UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE ENFERMAGEM
VANESSA MARIA SCHMOLLER
ESTUDO DOS EFEITOS COMPORTAMENTAIS E COGNITIVOS DO EXTRATO DE Rosmarinus officinalis L.
Sinop – MT 2018
VANESSA MARIA SCHMOLLER
ESTUDO DOS EFEITOS COMPORTAMENTAIS E COGNITIVOS DO EXTRATO DE
Rosmarinus officinalis L.
Trabalho de conclusão de curso apresentado a Banca Examinadora da Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT para obtenção do grau de Bacharel em Enfermagem, sob orientação da Profª Drª Claudia dos Reis e coorientação da Profª Drª Pacífica Pinheiro Cavalcanti.
Sinop – MT 2018
VANESSA MARIA SCHMOLLER
ESTUDO DOS EFEITOS COMPORTAMENTAIS E COGNITIVOS DO EXTRATO DE
Rosmarinus officinalis L.
Trabalho de curso apresentado ao Curso de Graduação em Enfermagem da Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus – Sinop, como requisito parcial
para obtenção do título de Bacharel em Enfermagem.
Comissão Examinadora abaixo assinada
_____________________________________________________ Profª Drª Claudia dos Reis
UFMT – Instituto de Ciências Naturais, Humanas e Sociais – Campus Universitário de Sinop
Orientadora/Presidente da Banca
________________________________________________________________ Profº Drª Patricia Marisco
UFMT - Instituto de Ciências da Saúde – Campus Universitário de Sinop Membro Titular
_________________________________________________________ Profª Drª Pacifica Pinheiro Cavalcante
UFMT - Instituto de Ciências da Saúde – Campus Universitário de Sinop Membro Titular
___________________________________________________ Profª Drª Carla Regina Andrighetti
UFMT - Instituto de Ciências da Saúde – Campus Universitário de Sinop Membro Suplente
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Antônio (in memoriam) e Elenir, meus irmãos, Michel e Isadora e a meu noivo Rodrigo que sempre estiveram ao meu lado, me incentivando e dando forças para que eu continuasse esta caminhada não poupando esforços para que eu pudesse realizar meu sonho, dedico também a minha amada sobrinha e afilhada Alice que reavivou minha alegria e vontade de crescer com sua chegada. Muito obrigada, amo muito vocês.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus que se fez presente em todos os passos que percorri durante este período, me dando forças e me sustentando até aqui.
A minha orientadora Profª Drª Cláudia Reis e coorientadora Profª Drª Pacífica Pinheiro Cavalcanti pelo apoio, pela confiança e paciência durante esse processo de orientação e finalização deste trabalho.
Minha mãe Elenir Schmoller, meu irmão Michel Schmoller e meu noivo Rodrigo Barros, que muitas vezes adiaram suas vontades para poder me ajudar, que juntamente a minha irmã Isadora Schmoller foram compreensivos nos momentos de estresse e ausência de minha parte.
Minha cunhada Bárbara Santana e minha madrinha Stela de Campos Santana pelo carinho, amor e doçura nas palavras de força e incentivo nas horas que eu mais precisei.
Agradeço ao meu pai Antônio Schmoller que infelizmente não se faz mais presente de corpo, mas que senti presente em meu coração em todos os momentos que precisei, o qual me instigou a chegar até aqui.
As minhas amigas e parceiras de estágio Samanta Aldete, Raquel Pupo e Isabela Daynara que sem dúvidas tornaram minha caminhada até aqui muito mais leve, obrigada pela parceria, companheirismo, positividade e amizade.
Agradeço também à Jéssica Ohana, Alessandra Tais, Jaqueline e Samanta que me ajudaram incansavelmente na análise comportamental dos camundongos.
Ao Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso – Campus de Cuiabá pelo fornecimento dos animais.
Aos demais professores que foram companheiros, pacientes e fundamentais nesse processo de formação acadêmica. Muito obrigada.
A Cleunice que me ajudou a confeccionar as lâminas das folhas de alecrim e também me ajudou a fazer as análises microscópicas.
A professora Carla e a seus alunos (as) do laboratório de Farmacognosia da Universidade Federal de Mato Grosso – Campus de Sinop que disponibilizaram espaço e me ensinaram a extrair o extrato bruto de Alecrim. E também ao mestrando Rafael que fez as diluições necessárias para o experimento.
“Conheça todas as teorias domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma humana seja apenas outra alma humana (JUNG, C.G.)”
RESUMO
A utilização de plantas medicinais para cura, prevenção e tratamento de doenças é uma prática antiga da humanidade que perpetua até os dias atuais. O alecrim (Rosmarinus officinalis L.) é uma planta nativa do mediterrâneo que é utilizada para fins culinários e indicada para uso tópico como cicatrizante, antimicrobiano para
Staphylococcus, Monilia e Bacillus subtilis, seu óleo tem efeitos quimiopreventivos,
antitumorais, atividades antioxidantes e melhora da memória. Assim, objetivou-se analisar estruturas secretoras da folha de alecrim e avaliar a eficácia do extrato das folhas dessa espécie no tratamento de depressão, ansiedade, compulsão e memória. Foram realizados cortes a mão livre das folhas adultas, frescas, de alecrim, confeccionado lâminas e analise em microscópio óptico, para extração do extrato foram utilizados 1kg de folha seca de alecrim moída e álcool 96% posteriormente evaporado por rotaevaporador. Foram testados 80 camundongos machos da linhagem “Swiss” com aproximadamente 45 dias de vida. Após aclimatação os animais foram divididos em 8 grupos de 10 animais cada: água filtrada (controle negativo), diazepam, imipramina, cafeína, piracetam, escopolamina e extrato de alecrim nas concentrações de 200mg/kg e 400mg/kg. Os compostos foram administrados via oral através de gavagem no período de 30 dias, 1 vez ao dia sempre no mesmo horário. Foram realizados os testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado, teste de esconder esferas, nado forçado, esquiva inibitória “step
down” e reconhecimento de objetos. Após os testes, os animais foram eutanasiados
através de inconsciência por aprofundamento de plano anestésico, em câmara de vaporização com isoflurano, durante 5 minutos, seguido de deslocamento cervical, de acordo com os aspectos éticos preconizados para pesquisa com animais. Os dados estatísticos foram computados no software estatístico, sendo expressos pela média e o desvio padrão da média por grupo, os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que o tratamento crônico com Rosmarinus officinalis L. nas doses 200 mg/kg apresentou efeito anticompulsivo, já o extrato na concentração de 400 mg/kg demonstrou possível efeito ansiolítico. Os animais que receberam o tratamento crônico com o extrato nas duas concentrações testadas também mostraram efeitos nootrópicos positivos. Logo recomenda-se mais estudos utilizando outros modelos de comportamento, bem como testes de toxicidade desses compostos, para que possa, posteriormente, ser efetivados ensaios clínicos randomizados podendo beneficiar seguramente os indivíduos.
