PURIFICAÇÃO DAS PECTINASES DE Aspergillus japonicus URM5620 POR SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS PEG/FOSFATO

PURIFICAÇÃO DAS PECTINASES DE Aspergillus japonicus

URM5620 POR SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS

PEG/FOSFATO

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Universidade Federal Rural de Pernambuco – Rede Nordeste de Biotecnologia/RENORBIO, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.

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Universidade Federal Rural de Pernambuco – Unidade Acadêmica de Garanhuns E-mail para contato: portots@yahoo.com.br

RESUMO – Objetivou-se purificar as pectinases poligalacturonase-PG, endopoligalacturonase - endoPG, pectina liase-PL e pectina esterase-PE de Aspergillus japonicus URM5620 utilizando Sistema de Duas Fases Aquosas (SDFA) PEG/Fosfato. Elas foram produzidas por fermentação sólida com a casca do maracujá (5g), por 72h, 30ºC e 50% umidade. Para SDFA foi utilizado um planejamento fatorial 24 com pontos centrais, variando as concentrações de PEG–CPEG (12,5, 15 e 17,5%) e fosfato–CFOS (15,

20 e 25%), massa molar de PEG–MPEG (400, 3350 e 8000 g/mol) e pH (6, 7 e 8). Foram

avaliados o fator de purificação (FP), a recuperação (Y) e partição (K). A melhor condição foi MPEG 8000 (g/mol), CFOS 15% (m/m), CPEG 17,5% (m/m) e pH 6. Os FPs

encontrados foram PG (2,0), PG (0,23), PL (1,2) e PE (2,6). Com exceção da endo-PG os valores Y foram superiores a 70%. Segundo K apenas a endo-PG e PL particionaram para a fase rica em PEG. O SDFA apresentou bom desempenho na extração das pectinases aumentando as purificações e recuperações das atividades.

1. INTRODUÇÃO

As pectinases são um grupo de enzimas responsáveis pela catálise da degradação de moléculas complexas denominadas substâncias pécticas, que são polissacarídeos estruturais da parede primária das células vegetais jovens e principais componentes da lamela média, através da reação de despolimerização (hidrolases e liases) e desesterificação (esterases) (PEDROLLI et al., 2009).

Com base no seu modo de ação, as pectinases são classificadas em poligalacturonase, pectina liase e pectina esterase. Poligalacturonase são ainda classificados em endopoligalacturonase (CE 3.2.1.15) e exopoligalacturonases (CE 3.2.167) que hidrolisam os internos e externos - (1,4) ligações glicosídicas de pectina, respectivamente. Pectina liase (CE 4.2.2.10) rachadas - (1,4) ligações glicosídicas por transeliminação, o que resulta em galacturonato com duplo ligação entre C-4 e C-5 na extremidade não redutora, enquanto pectina esterase (EC 3.1.1.11) catalisa a hidrólise de metilo grupo para produzir pectina e metanol (REHMAN; QADER; AMAN, 2012). As poligalacturonases (PG)

são o maior grupo de enzimas que despolimerizam a pectina/ácidos pécticos por clivagem das ligações glicosídicas em reações de hidrólise (PALANIVELU, 2006). A poligalacturonase é a principal enzima despolimerizante de interesse comercial (SOUZA et al., 2010).

Sistemas de duas fases aquosas, principalmente os sistemas com PEG e sal, têm sido amplamente usados para biosseparação de enzimas e proteínas por conta do seu baixo custo. Além do mais o tipo do polímero e do sal, forças iônicas e pH do meio, juntamente com as características da molécula alvo, são as variáveis que mais influenciam a partição das moléculas. SDFA tem também sido empregado em diversos campos na indústria biotecnológica para purificação de enzimas, interferon, anticorpos, e na bioconversão extrativa. Esta técnica é considerada potencialmente atrativa para obter enzimas industriais, com fácil aumento de escala e minimização da desnaturação das proteínas, entre outras vantagens. Com o objetivo de obter alto rendimento e também bom fator de purificação para a proteína-alvo, uma composição adequada para o SDFA deve ser selecionada para extrair de forma quantitativa a proteína desejável para uma das fases do sistema com a mínima contaminação possível (PORTO et al., 2010).

Este trabalho teve como objetivo purificar as pectinases poligalacturonase, endo-poligalacturonase, pectina liase e pectina esterase de Aspergillus japonicus URM5620 utilizando o Sistema de duas fases aquosas PEG/fosfato.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Fermentação sólida (FSS): O micro-organismo utilizado foi o Aspergillus japonicus URM5620 da micoteca da Universidade Federal de Pernambuco. A fermentação ocorreu em Erlenmeyer de 125 mL contendo 3g da casca do maracujá como substrato. O substrato foi umedecido a 50% com uma solução nutritiva (extrato de levedura 0,5% e dextrose 1% em tampão acetato de sódio 0,1M e pH 5,5), e a solução de esporos com concentração inicial de 107 esporos/mL. A fermentação ocorreu em entufa a 30ºC durante 72 horas. A extração foi realizada retirando-se o fermentado para a maceração com a adição de 30 mL de tampão acetato pH 4,5 e filtração em peneiras contendo gases para obtenção do extrato bruto. O extrato foi centrifugado 1000 rpm durante 20 minutos para a decantação das células e retirada do sobrenadante os quais foram armazenados a -20ºC.

