UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
BIANCA CHEREGATTI LONGO
SÍNTESE DE SCAFFOLDS DE VIDROS BIOATIVOS UTILIZANDO
NANOCRISTAIS DE CELULOSE COMO TEMPLATE
CAMPINAS 2018
BIANCA CHEREGATTI LONGO
SÍNTESE DE SCAFFOLDS DE VIDROS BIOATIVOS UTILIZANDO
NANOCRISTAIS DE CELULOSE COMO TEMPLATE
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Físico-Química.
Orientador: Prof. Dr. Celso Aparecido Bertran Coorientadora: Profª. Drª. Maria do Carmo Gonçalves
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA BIANCA CHEREGATTI LONGO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. CELSO APARECIDO BERTRAN.
CAMPINAS 2018
Banca Examinadora
Prof. Dr. Celso Aparecido Bertran (Orientador)
Profª. Drª. Andrea Cecilia Dorión Rodas (UFABC)
Drª. Juliana da Silva Bernardes (LNNano-CNPEM)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pela aluna BIANCA
CHEREGATTI LONGO, aprovada pela Comissão Julgadora em04 de abril de 2018.
“Cada pessoa deve trabalhar para o seu aperfeiçoamento e, ao mesmo tempo, participar da responsabilidade coletiva por toda a humanidade” (Marie Curie)
Dedico esta dissertação aos meus pais,
Agradecimentos
Primeiramente, a Deus por todas as conquistas.
Aos meus pais, Marcos e Sandra, e a minha irmã Bruna, por estarem sempre ao meu lado, acreditarem no meu potencial e me apoiarem durante todos esses anos de estudo e dedicação. Ao meu namorado, Andrigo, por ter muita paciência e compreensão comigo durante o desenvolvimento deste projeto e por sempre me apoiar e me acompanhar nas decisõesdifíceis.
Ao Professor Dr. Celso Aparecido Bertran, por ter me recebido com muito carinho e atenção ao seu grupo. Além de toda paciência e conhecimento compartilhado comigo durante a execução deste projeto.
À Professora Drª. Maria do Carmo Gonçalves, por terme acolhido com carinho e atenção no seu grupo de pesquisa.
Aos colegas do grupo Functional Materials and Interfaces Laboratory (FMILab), Fátima, João, Davi, Guilherme, Paula, Bruno, Carina Vitor e Beatriz pelas ótimas conversas, discussões e apoio científico. Agradeço, especialmente, a Mariana pelas excelentes sugestões que contribuíram muito para realização deste trabalho. E a Aline e a Evellyn, pela ajuda na realização de diversas tarefas. Aos colegas do grupo da Profª. Maria do Carmo, Daniela, Luiz, Cíntia e Coni, pela ajuda com uso do liofilizador e ultrassom de ponteira e pelo conhecimento científico compartilhado. Á colega Lia, pela ajuda e treinamento no uso da centrífuga analítica Lumisizer. Às amigas: Amanda, Flávia Elisa, Jaqueline, Júlia e Flávia Causs, pela amizade durante todos esses anos de Universidade e fora dela.
Ao Hugo Loureiro, pela ajuda e treinamento nos microscópios utilizados por mim. Ao Instituto de Química e à Unicamp pela oportunidade e disponibilidade de recursos e infraestrutura que possibilitaram a realização deste trabalho.
Aos técnicos do Instituto de Química, pelas análises realizadas durante o desenvolvimento deste projeto.
Resumo
Para alcançar o objetivo principal desta dissertação: síntese de scaffolds de vidro bioativo pela cópia de estruturas porosas formadas pela auto-organização denanocristais de celulose (CNC), ela foi realizada em duas etapas.
Na primeira etapa foi estudada a síntese de estruturas porosas formadas exclusivamente por sílica utilizando CNC como template, cujas características morfológicas foram semelhantes às desejáveis para os scaffolds de vidro bioativo. Na segunda etapa, a metodologia para obtenção de estruturas porosas de sílica foi modificada para permitir a incorporação de íons cálcio, fosfato e sódio na rede da sílica formando scaffolds dos vidros bioativos 58S ou 45S5.
As estruturas porosas de sílica, obtidas na primeira etapa deste trabalho, resultaram do processo de auto-organização dos nanocristais de celulose associado à cópia destas estruturas por nanopartículas de sílica obtidas pelo método de Stöber. A auto-organização dos CNC foi influenciada por diversos parâmetros, tais como, razão nanopartículas de sílica/CNC, modificação da carga superficial dos CNC com CTAB, força “g” de centrifugação, lavagens durante a centrifugação e método de secagem.Os resultados permitiram concluir que o processo de auto-organização dos CNC envolve dois mecanismos: o primeiro consiste na formação das paredes dos poros, devido à formação de fases nemática quirais pela auto-organização dos CNC, e o segundo consiste na floculação destes agregados de CNC, resultando em estruturas macroscópicas que foram copiadas pelas nanopartículas de sílica.
Na segunda etapa do trabalho, o método de síntese desenvolvido na primeira etapa, foi modificado para obtenção dos scaffolds de vidros bioativos através da inserção dos íons cálcio,fosfato e sódio na rede da sílica. Foram sintetizados scaffolds com composições similaresaos dos vidros bioativos 58S e 45S5, sendo que o último apresentou melhor resistência mecânica e manteve sua estruturaquando imerso em DMEM (meio de cultura para células).
Abstract
To reach the main aim of this work which was the synthesis of bioactive glass scaffolds by copying porous structures formed by the self-assembling of cellulose nanocrystals (CNC), this work was divided in two parts.
In the first partwas studied the synthesis of porous structures formed exclusively by silica using CNC as a template, whose morphological characteristics were similar to those desired for bioactive glass scaffolds. In the second part, the methodology to obtain silica porous structures was modified to permit the incorporation of calcium, phosphate and sodium ions in a silica network forming 58S or 45S5 bioactive glass scaffolds.
The preparation of a silica porous structure was carried out by a CNC self-assembly process associated with the copy of this organized structure by the silica nanoparticles. These were obtained using the Stöber method. The CNC self-assembly was affected by several parameters, such as: silica nanoparticles/CNC ratio, CNC surface charge modification with CTAB, centrifugal force “g”, washing during centrifugation and drying. The results showed that the CNC self-assembly process involves two mechanisms: the first one consists of pore wall formation by means of CNC chiral nematic phases, and the second consists of the flocculation of CNC aggregates forming macroscopic structures, which were copied by silica nanoparticles.
In the second part of this work, the developed and optimized method in the first part was modified to produce bioactive glass scaffolds through the insertion of calcium, sodium and phosphate ions in the silica network. Scaffolds with similar 58S and 45S5 bioactive glass compositions were synthetized, and the latter presented better mechanical resistance and maintained its structure when immersed in DMEM (medium suitable for cell growth).