ABSTRACT
Healing, prevention and diseases treatments with medicinal plants are an ancient practice that perpetuates in modern. Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) is a Mediterranean native plant used for culinary purposes and it is indicated for topical use as a cicatrizant and as an antimicrobial for Staphylococcus, Monilia and Bacillus
subtilis. Its oil has chemopreventive, antitumor effects, antioxidant activities, and it
works on improving memory. This study aimed to analyze rosemary secretory structures and to evaluate the efficacy of leaf extract in the depression, anxiety, compulsion and memory treatments. It was realized freehand cuts of fresh rosemary leaves to microscopic analysis. For the extract, it was utilized 1 kg of dried rosemary leaves (milled) and alcohol (96%), evaporated by a rotary evaporator. eighty male mice of the "Swiss" lineage with about 45 days old were tested. After acclimatization, the animals were divided into eight groups of ten animals: filtered water (negative control), diazepam, imipramine, caffeine, piracetam, scopolamine and rosemary extract at concentrations of 200mg/kg and 400mg/kg. The compounds were administered orally through gavage during 30 days, 1 time per day, always at the same time. It was performed the tests: open field, elevated plus maze, hiding spheres, forced swimming, inhibitory avoidance "step down" and object recognition. After the tests, the animals were euthanized through unconsciousness by deepening the anesthetic plane in a vaporization chamber with isoflurane for 5 minutes, followed by cervical dislocation, according to the ethical aspects recommended for animal research. The statistical data were computed in software, expressed by the mean and standard deviations of the mean per group, the results obtained in the present study demonstrated that the chronic treatment with Rosmarinus officinalis L. at doses 200 mg/kg showed anti-compulsive effect, the extract at the concentration of 400 mg/kg demonstrated possible anxiolytic effects. The animals that received chronic treatment with the extract at the two concentrations tested also showed positive nootropic effects. Further studies are therefore recommended using other behavioral models as well as toxicity tests of these compounds so that later randomized clinical trials can be carried out and can safely benefit individuals.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras 1A: Plantio de Alecrim. 1B: Alecrim florida ...20
Figura 2: Aparato usado para o teste de Atividade Locomotora Espontânea...32
Figura 3: Aparato usado para o teste do LCE...33
Figura 4: Aparato utilizado no Teste de Esconder Esferas...34
Figura 5: Aparato utilizado no teste de Nado Forçado. ...35
Figura 6: Teste de esquiva inibitória, “step-down”...36
Figura 7: Câmara de reconhecimento de objetos com objetos familiares...38
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste campo aberto...42 Gráfico 2 - Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste de labirinto em cruz elevado...43 Gráfico 3 - Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste de nado forado...46 Gráfico 4 - Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste de esconder esferas...47 Gráfico 5 - Efeito do tratamento crônico com o extrato de R. officinalis L. no teste a esquiva inibitória do tipo “step-down” na memória de curta duração...48 Gráfico 6 - Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste a esquiva inibitória do tipo ― “step-down” na memória de longa duração...49 Gráfico 7 - Efeito do tratamento crônico com o extrato de R. officinalis L no teste de
Reconhecimento de Objetos – memória de longa
duração...50 Gráfico 8 - Efeito do tratamento crônico com o extrato de R. officinalis L no teste de
Reconhecimento de Objetos – memória de curta
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. OBJETIVOS ... 19 2.1 OBJETIVO GERAL ... 19 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19 3. REVISÃO DE LITERATURA ... 20 3.1 ALECRIM ... 20 3.2 PSICOPATOLOGIAS ... 23 3.2.1 Depressão ... 23 3.2.2 Ansiedade ... 24
3.2.3 Transtorno Obsessivo Compulsivo (TOC) ... 25
3.2.4 Memória ... 26
3.3 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 27
3.4 FÁRMACOS QUE AGEM NO SNC ... 27
3.4.1 Diazepam ... 27 3.4.2 Imipramina ... 27 3.4.3 Cafeína ... 28 3.4.4 Escopolamina ... 28 3.4.5 Piracetam ... 29 4. MATERIAIS E MÉTODOS... 30 4.1 TIPO DE ESTUDO ... 30
4.2 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO ... 30
4.3 PREPARAÇÕES DE EXTRATOS ... 30
4.4 ANÁLISE ANATÔMICA ... 30
4.5 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 31
4.6 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 31
4.6.1 Campo Aberto ... 31
4.6.3 Esconder Esferas ... 34
4.6.4 Nado Forçado ... 35
4.6.5 Esquiva Inibitória “step down” ... 36
4.6.6 Reconhecimento de Objetos ... 37 4.7 EUTANÁSIA ... 39 4.8 ASPECTOS ÉTICOS... 39 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 39 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40 5.1 ANÁLISE ANATÔMICA ... 40 5.2 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 41
5.2.1 Teste de Atividade Locomotora Espontânea ... 41
5.2.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE) ... 42
5.2.3 Teste de Nado Forçado ... 45
5.2.4 Teste de Esconder Esferas ... 46
5.2.5 Teste Esquiva Inibitória tipo “step down” ... 48
5.2.6 Teste de Reconhecimento de Objetos ... 49
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 52
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais pela população é antiga e, segundo a OMS (Organização mundial da saúde), oito a cada dez pessoas utilizam plantas com fins terapêuticos para alivio de sintomas desagradáveis e cerca de seis a oito entre dez pessoas, que vivem em países subdesenvolvidos, usam e confiam na medicina tradicional para assistência primária da saúde (GONÇALVES et al., 2005).
No Brasil, o uso de plantas para fins medicinais é uma herança da cultura indígena, que junto com a prática pelos europeus e africanos, constituiu o início da fitoterapia no território brasileiro desde os primórdios até a atualidade (RIBEIRO, 2015).
Muitas plantas utilizadas em nosso país são de origem europeia; as mesmas foram trazidas pelos colonizadores e se adaptaram muito bem ao nosso clima e são cultivadas até hoje pela população. Dentre elas está o alecrim, cientificamente conhecida com Rosmarinus officinalis L. (LORENZI; MATOS, 2008).
As plantas medicinais e os fitoterápicos estão entre os principais recursos terapêuticos da Medicina Complementar e Alternativa e vêm sendo utilizados há muito tempo pela população brasileira nos cuidados com a saúde (NASCIMENTO JÚNIOR et al., 2016).
A eficácia de algumas plantas e compostos isolados é comprovada cientificamente para o tratamento de doenças mentais, por exemplo, a Passiflora
edulis popularmente conhecida como Maracujá é utilizada no tratamento de
depressão, ansiedade e insônia (VARGAS et al., 2007; COQUEIRO, PEREIRA; GALANTE, 2016).
A galantamina, isolada de plantas da família Amaryllidaceae é utilizada no tratamento da doença de Alzheimer (ZHANG et al., 2002 apud SILVA, 2016) o flavonóide apigenina encontrado nas flores da Matricaria chamomilla (Camomila) possui propriedade sedativa e ansiolítica, podendo se destacar pela sua capacidade de se ligar aos receptores GABA-A cerebrais se assemelhando aos benzodiazepínicos (ALONSO JR, 1998 apud HARTMANN; ONOFRE 2010).
De acordo com Silva, Alquini e Cavallet (2005) os conhecimentos de Anatomia Vegetal destacam-se quando se trata da difusão vegetativa, pois a identificação dos aspectos estruturais é importante para o sucesso da propagação, a qual depende da regeneração de tecidos vegetais. Uma das dificuldades de sucesso da propagação vegetativa através da micropropagação é a transferência das plantas
de um local com condições controladas para casas de vegetação ou outras áreas. Esse processo tem relação com as características estruturais.
Informações anatômicas como espessura de cutícula e estruturas secretoras são de grande relevância para a produção vegetal (NETO et al., 2012).
De acordo com Martins, Ferreira e Guilherme (2013), a atenção à saúde mental tem adquirido muita relevância nos últimos anos, visto a vida agitada que a população mundial vem levando nos dias atuais, tornando – se a chave principal para desencadeamento de doenças, relacionadas a eventos estressores vividos pelos mesmos.
Enquanto na linguagem popular a palavra demência tem a conotação de loucura, em medicina é usada com o significado de declínio adquirido, persistente, em múltiplos domínios das funções cognitivas e não cognitivas (VARELLA, 2018).
A Doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência neurodegenerativa em pessoas de idade a causa da doença ainda é desconhecida (VARELLA, 2018).
De acordo com Varella (2018) em algum momento da vida, 20% das mulheres e 8% dos homens apresentarão distúrbios de ansiedade. Na maioria dos casos, as crises persistirão por seis meses ou mais, muitas vezes vem associada a outra patologia, a depressão.
A cada dez pessoas que procuram o médico, pelo menos uma preenche os requisitos para o diagnóstico de depressão, do início insidioso, a patologia evolui continuamente para quadros que variam de intensidade e duração (VARELLA, 2018).
A ansiedade é uma das emoções mais perturbadoras do ser humano, também conhecida por nervosismo ou medo. Ela engloba fobias, crises de pânico, transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), transtorno obsessivo compulsivo (TOC) ou ansiedade generalizada (ZWIELEWSKI; BUP, 2014). Ela pode ser desencadeada por traumas, doenças, mortes, comportamentos e apegos ensinados ou observados, assim como experiências aparentemente impossíveis de lidar (ZWIELEWSKI; BUP, 2014).
Enquanto a ansiedade define-se pela antecipação de uma ameaça futura e o medo como uma ameaça presente, estes dois compartilham os mesmos sintomas físicos e mentais (DINIZ et al., 2012). Em uma somatização desses sintomas, o
indivíduo pode desenvolver a depressão, que é uma das psicopatologias mais comuns nos tempos atuais (CAMPOS, 2016).
