DETECÇÃO DO GENE eae EM AMOSTRAS DE Escherichia coli (AEEC) ISOLADAS DE COELHOS DE CRIAÇÕES DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL

1 Departamento. de Microbiologia e Imunologia , Instituto de Biologia, Unicamp-13081-970- Campinas, SP 2 Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas-II, USP,-05508-900- São Paulo, SP

3 Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp, Campus de Jaboticabal-14884-900- Jaboticabal, SP

DETECÇÃO DO GENE eae EM AMOSTRAS DE Escherichia coli

(AEEC) ISOLADAS DE COELHOS DE CRIAÇÕES DO

ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL

(CHARACTERIZATION OF eae GENE IN Escherichia coli (AEEC) STRAINS

ISOLATED FROM RABBITS IN THE STATE OF SÃO PAULO, BRAZIL)

A. DE S. PENTEADO

_{, L. A. UGRINOVICH}

_{, S. DA S. CORRÊA}

_,

M. N. OLIVEIRA

_{, A. F. P. DE CASTRO}

_{, F. A. DE ÁVILA}

RESUMO

Escherichia coli tem sido descrita como um dos principais agentes causadores de diarréia que acometem coelhos de criações dos países europeus, tradicionais criadores e consumidores da carne desses animais. No Brasil, a cunicultura surge menos expressiva, mas conta com número suficiente de criações para justificar maior atenção com agentes microbianos envolvidos na diarréia em coelhos. Este trabalho descreve, pela primeira vez em nosso país, o isolamento de colibacilos portadores do gene eae de coelhos com e sem diarréia. Todas as 90 amostras eae-positivas isoladas no presente estudo não apresentaram genes para produção das toxinas termolábeis (LT-I e LT-II), termoestáveis (STa, e STb) e shiga-toxinas (Stx1 e Stx2). Pela análise de biotipo, por meio do padrão de fermentação de carboidratos, foi verificado que nas amostras de E. coli isoladas, o padrão bioquímico apresenta-se distinto daquele observado na Europa.

PALAVRAS-CHAVE: Escherichia coli, diarréia, coelhos, gene eae.

SUMMARY

Escherichia coli has been described as one of the main etiological agents causing diarrhea among rabbits in European countries that traditionally breed and are consumers of the meat of these animals. In Brazil rabbit breeding is less expressive, but there are enough breeds to justify further attention with the microbial agents involved in rabbit diarrhea. This research reports, for the first time in Brazil, the isolation of rabbit E. coli harboring the eae gene from diarrheic and non-diarrheic animals. All 90 eae- positive strains of E. coli detected in this study did not produce thermolabile enterotoxins (LT-I and LT-II) , thermostable (STa and STb) and shiga-toxins (Stx1 and Stx2). Based on biotyping analysis according to the profile of carbohydrate fermentation revealed that rabbit E.coli isolated in Europe and Brazil belonged to different biotypes.

INTRODUÇÃO

Dentre os problemas sanitários que acometem criações de coelhos no Brasil, a diarréia talvez não seja a mais temida, pois geralmente não se apresenta letal para a maioria dos animais. No entanto, mesmo as formas mais brandas dessa doença levam a prejuízos financeiros para o produtor, pois afeta diretamente a conversão alimentar e o ganho de peso.

Em países europeus, principalmente Espanha, Holanda, Bélgica e França, tradicionais no consumo e criação de coelhos, são comuns as descrições de formas severas de diarréia, as quais são letais na maioria dos casos. Grande parte desses casos de diarréia é provocada pela bactéria Escherichia coli que apresenta características bem definidas quanto aos fatores de virulência (BLANCO et al., 1993; PEETERS et al., 1993). No entanto, a pesquisa deste agente diarreiogênico em amostras fecais de coelhos provenientes de criações brasileiras, de acordo com nosso conhecimento, é inexistente.