Lista de Ilustrações
Figura 1. Representação das transformações químicas e biológicas na superfície
dos vidros bioativos quando entram em contato com os fluidos corpóreos. Adaptado
de Lopes J.H. [6]. ... 23
Figura 2.Representação esquemática da rede da sílica com os íons nitrato, cálcio, fosfato e sódio que representam o precursor do vidro bioativo obtido por sol-gel. .... 25
Figura 3. Esquema representativo da produção de nanocristais de celulose pela hidrólise com ácido sulfúrico. Adaptada de Geise et al. []. ... 27
Figura 4. Esquema representativo da formação da fase nemática quiral em formato helicoidal pelos nanocristais de celulose. ... 28
Figura 5. Esquema representativo da formação de estruturas porosas de sílica. Os bastões verdes são os CNC e as esferas cinza são as nanopartículas de sílica. ... 30
Figura 6. Fluxograma das etapas da síntese de estruturas porosas de sílica utilizando CNC como template. ... 34
Figura 7. Representação da geometria cilíndrica dos nanocristais de celulose. ... 35
Figura 8. Micrografia eletrônica de transmissão dos nanocristais de celulose. ... 36
Figura 9. Fotografia do congelamento vertical das dispersões CNC/sílica. ... 39
Figura 10. Estimativa do comportamento quanto ao tamanho e ao potencial zeta das partículas das dispersões de CNC, CNC + TEOS e TEOS obtidas durante a titulação com CTAB. ... 43
Figura 11. Micrografias de SEM da estrutura obtida com 70 µL de TEOS e CNC como template, em diversas ampliações. ... 44
Figura 12.Micrografias de SEM da estrutura obtida com 200 µLde TEOS e CNC como template, em diversas ampliações. ... 45
Figura 13. Imagem de SEM das esferas de sílica de Stöber com diâmetro de 300 nm. ... 46
Figura 14.Imagens de SEMdas estruturas de sílica utilizando esferas de 300 nm (8,2 mL de TEOS) e CNC como template, em diferentes ampliações. ... 47
Figura 15. Fotografias do tubo falcon antes (a) e após (b) a centrifugação a 338 g. 48 Figura 16. Imagens SEM em diferentes ampliaçõesapós a calcinação das dispersões centrifugadas a 1613 g (a) e 338 g (b). ... 49
Figura 17. Imagens de SEM das amostras congeladas verticalmente por sistema
dip-coating (a e b) e por adição instantânea no N2 líquido (c e d), em diversas
ampliações. ... 50
Figura 18. Imagens de SEM, em diferentes ampliações, da dispersão CNC/sílica de
Stöber seca em banho de óleo de silicone. ... 51
Figura 19.Fotografias das amostras sintetizadas sem CNC (a) e com CNC (b) após
a calcinação. ... 52
Figura 20. Imagens de SEM das amostras obtidas sem o uso do template (a e b) e
das estruturas obtidas utilizando CNC (c e d), em diferentes ampliações. ... 52
Figura 21.Espectros ATR-IR da amostra de nanocristais de celulose seco em estufa
e da amostra de sílica/CNC antes e após calcinação. ... 53
Figura 22. Imagens SEM do material preparado pela dispersão sílica/CNC antes da
calcinação, em diversas ampliações. ... 54
Figura 23.Imagens SEM do material preparado pela dispersão sílica/CNC após
calcinação, em diversas ampliações. ... 55
Figura 24.Esquema representativo da formação da parede dos poros das estruturas
porosas de sílica utilizando nanocristais de celulose como template. Os bastões verdes são os nanocristais de celulose e as esferas azuis são as nanopartículas de sílica. ... 56
Figura 25. Esquema representativo do funcionamento da centrífuga Lumisizer. ... 57 Figura 26. Perfis de transmitância da dispersão CNC/sílica de Stöber após termino
da reação e remoção do etanol (Amostra 1). ... 58
Figura 27. Perfis de transmitância após 3 min de análise da dispersão CNC/sílica de
Stöber após reação e remoção do etanol (Amostra 1). ... 59
Figura 28.Perfisde transmitância após 18 min de análise da dispersão CNC/sílica de
Stöber após reação e remoção do etanol (Amostra 1). ... 60
Figura 29. Perfis de transmitância após 2h de análise da dispersão CNC/sílica de
Stöber após reação e remoção do etanol (Amostra 1). ... 60
Figura 30. Curva de estabilidade da dispersão CNC/sílica de Stöber após termino da
reação e remoção do etanol (Amostra 1). ... 61
Figura 31. Fotos da Amostra 1 antes (a) e depois (b) da centrifugação no LUM. .... 62 Figura 32. Distribuição do tamanho de partículas da dispersão CNC/sílica de Stöber
Figura 33. Perfis de transmitância da dispersão CNC/sílica após 2h de centrifugação
e redispersão em água deionizada (amostra 2). ... 64
Figura 34. Perfis de transmitância após 3 min de análise da dispersão CNC/sílica
redispersa em água deionizada (Amostra 2). ... 65
Figura 35.Perfis de transmitância após 18 min de análise da dispersão CNC/sílica
redispersa em água deionizada (Amostra 2). ... 65
Figura 36.Perfis de transmitância após 2h de análise da dispersão
CNC/sílicaredispersa em água deionizada (amostra 2). ... 66
Figura 37. Curva de estabilidade da dispersão CNC/sílica após 2h de centrifugação
e redispersão em água deionizada (Amostra 2). ... 67
Figura 38. Fotos da Amostra 2 antes (a) e depois (b) da centrifugação. ... 67 Figura 39. Curva de distribuição de tamanho de partículas da dispersão CNC/sílica
após 2h de centrifugação e redispersão em água deionizada (amostra 2). ... 68
Figura 40. Perfis de transmitância da amostra liofilizada redispersa manualmente em
água deionizada (Amostra Liofilizada). ... 69
Figura 41. Perfis de transmitância da amostra liofilizada redispersa em água
deionizada com uso de ultrassom (Amostra Ultrassom). ... 70
Figura 42. Curva de estabilidade das amostras liofilizadas redispersa manualmente
(liofilizada) e redispersa em ultrassom (ultrassom). ... 71
Figura 43. Curvas de distribuição de tamanho de partículas das amostras liofilizadas
redispersa manualmente (liofilizada) e redispersa em ultrassom (ultrassom). ... 72
Figura 44. Fluxograma das etapas realizadas na síntese dos scaffolds de vidros
bioativos 58S e 45S5 uitlizando CNC como template. ... 75
Figura 45. Imagens SEM em diversas ampliações dos scaffolds de vidro 58S
sintetizados pelo método A após a calcinação. ... 82
Figura 46.Imagens SEM em diversas ampliações dos scaffolds de vidro 58S
sintetizados pelo método B após a calcinação. ... 83
Figura 47. Gráfico de barras das composições esperada, obtida e corrigida do vidro
58S preparado pelo método B... 85
Figura 48. Espectro ATR-IR do vidro 58S sintetizado pelo método B. ... 86 Figura 49. Fotografia da estrutura física do scaffoldde vidro bioativo 58S após24 h
deimersão no DMEM. ... 86
Figura 50. Fotografias das amostras de vidro 58S calcinadas a 750 ºC e 850 ºC
Figura 51. Imagens SEM em diferentes ampliações do vidro 58S calcinado a 750 ºC.
... 88
Figura 52. Imagens SEM em diferentes ampliações do vidro 58S calcinado a 850 ºC. ... 89
Figura 53.Difratograma dos vidros 58S calcinadosa 600 ºC, 750 ºC e 850 ºC. ... 90
Figura 54. Imagens SEM em diversas ampliações do vidro 45S5 após calcinação. 92 Figura 55. Foto do scaffold de vidro 45S5 após calcinação. ... 92
Figura 56. Gráfico de barras das composições esperada, obtida e corrigida do vidro 45S5. ... 93
Figura 57. Imagens SEM em diversas ampliações do vidro 45S5 preparado com uma concentração 6 vezes maior de NaNO3. ... 94
Figura 58. Espectro ATR-IR do vidro 45S5 após a calcinação. ... 95
Figura 59. Difratograma do vidro 45S5 após calcinação. ... 96
Figura 60. Curvas de TGA do vidro 45S5 após a calcinação. ... 96
Figura 61. Curva de TGA dos nanocristais de celulose seco em estufa a 70 ºC por 24 h. ... 97
Figura 62. Foto do vidro 45S5 após 24 h de imersão no DMEM. ... 98
Figura 63.Cinética de lixiviação dos íons Si, Ca2+, Na e P dos vidros 45S5 determinada por ICP-OES... 99
Lista de Tabelas
Tabela 1.Valores do volume de TEOS calculados para os diferentes diâmetros
previstos das esferas de sílica e das correspondentes área total e massa de nanocristais de celulose. ... 37
Tabela 2. Centrífugas com seus respectivos raios, velocidade de rotação e
força “g” ... 38
Tabela 3. Massa das amostras de vidro 45S5 utilizadas na lixiviação ... 78 Tabela 4. Composição em mol dos vidros bioativos 58S sintetizados pelos métodos