Atualmente, estar deprimido é uma condição comum que atinge com maior frequência pessoas de 20 a 50 anos (TABORDA; ABDALLA FILHO; CHALUB, 2012) o que vem caracterizando uma assustadora epidemia dessa doença (PIGNARRE, 2012), causando grandes impactos econômicos, se comparado a cardiopatias, câncer e AIDS (OMS, 2001). Este agravo afeta pessoas de todas as idades e estilos de vida, causando tristeza profunda e sentimento de incapacidade, até mesmo limitando o indivíduo em fazer tarefas simples do dia a dia, como realizar o auto cuidado, e no pior dos casos, levando ao suicídio, que é a segunda maior causa de morte no mundo entre jovens de 15 a 29 anos, destacou a OMS (2017).
Atualmente, a depressão é um problema de saúde pública que é caracterizada pela perda de prazer pela vida, melancolia e tristeza podendo levar o indivíduo ao suicídio.
A ansiedade, na maior parte das vezes, vem associada a depressão, não permitindo que o indivíduo realize suas atividades diárias a quem sempre terá algo lhe importunando em seu subconsciente, fazendo o indivíduo sofrer por antecipação por algo que ainda nem ocorreu e talvez nem ocorrerá.
Em um agravamento desse transtorno o paciente pode desenvolver o Transtorno Obsessivo Compulsivo (TOC), dividido em duas fases: obsessão, que é caracterizada pelo pensamento recorrente, e compulsão, que é caracterizada por uma ação realizada diversas vezes com a intenção de não pensar mais naquilo, tornando-se um ciclo vicioso.
Como já citado acima a Doença de Alzheimer (DA) é um problema que também vem crescendo com o passar dos anos, visto que a expectativa de vida das pessoas aumentou com o passar do tempo. Acredita-se que em 2050 mais de 25% da população mundial será idosa, logo apresentando mais chance de desenvolver doenças neurodegenerativas (SERENIKI; VITAL, 2008).
A DA trata-se de uma psicopatologia neurodegenerativa, que afeta principalmente os idosos, cujos sintomas principais são: perda de memória recente, alteração de memória e déficit de cognição (deficiência na linguagem e função visuo - espacial). A doença afeta aproximadamente 10% dos indivíduos com 65 anos ou mais (SERENIKI; VITAL, 2008) isso significa aproximadamente 24 milhões de idosos que sofrem com essa doença; e ainda segundo projeções, em 30 anos o número de
indivíduos com essa patologia pode quadruplicar chegando a 81 milhões de casos (FERRI et al., 2005).
Por sua vez, a doença de Alzheimer, doença que ainda não tem cura, também vem preocupando muito a Organização Mundial da Saúde, por se tratar de uma doença neurodegenerativa que atinge principalmente a faixa etária dos idosos, acarretando perda de memória.
O Brasil é um país rico em plantas medicinais e seu uso muito comum em nosso estado. As Plantas medicinais tem menor índice de efeitos colaterais, comparados a fármacos industrializados, além de baixo custo comercial, mais acessível e de fácil cultivo em todo o território nacional. Dessa forma decidiu-se avaliar se o extrato alecrim, comumente cultivados em hortas em quintais das famílias brasileiras, apresenta algum efeito positivo em alguns transtornos comportamentais e cognitivos. O objetivo deste trabalho foi avaliar se o alecrim, muito utilizado para fins culinários, apresenta algum efeito terapêutico na depressão, ansiedade, compulsão e perda de memória.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Analisar se o extrato de Rosmarinus officinalis L. tem efeito farmacológico positivo na depressão, ansiedade, compulsão e memória em camundongos “Swiss” através de testes comportamentais.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterização anatômica das folhas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.); Verificar os benefícios do extrato de alecrim sobre a memória através do teste
de Esquiva Inibitória do tipo “step-down” e Reconhecimento de Objetos;
Avaliar os efeitos ansiolíticos e antidepressivos do extrato de alecrim por meio dos testes de Atividade Locomotora Espontânea, Labirinto em Cruz Elevado e Nado Forçado;
Estimar a potencialidade do extrato de alecrim sobre o tratamento de compulsões através do teste de esconder esferas.
3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1 ALECRIM
Segundo (ITF, 2008) o alecrim apresenta: Nome científico: Rosmarinus officinalis L. Família: Lamiaceae
Gênero: Rosmarinus
Sinonímia botânica: Não há relatos.
Sinonímia popular: alecrim, alecrim da horta, alecrim de jardim, alecrim de cheiro, alecrim rosmarinho, alecrinzeiro, erva da graça, libanotis, rosmarino, alecrim de casa, alecrim comum, erva cooada, flor de olimpo e rosa marinha. Partes usadas: Folhas, flores e óleo essencial.
A pequena planta nativa da região mediterrânea adapta–se muito bem a regiões de clima temperado e solo rico em calcário. Possui hábito subarbusivo lenhoso, ereto e pouco ramificado, podendo chegar a 1,5 m de altura; apresenta folhas lineares, coriáceas (Figura 1A) medindo de 1,5 a 4 cm de comprimento por 1 a 3 mm de espessura; flores azuis claras (Figura 1B) e com aroma forte e agradável São encontradas mais de 10 variedades cultivadas dessa planta, todas para o mesmo uso, diferenciando - se apenas pelo aroma (LORENZI; MATOS, 2008).
Figuras 1A: Plantio de Alecrim. 1B: Alecrim florido Fonte: Google imagens.
O nome do gênero Rosmarinus significa arbusto aromático em que ros, do grego rhops, significa arbusto, e marinus seria uma derivação de myrinus, aromático.
Seu uso é milenar, sendo utilizado como um dos ingredientes para embalsamar múmias no Egito Antigo. Para os gregos a planta simbolizava amor e morte, era utilizada em casamentos para representar fidelidade. Para Shaskespeare em Hamlet o alecrim tinha simbologia de lembrança. Já no século 19 em Portugal, o alecrim era queimado para que sua fumaça inalada pelas crianças as livrasse de quebranto (SAAD et al., 2016)
Suas folhas e flores triturados formam um excelente tempero para alimentos como carnes e massas, muito utilizado pela população.
Já dados da literatura demonstram seu uso etnofarmacológico empregado às suas folhas, que são preparadas em forma de chá por infusão (LORENZI; MATOS, 2008).
De acordo com Ozarowski (2013) o extrato de Rosmarinus officinalis L. promove a melhora da memória de longo prazo em ratos, o que é explicado pelo fato da planta inibir a atividade de acetilcolinesterase no cérebro desses animail.
No entanto o uso de Rosmarinus officinalis L. medicinalmente é muito diversificado (LORENZI; MATOS, 2008).
Estudos farmacológicos apontam o efeito terapêutico, no uso tópico como cicatrizante, antimicrobiano contra Staphylococcus, Monilia (Lorenzi e Matos, 2008) e B. subtilis (Trajano et al., 2009), Vibrio cholerae, Escherichia coli, Corynebacteria,
Pseudomonas (bactérias gram-negativas) e Lactobacillus (bactérias gram-positivas),
cefaleias de origem digestiva, enxaqueca, dores reumáticas, contusões, antiespasmódico, hepático, melhora da cognição e memória (ITF, 2008).
Além disso, tem efeitos positivos como colagogo carminativo, sendo também utilizado no tratamento de cistites, enterocolites e hemorroidas inflamadas (LORENZI; MATOS, 2008).
De acordo com Takaki (2008) é analgésico, expectorante, antiepiléptico e, segundo Rašković (2014), melhora problemas de circulação e fadiga. Segundo Erkan; Ayranci e Ayranci (2008), o óleo de alecrim tem efeitos quimiopreventivos, antitumorais e antioxidantes.
O extrato aquoso mostra efeito protetor sobre hepatócitos, exibindo também melhora em úlceras gástricas e inflamação, enquanto as soluções alcoólicas se mostram eficazes como colerética, diurética, hipoglicêmica e anti-hiperglicêmica.
Possivelmente esses efeitos devem-se aos múltiplos efeitos que envolvem mecanismos pancreáticos e extrapancreáticos, dependendo do modo de preparo da
solução, seja ela aquosa ou hidroalcoólica, podemos ter atividades diferentes que precisam se mais bem investigadas (SAAD et al., 2016).