Em coelhos, ao contrário do que ocorre na maioria das espécies animais, a Escherichia coli normalmente não faz parte da microbiota intestinal. Essa característica se deve ao fato da presença de ácidos graxos voláteis (AGV) no intestino desses animais, o que inibe o crescimento dessa bactéria em animais sãos. No entanto, problemas na taxa de trânsito intestinal, métodos de alimentação e principalmente a composição alimentar podem alterar condições entéricas normais e favorecer a proliferação de E. coli no intestino de coelhos. Exemplos desses problemas podem ser dietas ricas em proteínas (acima de 18%), que provocam um incremento de amônio no ceco, promovendo elevação do pH; ou também dietas de alta concentração de fibras (acima de 17%) e baixa concentração de amido, o que favorece o decréscimo na concentração de AGV, tornando propício o ambiente para a proliferação de colibacilos. Condições de estresse, como falta de água para beber, frio e enfermidades respiratórias, também podem contribuir para um aumento da infecção (BLANCO et al., 1997a).

Desse modo, quando se realiza a coprocultura de fezes de coelho e o resultado obtido corresponde a um crescimento abundante de E. coli, a amostra normalmente apresenta-se como patogênica quando investigada para a presença de fatores de virulência (VARGA & PESTI, 1982).

Estudos realizados com a amostra de Escherichia coli denominada de RDEC-1, isolada de coelhos com diarréia, haviam identificado um novo mecanismo de patogenicidade, os quais não compreendiam produção de toxinas e não eram invasores (CANTEY & BLAKE, 1977). Posteriormente, foi descrita, em colibacilos isolados de coelhos com diarréia, a presença de genes envolvidos na

formação de lesões do tipo A/E (attaching and effacing) (MOON et al., 1983), entre eles, o gene eae (JERSE et al., 1990), que codifica uma proteína, denominada intimina de 94 kDa, que promove uma união íntima entre bactéria e célula hospedeira, desencadeando a destruição das microvilosidades das células do epitélio intestinal e a indução de formações citoplasmáticas semelhante a “pedestais” no ponto de contato com a bactéria (KNUTTON et al., 1989). Essa lesão é tipica de amostras de Escherichia coli entero-patogênicas (EPEC) e enterohemorrágicas (EHEC); a primeira causa diarréia em crianças de até um ano de idade (LEVINE et al., 1987), e a segunda é responsável pela síndrome urêmica-hemolítica (GRIFFIN et al., 1988) também em humanos. Amostras que produzem lesão A/E sem estarem ligadas aos dois grupos anteriores podem ser classificadas como AEEC (attaching and effacing Escherichia coli), ou REPEC (Rabbit EPEC), no caso de infecções em coelhos (ROBINS-BROWNE et al., 1994).

Pelo seqüenciamento pode-se determinar que os genes eae da amostra E2348/69 (EPEC) de origem humana e das amostras AEEC de coelho possuem seqüências homólogas de DNA (POHL et al., 1993; LEROY et al., 1994) chegando a apresentar homologia superior a 80% do gene eae de alguns sorotipos de amostras EPEC e EHEC e da bactéria Citrobacter rodentium (AGIN et al., 1996). A classificação de amostras de E. coli segundo seu padrão de fermentação de carboidratos permitiu a OKERMAN & DEVRIESE (1985) estabelecer um sistema de biotipagem baseando-se na fermentação de carboidratos. Esses carboidratos recebem como códigos números, sendo determinado o biotipo pela somatória dos números de todos os carboidratos que a amostra fermentou (PEETERS et al., 1988). Pela realização da biotipagem, observou-se que amostras de Escherichia coli portadoras do gene eae e que não fermentavam a ramnose eram isoladas de grande parte dos casos de diarréia severas em países europeus

Quanto à produção de toxinas, existem poucos relatos sobre a existência deste fator de virulência em amostras AEEC isoladas de coelhos com diarréia. O’BRIEN et al., (1982) identificaram pequena quantidade de Stx produzida pela amostra RDEC-1, no entanto POHL et al., (1993), ao testarem 41 amostras AEEC isoladas de coelhos, quanto à produção de Stx1 e Stx2, incluindo a amostra RDEC-1, identificaram apenas uma amostra pertencente ao sorotipo O26:K-:H11 como produtora de Stx1; a amostra RDEC-1 apresentou resultado negativo para produção das toxinas testadas.