A e B ... 84
Tabela 5. Composições em mol dos vidros 45S5 ... 93 Tabela 6. Valores de concentração máxima esperada para elemento durante a
Lista de Abreviaturas
ATR-IR:Espectroscopia no infravermelho acoplada com acessório de refletância total atenuada
CNC: nanocristais de celulose, do inglês cellulose nanocrystals
CTAB: brometo de hexadeciltrimetil amônio, do inglês hexadecyltrimethylammonium
bromide
DLS: Espalhamento Dinâmico de Luz (Dynamic Light Scattering) DMEM:Dulbecco’s modified Eagle’s médium
DRX: Difração de Raios X FRX: Fluorescência de Raios X HCA: Hidroxiapatita carbonatada
ICP-OES:Espectrometria de emissão óptica por plasma acoplado(Inductively
Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry)
SEM: Microscopia Eletrônica de Varredura(Scanning Electron Microscopy) STEP:Space and Time Resolved
Tc:Temperatura de Cristalização
TEP: Trietil fosfato
TEOS: Tetraetilortosilicato
TGA: Análise Termogravimétrica (Thermogravimetric Analysis) Tg:Temperatura de transição vítrea
Sumário
1 Prefácio ... 20 2 Introdução... 21 2.1 Vidros bioativos ... 21 2.2 Método Sol-gel ... 24 2.3 Nanocristais de celulose ... 262.4 Obtenção de estruturas porosas de sílica ... 29
3 Objetivos ... 32
3.1 Objetivo geral ... 32
3.2 Objetivos específicos ... 32
CAPÍTULO I: SÍNTESE DE ESTRTUTURAS POROSAS DE SÍLICA UTILIZANDO NANOCRISTAIS DE CELULOSE COMO TEMPLATE ... 33
4 Procedimento experimental ... 34
4.1 Materiais ... 34
4.2 Modificação da carga superficial dos nanocristais de celulose com o brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) ... 34
4.3 Cálculo da área superficial dos nanocristais de celulose e da quantidade de precursor TEOS ... 35
4.4 Síntese das estruturas porosas de sílica ... 37
4.4.1 Síntese de dispersões de CNC/sílica de Stöber ... 37
4.4.2 Remoção do solvente etanol ... 38
4.4.3 Centrifugação das dispersões CNC/sílica de Stöber ... 38
4.4.4 Lavagem das dispersões centrifugadas ... 39
4.4.5 Congelamento em N2 líquido das dispersões após a centrifugação ... 39
4.4.6 Liofilização das dispersões após o congelamento. ... 40
4.4.7 Calcinação ... 40
4.5 Caracterização das estruturas porosas de sílica ... 40
4.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura ... 40
4.5.3 Espectroscopia Vibracional de Infravermelho ... 40
4.5.4 Centrífuga analítica Lumisizer ... 40
5 Resultados e Discussão ... 42
5.1 Modificação da carga superficial dos nanocristais de celulose com o brometo de hexadeciltrimetil amônio ... 42
5.2 Cálculo da área superficial de CNC e da quantidade de TEOS ... 44
5.3 Estudos dos parâmetros que contribuem para formação de estruturas porosas de sílica utilizando CNC como template ... 48
5.3.1 Centrifugação das dispersões CNC/sílica de Stöber ... 48
5.3.2 Lavagem com água das dispersões entre as etapas de centrifugação . 49 5.3.3 Congelamento em N2 líquido das dispersões após a centrifugação ... 50
5.4 Comparação entre as estruturas formadas utilizando CNC com as estruturas obtidas sem o uso do template ... 51
5.5 Caracterização das amostras por Espectroscopia Vibracional de Infravermelho ... 53
5.6 Estudo para entendimento da formação das estruturas porosas de sílica utilizando CNC como template ... 54
5.7 Análise da formação das estruturas porosas de sílica com a centrífuga analítica Lumisizer ... 56
5.7.1 Análise da dispersão CNC/sílica durante a primeira etapa de centrifugação ... 57
5.7.2 Análise da dispersão CNC/sílica durante a segunda etapa de centrifugação ... 63
5.7.3 Análise da amostra CNC/sílica após a liofilização ... 68
5.7.4 Análise dos resultados obtidos na análise com a centrífuga analítica Lumisizer e por Microscopia Eletrônica de Varredura ... 72
CAPÍTULO II: SÍNTESE DE SCAFFOLDS DE VIDROS BIOATIVOS UTILIZANDO NANOCRISTAIS DE CELULOSE COMO TEMPLATE ... 74
6 Procedimento experimental ... 75
6.1 Materiais ... 75
6.2 Síntese dos scaffolds de vidros bioativos ... 75
6.2.1 Síntese das dispersões CNC/vidro ... 75
6.2.2 Remoção do etanol ... 76
6.2.3 Centrifugação das dispersões ... 76
6.2.4 Lavagem das dispersões entre as etapas de centrifugação ... 76
6.2.5 Congelamento vertical em N2 líquido ... 77
6.2.6 Liofilização ... 77
6.2.7 Calcinação ... 77
6.2.8 Lixiviação ... 78
6.3 Caracterização dos scaffolds de vidros bioativos ... 78
6.3.1 Microscopia Eletrônica de Varredura ... 78
6.3.2 Espectroscopia Vibracional de Infravermelho ... 78
6.3.3 Difração de Raios-X ... 79
6.3.4 Fluorescência de Raios-X ... 79
6.3.5 Análise Termogravimétrica ... 79
6.3.6 Espectrometria de emissão óptica por plasma acoplado (ICP-OES) ... 79
7 Resultados e discussão... 81
7.1 Vidros bioativos 58S... 81
7.2 Síntese de scaffolds de vidros bioativos 58S ... 81
7.2.1 Caracterização estrutural dos scaffolds de vidros bioativos 58S ... 82
7.2.2 Caracterização da composição dos vidros bioativos 58 S por Fluorescência de Raios-X ... 83
7.2.3 Caracterização do vidro 58S por Espectroscopia Vibracional de Infravermelho ... 85
7.2.5 Caracterização estrutural dos vidros 58S calcinados a 750 ºC e 850 ºC 88
7.2.6 Caracterização dos vidros 58S por Difração de Raios-X ... 89
7.3 Vidros bioativos 45S5 ... 90
7.3.1 Síntese dos vidros bioativos 45S5 ... 91
7.3.2 Caracterização estrutural dos vidros 45S5 ... 91
7.3.3 Caracterização da composição dos vidros bioativos 45S5 por Fluorescência de Raios X ... 92
7.3.4 Caracterização do vidro 45S5 por Espectroscopia Vibracional no Infravermelho ... 94
7.3.5 Caracterização do vidro 45S5 por DRX ... 95
7.3.6 Caracterização do vidro 45S5 por TGA ... 96
7.3.7 Estabilidade do scaffoldde vidro bioativo 45S5 no DMEM ... 98
7.3.8 Lixiviação dos íons constituintes do vidro 45S5... 98
8 Conclusões ... 101
9 Perspectivas futuras... 103
1 Prefácio
Para melhor compreensão e facilidade de leitura, a Dissertação de Mestrado foi dividida em dois capítulos.
No Capítulo I é apresentado o estudo da formação de estruturas porosas formadas exclusivamentepornanopartículas de sílica utilizando nanocristais de celulose como template, de forma a compreender a influência dos diversos parâmetros reacionais em relação à auto-organização dos nanocristais de celulose, bem como estudar o processo de formação destas estruturas organizadas.
No Capítulo II é apresentada a modificação da metodologia desenvolvida no primeiro capítulo para produção de scaffolds de vidros bioativos com composições similares aos dos 58S e 45S5, pela inserção dos íons cálcio, fosfato e sódio na rede da sílica.
2 Introdução
2.1 Vidros bioativos
Atualmente, o desenvolvimento de novos biomateriais para aplicação biomédica no reparo de danos ao tecido ósseo tem se destacado, principalmente, pelo aumento de casos de acidentes, infecções e câncer [1]. Entre os biomateriais, uma classe que merece destaque no reparo de danos ao tecido ósseo é a dos vidros bioativos, surgidos na década de 60 [2].
O primeiro vidro bioativo reportado foi descoberto por Larry Hench sendo denominado de Bioglass®45S5, este é um vidro quaternário com composição molar igual a 46,1% de SiO2, 26,9% de CaO, 24,4% de Na2O e 2,6% de P2O5[3].
De maneira geral os vidros bioativos são formados por diferentes óxidos classificados de acordo com suas funções: a) Óxidos Formadores de Rede (SiO2 e
P2O5)compostos por elementos não-metálicos, os quais formam a rede vítrea
através das ligações múltiplas com os átomos de oxigênio; b) Óxidos Modificadores de Rede (CaO e Na2O) constituídos por elementos alcalinos e alcalinos terrosos e c)
Óxidos Intermediários (ZnO e Al2O3) inseridos na rede vítrea somente quando é
desejável modificar seu comportamento térmico [4].
Os vidros bioativos são capazes de estimular a regeneração óssea mais rapidamente que as biocerâmicas, formam uma ligação com o tecido ósseo sem interposição de tecido fibroso e sem causar respostas inflamatórias quando implantados [5]. São capazes de promover a diferenciação de célulastroncos mesenquimais em osteoblastos e estimular a adesão e atividade enzimática destas células [6].