O extrato hidroalcoólico dessa planta em altas doses tem efeito ansiolítico, efeito este que ocorre provavelmente devido à presença de flavonóides e das suas propriedades antioxidantes na remoção de radicais livres. Aliás, as presenças de compostos como apigenina, ácidas carnósico e luteolina estão envolvidas no caráter ansiolítico da planta (NOORI AHMAD ABADI et al., 2016).
O óleo essencial tem sido utilizado na aromoterapia, tanto no tratamento de ansiedade como para induzir um estado de alerta (FERNANDES; NIETO, 1982; SAAD et al., 2016), além disso observou-se que o ácido rosmarínico mostrou-se ser um promissor agente protetor da memória em pacientes com Alzheimer (FERNANDES; NIETO, 1982; ALKAM et al., 2007; SAAD et al., 2016).
Arruda et al (2014) observaram em testes laboratoriais de comportamento, que animais tratados com óleo de alecrim tiveram semelhança nos teste de ansiedade e depressão comparados aos controles positivos, apresentando resultados satisfatórios.
Ferlemi (2015) também verificou em testes comportamentais que camundongos tratados com alecrim tiveram um resultado positivo nos testes das mesmas patologias citadas acima.
O autor também verificou que nos testes que avaliam memória teve resultados pouco significativos, porem ao analisar a Acetilcolinesterase, principal enzima relacionada a memória no tecido cerebral, observou-se efeito inibitório.
De acordo com Gachkar et al., (2007) apud Saad et al., (2016) essas propriedades sucedem de sua de sua constituição química : 1,8 cineol, p-cimeno, linalool, timol, acetato de bornila, borneol, canfeno, β-pineno, α-pineno, eucaliptol e α-terpineol. Ainda contém limoneno, β-cariofileno, verbenona e mirceno.
Pode-se verificar também a presença de diterpenoides amargos (carnosol, ácido carnosólico e ácido carnósico, isorosmanol, rosmanol, epirosmanol, rosmaridifenol e ácido rosmarínico) flavonoides (luteolina, nepetina e pepitrina) e triterpenoides (ácido aleanólico, ácido ursólico e α e β-amirina) (ESCOP, 1996 apud SAAD et al., 2016).
Apesar da ampla terapêutica, seu uso indiscriminado pode levar a toxicidade, podendo causar eritema, dermatites, fotossensibilização (ITF, 2008), irritação renal (SAAD et al., 2016) sono profundo, espasmos, gastroenterite, hematúria, irritação
nervosa e, em doses maiores, à morte (LORENZI; MATOS, 2008). Não deve ser utilizado por homens com problemas na próstata, pacientes com gastrenterites, crianças menores de 3 anos e contraindicado para gestantes, por falta de dados (SAAD et al., 2016).
3.2 PSICOPATOLOGIAS 3.2.1 Depressão
Os pacientes que sofrem de depressão apresentam sintomas como: tristeza intensa, perda de interesse e prazer, cansaço, alterações do sono e apetite, dificuldade para se concentrar, irritabilidade, diminuição da libido e ideação suicida (TABORDA; ABDALLA FILHO; CHALUB, 2012).
Pessoas que tem parentes de 1ª grau com esse transtorno apresentam 2 a 4 vezes maior chance de desenvolver a doença se comparadas a pessoas que não apresentam esse fator de risco (SULLIVAN; KENDLER, 2001 apud HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
A depressão envolve muitos fatores que podem contribuir para o seu desenvolvimento, um deles é a diminuição da ligação de serotonina (5-HT) aos receptores serotonérgicos pós – sinápticos. A serotonina tem um efeito importante nas funções neurovegetativas, como sono, sensibilidade à dor, função sexual e apetite (MAES; MELTZER, 1995 apud HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
O suicídio é uma das consequências da depressão, sendo uma das principais causas de morte em todo o mundo, principalmente entre os jovens de 15 e 29 anos. Em consequência destas estatísticas, trata-se de um problema de saúde pública. De acordo com Chachamovich et al, 2009, no Brasil 24 pessoas se suicidam por dia e a OMS apontou que no mundo 800 mil pessoas cometem suicídio anualmente. O Ministério da Saúde divulgou que no Brasil o número aumentou entre 2011 a 2015 em 12% (GALILEU, 2017).
Nos últimos dez anos 18% da população mundial, cerca de 322 milhões de pessoas vivem com esse transtorno mental no mundo, sendo apenas no Brasil, 11.548.577 equivalendo a 5,8% da população brasileira, prevalecendo a maior incidência na população feminina (OMS, 2017). Conforme Hales; Yudofsky; Gabbard (2014) a cada dez pessoas dois desenvolvem depressão durante a vida, e em 2020 será a doença que mais causará incapacidade no mundo.
Episódios depressivos são tratáveis na maioria das vezes. A melhor abordagem e mais eficaz é a associação de farmacoterapia e intervenções psicoterapêuticas. Normalmente se inicia o tratamento com fármacos inibidores da recaptação de serotonina (ISRS) (SADOCK, SADOCK, 2012; HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014). Além dessa classe de medicação, o mercado farmacêutico oferece as classes de: antidepressivos inibidores da enzima monoamina oxidase (MAO), tricíclicos e inibidores da recaptação de serotonina e noradrenalina (NUNES FILHO; BUENO; NARDI, 2005; GOODMAN; GILMAN, 2010; HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2011).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (2017), esta psicopatologia pode ser caracterizada como leve, moderada ou grave, dependendo da intensidade dos sintomas. Milhares de pessoas com este transtorno podem levar uma vida normal, mesmo quando os recursos são falhos.
3.2.2 Ansiedade
De todos os transtornos psiquiátricos o transtorno de ansiedade é o mais comum, resultando considerável prejuízo funcional e sofrimento. Sabe-se que 50 a 60% das pessoas que sofrem de depressão vão desenvolver ou já desenvolveram o transtorno de ansiedade (HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
O paciente ansioso tem maior chance de realizar disfunções cognitivas, complicando um problema não conseguindo enxergar possibilidades ou ideias para solucioná-lo ou lidar com ele, reduzindo, assim, sua capacidade de enfrentamento e tornando-o vulnerável (ZWIELEWSKI; BUP, 2014).
Todos têm uma ansiedade natural como uma resposta a um perigo, porém se torna anormal a partir do momento que a situação parece pior do que realmente é ou demora passar (GELDER; MAYOU; COWEN, 2006). Seus sintomas se definem por inquietação, insônia, irritabilidade, tensão muscular, taquipnéia, tremor, taquicardia, sudorese, xerostomia (LOUZÃ NETO; ELKIS, 2007) dificuldade para se concentrar, fadiga, preocupação excessiva (HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014), tontura, cefaléia, formigamento as extremidades, terror noturno, amenorreia, fracasso na ereção, micção e evacuação frequente, desconforto epigástrico e temor antecipatório (GELDER; MAYOU; COWEN, 2006).
De acordo com Hales, Yudofsky e Gabbard (2014) alterações na estrutura e na função da amígdala, estrutura do SNC que está ligada diretamente ao medo,
pode estar relacionadas ao transtorno de ansiedade, bem como alterações no complexo receptor de GABA – benzodiazepínico (LOUZÃ NETO; ELKIS, 2007).
A ansiedade patológica não prejudica apenas o bem-estar psíquico e funcional do indivíduo, ela acomete a saúde de modo geral aumentando as chances da pessoa de manifestar outras doenças, especialmente as cardíacas (DINIZ et al., 2012).
O diagnóstico diferencial deve ser feito pelo profissional médico e o tratamento medicamentoso pode ser realizado com benzodiazepínicos, antidepressivos, inibidores da monoaminoxidase, azapironas e antagonistas dos receptores β (beta) (GELDER; MAYOU; COWEN, 2006; LOUZÃ NETO; ELKIS, 2007; SADOCK; SADOCK, 2012; HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
3.2.3 Transtorno Obsessivo Compulsivo (TOC)
Em um agravamento do quadro clínico, o paciente ansioso pode desenvolver outros transtornos, um deles é o Transtorno Obsessivo Compulsivo (TOC), que se caracteriza por pensamentos recorrentes e persistentes em algo específico, impulsos ou imagens que causam ansiedade ou angustia (SILVA, 2006; DINIZ et al., 2012). Os principais sintomas obsessivo-compulsivos são: pensamentos, ruminações, impulsos, fobias, rituais compulsivos, lentidão anormal, ansiedade, depressão e despersonalização (GELDER; MAYOU; COWEN, 2006).