Sistema de duas fases aquosas (SDFA): Para a purificação da poligalacturonase (PG) produzida por Aspergillus japonicus URM5620 os experimentos foram conduzidos conforme planejamento fatorial completo 24. Utilizou-se o programa STATISTICA (Statsoft Inc 8.0) onde os dados foram submetidos a análise de variância com p<0,05 de significância contendo 20 ensaios com 4 repetições do ponto central objetivando estimar o erro experimental. As variáveis avaliadas no SDFA PEG/fosfato foram concentrações de PEG–CPEG (12,5, 15 e 17,5%) e fosfato–CFOS (15, 20 e 25%), massa molar de PEG–

MPEG (400, 3350 e 8000 g/mol) e pH (6, 7 e 8). A purificação ocorreu em tubos de centrífuga

graduados (15 mL), contendo as quantidades calculadas de PEG e sal, onde foi adicionado o extrato enzimático fermentado. Em seguida adicionou-se água deionizada para ajustar a concentração final desejada de cada componente e completar o peso final do sistema fixado em 5g. A melhor condição de purificação foi considerada o ensaio que proporcionou a melhor combinação com base no fator de

purificação (FP). Foram calculados também o coeficiente de partição (K) e recuperação da atividade (Y).

Atividade de Poligalacturonase (PG - E.C.3.2.1.67): A atividade da exo-PG foi determinada como o proposto por Miller (1959) misturando 500 μL de uma solução de pectina cítrica 1,0% em tampão acetato 0,1 M pH 4,5 incubado a 40°C por 15 minutos, para estabilização de temperatura e 500 μL de extrato enzimático, incubado a 40°C por 40 minutos em banho-maria. Após decorrido este tempo, foi retirado 100μL desta mistura de reação e adicionou-se 1 mL de solução de DNSA, a mistura foi mantida em ebulição por 5 minutos para formação de cor, resfriados em banho de gelo e adicionados 5,0 mL de água destilada e agitado em vórtex. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a 540 nm. A atividade enzimática foi calculada de acordo com curva padrão estabelecida com ácido α-D-galacturônico como açúcar redutor. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1μmol de ácido galacturônico por minuto (U/mL= μmol/mL.min). Atividade de endo-Poligalacturonase (endo-PG – E.C. 3.2.1.15): A atividade da endo-PG foi medida com um viscosímetro de Ostwald. Misturou-se 5,5 mL de solução de pectina 2,5% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,2 M pH 4,5, com 250 μL do extrato enzimático. As misturas foram homogeneizadas em vórtex e submetidas a incubação durante 10 minutos a 50ºC, ao passar desse período a reação foi interrompida colocado as misturas em um banho de gelo. O branco foi realizado igualmente ao citado anterior com substituição do extrato enzimático por água destilada. Sendo medida também o tempo de escoamento da água destilada. Uma unidade viscosimétrica (UV) foi definida como a quantidade de enzima necessária para diminuir em 50% a viscosidade inicial da solução do substrato em um minuto de reação.

Atividade de pectina esterase (PE – E.C. 3.1.1.11): A atividade da PE foi realizada incubando em banho-maria por 2 horas a 50 ° C, 2,0 mL de solução de pectina 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,2 M pH 4,5 e 1,0 mL do extrato enzimático. A reação foi interrompida com um banho de água fervente por 3 min e resfriamento em banho de gelo. Adicionou-se 10μL de fenolftaleína e titulou-as com NaOH 0,01 M. O branco foi preparado com as mesmas condições da amostra, substituindo-se o extrato enzimático por igual volume de tampão. Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera um microequivalente de grupos carboxílicos em 1h de reação, nas condições descritas.

