Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 17

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Boletim de Pesquisa

e Desenvolvimento

17

Flábio Ribeiro de Araújo

Valeska Shelda Pessoa de Melo

Carlos Alberto do Nascimento Ramos

Cláudio Roberto Madruga

Cleber Oliveira Soares

Raul Henrique Kessler

Nalvo Franco de Almeida

Graziela Santos de Araújo

Leucio Camara Alves

Roberto Augusto de Almeida Torres Júnior

Stênio Perdigão Fragoso

Paulo Rodrigo Claure Arauco

Gisele Bacenelli

Maristelli Barbosa de Oliveira

Desenvolvimento de Ensaios de

Imunoadsorção Enzimática

Baseados em MSP1a e MSP2

Recombinantes de Isolado

Brasileiro de Anaplasma

marginale

Campo Grande, MS

2004

ISSN 1679-0790 Novembro, 2004

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Corte Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

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Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na:

Embrapa Gado de Corte

Rodovia BR 262, km 4, CEP 79002-970 Campo Grande, MS Caixa Postal 154

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Comitê de Publicações da Unidade

Presidente: Ivo Martins Cezar

Secretário-Executivo: Mariana de Aragão Pereira

Membros: Antonio do Nascimento Rosa, Arnildo Pott, Cacilda Borges do Valle, Ecila

Carolina Nunes Zampieri Lima, Lúcia Gatto, Maria Antonia Martins de Ulhôa Cintra, Mariana de Aragão Pereira, Rodiney de Arruda Mauro, Tênisson Waldow de Souza

Supervisor editorial: Ecila Carolina Nunes Zampieri Lima Revisor de texto: Lúcia Helena Paula do Canto

Normalização bibliográfica: Maria Antonia M. de Ulhôa Cintra Foto de capa: Flábio Ribeiro de Araújo

Editoração eletrônica: Ecila Carolina Nunes Zampieri Lima

1a_edição

1a_{impressão (2004): 500 exemplares}

A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação

dos direitos autorais (Lei no_9.610).

CIP-Brasil. Catalogação-na-publicação. Embrapa Gado de Corte.

Desenvolvimento de ensaios de imunoadsorção enzimática baseados em MSP1a e MSP2 recombinantes de isolado brasileiro de Anaplasma marginale / Flábio Ribeiro de Araújo ... [et al.]. − Campo Grande : Embrapa Gado de Corte, 2004.

24 p. ; 21 cm. − (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Gado de Corte, ISSN 1679-0790 ; 17).

ISBN 85-297-0187-9

1. Imunologia. 2. Anaplasma marginale. 3. Bovino. 4. Técnica imunoenzimática. 5. Brasil. I. Araújo, Flábio Ribeiro de. II. Melo, Valeska Shelda Pessoa de. III. Ramos, Carlos Alberto do Nascimento. IV. Madruga, Cláudio Roberto. V. Soares, Cleber Olivei-ra. VI. Kessler, Raul Henrique. VII. Almeida, Nalvo Franco de. VIII. Araújo, Graziela Santos de. IX. Alves, Leucio Camara. X. Torres Júnior, Roberto Augusto de Almeida. XI. Fragoso, Stênio Perdigão. XII. Arauco, Paulo Rodrigo Claure. XIII. Bacenelli, Gisele. XIV. Oliveira, Maristelli Barbosa de. XV. Embrapa Gado de Corte (Campo Grande, MS). XVI. Título. XVII. Série.

CDD 636.0896079 (21. ed.) © Embrapa 2004

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Autores

Flábio Ribeiro de Araújo

Médico-Veterinário, M.Sc., CRMV-MS No_1.895,

Embrapa Gado de Corte, Rodovia BR 262 Km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002-970 Campo Grande, MS. Endereço eletrônico: [email protected] Valeska Shelda Pessoa de Melo

Médica-Veterinária, M.Sc., Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE. Endereço eletrônico: [email protected] Carlos Alberto do Nascimento Ramos

Médico-Veterinário, Bolsista de Mestrado Fundect-CNPq. Cláudio Roberto Madruga

Méd.-Vet., Ph.D., CRMV-MS No_{0587, Embrapa Gado}

de Corte, Rodovia BR 262 Km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002-970 Campo Grande, MS. Endereço eletrôni-co: [email protected]

Cleber Oliveira Soares

Méd.-Vet., Ph.D., CRMV-RJ No_{5.344, Embrapa Gado}

de Corte, Rodovia BR 262 Km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002-970 Campo Grande, MS. Endereço eletrôni-co: [email protected]

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Raul Henrique Kessler

Médico-Veterinário, Ph.D., CRMV-MS No_0575,

Embrapa Gado de Corte, Rodovia BR 262 Km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002-970 Campo Grande, MS. Endereço eletrônico: [email protected] Nalvo Franco de Almeida