A bioatividade da maioria dos vidros bioativos está relacionada à formação de uma camada de hidroxiapatita carbonatada (HCA) na interface entre o vidro e os fluidos biológicos. Os componentes da HCA são os íons fosfato e cálcio, os quais são os principais constituintes da matriz mineral dos ossos e dentes [4,7].
Segundo o mecanismo proposto por Hench a bioatividade dos vidros bioativos é consequência de reações entre eles e os fluidos biológicos que podem ser representadas por cinco etapas [6,8]:
1) Troca iônica rápida entre os íons Na+ e/ou Ca2+ do vidro com os íons H3O+ da
solução, criando grupos silánois (Si-OH) na superfície do vidro: 𝑆𝑖 − 𝑂−𝑁𝑎
𝑣𝑖𝑑𝑟𝑜
+ + 𝐻
(𝑆𝑖 − 𝑂−)
2𝐶𝑎 𝑣𝑖𝑑𝑟𝑜 2+ + 𝐻3𝑂 𝑠𝑜𝑙𝑢 çã𝑜 + 𝑆𝑖𝑂𝐻++ 𝐶𝑎 𝑎𝑞 2+ + 𝑂𝐻− (Equação 2)
Nesta etapa ocorre a dissolução parcial do vidro, ocasionando perda dos íons sódio e cálcio por troca iônica com os íons hidrônios da solução. Esta lixiviação promove aumento local do pH ocasionando na formação de uma região catiônica rica em sílica na superfície do vidro;
2) Em pH alto, os íons OH- atacam a sílica presente na rede vítrea quebrando as ligações Si-O-Si. A sílica é liberada na solução na forma de Si(OH)4,
resultando na formação de grupos silánois na interface vidro/solução: 𝑆𝑖 − 𝑂 − 𝑆𝑖 𝑣𝑖𝑑𝑟𝑜 + 𝐻2𝑂 𝑆𝑖 − 𝑂𝐻 + 𝑂𝐻 − 𝑆𝑖 (Equação 3)
3) Condensação dos grupos silánois na superfície do vidro e consequente repolimerização da camada rica em sílica;
𝑆𝑖 − 𝑂𝐻 + 𝑂𝐻 − 𝑆𝑖 𝑆𝑖 − 𝑂 − 𝑆𝑖 + 𝐻2𝑂 (Equação 4)
4) Migração das espécies Ca2+ e PO43− para a interface vidro/solução e formação de um filme amorfo de CaO-P2O5 na camada rica em sílica;
5) Incorporação dos íons hidróxidos e carbonatos da solução na superfície do vidro, levando a cristalização do filme de CaO-P2O5 e formação da
hidroxiapatita carbonatada.
Após o término das reações químicas, que transformam a superfície do vidro em um ambiente propício para o crescimento celular, iniciam-se os processos biológicos que resultam na formação da ligação do vidro com o tecido hospedeiro, os quais estão representados na Figura 1 [6,8].
Figura 1. Representação das transformações químicas e biológicas na superfície dos vidros bioativos quando entram em contato com os fluidos corpóreos. Adaptado de Lopes J.H. [6].
A bioatividade dos vidros bioativos depende dacomposição, da estrutura e da porosidade. Vidros com elevada bioatividade devem conter poros interconectados com diâmetro na ordem de 50 µm para permitir a passagem e crescimento dos osteoblastos, materiais com estas propriedades são denominados scaffolds [9,10,11].
Scaffolds com elevada área superficial e paredes de poros finas, necessitam de pouco tempo para os íons Si, Ca, P e Na serem lixiviados quando em contato com os fluidos biológicos, culminando em rápida biodegradabilidade e formação da camada de hidroxiapatita carbonatada. Enquanto que os scaffolds com menor área superficial e paredes de poros mais espessas, requerem maior tempo de lixiviação e de biodegradabilidade [10,12].
As propriedades estruturais, bem como a bioatividade dos vidros bioativos dependem fortemente do seu método de obtenção. Há dois métodos de produção dos vidros: método de fusão e resfriamento e método sol-gel.
O método convencional de fusão e resfriamento consiste na fusão dos reagentes precursores a aproximadamente 1400ºC seguido de resfriamento rápido em moldes ou em água [8]. Os scaffolds obtidos por esse método possuem baixa
área superficial e menor volume de poros, porém com elevada resistência mecânica. Os vidros bioativos produzidos por este método devem conter o sódio em sua composição, porque este íon é um agente fundente (reduz a temperatura de fusão do vidro) [13].
O método sol-gel, descoberto por Li e seus colaboradores [14], é realizado em temperatura ambiente e permite obter materiais mesoporososna forma de nanopartículas e monólitos de elevada área superficial e nanoporosidade, propriedades que contribuem para a bioatividade [15,16]. Portanto, este método é mais vantajoso em relação a obtenção de scaffolds com estruturas que contribuem para a bioatividade do que os produzidos pelo método convencional de fusão e resfriamento.
2.2 Método Sol-gel
O método sol-gel é uma rota sintética baseada em reações químicas que consistem na hidrólise seguida da condensação do precursor alcóxido em temperatura ambiente. As etapas posteriores consistem na formação do sol - dispersão de partículas coloidais com tamanho entre 1 nm e 100 nm, ou na formação de gel – rede tridimensional (3D) rígida e interconectada. A obtenção de sol ou de gel depende das condições reacionais: concentração de precursor e de solvente, pH e tempo de hidrólise e de gelação [17].Todas estas etapas ocorrem concomitantemente.
A etapade hidrólise é regida por mecanismos de substituição nucleofílica bimolecular (SN2) do precursor alcóxido e pode ser catalisada por base ou por ácido.
Na hidrólise básica são obtidas estruturas altamente ramificadas com poros maiores do que a obtida via hidrólise ácida, porque as etapas de hidrólise e condensação em meio básico são rápidas e resultam na formação de ligações cruzadas entre as cadeias já nas primeiras etapas do processo [17,18].
Em sistemas diluídos o mecanismo da hidrólise básica resulta na formação de partículas dispersas no meio e esses sistemas formam sóis conhecidos como Sílica de Stöber[19]. O método de Stöber consiste na hidrólise e condensação do precursor tetraetilortosilicato (TEOS) em solução alcoólica, utilizando hidróxido de amônio (NH4OH) como catalisador para obtenção de nanopartículas esféricas
das nanopartículas obtidas por este método depende da concentração do precursor e de NH4OH, da razão água/etanol e água/SiO2 [21,22].
As reações de hidrólise (Equação 4) e condensação (Equação 5) que ocorrem durante a síntese de Stöber estão representadas abaixo [21]:
𝑆𝑖(𝑂𝐶2𝐻4)4 (𝑎𝑞 )+ 𝐻2𝑂 𝑂𝐻−
(𝑂𝐶2𝐻4)3𝑆𝑖𝑂𝐻(𝑎𝑞 )+ 𝐶2𝐻4𝑂𝐻(𝑎𝑞 )(Equação 5)
(𝑂𝐶2𝐻4)3𝑆𝑖𝑂𝐻(𝑎𝑞 )+ 𝐻2𝑂 𝑆𝑖𝑂2 𝑠 + 3𝐶2𝐻4𝑂𝐻(𝑎𝑞 ) (Equação 6)
No método sol-gel, os vidros são obtidos pela inserção dos íonscálcio, sódio e fosfato na rede da sílica durante as reações de hidrólise e condensação. Somente após a calcinação, a rede vítrea é consolidada pela formação dos óxidos (CaO, P2O5
e Na2O) [22]. Na Figura 2 está representada simplificadamente a rede de sílica, que
é um precursor para o vidro sol-gel com íons nitrato de cálcio, fosfato e sódio e que após sua calcinação, será consolidada em rede vítrea através da formação dos óxidos (SiO2, CaO, P2O5 e Na2O), das ligações múltiplas com os átomos de oxigênio
e liberação de gases.
Figura 2.Representação esquemática da rede da sílica com os íons nitrato, cálcio, fosfato e sódio que representam o precursor do vidro bioativo obtido por sol-gel.
No método sol-gel também é possível utilizar templatesdurante a síntese para produção de materiais com estruturas apropriadas para a aplicação desejada [12].
