidrogênio residual utilizando a enzima
catalase, proveniente de fígado bovino
Para remover o peróxido de hidrogênio residual das amostras, a fim de evitar interferências nos ensaios microbiológicos, foi utilizada a enzima catalase proveniente de fígado de bovino, a qual consome o H2O2 segundo a reação apresentada na Equação 8.
2 Equação 8
Considerando as informações técnicas fornecidas pelo fabricante: em 1 mg da catalase em pó há em torno de 2,0 a 5,0 x103 unidades de enzima, sendo que 1 unidade é
capaz de decompor 10-6 mol de peróxido de hidrogênio por minuto em pH 7, foi possível
preparar uma solução estoque na concentração correta para consumir todo o peróxido remanescente presente na solução. Portanto, foi preparada uma solução de catalase em tampão fosfato 50 mmol L-1 em pH 7 (devido a melhor solubilidade da enzima nesse meio)
de concentração 2,77 g L-1.
Foram retiradas alíquotas em linha das soluções submetidas aos processos de degradação e foi adicionado 1 mL da solução estoque de catalase, a fim de consumir o peróxido residual da amostra e não ocorrer interferências nos ensaios de toxicidade aguda. Para confirmar o total consumo do peróxido no meio, foi realizado um teste baseado no método descrito por Nogueira, Oliveira e Paterlini (2005).
4.6 Avaliação da atividade antimicrobiana e toxicidade aguda
É importante conhecer o comportamento antimicrobiano da amostra submetida aos processos de degradação, além de sua toxicidade aguda. Através desses aspectos, pode-se
avaliar se os processos de degradação foram efetivos ou não, uma vez que não é desejável que após a degradação do fármaco, a atividade antimicrobiana da solução ainda seja alta ou que sua toxicidade seja maior que a inicial.
4.6.1 Atividade antimicrobiana (AAM) utilizando as bactérias Escherichia coli
e Bacillus subtillis
O teste de atividade antimicrobiana (AAM) foi realizado segundo Caianelo et al. (2016), com adaptações. Nos ensaios, foram utilizadas as bactérias Escherichia coli K12 (ATCC 23716) e Bacillus subtillis (ATCC 168) como organismos teste. Estas bactérias foram cultivadas em meios líquidos e sólidos. Para isso, foi utilizado meio de cultura Mueller-Hinton-agar (meio sólido) e caldo de cultura Mueller-Hinton Broth (meio líquido), esterilizados em autoclave a 1 atm e temperatura de 20 0C durante 20 minutos. Também foi
preparado o padrão Mc Farland, utilizado como referência para ajustar o número de unidades formadoras de colônias da suspensão bacteriana, assegurando que na faixa de absorbância de 0,08 a 0,10 a 620 nm há 108 UFC mL-1.
Para a realização do ensaio foram utilizadas amostras da colônia de E. coli K12 (ATCC 23716) e Bacillus subtillis (ATCC 168) congeladas em tubo criogênico com Mueller-Hinton-glicerol (60:40, v/v), as quais foram transferidas para um frasco de cultura de célula T de 25 mL, contendo 10 mL de caldo de cultura Mueller-Hinton Broth. Esses frascos foram incubados em um shaker por 24 h na temperatura de 37 ˚C.
Era desejável que os ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana das soluções de DOX submetidas aos processos de degradação fossem realizados com uma população de bactérias E. coli e B. subtillis de 1,0x106 UFC mL-1. Para atingir essa densidade, foi realizado o
repique das bactérias em meio sólido e líquido durante quatro dias antes do ensaio, sendo a última replicação do cultivo feita 24 horas antes do início do ensaio. Instantes antes da realização do ensaio, foi calculada a razão da absorbância da suspensão de bactérias pela absorbância do padrão Mc Farland para saber qual seria o fator de diluição da suspensão para que ela apresentasse uma população de 108 UFC mL-1. Uma vez diluída a suspensão, foi
qual deveria apresentar valor próximo de 1. A partir deste valor, a suspensão foi diluída 100 vezes em meio líquido para atingir a população final de 106 UFC mL-1.
As soluções de doxiciclina submetidas aos processos de degradação foram concentradas por extração em fase sólida (SPE) e diluídas 50 vezes em solução tamponada de fosfato de potássio 1 mmol L-1 a pH 8. A faixa da diluição serial adotada neste ensaio foi
determinada a partir da curva dose resposta, a qual foi preparada e testada previamente para determinar a necessidade de diluição das amostras.
Nos ensaios foram utilizadas placas de 96 poços, e nessas foram adicionados 100 µL de solução tampão fosfato de potássio 1 mmol L-1 a pH 8,0 em todos os poços, exceto no
primeiro poço de cada fileira. Nestes, foram adicionados 300 µL da solução submetida ao processo de degradação diluída 50 vezes em tampão fosfato, nos diferentes tempos de ensaio. Em seguida, foi realizada uma diluição serial da amostra, apresentada na Figura 4.4, transferindo e homogeneizando 200 µL da solução desde o primeiro poço, de um poço para o outro, até o penúltimo poço, permanecendo assim o último (24o poço) somente com
tampão fosfato. Por último, foram adicionados 100 µL da suspensão da cultura da bactéria,
E. coli ou B. subtillis, em todos os poços. Deste modo, foi possível avaliar o comportamento
da bactéria em um meio onde há maior concentração da solução degradada até sua concentração zero. A placa foi tampada e colocada em um shaker com temperatura controlada em 37˚C por 8 horas.
Figura 4.4: Representação da diluição serial feita nos ensaios de AAM.
Para a análise de dados, foram obtidas as absorbâncias de cada poço, em comprimento de onda de 620 nm, e estas foram convertidas em inibição do crescimento bacteriano (I), de acordo com a Equação 9.
Equação 9
Sendo, Acontrole correspondente a absorbância do último poço, que continha o tampão