O estudo de amostras de Escherichia coli isoladas de fezes de coelhos de criações brasileiras teve como objetivo principal a pesquisa dos fatores de virulência típicos de amostras patogênicas para coelhos de países

europeus, para verificar se amostras de REPEC, portanto eae-positivas, ocorriam no Brasil e qual a seria a sua importância para cunicultura nacional.

MATERIAL E MÉTODOS Amostras bacterianas.

Do estudo de 300 amostras de fezes, foram isoladas 178 amostras de Escherichia coli de diferentes criações do Estado de São Paulo, Brasil, das quais 148 eram diarréicas. Do crescimento bacteriano obtido da semeadura em MacConkey (Difco), foram escolhidas três colônias com aparência de E. coli de cada amostra fecal semeada, as quais foram submetidas às provas bioquímicas de EPM (TOLEDO et al., 1982a), MiLi (TOLEDO et al., 1982b) e citrato (EDWARDS & EWING, 1972) para identificação, e posterior estocagem em meio de BHI (Difco) acrescido de 15% de glicerol a -25ºC, e meio de Ligniéres (BIER, 1966).

Teste de PCR para gene eae.

Para o teste de amplificação do gene eae, seguiu-se metodologia seguiu-semelhante à utilizada por BLANCO et al. (1997b). Amostras de E. coli eram recolhidas do crescimento em TSA( trypticase soya agar), misturadas a 100µL de água e fervidas por 10min, para liberação e desnaturação do material genético. Os iniciadores de oligonucleotídeos utilizados foram descritos por GANNOM et al. (1993) e designados com base na publicação da seqüência de nucleotídeos do gene eae da amostra EPEC E2348/69 (sorotipo O127:H6) (acesso ao

GenBank. no

M58154 e M34051) (JERSE et al., 1990). Esse par de iniciadores amplifica uma seqüência de nucleotídeos de 815pb. São eles: eae1: 5’ - ACG TTG CAG CAT GGG TAA CTC (bases 1054 a 1074) e eae2: 5’ - GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG (bases 1869 a 1849). A amplificação do DNA bacteriano foi realizada em um volume de 100µL de solução contendo 10µL do DNA molde, 50pmol de cada iniciador; 0,2mM (cada) de

dATP, dGTP, dCTP e dTTP; 1,5mM MgCl_2, 20mM Tris

HCl (pH 8,4); 50mM KCl e 2,5U de Taq DNA Polimerase (Gibco-BRL). Após adição de uma camada de óleo mineral, procedia-se a 30 ciclos das temperaturas; 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto. O produto amplificado era corrido em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio e observado em transiluminador de UV.

Shiga-toxina (Stx1 e Stx2)

Para o estudo de Stx1, os iniciadores utilizados foram os seguintes: VT1-A : 5’- CGC TGA ATG TCA TTC GCT CTG C- 3’ e VT1-B : 5’ – CGT GGT ATA

GCT ACT GTC ACC– 3’ na concentração de 50pmol por 100mL de reação. Esses iniciadores amplificam um fragmento de 302 pares de bases, localizado entre os nucleotídeos de 113-134 para A e 394-414 para VT1-B (VT1-Blanco, M., comunicação pessoal). No estudo de Stx2, os iniciadores utilizados foram: VT2-A : 5’- CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG - 3’ e VT2-C : 5’ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC - 3’ na concentração de 50pmol por 100mL de reação. Esses iniciadores amplificam um fragmento de 515 pares de bases, localizados entre os nucleotídeos de 50-69 para VT2-A e 543-565 para VT2-C (Blanco, M., comunicação pessoal). Utilizou-se a mesma metodologia empregada nos demais testes, com exceção da temperatura de anelamento dos iniciadores, que foi de 55ºC por 1 minuto para ambos os iniciadores.