Diversos trabalhos têm estudado a formação de estruturas porosas de sílica pela combinação do método de Stöber e o uso de um detemplateorgânico de dimensões micrométricas. A estrutura obtida por esta combinação provém do recobrimento da superfície e cópia da estrutura do template pelas nanopartículas, sendo que as características estruturais do materialdependem das propriedades químicas e físicas do template, tais como: tamanho, auto-organização e presença de grupos funcionais na superfície [23,24].
Neste trabalho o objetivo foi obter scaffolds de vidros bioativos para uso em preenchimento de implantes muco-maxilares pela combinação do método de Stöber e de um template. Como neste tipo de aplicação é ideal que a lixiviação dos íons constituintes do material seja rápida e que ocorra invasão e crescimento de osteoblastos, é desejável que o scaffold possua elevada área superficial, elevada porosidade, com poros de diâmetro próximos de 50 µm e com paredes finas [10,11]. Portanto, o template escolhido foram os nanocristais de celulose devido,principalmente, a sua propriedade de auto-organização em dispersão [25].
2.3 Nanocristais de celulose
Os nanocristais de celulose (CNC, cellulose nanocrystals) têm sido amplamente utilizados na obtenção denanocompósitos poliméricos [26] e de aerogéis [27] para uso em diversas aplicações. Vários trabalhos também têm estudado seu uso como template para obtenção de nanorodse mesoporos de sílica [21,28], bem como na produção de nanorodsde materiais superparamagnéticos [22].
Os CNC são obtidos por hidrólise ácida controlada da celulose, a qual pode ser proveniente de plantas e de alguns animais marinhos, como os tunicatos ou, também, sintetizada por fungos e bactérias [29]. Durante o processo de hidrólise os íons hidrônios entram nos domínios amorfos entre as cadeias de celulose, promovem a clivagem hidrólitica das ligações glicosídicas e, após sonificação, liberam cristais de dimensões nanométricas individuais [30]. A hidrólise pode ser realizada com alguns ácidos, tais como: clorídrico, sulfúrico, fosfórico [31], bromídrico [32] e nítrico [33]. O ácido sulfúrico é mais utilizado, pois os íons sulfato reagem via esterificação com os grupos hidroxila presentes na superfície da celulose formando grupos aniônicos de éster de sulfato. A presença desses grupos aniônicos induz a formação de uma camada eletrostática negativa na superfície dos CNC, a qual promove sua dispersão e estabilidade em água. Porém, isto reduz a
termoestabilidade dos nanocristais, desta forma, para melhorar esta propriedade, os CNC são neutralizados com hidróxido de sódio após o término do processo de hidrólise [34,35]. As dimensões (comprimento e diâmetro) dos CNC dependem da origem da celulose e das condições do processo de hidrólise [28].
Figura 3. Esquema representativo da produção de nanocristais de celulose pela hidrólise com ácido sulfúrico. Adaptada de Geise et al. [36].
A vasta aplicação dos CNC é devido a serem provenientes de fonte renovávele às suas interessantes propriedades de biocompatibilidade, não toxicidade, elevada cristalinidade, elevada área superficial e elevada resistência mecânica. Outra propriedade extremamente importante, principalmente para o desenvolvimento deste trabalho, é a habilidade dos nanocristais de celulose de se auto organizarem em dispersão, sendo que em determinadas concentrações podem formar fases nemáticas quirais [34,37].
Fase nemática ou cristal líquido é um materialordenado que está em um estado intermediário ao líquido e sólido, pois possui propriedades de fluidez (característico do estado líquido) e de ordem a longas distâncias (característico do estado sólido). Os nanocristais de celulose são capazes de formar uma fase nemática, pois seu comprimento é muito maior do que seu diâmetro, assim, podem ordenar-se unidimensionalmente a longas distâncias, ocasionado birrefringência [38].
As moléculas da celulose são quirais, desta forma, são formadas fases nemáticas quirais, onde os CNC se empacotam para minimizar as interações
desfavoráveis e maximizar as interações dipolares atrativas, formando uma macroestrutura helicoidal [34,39].
Figura 4. Esquema representativo da formação da fase nemática quiral em formato helicoidal pelos nanocristais de celulose.
A formação da fase nemática quiral depende do tamanho e concentração dos nanocristais de celulose, bem como do dispersante [35,40]. Os CNC iniciam a formação de fases nemáticas acima da concentração crítica de 4,55 % (m/m), porém o trabalho de Tiffany Abitbol et al.[40] demonstrou que utilizando etanol como dispersante há formação de fase nemática quiral em uma concentração próxima de 4% (m/m).
São três as concentrações críticas que distinguem as características das fases nemáticas. Em baixas concentrações, as dispersões de CNC estão na fase isotrópica (opticamente homogênea, cujo índice de refração é o mesmo em qualquer direção). Em concentrações mais elevadas, próximas de 4,55% (m/m), atinge-se a primeira concentração crítica e forma-se a fase bifásica, onde coexistem as fases isotrópica e anisotrópica (índice de refração varia de acordo com a direção – birrefringência). Quando a concentração aumenta e atinge a segunda concentração crítica, cujo valoré de aproximadamente 13,13% (m/m), ocorre a transição da fase bifásica para a anisotrópica. A fase nemática quiral é formada quando se atinge a primeira concentração crítica e sua completa consolidação ocorre quando a segunda concentração crítica é atingida [41].
A formação de fases nemáticas quirais pelos CNC não é regida somente por atingir as concentrações críticas, mas outros parâmetros podem interferir na obtenção das fases nemáticas dependendo da carga dos nanocristais de celulose. Para os nanocristais de celulose neutros (produzidos pela hidrólise com HCl), a formação da fase nemática quiral depende somente da razão aspecto (comprimento/diâmetro) dos CNC, enquanto que para os CNC carregados, esta
formação é mais complexa e depende de diversos parâmetros, como por exemplo: grupos sulfatos presentes na sua superfície facilitam e estabilizam a formação da fase nemática quiral [34,35].
2.4 Obtenção de estruturas porosas de sílica
Os nanocristais de celulose, como citado anteriormente, estão sendo utilizadoscomo template para obtenção de materiaisporosos de sílica e estruturalmente organizados, devido, principalmente, à sua propriedade de auto-organização em solução, a qual permite obter estruturas porosas e organizadas de dimensões micrométricas [23].
A formação destas estruturas porosas está relacionada ao recobrimento da superfície dos CNC por nanopartículas de sílica e à cópia da estrutura formada pela auto-organização dos mesmos. Este recobrimento da superfície dos CNC pelas nanopartículas de sílica é orientado por interação eletrostática entre as cargas superficiais dos CNC e das nanopartículas de sílica. Desta forma, a compreensão e a eficiência desta interação é de extrema importância para a obtenção destas estruturas porosas. Vale ressaltar que os nanocristais de celulose podem ser removidos do material pelo seu tratamento térmico a temperaturas superiores a 300 ºC, o que permite que haja formação de novos poros e que ocorra a consolidação da rede da sílica. Porém, isto não ocasiona a destruição da estrutura auto organizada dos CNC, a qual foi copiada pelas nanopartículas de sílica [34,42,43,44].
Na Figura 5 está simplificadamente representada a formação das estruturas porosas de sílica utilizando nanocristais de celulose como template.
Figura 5. Esquema representativo da formação de estruturas porosas de sílica. Os bastões verdes são os CNC e as esferas cinza são as nanopartículas de sílica.
Os diversos trabalhos que utilizam CNC como template têm demonstrado que a sua auto-organização, além de ser dirigida pela interação eletrostática sílica/CNC, depende de diversos fatores, tais como: pH, concentração, força “g” de centrifugação, razão nanopartículas/CNC e método de secagem [45].
Além disso, nanocristais de celulose obtidos pela hidrólise com ácido sulfúrico apresentamcarga superficial negativa devido à presença de grupos éster de sulfato na sua superfície. Desta forma, uma alternativa interessante para favorecer a interação sílica/CNC é modificar a carga superficial dos nanocristais de celulose com o surfactante catiônico brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB, hexadecyltrimethylammoniumbromide) [21,46,47], pois o método de Stöber produz nanopartículas de sílica carregadas negativamente, uma vez que o pH do meio reacional é próximo de 10 e o ponto isoelétrico da sílica é, aproximadamente, em pH = 2,4 [48]. Assim, a modificação da carga superficial dos CNC com o CTAB pode resultar em interações eletrostáticas entre os CNC e as nanopartículas de sílica de Stöber.