De acordo com Diniz et al., (2012) 15 a 43,5% das pessoas que sofrem de transtorno de ansiedade (TA) também sofrem de TOC. Apesar desses dados, o TOC se classifica como um transtorno e não como um sintoma de outros transtornos de ansiedade.
Os sintomas do TOC começam a aparecer geralmente na adolescência ou no início da idade adulta, mas existem casos que isso pode se antecipar. 75% dos casos aparecem depois dos 30 anos, 15% tendem a surgir entre 10 e 15 anos com sintomas súbitos sem nenhum estresse ou evento precedente (HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014). Aproximadamente 70% dos pacientes com TOC são homens (SWEDO et al., 1989 apud HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
O diagnóstico do TOC baseia-se puramente no exame psiquiátrico e histórico do paciente, na maioria das vezes o diagnóstico é muito claro, porém em alguns casos o TOC pode ser confundido com depressão, psicose, fobias ou transtorno da personalidade obsessivo – compulsivo grave (HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
O tratamento é baseado em terapia associado com medicamentos antidepressivos tricíclicos ou inibidores seletivos da recaptação de serotonina e ansiolíticos (GELDER; MAYOU; COWEN, 2006; HALES; YUDOFSKY; GABBARD, 2014).
3.2.4 Memória
De acordo com Izquierdo (2002) memória é a aquisição, a formação, a conservação e a recordação de informações, “só lembramos aquilo que foi gravado, aprendido.”
A memória envolve o armazenamento de informações vivenciadas por um indivíduo, referentes a algum evento específico, situado no tempo e no espaço (JAEGER, 2016). O conjunto de memórias faz com que o indivíduo seja como é, faz com que cada um se torne um ser ímpar para o qual não existe outro idêntico (IZQUIERDO, 2002). O hipocampo é considerado a estrutura cerebral mais importante envolvida no processo de formação e armazenamento da memória, dessa forma a capacidade de reter informações depende da integralidade do hipocampo (LARKIN et al., 2014).
Existem três tipos de memória: memória de curto prazo, longo prazo e de trabalho (IZQUIERDO, 2002; BEAR; CONNORS; PARADISO, 2008). A memória de curto prazo é aquela que se recorda por um breve espaço de tempo, como segundos ou horas e que são vulneráveis a perturbações. Já a memória de longo prazo dura dias, meses e até mesmo anos porque foi originalmente armazenada. Por fim a memória de trabalho que é aquela que é armazenada por tempo limitado e exige ensaio/repetição para ser conservada (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2008).
Com o aumento da população idosa no país o número de pessoas com Doença de Alzheimer também aumentou, esta é uma das principais doenças relacionada à perca de memória. Um estudo em 2002 mostrou que entre 1656 sujeitos com idade igual ou superior a 65 anos, 7,1% (118 indivíduos) tinham demência sendo que destes 55,1% foram diagnosticados com Doença de Alzheimer (CHAVES; FINKELSZTEJN; STEFANI, 2009).
A Doença de Alzheimer é a doença neurodegenerativa mais comum em idosos; em geral o primeiro sinal da doença é a perda da memória recente, enquanto vagas lembranças são presentes no estágio inicial da doença (SERENIKI; VITAL, 2008).
3.3 TESTES COMPORTAMENTAIS
A pesquisa pré-clínica em animais tem sido um importante instrumento para o atual entendimento dos transtornos de ansiedade, depressão e memória, envolvendo mecanismos neurais e psicofarmacológicos, A obtenção de evidências científicas clínicas que permitam produzir medicamentos fitoterápicos é um caminho que a ciência farmacológica percorre, onde modelos animais para pesquisa de novos fármacos são ferramentas fundamentais e o passo inicial (CARLI; MENDES, 2011).
A utilização de animais é uma ferramenta importante para o estudo e a compreensão dos transtornos psiquiátricos e déficits de memória, principalmente na busca de novos e melhores tratamentos (RODRIGUES, 2015).
Respeitando todas as normas estabelecidas por Guias de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da constituição, deveres e responsabilidades regidos pela Lei nº 11.794, de 2008.
3.4 FÁRMACOS QUE AGEM NO SNC 3.4.1 Diazepam
Diazepam faz parte do grupo dos benzodiazepínicos que possuem propriedades ansiolíticas, sedativas, miorrelaxantes, anticonvulsivantes e efeitos amnésicos. Sabe-se atualmente que tais ações são devidas ao reforço da ação do ácido gama-aminobutírico (GABA), o mais importante inibidor da neurotransmissão no cérebro (ANVISA, 2015).
O fármaco parece agir nos níveis límbico, talâmico, produzindo efeitos ansiolíticos, sedativos, hipnóticos e de relaxante muscular e anticonvulsivante. Os benzodiazepínicos podem produzir todos os níveis de depressão do sistema nervoso central, de sedação moderada, hipnose e coma (RANG et al., 2012). O medicamento pode produzir tolerância, o individuo tem que aumentar a dose progressivamente para surtir o efeito desejado, e também induz à dependência do usuário ao fármaco. Os efeitos adversos são náuseas, tremores, sonolência, amnésia, confusão e mudanças na libido (PAGE et al., 2004; RANG et al., 2012). 3.4.2 Imipramina
A imipramina pertence ao grupo de medicamentos dos antidepressivos tricíclicos, que são usados para tratar depressão e distúrbios do humor (RANG et al., 2012).
Este fármaco atua aumentando a oferta de noradrenalina e serotonina no cérebro, ou fazendo seus efeitos durarem mais tempo. A imipramina tem várias propriedades farmacológicas, incluindo-se as propriedades alfadrenolítica, anti-histamínica, anticolinérgica e bloqueadora do receptor serotoninérgico (5-HT). Contudo, acredita-se que a principal atividade terapêutica da imipramina seja a inibição da recaptação neuronal de noradrenalina (NA) e serotonina (5-HT). A imipramina é chamada de bloqueador "misto" da recaptação, ou seja, ela inibe a recaptação da noradrenalina e da serotonina, aproximadamente na mesma proporção (RANG et al., 2012).
3.4.3 Cafeína
A cafeína (1, 3, 7-trimetilxantina) é uma metilxantina que apresenta efeitos estimulantes sobre o coração, a respiração e o comportamento (SOUZA; SICHIERI, 2005; SIMONS et al., 2012).
De acordo com Simons et al., (2012) é a droga psicoestimulante mais consumida no mundo e está presente em alguns produtos como: café, chá, refrigerante a base de cola e chocolate.
O mecanismo de ação da cafeína envolve o antagonismo dos receptores de adenosina que ficam acoplados a proteína G de forma competitiva (GUERRA; BERNARDO; GUTIÉRREZ, 2000). A adenosina é um nucleosídeo com ações no sistema nervoso central e também na região periférica, que quando recebe algum tipo de interação no seu receptor A1. A cafeína tem ação antagonista nos receptores A1, com isso há aumento dos níveis de AMPcíclico (AMPc), considerado um segundo mensageiro intracelular, isso significa que as atividades neurais ocorrem de forma mais acelerada, sendo assim, há um aumento da concentração (RANG; DALE; RITTER; FLOWER; HENDERSON, 2012)..
3.4.4 Escopolamina
A escopolamina é um alcalóide encontrado principalmente na planta Datura
stramonium L., da família Solanaceae. Por ser um composto terciário de amônio, é
suficientemente lipossolúvel para ser rapidamente absorvido pelo intestino e, sobretudo, penetrar na barreira hematoencefálica. A escopolamina pertence à classe dos antagonistas de receptores colinérgicos: muscarínicos. Os efeitos adversos inerentes à escopolamina incluem visão turva, ressecamento na boca, fadiga, sonolência, sensação de mal-estar e enjôos (RUSSOMANO et al., 2005).