Atividade de pectina liase (PL – E.C. 3.2.1.10): A atividade da PL foi determinada misturando 1,0 mL de solução 0,5% (p/v) de pectina cítrica em tampão Acetato 0,2M pH 4,5 com 1,0 mL de extrato enzimático, incubando-as por 1 hora a 40°C. A reação foi interrompida pela adição de 3,5 ml de HCl 0,5 M. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 235ηm contra o branco preparado nas mesmas condições da amostra, substituindo-se o extrato enzimático por igual volume de tampão. Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 µmol de produtos urônicos insaturados por minuto, com base no coeficiente de extinção molar (ε235 = 5550 M-1cm-1), no qual é utilizado para o cálculo de atividade UA = (ΔA/ε235). 106(µmol/mL/min), onde ΔA é o aumento de absorbância por minuto.

modificado, que utiliza como o corante o Coomassie Brilliant Blue. Em seguida os dados foram plotados em uma curva de calibração feita a partir de uma solução de soroalbumina bovina (BSA). A reação ocorreu com a mistura de 50 μL do extrato enzimático bruto ou purificado em 1,5 mL da solução de Bradford. Os tubos foram agitados e lidos em espectrofotômetro a 595 nm. O branco foi realizado nas mesmas condições só que no lugar da amostra foi adicionado água destilada.

3. RESULTADOS E SDISCUSSÕES

3.1. Extração da Poligalacturonase (PG - E.C.3.2.1.67)

O objetivo inicial deste trabalho foi determinar a melhor condição para a extração da PG, pectinase de maior interesse comercial e em seguida a extração das demais enzimas (PE, PL e endo-PG) com base no resultado obtido da PG. Assim os resultados de extração da PG no SDFA PEG/Fosfato estão representados na Tabela 1.

Tabela 1: Resultados do planejamento fatorial 24 para a purificação de poligalacturonase produzidas por A. japonicus URM5620 utilizando PEG/Fosfato

Ensaio MPEG (g/mol) CPEG (%m/m) Cfos (%m/m) pH K Y Top FPTop 1 400 12,5 15 6 4,65 53,94 0,72 2 8000 12,5 15 6 3,32 66,55 1,74 3 400 17,5 15 6 5 64,70 1,30 4 8000 17,5 15 6 6,54 121,87 2,06 5 400 12,5 25 6 7,4 51,82 0,93 6 8000 12,5 25 6 10,91 80,85 1,19 7 400 17,5 25 6 6,68 69,68 1,09 8 8000 17,5 25 6 12,71 102,41 1,22 9 400 12,5 15 8 *** *** *** 10 8000 12,5 15 8 2,36 14,41 0,21 11 400 17,5 15 8 3,46 36,41 0,41 12 8000 17,5 15 8 6,15 41,38 0,57 13 400 12,5 25 8 2,12 14,28 0,20 14 8000 12,5 25 8 7,83 43,44 0,66 15 400 17,5 25 8 0,37 3,36 0,05 16 8000 17,5 25 8 8,20 54,70 1,30 17 3350 15 20 7 7,94 64,08 1,00 18 3350 15 20 7 9,06 64,98 1,04 19 3350 15 20 7 8,78 61,00 0,96 20 3350 15 20 7 8,87 63,64 1,06

YTOP - recuperação da fase TOP; FPTOP- fator de purificação na fase TOP; YTOP- recuperação da fase TOP; MPEG – massa

Como observado na Tabela 1 o sistema 9 não apresentou separação de fases. Segundo (PORTO et al., 2010) os valores máximos e mínimos de PEG e o sal não podem variar muito, pois se corre o risco de vários pontos da matriz do planejamento permanecerem na região a baixo da curva binodal onde estão localizadas na região monofásica. Altas concentrações de sais dificultam a solubilização nos sistemas por supersaturação do meio e o tempo de agitação pré-determinado de 1 minuto pode ser insuficiente para solubilização uma vez que além dos sais há também o PEG que contribui para a dificuldade na solubilização dos sólidos. Carvalho et al., (2008) e Oliveira et al., (2001) em suas pesquisas concluíram que polímeros com maior massa molar tem o poder de mover a curva binodal para a esquerda do gráfico, próximo ao ponto de origem dos eixos, possibilitando um aumento da área bifásica, ou seja onde se formam o sistema de duas fases aquosas.

O SDFA PEG/Fosfato apresentou maior fator de purificação de 2,06 no ensaio MPEG 8000 (g/mol), CFOS 15% (m/m), CPEG 17,5% (m/m) e pH 6 na fase superior rica em PEG (TOP). A recuperação da atividade inicial neste sistema consegui alcançar valor acima de 100%. Segundo Mayerhoff, Roberto e Franco (2004) esse fato pode ter ocorrido porque provavelmente houve eliminação dos inibidores durante a purificação no SDFA.

A resposta K representa quantitativamente o comportamento de particionamento das enzimas, se elas migraram mais para a fase rica em sal ou rica em PEG. A PG apresentou maior afinidade pela fase rica em PEG no SDFA PEG/Fosfato, onde esse fato é comprovado pelos valores de K mostrados na Tabela 1. Se K>1 a migração das pectinases foram mais para a fase rica em PEG, se K<1, as pectinases migraram mais para a fase rica em sal.