O trabalho de Tiffany Abitbolet al.[40] demonstrou que nanocristais de celulose modificados com o CTAB, utilizando etanol como dispersante (o mesmo utilizado no método de Stöber), formam fase nemática em concentrações menores do que quando utiliza-se água como dispersante [40].
Portanto, no desenvolvimento desta dissertação, de acordo com as considerações sobre as cargas presentes na superfície dos CNC obtidos por hidrólise com ácido sulfúrico e na necessidade de fortalecer a interação CNC/sílica,
o surfactante CTAB foi utilizado para modificar a carga superficial dos CNC. Esta modificação teve também como objetivo auxiliar na sua auto-organização estrutural, para obtenção de estruturas macroscópicas porosas a serem copiadas por nanopartículas de sílica e utilizadas como modelo para desenvolvimento de uma metodologia para formação de scaffolds de vidros bioativos com promissora aplicação em implantes ósseos.
Desta forma, a execução desta dissertação foi realizada em duas etapas: Síntese de estruturas porosas de sílica utilizando CNC como template(Capítulo I) e Síntese de scaffolds de vidros bioativos utilizando CNC como template (Capítulo II). Na primeira etapa foi estudado somente o sistema contendo sílica e nanocristais de celulose para melhor compreensão da interação entre as nanopartículas de sílica e os CNC, bem como analisar os efeitos dos parâmetros reacionais (razão sílica/CNC, concentração, força “g” de centrifugação e método de secagem). Na segunda etapa a metodologia desenvolvida no capítulo I, foi modificada para formação de scaffolds de vidros bioativos pelainserção e permanência dos íons cálcio, fosfato e sódio na rede da sílica.
3 Objetivos
3.1 Objetivo geral
O trabalho consiste em obter scaffolds de vidros bioativo, utilizando o fenômeno de auto-organização dos nanocristais de celulose como template. Esses scaffolds poderão ser utilizados como indutor na regeneração óssea, principalmente em implantes buco-maxilares.
3.2 Objetivos específicos
- Estudaro efeito da modificação da carga superficial dos CNC com o surfactante CTAB;
- Analisar a interação eletrostática das nanopartículas de sílica com os CNC;
- Estudaro efeito do aumento na concentração de TEOS e dodiâmetrodas nanopartículas de sílica na obtenção das estruturas porosas;
- Sintetizar nanopartículas de sílica pelo método de Stöber associado ao uso de CNC como template para obtenção de estruturas porosas e organizadas de sílica; - Determinar a força centrífuga relativa (RCF, relative centrifugal force), ou força “g” de centrifugação, para auxiliar na auto-organização dos nanocristais de celulose modificados com CTAB;
- Estudar o processo de auto-organização dos nanocristais de celulose com o uso da centrífuga analítica Lumisizer;
- Desenvolver um modelo de síntese baseado no método de Stöber para produção de scaffolds de vidros bioativos, utilizando nanocristais de celulose como template; -Caracterizar a composição e a bioatividade dos scaffolds dos vidros bioativos sintetizados.
CAPÍTULO I: SÍNTESE DE ESTRTUTURAS POROSAS DE SÍLICA
UTILIZANDO NANOCRISTAIS DE CELULOSE COMO TEMPLATE
4 Procedimento experimental
Na Figura 6 está apresentado o fluxograma das etapas realizadas durante a síntese das estruturas porosas de sílica utilizando CNC como template. Cada etapa será explicada detalhadamente nos próximos itens.
Figura 6. Fluxograma das etapas da síntese de estruturas porosas de sílica
utilizando CNC como template.
4.1 Materiais
Os nanocristais de celulose foram fornecidos na forma de dispersão aquosa 11,7%(m/m) e produzidos pela Forest Products Laboratory (FPL), laboratório integrante da Universidade de Maine USA. Segundo as informações do fabricante, os CNC foram obtidos a partir da hidrólise da polpa da madeira, um material intermediário da indústria de papel e celulose, com ácido sulfúrico.
Os reagentes TEOS, CTAB e etanol 98% foram adquiridos da Sigma-Aldrich. O hidróxido de amônio (NH4OH) foi adquirido da Synth.
4.2 Modificação da carga superficial dos nanocristais de celulose
com o brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB)
A modificação da carga superficial dos nanocristais de celulose pelo surfactante CTAB foi analisada por titulação com este reagente, utilizando oequipamento Malvern, modelo ZetasizerNano Zs-Zen3600, laser de 633 nm, ângulo
de medida 173º e temperatura de 25 ºC. Durante a titulação o potencial zeta e o tamanho das partículas foram determinados simultaneamente.
A modificação da carga superficial dos CNC foi estudada para três dispersões em pH 10:
Dispersão 1: 1,30 g da dispersão aquosa de CNC 11,7% (m/m)foram
dispersos em20 mL de água deionizada, 80 mL de etanol 98% e 10 mL da solução etílica 4,2% (v/v) de NH4OH, resultando em uma concentração de 0,16% (m/m) de
CNC;
Dispersão2: Formada pela dispersão 1, à qual se adicionou70 µL de TEOS; Dispersão 3:Dispersão sem a presença de CNC e formada pela mistura de
70 µL de TEOS em 20 mL de água deionizada, 80 mL de etanol 98% e 10 mL da solução etílica 4,2% (v/v) de NH4OH.
A titulação das três dispersões foi realizada a partir da solução etílica 0,1 mol/L de CTAB. Volumes desta solução foram adicionados a cada nova medida de forma a aumentar a concentração em incrementos de 0,002 mol/L até atingir a concentração final de 0,03 mol/L.
4.3 Cálculo da área superficial dos nanocristais de celulose e da
quantidade de precursor TEOS
Para o cálculo da área superficial dos CNC foi considerada a geometria cilíndrica, como representada na Figura 7 e considerando-se somente sua área lateral.
Figura 7. Representação da geometria cilíndrica dos nanocristais de celulose.
A área (𝐴𝐶𝑁𝐶) e o volume (𝑉𝐶𝑁𝐶) de um único nanocristal de celulose foram
calculados, respectivamente, pelas Equações 7 e 8.
𝐴𝐶𝑁𝐶= 𝜋𝑊𝐿 (Equação 7) 𝑉𝐶𝑁𝐶=𝜋𝑊
2𝐿
4 (Equação 8)
Os valores de W (diâmetro) e L (comprimento) foram determinados utilizados o microscópio eletrônico de transmissão JEM 1400 plus (JEOL), sob voltagem de aceleração de 120 kV, e as imagens adquiridas pela câmera Multiscan 794 (Gatan), com resolução de 1k x 1k. Esta análise foi realizada pelo grupo de pesquisa da
Profª. Maria do Carmo Gonçalves. Uma imagem representativa é mostrada na Figura 8.
A partir desta e de outras micrografias, mediu-se a dimensão de cerca de 200 nanocristais de celulose, resultando em diâmetro e comprimento médio de W= 11 ± 4 nm e L= 83 ± 41nm. Foi possível calcular também a razão de aspecto média (L/W), cujo valor foi igual a 7,5 ± 3,5.
Figura 8. Micrografia eletrônica de transmissão dos nanocristais de celulose.
A área superficial total (Atotal) para uma determinada massa de CNC (mCNC) foi
calculada pela Equação 9, extraída do trabalho Alain Dusfrene [49], eonsiderando a densidade da celulose igual a 1,50g/cm3.
𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝜌𝑚𝐶𝑁𝐶 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑒 𝑥
𝐴𝐶𝑁𝐶
𝑉𝐶𝑁𝐶
(Equação 9)
Para a formação das estruturas porosas de sílica, um dos objetivos desta dissertação, foi necessário que as nanopartículas de sílica de Stöber recobrissem completamente a superfície dos CNC. Para isso, foi calculado o volume do reagente TEOS de acordo com o diâmetro esperado das esferas de sílica e da área total dos nanocristais de celulose.
O volume (VSi) e a área (ASi) de uma única nanopartícula de sílica foram
calculados, respectivamente, pelas Equações 10 e 11. 𝑉𝑆𝑖 = 4𝜋𝑅
3
3 (Equação10) 𝐴𝑆𝑖= 4𝜋𝑅2(Equação 11)
O número de nanopartículas de sílica (𝑛𝑆𝑖) necessário para recobrir a área total dos nanocristais de celulose (𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙) é a razão entre𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙/𝐴𝑆𝑖.O volume de
TEOS (𝑉𝑇𝐸𝑂𝑆) foi calculado pela Equação 12.