Enterotoxina Termolábil e Termoestável ( I, LT-II, STa e STb)

Para pesquisa de toxinas LT-I, LT-II, STa e STb, também foi utilizada a técnica de PCR. Para LT-I os iniciadores foram os sequintes: LTIA : 5’- GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC – 3’ e LTIB : 5’ – CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC – 3’. Esses iniciadores amplificam uma seqüência de 696 pares de bases do gene que codifica para LT-I (Blanco M., comunicação pessoal). Um fragmento de 176pb do gene que codifica para STa foi pesquisado pelos seguintes iniciadores: STI-A : 5’- ATT TTT ATT TCT GTA TTG TCT TT, - 3’e STI-B : 5’- GGA TTA CAA CAC AGT TCA CAG CAG T. – 3’. Estão localizados nos nucleotídeos de 22-44 e 173-197, respectivamente (Blanco, M., comunicação pessoal). Os iniciadores para LT-II foram: LTII1 5’ - AGA TAT AAT GAT GGA TAT GTA TC – 3’ e LTII2 : 5’- TAA CCC TCG AAA TAA ATC TC – 3’, que amplificam uma seqüência de 300pb e estão respectivamente localizados nos nucleotídeos 214-235 e 494-513 do gene que codifica para LTII (Blanco, J., comunicação pessoal) Os iniciadores para STb foram: STII-1: 5’- ATC GCA TTT CTT CTT GCA TC – 3’ e STII-2: 5’- G GGC GCC AAA GCA TGC TCC – 3’, que amplificam uma seqüência de 172pb e estão localizados respectivamente nos nucleotídeos 178-197 e 334-352 do gene que codifica para STb (Blanco, J., comunicação pessoal). Os iniciadores para LT-I foram utilizados na concentração de 50pmol por 100mL de reação, e os iniciadores para STa foram utilizados na concentração de 50pmol por 100mL de reação. Ambas as provas foram realizadas na temperatura de 48°C, para anelamento dos iniciadores. A concentração dos iniciadores para LT-II e STb foi de 50pmol por reação de 100mL e as temperaturas de anelamento foram de 52°C para LT-II e 60°C para STb. As demais condições de reação dos testes seguiram metodologia anteriormente descrita

para outras reações de PCR.

Biotipagem.

A biotipagem foi realizada segundo técnica descrita por CAMGUILHEM & MILON (1989), com algumas modificações, e baseia-se na capacidade das amostras testadas de fermentar os seguintes carboidratos: sorbose, dulcitol, D-rafinose, sacarose e L-ramnose. Foi utilizado o meio indicador de pH vermelho de fenol (Difco), que foi preparado segundo recomendações do fabricante. Uma alíquota de 50mlL foi retirada de um volume de 500mL, na qual se dissolveu o carboidrato para se proceder à esterilização por filtragem em filtros 0,22µm (Millipore). O filtrado foi adicionado ao meio restante acrescido de 2% de ágar, previamente esterilizado por autoclavação e vertido em placas de Petri. Cada amostra foi semeada em “spot” em placas contendo, cada uma, um carboidrato diferente. Também foram semeados controles positivos e negativos para cada carboidrato. Amostras capazes de fermentar o carboidrato em questão viravam o indicador vermelho de fenol para amarelo após incubação a 37°C por 18h. Pelo esquema proposto por CAMGUILHEM & MILON, cada carboidrato recebe um número de código: sorbose (código 1), dulcitol (código 2), D-rafinose (código 4), sacarose (código 8) e L-ramnose (código 16). O biotipo é determinado pela somatória dos números de código dos carboidratos que a amostra fermentou. Por exemplo, se uma amostra fermentou os carboidratos D-rafinose, sacarose, L-ramnose (4+8+16=28) ela se enquadra no biotipo 28.

RESULTADOS Teste de PCR.

Foram identificadas 90 (50,56%) amostras eae+ entre as 178 amostras isoladas (Figura 1, Tabela 1). O teste de PCR para identificação das toxinas Stx1 e 2, LT-I e LT-LT-ILT-I, STa e STb foi realizado com as 178 amostras isoladas, todas apresentando resultados negativos neste teste.

Biotipagem.

Observamos que 93 amostras, correspondendo a 52,23% das 178 estudadas, apresentaram o biotipo 28 (sorbose-, dulcitol-, D-rafinose+, sacarose+, L-ramnose+), 35, correspondendo a 19,66% de 178, apresentaram o biotipo 30 (sorbose-, dulcitol+, D-rafinose+, sacarose+, L-ramnose+), e 13 amostras (7,30%) apresentaram mais de um biotipo entre as três colônias estudadas. As demais amostras se encontram distribuídas entre os seguintes biotipos: 2(1), 9(2), 16(5), 17(2), 18(2), 19(7), 25(2), 26(5), 29(7), 31(4).