A acetilcolina (ACh), é um neurotransmissor excitatório, liberada de neurônios colinérgicos pós – ganglionares, que estimula receptores muscarínicos específicos na superfície das células parietais. Contudo o antagonismo desses receptores, que é o caso da escopolamina, causa uma redução de excitação. A deficiência desse tipo de efeito mediado pela ACh no cérebro, possivelmente está associada à demência, embora em camundongos apresentem apenas uma leve disfunção cognitiva (perda de memória recente) de acordo com a dose administrada (WESS; EGLEN; GAUTAM, 2007 apud RANG; DALE; RITTER; FLOWER; HENDERSON, 2012). 3.4.5 Piracetam
Pertence ao grupo farmacoterapêutico dos nootrópicos, o piracetam que é uma pirrolidona (2-oxo-1-pirrolidina-acetamida), um derivado cíclico do ácido gama-aminobutírico (GABA), é um fármaco usado por muitos anos em diferentes países para tratar impedimentos cognitivos no envelhecimento e em doenças neurodegenerativas. O seu mecanismo de ação foi inicialmente relacionado a modulação dos sistemas colinérgico e glutamatérgico e com isso promove a melhoria dos eventos relacionados a neuroplasticidade. Mais recentemente suas ações foram relacionadas a melhora na fluidez das membranas, inclusive das mitocondrias de células neuronais e melhorar o desempenho cognitivo (VAZ et al., 2011).
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 TIPO DE ESTUDO
O presente estudo tem caráter observacional comportamental. A manipulação experimental e a descrição de repertórios comportamentais são apenas alguns exemplos das muitas ferramentas utilizadas pela ecologia comportamental para incrementar a compreensão sobre as interações entre animais e plantas (DEL-CLARO et al., 2009).
4.2 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
Foram usadas folhas adultas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) para a análise anatômica e para a produção do extrato. As folhas foram obtidas a partir de mudas, já desenvolvidas, adquiridas em floriculturas e transplantadas em canteiros, na Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus Universitário de Sinop. Amostras testemunhas do material florífero e herborizado foram depositadas no Herbário Centro Norte Matogrossense da UFMT/CUS para obtenção de exsicatas, localizado 11°52’01.5”S 55°30’46.8”W.
4.3 PREPARAÇÕES DE EXTRATOS
Para obtenção do extrato, o material foi coletado e submetido à secagem em estufa a 40°C, moído e extraído três vezes por maceração com etanol 96%, na proporção de 1:10 (droga:solvente), em um volume de 15000 microlitros onde, 150uL de Propilenoglicol e 450uL de DMSO, completado com solução salina. por quinze dias à temperatura ambiente, sendo agitado diariamente. O extrato foi filtrado com papel de filtro e em seguida concentrado usando evaporador rotatório sob pressão reduzida.
4.4 ANÁLISE ANATÔMICA
Momentos antes dos cortes foram coletadas folhas totalmente adultas levadas para o Laboratório de Anatomia Vegetal do Câmpus Universitário de Sinop - MT para confecção das lâminas através de cortes transversais à mão livre da lâmina foliar, com o auxílio de uma lâmina de barbear, em material fresco e corados com Lugol para observação das estruturas.
As amostras foram analisadas em microscópio óptico da marca OPTON e a imagens capturadas em uma câmera acoplada ao microscópio com auxilio do programa ScopePhoto.
4.5 DELINEAMENTO DO ESTUDO
A pesquisa foi realizada no período de junho de 2017 a janeiro de 2018, com 80 camundongos machos da linhagem “Swiss”, de aproximadamente 45 dias de vida, provenientes do biotério da Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus de Cuiabá. Os mesmos foram aclimatados durante 15 dias no biotério do laboratório de comportamento animal, do Câmpus de Sinop, com ciclo claro/escuro 12 horas cada, umidade relativa do ar em torno de 80% e temperatura entre 21 a 23°C, recebendo ração própria para camundongos e água filtrada a livre demanda.
Os animais foram separados em caixas de polietileno 60cmx40cm, em 8 grupos com 10 animais em cada, que receberam diferentes fármacos via gavagem, sendo eles: I - que recebeu 10mg/kg de cafeína; II- 30mg/kg de imipramina, III- 2mg/kg de diazepam; IV - água filtrada, V e VI - 200 mg/kg e 400 mg/kg do extrato de Rosmarinus officinalis, VII - 200 mg/kg de piracetam e o grupo VIII - 1 mg/kg de escopolamina que só recebeu tratamento de forma aguda, no momento do Teste de Reconhecimento de Objetos.
Essas caixas foram forradas com maravalha estéril e limpas 3 vezes na semana para prevenir o crescimento de organismos que prejudiquem o bem-estar dos camundongos. Após o período de aclimatação, iniciou-se a administração dos extratos e fármacos controles via oral utilizando o método de gavagem 10UI, 1x ao dia sempre no mesmo horário. Posteriormente, os animais passaram pelos testes de comportamento, descritos a seguir:
4.6 TESTES COMPORTAMENTAIS 4.6.1 Campo Aberto
Para este teste utiliza-se um aparato redondo com a base dividida por quadrantes (Figura 2), no qual avalia-se a locomoção do indivíduo. O animal foi posto no centro do aparato, em seguida cronometrou-se 5 minutos contando quantos quadrantes ele percorreu neste período. Este teste foi o primeiro a ser feito visando analisar se o animal estava com a locomoção preservada para que não houvesse interferência nos testes subsequentes (OYEKUNLE; IBIRONKE; OPABUNMI, 2012).
Figura 2: Aparato usado para o teste de Atividade Locomotora Espontânea Fonte: Imagens do próprio pesquisador.
4.6.2 Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
Utilizou-se um aparato de madeira, na forma de cruz, elevado 50 cm do chão, que contam com dois braços abertos (50 x 10 cm) e dois fechado (50 x 10 x 40 cm) (Figura 3) para avaliar o nível de ansiedade do animal. O mesmo foi posto no centro do aparato, cronometrando 5 minutos, sendo que, durante esse tempo, ainda se cronometrou quantos minutos o camundongo ficou no braço aberto e quantos minutos ficaram no braço fechado, contando-se, ainda, quantas vezes ele entra no braço aberto e no braço fechado.
Figura 3: Aparato usado para o teste do LCE. Fonte: Imagens do próprio pesquisador.
O animal foi posicionado no centro do labirinto, com a cabeça voltada para um dos braços fechados, podendo andar livremente durante 5 minutos; após esse tempo o equipamento foi limpo com álcool 70%, para evitar qualquer alteração nos resultados devido ao cheiro dos outros animais. Cada animal foi observado e contado o número de entradas nos braços abertos (EBA), o tempo de permanência nos braços abertos (TBA), o número de entradas nos braços fechados (EBF) e o tempo de permanência nos braços fechados (TBF), para obter os índices de ansiedade. O índice ansiolítico foi determinado pelo aumento ou diminuição das porcentagens de EBA e TBA, sabendo que o animal tem aversão natural aos braços abertos e que, se for obrigado a permanecer neles, possivelmente demonstrará sinais de medo, caso contrário, certamente ficará mais tempo nos braços fechados (CARVALHO et al., 2012; RODRIGUES et al., 2011).
Foi utilizado pela primeira vez por Handley e Mithani, em 1984, a partir do modelo criado por Montgomery, em 1955 (CARLINI; MENDES, 2011; AYUOB et al., 2016).
Este teste é amplamente utilizado como triagem inicial para avaliar tanto fármacos com ação ansiolítica como fármacos com ação ansiogênica sobre a atividade exploratória de roedores, baseado no medo inato que estes animais apresentam a espaços abertos e não envolve treinamento prévio ou o uso de outros
testes, assim, tendem à permanecer mais tempo nos braços fechados. Portanto o aumento da exploração, a permanência e o número de entradas nos braços abertos pode ser um indicador de ansiólise (CARLINI; MENDES, 2011).
4.6.3 Esconder Esferas
Para este experimento caixas de policarbonato de 27x16x13 cm foram forradas com uma camada de 5 cm de maravalha sobre a qual foram distribuídas, ao acaso, 25 esferas de vidro com 1,5 cm de diâmetro (Figura 4). Essas caixas foram cobertas com uma placa de acrílico transparente com pequenos furos para ventilação (Figura 4).
Figura 4: Aparato utilizado no Teste de Esconder Esferas. Fonte: Imagens do próprio pesquisador.
Após 30 dias do tratamento (gavagem) com os fármacos e os extratos de alecrim, cada animal foi colocado em uma caixa individual e, ao término de 30 minutos, ele foi retirado e o número de esferas de vidro escondidas pelos animais registrado. Foram consideradas escondidas as esferas que estavam completamente cobertas pela maravalha (UMATHE et al., 2009 apud VERMA; AGRAWAL, 2018).