Cientista de Computação, Ph.D., Professor Adjunto do Departamento de Computação e Estatística da Universi-dade Federal de Mato Grosso do Sul − UFMS, Campo Grande, MS. Endereço eletrônico: [email protected] Graziela Santos de Araújo

Cientista de Computação, M.Sc., Departamento de Computação e Estatística da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul − UFMS, Campo Grande, MS. Endereço eletrônico: [email protected]

Leucio Camara Alves

Médico-Veterinário, Ph.D., Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE. Endereço eletrônico: [email protected] Roberto Augusto de Almeida Torres Júnior

Engenheiro-Agrônomo, Ph.D., CREA No_9.880/GO,

Embrapa Gado de Corte, Rodovia BR 262, Km 4, Caixa Postal 154, 79002-970 Campo Grande, MS. Endereço eletrônico: [email protected]

Stênio Perdigão Fragoso

Biólogo, Ph.D., Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Curitiba, PR. Endereço eletrônico:

[email protected]

Paulo Rodrigo Claure Arauco

Biólogo, Técnico do Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Curitiba, PR. Endereço eletrônico:

[email protected] Gisele Bacenelli

Acadêmica de graduação em Biologia. Bolsista de Iniciação Científica Fundect-CNPq.

Maristelli Barbosa de Oliveira

Acadêmica de graduação em Biologia. Bolsista de Iniciação Científica Fundect-CNPq.

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Sumário

Resumo ... 7

Abstract ... 9

Introdução ... 10

Metodologia ... 10

Resultados e Discussão ... 14

Conclusão ... 21

Agradecimentos ... 21

Referências Bibliográficas ... 21

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Desenvolvimento de Ensaios de

Imunoadsorção Enzimática

Baseados em MSP1a e MSP2

Recombinantes de Isolado

Brasileiro de Anaplasma marginale

Flábio Ribeiro de Araújo

Valeska Shelda Pessoa de Melo Carlos Alberto do Nascimento Ramos Cláudio Roberto Madruga

Cleber Oliveira Soares Raul Henrique Kessler Nalvo Franco de Almeida Graziela Santos de Araújo Leucio Camara Alves

Roberto Augusto de Almeida Torres Júnior Stênio Perdigão Fragoso

Paulo Rodrigo Claure Arauco Gisele Bacenelli

Maristelli Barbosa de Oliveira

Resumo

Ensaios de imunoadsorção indireta (ELISAs) baseados em MSP1a e MSP2 recombinantes de isolado brasileiro de Anaplasma marginale foram desenvolvi-dos para detecção de anticorpos contra esta riquétsia em bovinos. As altas sensibilidades (99% para ambos os testes) e especificidades (100% para ambos os ensaios) foram confirmadas pela análise de soros positivos ou negativos para anticorpos contra A. marginale, respectivamente, por imunofluorescência indireta. Pela análise de 583 amostras de soros de bovinos de três mesorregiões do Estado de Pernambuco, a concordância entre os dois testes foi alta, com índice kappa de 0,89. As prevalências de bovinos soropositivos também foram determinadas pelos dois ensaios, os quais definiram as mesorregiões de Recife e Zona da Mata como de estabilidade enzoótica para anaplasmose; e a mesorregião do Agreste como de instabilidade enzoótica. Os desempenhos similares dos dois ELISAs sugerem que ambos os testes podem ser usados em estudos

epidemiológicos, para a detecção de anticorpos contra A. marginale em bovinos. Termos para indexação: Imunologia, técnica imunoenzimática, Brasil.

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Development of

Enzyme-linked Immunosorbent

Assays Based on

Recombinant MSP1a and

MSP2 from a Brazilian

Isolate of Anaplasma

marginale

Abstract

Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on recombinant MSP1a and MSP2 from a Brazilian isolate of Anaplasma marginale were developed for detecting antibodies against this rickettsia in cattle. The high sensitivities (99% for both tests) and specificities (100% for both tests) were confirmed with sera from cattle positive or negative for A. marginale antibodies, respectively, by immunofluorescent antibody test. By the analysis of 583 sera samples from cattle of three regions of Pernambuco State, Brazil, the agreement between both tests was high, with a kappa index of 0.89. Prevalences of seropositive cattle were also assessed by both ELISAs, which defined the regions of Recife and Zona da Mata as enzootically stable for anaplasmosis; and the region of Agreste as enzootically unstable. The similar performances of the ELISAs suggest that both tests can be used in epidemiological surveys for the detection of antibodies to A. marginale in cattle.