DISCUSSÃO

A diarréia em coelhos, assim como na maioria dos animais de interesse econômico, causa prejuízos financeiros, tanto pela mortalidade quanto pela queda de ganho de peso. Com base em pesquisas com agentes diarreiogênicos que acometem criações de coelhos na Europa (BLANCO et al., 1993; 1997a, b), conseguiu-se identificar 178 (59,33%) amostras de Escherichia coli entre as 300 amostras de fezes coletadas em criações de coelhos do Estado de São Paulo. O principal fator de virulência expresso por essas amostras foi a presença do gene eae. Esse gene, responsável pela produção de uma proteína, intimina, é um dos principais elementos do conjunto de genes que promovem a lesão de attaching and effacing (A/E) (JERSE et al., 1990; 1991) em células do epitélio intestinal, causando a diarréia por mecanismos até hoje não bem elucidados (KNUTTON et al., 1989).

A biotipagem, aliada à sorogrupagem, permitiu caracterizar os sorobiogrupos O132:B28 e O132:B30 como predominantes entre as amostras de E. coli isoladas de coelhos com diarréia. A diferença de biotipos entre amostras dos dois continentes, americano e europeu, pode explicar esse fato, pois em nosso estudo não foi encontrada nenhuma amostras eae+ não fermentadora do carboidrato ramnose, padrão de biotipo próprio da maioria das amostras de E. coli diarreiogênicas do continente europeu. Como pode ser observado, a freqüência do gene eae foi semelhante em amostras diarréicas e não diarréicas. A dinâmica da patogenia por REPEC ainda é desconhecida, mas o fato da diarréia em coelhos, no Brasil, ser provocada por amostras REPEC de virulência moderada permite que o animal se restabeleça e se torne portador da bactéria, podendo, desse modo, serem isoladas de animais sãos. Esta característica de similaridade de presença entre amostras diarréicas e não diarréicas também é observada em amostras EPEC isoladas da população infantil (Trabulsi, L.R., comunicação pessoal). De qualquer modo, a freqüência do gene eae em amostras de E. coli isoladas de coelhos no Brasil foi surpreendentemente elevada, quando comparada com outros animais, como por exemplo bovinos. AIDAR et al., (2000), examinaram 52 amostras de E.coli isoladas de bezerros com diarréia e encontraram apenas quatro amostras eae+. Estes achados nos levam a sugerir que as REPEC são importante causa de diarréia em coelhos em nosso país, e, embora com mortalidade mais baixa, ao contrário da Europa, provoca danos aos animais que sobrevivem , tais como desnutrição, atraso no desenvolvimento, com menor conversão alimentar (BLANCO et al., 1997b).

Tabela 1 - Resumo dos principais resultados obtidos no

estudo de amostras de Escherichia coli isoladas de coelhos.

(*) D- Rafinose, Sacarose, L-Ramnose.

(**) Dulcitol, D- Rafinose, Sacarose, L-Ramnose.

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Figura 1 - Resultados dos testes de PCR para algumas

amostras de Escherichia coli eae-positivas isoladas de coelhos no Brasil. Canaleta 1: Padrão de peso molecular; canaleta 2: Amostra de E.coli E2348/69, controle positivo; canaleta 3: E. coli K12 (C600), controle negativo e canaletas 4 – 8 amostras de E.coli eae-positivas isoladas no Brasil.

Amostras estudadas 178

Amostras diarreicas 148 (83,15%)

Amostras eae + 90 (50,56%)

Amostras eae+ entre as diarriecas 74 (50,00%) Amostras eae+ entre as não diarriecas 16 (53,33%) Amostras do biotipo 28 (*) 93 (52,23%) Amostras do biotipo 30 (**) 35 (19,67%) Amostras que apresentaram biotipos diferentes entre as

3 colônias isoladas

13 (7,30%) Amostras distribuídas entre outros biotipos 37 (20,80%) Amostras de sorobiogrupo O132:B28 entre as eae+ 43 (47,78%) Amostras de sorobiogrupo O132:B30 entre as eae+ 15 (16,67%) Amostras produtoras de toxinas 0 (0,00%)

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