𝑉𝑇𝐸𝑂𝑆= 𝑛𝑆𝑖𝑉𝑆𝑖(Equação 12)
Na Tabela 1 estão indicadosos volumes de TEOS calculados para os diferentes diâmetros esperados das esferas de sílica de Stöber e área total e massa de CNC correspondentes.
Tabela 1. Valores do volume de TEOS calculados para os diferentes diâmetros
previstos das esferas de sílica e das correspondentes área total e massa de nanocristais de celulose. Diâmetro previsto das esferas de sílica (nm) Massa de CNC (g) Área total de CNC (m2) Volume de TEOS (µL) 10 0,150 40 70 30 0,150 40 200 300 0,615 164 8200
4.4 Síntese das estruturas porosas de sílica
4.4.1 Síntese de dispersões de CNC/sílica de Stöber
As dispersões de CNC/sílica de Stöber com diâmetros previstos de 10 nm e 30 nm foram preparadas pela redispersão de 1,30 g da dispersão aquosa de CNC 11,7% (m/m) em 20 mL de água deionizada, seguida da adição de 80 mL de etanol 98%, 0,49 g de CTAB e 10 mL da solução etílica 4,2% (v/v) de NH4OH. A
dispersão resultante foi agitada por 10 minutos, seguida da adição dos volumes de TEOS mostrados na Tabela 1 e mantida sob agitação por mais 20 h.
Para a síntese da dispersão CNC/sílica de Stöber com diâmetro previsto de 300 nm alterou-se as quantidades de alguns reagentes como indicado na Tabela 1: 5,26 g da dispersão aquosa 11,7% (m/m) de CNC e 6,3 mL de NH4OH concentrado.
O volume de TEOS foi de 8,2 mL. O procedimento experimental foi realizado conforme descrito no primeiro parágrafo desta seção, porém o tempo de reação foi de 24 h.
Para fins de comparação, também foram preparadas amostras sem a adição de nanocristais de celulose.
4.4.2 Remoção do solvente etanol
O etanol presente no meio reacional foi removido, após o término da reação, utilizando um sistema de pressão reduzida que evapora o etanol. O meio reacional foi mantido neste sistema por 3 horas. A remoção do etanol é essencial para que a dispersão possa ser congelada e liofilizada após o procedimento de centrifugação.
4.4.3 Centrifugação das dispersões CNC/sílica de Stöber
Para se obter os sistemas organizados formados por CNC e sílica de Stöber, eles foram inicialmente centrifugados em duas rotações, 1200 rpm e 3000 rpm por diferentes períodos de tempo. O tempo de centrifugação foi determinado por observação de variação do volume de precipitadodurante a centrifugação. Após 2h não se observou mais variação de volume. Como as centrifugações foram realizadas em centrifugas diferentes e para permitir a reprodutibilidade do trabalho, as velocidades de centrifugação foram transformadas no parâmetro da força “g” calculado pela Equação 13 [50].
𝑅𝐶𝐹 𝑜𝑢 𝑓𝑜𝑟ç𝑎 𝐺 = 1,12 . 𝑅 . 𝑅𝑃𝑀1000 2(Equação 13)
Em que R é o raio da centrífuga em milímetros e RPM é a velocidade de rotação em rotações por minuto. A centrifugação a rotação de 3000 rpm foi realizada em uma centrífuga Tomy Seiko modelo IC 15SN com raio de 154 mm. E acentrifugação a 1200 rpm, foi realizada em uma centrífuga Fanem 215, com raio de 190 mm. Os raios utilizados na equação 13 foram medidos do centro do eixo da centrífuga ao fundo do tubo usado na centrifugação. A Tabela 2 traz as características das centrífugas e a força g resultante.
Tabela 2. Centrífugas com seus respectivos raios, velocidade de rotação e força "g".
Centrífuga Raio (mm) Velocidade de rotação (rpm) Força “g” (g)
Tomy Seiko 154 1200 338
4.4.4 Lavagem das dispersões centrifugadas
O efeito da lavagem dos precipitados obtidos pela centrifugação das dispersões de CNC/sílica de Stöber durante as diferentes etapas de centrifugação, também foi analisadopara determinar se esta lavagem auxiliava ou não na auto-organização dos nanocristais de celulose.
4.4.5 Congelamento em N
2líquido das dispersões após a
centrifugação
Para determinação da influência do procedimento de congelamento das amostras após centrifugação na auto-organização dos CNC, foram testadas duas formas de congelamento:
- Congelamento vertical: no qual o precipitado resultante da centrifugação foi inserido em uma seringa de 5 mL (1 cm de diâmetro e 6 cm de comprimento) e mergulhado verticalmente em N2 líquidocom a utilização de um sistema dip-coating
com velocidade controlada de 0,51 cm/min. Após o término do congelamento, a ponta da seringa foi cortada com estilete permitindo a extrusão do material congelado com o auxílio do êmbolo.
- Congelamento por adição instantânea: o precipitado resultante da centrifugação foi transferido para a seringa de 5 mL e adicionado instantaneamente em nitrogênio líquido. Após o término do congelamento, a ponta da seringa foi cortada com estilete permitindo a extrusão do material congelado com o auxílio do êmbolo.
4.4.6 Liofilização das dispersões após o congelamento.
A liofilização das dispersões após o congelamento foi realizada no equipamento da marca Liotop modelo K105 durante 48 horas.
4.4.7 Calcinação
As amostras foram calcinadas após a liofilização com taxa de aquecimento de 1ºC/min até 600ºC, permanecendo nesta temperatura durante 6 horas.
4.5 Caracterização das estruturas porosas de sílica
4.5.1 Espalhamento Dinâmico de Luz
O tamanho e o potencial zeta das nanopartículas de sílica de Stöber e dos nanocristais de celulose foram analisados pela técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) utilizando o equipamento da marca Malvern, modelo ZetasizerNano Zs-Zen3600, laser de 633 nm, ângulo de medida 173º e temperatura de 25 ºC.
4.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura
A morfologia das estruturas de sílica sintetizadas foi analisada pela técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM), utilizando o microscópio eletrônico de varredura Quanta FEG 250 (FEI), com aceleração do feixe dos elétrons de 5 kV. A metalização das amostras foi realizada com carbono, seguida de metalização com ouro durante 180s em um metalizador BalTec Maschinenbau AG, modelo Med 020, Pfäffikon, Suíça.
4.5.3 Espectroscopia Vibracional de Infravermelho
As amostras foram analisadas por Espectroscopia de Infravermelho por Refletância Total Atenuada (ATR) em um espectrofotômetro Agilent Techonologies Cary 630 FTIR. O espectro foi obtido na faixa espectral de400 a 4000 cm-1, com resolução de 4 cm-1. Para realização das análises do gel de nanocristal de celulose, o mesmo foi seco em estufa a 70 ºC durante 24 h e moído com auxílio de um almofariz.
4.5.4 Centrífuga analítica Lumisizer
O comportamento e a estabilidade durante a centrifugação das dispersões CNC/sílica de Stöber sintetizadas utilizando 70 µL de TEOS (esferas com diâmetro de 30 nm) foram analisados usando o equipamento da marca Lum, modelo
Lumisizer 611 (NIR), comprimento de onda de 835 nm e raio interno de 130 mm. Utilizou-se uma cubeta de policarbonato com caminho óptico de 10 mm e volume de 1,5 mL.
As duas etapas de centrifugação da dispersão sílica/CNC, descritas no item 3.4.3, foram realizadas neste equipamento. Uma alíquota de 1,5 mL da dispersão após a remoção do etanol foi transferida para a cubeta e centrifugada por 2 h a 338 g (1525 rpm). Em seguida, desta mesma amostra, retirou-se o sobrenadante e completou o volume da cubeta (1,5 mL) com água deionizada. Esta dispersão foi centrifugada novamente por mais 2h a 338 g.
Analisou-se também duas amostras após a etapa de liofilização. Em uma delas, 0,0016 g da amostra liofilizada foram redispersos manualmente em 1,5 mL de água deionizada. A outra amostra foi dispersa com o auxílio de ultrassom por 30 minutos e ambas foram centrifugadas no Lum a 23g (400 rpm) durante 13 min.