Quanto menor número de esferas escondidas, maior o efeito anti-compulsivo do tratamento realizado, visto que os roedores exibem o comportamento de esconder (enterrar) objetos aversivos como uma fonte de choque, alimentos nocivos
ou objetos inanimados como as esferas de vidro (FRIEDE; FREUDENSTEIN, 2002 apud BADGUJAR; SURANA, 2010).
O teste de esconder esferas é caracterizado por avaliar o comportamento do animal no que diz respeito à tentativa de esconder objetos potencialmente “perigosos”, sendo este comportamento reduzido ou suprimido pela ação de drogas ansiolíticas (LAPA et al., 2008; NICOLAS et al., 2006; SUGIMOTO et al., 2007 apud LAZIC, 2015).
4.6.4 Nado Forçado
Neste teste foi usado um recipiente, com 30 cm de diâmetro e 50 cm de altura, contendo 40 cm de volume de água, em temperatura ambiente, onde o animal foi analisado por 5 minutos (Figura 5).
Figura 5: Aparato utilizado no teste de Nado Forçado. Fonte: Imagens do próprio pesquisador.
O teste de nado forçado foi elaborado e descrito por Porsolt et al. (1978), faz parte do grupo de modelos etológicos baseados em estresse ambiental ou “desespero comportamental” (frequência da imobilidade) (CARLINI; MENDES, 2011).
O camundongo foi colocado no recipiente, obrigado a nadar sem possibilidade de fuga, durante 5 minutos. Nos primeiros 2 minutos esperava - se o comportamento de fuga, com nado em volta da circunferência do cilindro ou a tentativa de sair do ambiente de risco, caracterizando um momento de ansiedade. Nos últimos 3 minutos espera-se o estado de imobilidade, isto é, que o animal mantenha apenas os movimentos necessários para sobrevivência, demonstrando sinais de depressão. Considera-se efetivo o tratamento se o animal lutar pela fuga do ambiente de perigo o maior tempo possível. Assim, o teste foi avaliado de acordo com o aumento ou a diminuição do tempo de nado (MENEZES et al., 2008; CARLINI; MENDES, 2011).
4.6.5 Esquiva Inibitória “step down”
O equipamento usado consiste de uma caixa de vidro e plástico (50 x 25 x 25 cm), cujo chão apresenta barras de alumínio de 1 mm de diâmetro com espaçamentos de 1 cm de distância, conectado a um estimulador elétrico (Figura 6), e do lado esquerdo da caixa tem uma plataforma que não possui estímulo elétrico (25 x 8 x 5 cm).
Figura 6: Teste de esquiva inibitória, “step-down”. Fonte: Imagens do próprio pesquisador.
No primeiro dia do teste, os camundongos foram colocados no aparato durante 3 minutos para se familiarizar com o ambiente novo. No segundo dia, o animal foi posicionado na plataforma com o rosto virado para o lado oposto do pesquisador e no momento em que o camundongo colocou as quatro patas no assoalho de grade, recebeu um choque nas patas de 0,3 mA/s. Depois do estímulo o camundongo foi retirado imediatamente da caixa e após 1 hora foi reposicionado na plataforma, para avaliação da memória de curta duração (MCD). O tempo que os animais levarem para descer com as quatro patas da plataforma foi usado para indicar a retenção de memória. Conforme estabelecido o intervalo de 180 segundos foi determinado como tempo máximo de espera (latência) para a descida do animal durante os testes.
No terceiro dia, o animal foi colocado novamente na plataforma, para a avaliação da memória de longa duração (MLD) após 24 horas do treino. No padrão, o camundongo também levou no máximo 180 segundos, para se aventurar na grade do assoalho. Esse intervalo de tempo, em que o animal se sentiu seguro para descer, foi usado como indicativo de retenção de memória de longa duração (RODRIGUES et al, 2011; CARLINI; MENDES, 2011).
O teste de esquiva inibitória tipo “step-down” avalia a latência, ou seja, o tempo para descida dos camundongos da plataforma, é muito utilizado em laboratórios para avaliação da aprendizagem e memória (IZQUIERDO et al., 1998; VAKILI, et al., 2004; MAIA et al., 2009). A avaliação envolve uma fase de treino e pós-treino e um choque de baixa intensidade, o qual é um estímulo aversivo para que o animal não execute uma determinada tarefa que foi apresentada a ele (CARLINI; MENDES, 2011).
4.6.6 Reconhecimento de Objetos
A tarefa de reconhecimento de objetos foi realizada de acordo com Lager et al., (2013) ,esta tarefa foi realizada em uma câmara de madeira de dimensões 30x 30 x 30 cm, com paredes pintadas em preto, a parede frontal é feita em acrílico e o chão coberto com etil vinil acetato. Os objetos utilizados foram tijolos plásticos de montagem, cada um com diferentes formas e cores, porém mesmo tamanho. Ao longo das experiências os objetos foram utilizados de modo contrabalanceado a fim de mostrar que os animais não demonstram preferência por qualquer um dos objetos. A câmara e os objetos foram completamente limpos antes e depois de cada ensaio com etanol 30% (Figura 7).
Esta tarefa consiste de três fases distintas, cada uma com 10 minutos de duração: uma sessão de habituação, uma sessão de treino e uma sessão de teste no qual o animal deveria discriminar um objeto familiar de um objeto novo. Na primeira sessão, os camundongos foram habituados ao aparelho comportamental sem a presença de objetos e, em seguida, devolvidos à sua gaiola de origem. Vinte e quatro horas após foi realizada a sessão de treino, em que os animais foram expostos a dois objetos iguais (objeto A), e o tempo de exploração foi registrado com dois cronômetros. Uma hora de trinta minutos após o treino, foi realizada a sessão teste na qual foi colocado o camundongo novamente na câmara com um objeto A (famíliar) e o outro foi substituído pelo objeto B (novo) e cronometrado o tempo em que o animal explorou cada objeto para avaliar a memória de curto espaço. Vinte e quatro (24) horas após a sessão treino os camundongos foram colocados na câmara de comportamento e um dos objetos familiares (objeto A) foi substituído por um novo objeto (objeto B).
O tempo explorando o objeto familiar e o objeto novo foi cronometrado. A exploração foi considerada quando o animal atingiu, tocou ou direcionou o focinho para o objeto a uma distância de menos de 2 cm. Escalar ou sentar no objeto não foi considerado exploração.
Um escore de discriminação foi então calculado, levando em consideração a diferença entre o tempo de exploração do objeto novo e familiar no dia do teste, e utilizado como um parâmetro cognitivo (Tnovo - Tfamiliar). (LAGER et al., 2013).
Figura 7: Câmara de reconhecimento de objetos com objetos familiares. Fonte: Imagens do próprio pesquisador.
4.7 EUTANÁSIA
Após os testes comportamentais, os camundongos foram eutanasiados, através de inconsciência por aprofundamento de plano anestésico, em câmara de vaporização com isoflurano, durante 5 minutos, seguido de deslocamento cervical.
O método escolhido tem como vantagem a ausência de contaminação do material biológico; procedimento rápido quando executado de forma adequada e por profissional qualificado, são indicados para animais abaixo de 7 kg ou em casos de dificuldade de venopunção; o isofluorano não são inflamáveis e nem explosivos nas concentrações utilizadas (CONCEA, 2013). Após o procedimento, os animais foram descartados apropriadamente e coletados por empresa especializada.
4.8 ASPECTOS ÉTICOS
O presente trabalho respeitou todas as normas estabelecidas por Guias de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório com constituição, deveres e responsabilidades regidos pela Lei nº 11.794, de 2008 (SILVANIA et al., 2013).
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados estatísticos foram computados no software estatístico, sendo expressos pela média e o desvio padrão da média por grupo (D.P.M.), a diferença foi considerada estatisticamente significativa para valores de p<0,05. Os dados foram analisados através do teste de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados encontrados neste trabalho demonstram uma análise da anatomia vegetal da folha do Rosmarinus officinalis e o efeito do extrato hidroalcoólico de Rosmarinus officinalis no tratamento crônico de depressão, ansiedade, compulsão e défict de memória.
5.1 ANÁLISE ANATÔMICA
A epiderme unisseriada com células recobertas por cutícula delgada que impedem a perda de água da planta (Figura 8A-E). Apresentam tricomas tectores unicelulares, multicelulares (Figura 8A), simples e ramificados na face abaxial e tricomas glandulares que estão presentes em ambas as faces, é nos tricomas glandulares que o óleo da planta fica armazenado, nas nervuras e nas margens foliares, sendo que os da face abaxial são maiores que os da face adaxial. Estão presentes dois tipos de tricomas glandulares: séssil formado por quatro células na glândula, encontrado somente na face abaxil e outros menores e pendunculado, presentes em ambas as faces.