Mokhtarani et al., (2008), perceberam comportamento para K iguais ao deste trabalho. Em sua pesquisa eles estudaram o particionamento de ciprofloxacina no SDFA e concluíram que o aumento da percentagem de CPEG aumentou o valor de K, e que o coeficiente de partição reduziu a baixas concentrações de PEG. Bora Borthankur e Dutta (2003) também afirmaram em seu trabalho de particionamento utilizando sistema de duas fases aquosas com antibióticos de cefalosporina, que os valores de K aumentaram em altas concentrações de PEG.

Outros autores obtiveram bons resultados de purificação e recuperação utilizando os sais fosfato para o SDFA. Babu, Rastogi e Raghavarao (2008) obtiveram um FP 4 e 2,7 para a bromelina e polifenoloxidase do abacaxi no SDFA PEG/Fosfato no ensaio MPEG 1500 (g/mol), CPEG 18% (m/m),

CFOS 14% (m/m) e pH 7. Deloisa, Hernández e Palomares (2009) em seu trabalho para recuperação de

lacase a partir do composto residual de Agaricus bisporus em SDFA, encontraram uma recuperação de 95% com PEG 1000, CPEG 18,2% (m/m) e concentração de fosfato – Cfos 15% (m/m).

Os efeitos principais, interações de segunda e terceira ordem para o SDFA PEG/Fosfato estão representados na Tabela 2.

Tabela 2: Efeitos principais e interações entre as variáveis para a extração de poligalacturonase – PG produzida por A. japonicus URM5620 no SDFA PEG/Fosfato.

Ensaio K Y FP 1 14,32* 33,78* 23,98* 2 5,32* 24,70* 13,20* 3 12,50* 3,10* -2,02 4 -13,48* -58,91* -38,70* 1x2 3,95* 8,90* 1,88 1x3 8,99* 7,75* -0,42 1x4 4,48* -4,61* -0,41 2x3 -5,61* -13,09* -5,61* 2x4 0,61 -6,09* 0,90 3x4 -5,88* 3,77* 13,20* 1x2x3 0,72 -1,34 5,50* 1x3x4 -0,42 10,09* 15,39* 1x2x4 -1,48 -5,18* 6,44* 2x3x4 -3,10 -5,31* 2,41

(1) MPEG – massa molar do PEG, (2) CPEG – concentração do PEG, (3) CFOS – Concentração de fosfato e (4) pH. (*) variáveis significantes a p<0,05 .

Tendo como variável resposta o fator de purificação, observa-se na Tabela 2 que os efeitos principais da massa molar do PEG (1) e concentração de fosfato (3) foram os mais significativos (p<0,05) positivamente. Isso mostrou que estas variáveis influenciaram no aumento da resposta por si só. O pH (4) apresetou efeito negativo,mostrando que esta variável diminuiu a resposta desejada.

Para os efeitos das interações de segunda ordem, o efeito entre concentração de fosfato (3) e pH (4) foi o mais significativo e apresentou sinal positivo. Interação positiva significa que as variáveis com efeitos sinérgicos, ou seja, a medida que se aumenta ou diminui os níveis de uma variável, a resposta será favorecida se a outra variável se comportar da mesma forma. Neste caso de acordo com a Tabela 2 o maior fator de purificação ocorreu com diminuição dos níveis de ambas as variáveis.

Para a resposta recuperação (Y) o efeito principal pH (5) foi o mais significante negativamente. Entretanto a interação de segunda ordem que mais influenciou a resposta significativamente foi entre concentração de PEG (2) e concentração de fosfato (3). Essa interação foi negativa mostrando que variáveis de primeira ordem tiveram efeito antagônico uma sobre a outra. Ou seja, para que a resposta possa ser favorecida será necessário diminuir o nível da variável que menos influenciou, neste caso a concentração de fosfato (3), e aumentar o nível da variável que mais influenciou a resposta positivamente, concentração de PEG (2).

A extração da endo-poligalacturonase, pectina liase e pectina esterase foram determinadas com base no melhor sistema de extração da PG (MPEG 8000 (g/mol), CFOS 15% (m/m), CPEG 17,5%

recuperação da atividade inicial após processo de extração (Y). A PE obteve o maior índice de recuperação 163,8% dentre as enzimas estudadas e apresentou FP 2,6. A endo-PG apresentou um FP de 0,37 com Y 23,46%. Os coeficientes de particionamento K da PL, PE e endo-PG foram 2,17, 0,93 e 0,29, respectivamente.

Os resultados do SDFA PEG/Fosfato mostraram que o melhor desempenho para extração da principal pectinase a PG foi no sistema constituído por MPEG 8000 (g/mol), CFOS 15% (m/m), CPEG

17,5% (m/m) e pH 6. O SDFA aumentou a purificação das pectinases bem como a recuperação da atividade. Com exceção da endo-PG que apresentou recuperaçao a baixo de 50%. Segundo K apenas a PG e PL particionaram para a fase rica em PEG.

4. REFERÊNCIAS

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