5 Resultados e Discussão
5.1 Modificação da carga superficial dos nanocristais de celulose
com o brometo de hexadeciltrimetil amônio
Para formação das estruturas porosas de sílica é necessário que haja o completo recobrimento da superfície dos CNC pelas nanopartículas de sílica. Como citados anteriormente, diversos trabalhos na literatura têm relatado o uso do surfactante catiônico CTAB para modificar a carga superficial dos CNC, a fim de auxiliar e fortalecer sua interação eletrostática com as nanopartículas de sílica sintetizadas pelo método de Stöber. Isto se deve ao fato de que os nanocristais de celulose possuem carga superficial negativa devido à presença dos grupos de éster de sulfato na sua superfície. Assim, a modificação do potencial zeta para valores positivos pela adição de CTAB facilitará sua interação com as nanopartículas de sílica, pois estas também são carregadas negativamente, uma vez que a síntese de Stöber ocorre em meio básico (aproximadamente pH 10) e seu ponto isoelétrico é próximo de pH 2,4 [48].
Para melhor compreensão da modificação da carga superficial dos CNC, analisou-se o efeito da adição do surfactante CTAB sobre o tamanho e o potencial zeta de dispersões: de CNC, de CNC/sílica de Stöber sintetizadas utilizando 70 µL de TEOS (o que será detalhado na seção 4.2) e as mesmas condições reacionais que foram utilizadas na síntese de Stöber (solvente etanol/H2O 80% (v/v) em pH 10)
e apenas TEOS nas mesmas condições de síntese. As três dispersões estudadas receberam os nomes de CNC, CNC + TEOS e TEOS.
Na Figura 10 é possível verificar que o aumento da concentração de CTAB ocasionou aumento no diâmetro das partículas das três dispersões, bem como a diminuição da carga superficial negativa, tornando as partículas menos carregadas (potencial zeta mais próximo de zero) e menos estáveis. Observa-se que as duas dispersões contendo nanocristais de celulose (CNC e CNC + TEOS) apresentaram comportamento semelhante, em que houve uma inclinação abrupta na curva de tamanho, variando de nanômetros para micrômetros, entre as concentrações de 0,005 mol/L e 0,01 mol/L de CTAB. Já os valores de potencial zeta variaram de aproximadamente -25 mV até -15 mV, indicando a diminuição da estabilidade das dispersões e a agregação das partículas. Para a dispersão contendo somente TEOS, observou-se aumento de tamanho e diminuição da carga negativa
continuamente com o aumento da concentração do surfactante, indicando que estas alterações foram causadas pela adição de CTAB. Além disso, o tamanho das partículas foi menor do que o seu tamanho na presença de CNC.
Estes resultados demonstraram que o CTAB reduziu a carga superficial negativa dos nanocristais de celulose, levando à formação de agregados de aproximadamente 10 µm, sendo que a alteração de tamanho e potencial zeta foi mais pronunciada na concentração de 0,01 mol/L de CTAB (na qual houve aumento abrupto do tamanho das partículas). Além disso, apesar do potencial zeta dos CNC ainda ter sido negativo, é possível inferir que devido ao balanço de interações atrativas e repulsivas houve uma interação de longa distância (do tipo van der Waals) entre as nanopartículas de sílica e os CNC. Contribuíram para este efeito a força iônica e a presença de etanol no meio reacional.
Os resultados permitiram escolher a concentração de CTAB igual a 0,01 mol/L, considerando que nesta concentração houve a formação dos agregados de CNC e interação do tipo van der Waals com as nanopartículas de sílica.
Figura 10. Estimativa do comportamento quanto ao tamanho e ao potencial zeta das partículas das dispersões de CNC, CNC + TEOS e TEOS obtidas durante a titulação com CTAB.
Vale ressaltar que os resultados apresentados na Figura 10 demonstram qualitativamente o comportamento das dispersões em relação a adição de CTAB, uma vez que estas dispersões não são estáveis e o equipamento DLS tem uma
limitação em medir quantitativamente os valores de tamanho e potencial zeta neste tipo de dispersão.
5.2 Cálculo da área superficial de CNC e da quantidade de TEOS
Após estudar a modificação da carga superficial dos CNC pelo CTAB e determinar a quantidade de surfactante ideal para permitir sua interação com as partículas de sílica, foram calculadas a área superficial dos nanocristais de celulose e a quantidade de precursor TEOS que deveria ser utilizado na síntese das nanopartículas de sílica de Stöber. Foram realizadas sínteses por três métodos para a produção de nanopartículas com diferentes diâmetros.A primeira síntese realizada foi baseada no trabalho de Li Chen et al. [24], em que o diâmetro esperado das nanopartículas de sílica seria de 10 nm. A massa de nanocristais de celulose usada foi de 0,15 g, cuja área superficial calculada foi de 40 m2e o volumecalculado de TEOS foi de 70 µL (Tabela 1). Após a realização de todas as etapas para obtenção da estrutura porosa de sílica descrita na seção 3.5, a morfologia do material obtido foi analisada por SEM. As micrografias obtidas para o material são mostradas na Figura 11.
Figura 11. Micrografias de SEM da estrutura obtida com 70 µL de TEOS e CNC como template, em diversas ampliações.
Nas micrografias da Figura 11 observa-se que a estrutura obtida utilizando 70 µL de TEOS apresentou poros com diâmetro na faixa de 10 a 50 µm e suas paredes são finas e bem definidas. Porém, observando a micrografia de maior ampliaçãoda Figura 10, nota-se que o diâmetro das nanopartículas de sílica foi de, aproximadamente, 30 nm e não de 10 nm como obtido no trabalho de Li Chen et al. [24]. Esta diferença de tamanho pode ter ocorrido devido à presença do CTAB na síntese realizada neste trabalho, uma vez que este reagente não foi utilizado no trabalho de Li Chen et al. [24].
A partir da constatação da formação das partículas com diâmetro de 30 nm, os cálculos realizados inicialmente, considerando o diâmetro das partículas igual a 10 nm, foram refeitos para um diâmetro de partícula igual a 30 nm. Como resultado deste novo cálculo, obteve-se que para o recobrimento dos CNC com nanopartículas de 30 nm seria necessário um volume de TEOS de 200 µL para 0,15 g de CNC (Tabela 1).
O resultado da síntese da estrutura porosa de sílica, realizada pela adição de 200 µL de TEOS a 0,15g de CNC, segundo a metodologia descrita na seção 3.5, pode ser observado nas micrografias apresentadas na Figura 12.
Figura 12.Micrografias de SEM da estrutura obtida com 200 µLde TEOS e CNC como template, em
diversas ampliações.
A comparação das estruturas porosas mostradas na Figura 11 com as estruturas mostradas na Figura 12 mostra que a utilização de uma maior concentração de TEOS (200 µL) resultou em paredes dos poros com maior espessura. A quantidade e tamanho dos poros foram menores do que na estrutura obtida utilizando menor concentração (70 µL). Isto ocorreu porque, apesar da utilização de menor concentração de TEOS, o diâmetro das nanopartículas de sílica foi semelhante ao obtido utilizando 200 µL. Desta forma, aumentando a
concentração do precursor mais nanopartículas foram formadas, resultando em uma estrutura com poros menores e, consequentemente, mais densa.
Foi realizada uma síntese de caráter exploratório de estruturas porosas de sílica utilizando nanopartículas com diâmetro de 300 nm, cerca de 10 vezes maior que as obtidas para as estruturas mostradas nas Figuras 11 e 12. A síntese das nanopartículas de 300 nm foi realizada com algumas adaptações no procedimento reportado Ibrahim et al.[20] e o resultado de uma síntese realizada, sem a adição de CNC, pode ser observadona Figura 13.
Figura 13. Imagem de SEM das esferas de sílica de Stöber com diâmetro de 300 nm.
Na Figura 13 nota-se que as nanopartículas de sílica possuem morfologia esférica e uniforme, com diâmetro próximo de 300 nm.
Para síntese de estruturas porosas utilizando nanopartículas de sílica de 300 nm, foi necessário calcular uma nova massa de CNC para que houvesse completo recobrimento da sua superfície por partículas de sílica. Como resultado deste cálculo, foi adicionado 8,2 mL de TEOS em 0,615 g de nanocristais de celulose. A morfologia da estrutura obtida pode ser observada na Figura 14.