Figura 8: Seção transversal da lâmina foliar de Rosmarinus officinalis L. (A) TR (tricoma) 1 – Tricoma glandular em face interna, CT (corte transversal) 1 - A epiderme, recoberta por cutícula delgada, de secção transversal com aumento de 200x. (B) CT2 - A epiderme, recoberta por cutícula delgada, de secção transversal com aumento de 200x.(C) CT3 - A epiderme, recoberta por cutícula delgada, de secção transversal com aumento de 400x. (D) CT4 - A epiderme, recoberta por cutícula delgada, de secção transversal com aumento de 400x. (E) CT5 - A epiderme, recoberta por cutícula delgada, de secção transversal com aumento de 400x.
Devido estudos sobre a anatomia vegetal de Rosmarinus officinalis serem escassos na literatura, neste estudo foram utilizados artigos que falam sobre as caracteristicas anatomicas de plantas que pertencem a mesma família do
Rosmarinus officinalis, a familia Lamiaceae para discussão dos resultados.
Em secção transversal, a lâmina foliar de Ocimum gratissimum L. (Manjericão) um subarbusto aromático pertencente à família Lamiaceae, mesma família do Alecrim, possui epiderme unisseriada, com células da face adaxial maiores em relação às da face abaxial (FERNANDES et al., 2014), já a Salvia
hispanica L. (Chia) possui epiderme adaxial é unistrata com grandes células
prismáticas de paredes e cutícula convexas radiais e tangenciais finas, a epiderme abaxial possui células iguais de forma, menor, cutícula lisa e fina, planta que também pertence a família Lamiaceae (DI SAPIO et al. 2012).
De Oliveira et al., 2013 afirma que a Scutellaria agrestis A. St. –Hil Lamiaceae, possui diversos tricomas de tector com preservação, é composta por células simples ou múltiplas e uniseriadas; eles são geralmente, ligeiramente curvo no ápice e raramente reto, e revestidos com uma cutícula granulada, os tricomas do tector longo com um maior número de células são observados no lado adaxial, cobrindo toda a superfície da lâmina da folha, enquanto pequenos tricomas estão concentrados nas margens, cobrindo as veias em ambos os lados.
Em um estudo realizado por Félix-Silva, 2012 mostra que a folha de Alecrim apresenta tricomas tectores em forma de estrela e tricomas glandulares e epiderme superior contendo células poligonais de contorno reto.
5.2 TESTES COMPORTAMENTAIS
5.2.1 Teste de Atividade Locomotora Espontânea
O teste do campo aberto foi realizado para analisar qualquer efeito inespecífico, que poderia interferir nos resultados do extrato de Alecrim, avaliando a locomoção espontânea dos animais. Os resultados evidenciam que não houve alterações significativas na mobilidade dos animais expostos ao extrato de Alecrim e demais medicações administradas.
Neste teste os animais foram tratados com duas doses do extrato bruto de Alecrim, controle negativo, imipramina (controle positivo para depressão), diazepam (controle positivo para ansiedade), cafeína (controle para a memória), piracetam (controle para memória) e escopolamina (controle para memória). Após análise estatística do número de cruzamentos percebeu que não houve alteração na
mobilidade dos animais após o tratamento crônico de 30 dias conforme demonstra o Gráfico 1.
Gráfico 1: Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste de campo aberto (200 e 400 mg/kg- E 200 e E 400 v.o.), IMI - Imipramina (30mg/kg v.o.), DZP - diazepam (1mg/kg v.o), cafeína (10mg/kg v.o) como controle positivo, Controle negativo: CONT- água filtrada como controle negativo em camundongos avaliados no teste campo aberto. # p<0,05 (N=10)
Um estudo realizado por Ayuob et al., (2017) com o tratamento crônico de,
Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) verificou - se uma redução significativa de
cruzamentos, se sugerindo que a planta possui algum composto que causa letargia ou déficit de mobilidade nos animais podendo comprometer testes subsequentes, comparado aos controles. Já no estudo de Abbasi-Maleki, Bakhtiarian e Nikoui, 2017 os animais que consumiram Mentha piperita, da mesma família do Rosmarinus
officinalis L., Lamiaceae, ao comparar com os grupos controle não houve alterações
significativas na contagem de cruzamentos. O tratamento com óleo essencial, carnosol e betulínico ácido isolado de Rosmarinus officinalis 100mg/kg mostrou que o consumo deste composto não causou qualquer alteração significativana atividade locomotora de camundongos em relação ao grupo controle corroborando com nossos resultados (MACHADO et al., 2012).
O Gráfico 2 revela os resultados dos efeitos da administração crônica do extrato de alecrim (200 e 400mg/kg), controles negativos e DZP (1 mg/kg controle positivo). O teste do labirinto em cruz elevado avaliou o comportamento semelhante à ansiedade dos animais após o periodo de tratamento. A análise estatística mostrou uma diferença significativa entre o grupo tratado com extrato de Alecrim 400 mg/kg, quando comparado ao grupo controle negativo (água filtrada). Os animais que tomaram o extrato ficaram menos tempo no braço fechado do aparato, podendo sugerir um efeito ansiolítico. O teste LCE avalia diferentes parâmetros que estão relacionados à atividades ansiolíticas, motora e exploratória, tornando possível várias interpretações de comportamentos (RODGERS et al., 1997; ESPEJO, 1997 apud RODRIGUE, 2015).
B
C
Gráfico 2 - Efeito do tratamento crônico com o R. officinalis L. no teste de labirinto em cruz elevado (200 e 400 mg/kg- E 200 e E 400 v.o.), DZP - diazepam (1 mg/kg v.o.), como controle positivo, controle negativo: CONT- água filtrada, como controle negativo em camundongos avaliados no teste LCE, na percentagem de entradas nos braços abertos (%EBA) (A), número de entradas nos braços fechados (EBF) (B) e porcentagem do tempo nos braços fechados (%TBF) (C) durante 5 min.* O grupo que recebeu E 400 - extrato de alecrim 400 mg/kg permaneceu menos tempo no braço fechado comparado ao CONT- (água filtrada). #p<0,05 (N=10)
Neste teste é analisado o percentual de entradas nos braços abertos e o tempo que ele permanece nesse local, porque roedores evitam lugares elevados e desprotegidos (lugares perigosos) (KOMADA; TAKAO; MIYAKAWA, 2008; FRUSSA-FILHO, et al 2010 apud PINTO et al., 2012). De acordo com Ferlemi et al., (2015) o chá de Rosmarinus officinalis (130mg/kg) apresentou resultados positivos na atividade ansiolítica comparados ao controle (água filtrada), assemelhando-se com os resultados obtidos no estudo de Abdelhalim et al., (2015) que também testou os compostos do Rosmarinus officinalis. O mesmo foi observado por Ayuob et al., 2017 em camundongos albinos suíços tratado com Fluoxetina, Ocimum basilicum e expostos a estresse crônico moderado e imprevisível, onde os animais são expostos a fatores estressantes como: agitação intermitente, ambiente frio, alta umidade, luz contínua, ruído, assoalho descoberto (sem maravalha), gaiola-casa suja e molhada, bebedouro vazio e restrição alimentar, mostraram maior tempo no braço aberto comparado com os grupos controles.
5.2.3 Teste de Nado Forçado
O efeito do tratamento crônico da administração oral do extrato de Alecrim, imipramina (controle positivo), controles negativos: água filtrada, em camundongos adultos, avaliados no teste do nado forçado, estão demonstrados no Gráfico 3. ANOVA de uma via não revelou efeitos significantes entre os grupos. Este teste é amplamente utilizado em modelos farmacológicos para avaliar atividades antidepressivas, identificando substâncias com potenciais efeitos semelhantes aos antidepressivos (ABBASI-MALEKI; BAKHTIARIAN; NIKOUI, 2017).
O teste avalia o tempo de imobilidade do animal, um animal é considerado imóvel quando permanece flutuando passivamente na água, fazendo apenas os movimentos necessários para manter a cabeça acima da água (MACHADO et al., 2009; MACHADO et al., 2012).