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Desenvolvimento de ensaios de imunoadsorção enzimática baseados em MSP1a eMSP2 recombinantes de isolado brasileiro de Anaplasma marginale

Introdução

A anaplasmose, causada pela riquétsia Anaplasma marginale, é uma doença endêmica em áreas tropicais e subtropicais do mundo, transmitida por carrapa-tos. A enfermidade causa consideráveis perdas econômicas à bovinocultura de corte e de leite (Kocan et al., 2003), e é caracterizada, durante a fase aguda da infecção, por febre, anemia, fraqueza generalizada, mucosas pálidas, perda de peso (Ajayi et al., 1978), aborto (Correa et al., 1978), decréscimo na produção de leite e mortalidade (Palmer et al., 1986).

Uma variedade de testes sorológicos, como a imunofluorescência indireta – IFI – (Lohr et al., 1973), a fixação de complemento (Gainer, 1961), o teste de aglutinação (Welter & Zuschek, 1962) e a imunoadsorção enzimática – ELISA – (Thoen et al., 1980) têm sido usados para detectar anticorpos contra A.

marginale. Embora a sensibilidade desses testes, em geral, seja considerada

aceitável, há potencial para ocorrência de reações falso-positivas quando antígenos brutos são utilizados, por causa da contaminação com proteínas de eritrócitos (Barry et al., 1986).

Os avanços nas técnicas bioquímicas, imunológicas e moleculares durante a última década têm sido aplicados à pesquisa com A. marginale (Kocan et al., 2003). Como resultado, as proteínas principais de superfície (Major Surface

Proteins – MSPs) com potencial para diagnóstico foram identificadas (Palmer et

al., 1986; Oberle et al., 1988; Visser et al., 1992).

Os objetivos do presente estudo foram desenvolver, avaliar e comparar ELISAs baseados em MSP1a e MSP2 recombinantes, duas proteínas imunodominantes de membrana de A. marginale, com a finalidade de disponibilizar métodos mais eficazes de diagnóstico dessa riquétsia.

Metodologia

A extração de DNA genômico de A. marginale foi realizada a partir do sangue de um bezerro Nelore, esplenectomizado, infectado experimentalmente com um isolado brasileiro de A. marginale (Zona da Mata, PE), mantido em isolamento na Embrapa Gado de Corte. O sangue desse animal foi colhido em frascos contendo heparina como anticoagulante, quando a riquetsemia atingiu 87%.

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Desenvolvimento de ensaios de imunoadsorção enzimática baseados em MSP1a e

MSP2 recombinantes de isolado brasileiro de Anaplasma marginale

O DNA foi purificado a partir de 350 µL de sangue, utilizando kit Easy DNA (Invitrogen, EUA), conforme metodologia descrita pelo fabricante. A qualidade e concentração do DNA extraído foram avaliadas por espectrofotometria, em aparelho GeneQuant (Pharmacia, EUA), bem como por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídeo e visualização em transiluminador UV.

Os oligonucleotídeos iniciadores para amplificação dos fragmentos de DNA foram desenhados baseando-se nas seqüências de msp1a e msp2 disponíveis no Genbank (números de acesso - msp1a: AY010247 e msp2: AF317726), usando-se o programa DNASTAR. No caso de msp1a, os oligonucleotídeos

msp1aF (5’ GGGTACGCCACCTATCTCGC 3’) e msp1aR (5’

AACAAGCTGTGTAGTAGTGTCCGAAGG 3’) foram desenhados para amplificar um fragmento de 626 pares de bases – pb –, que codifica para a porção hidrofílica da região carboxi (C)-terminal da proteína MSP1a. No caso de msp2, os oligonucleotídeos msp2F (5’ GCAGGCGGCGAGGGTCTATTTTCA 3') e

msp2R (5' AGAATCCCCCTAAGCGTTGCCGAACCTCAA 3') foram desenhados

para amplificar um fragmento de 1.211 pb, que codifica para parte da região amino (N) terminal conservada, toda a região central hipervariável e toda a região C-terminal da proteína MSP2.

As reações da polimerase em cadeia – PCR – foram preparadas em um volume de 50 µL, contendo 10 mM de tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de cada dNTP, 100 ηg de cada oligonucleotídeo iniciador, 100 ηg de DNA, e 2,5 U de Taq DNA polimerase (CenBiot, Brasil). A amplificação foi realizada em termociclador PTC-200 (MJ Research), no seguinte esquema: 35 ciclos de desnaturação a 94°C por um minuto; anelamento a 61°C por um minuto para msp1a e a 60°C por um minuto para msp2, e extensão a 72°C por um minuto para msp1a e um minuto e meio para msp2. Adicionalmente, para ambos os fragmentos, realizou-se extensão final a 72°C por sete minutos. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídeo e visualizado em transiluminador UV. Em segui-da, foram utilizados para ligação ao plasmídeo de expressão pTrcHis-TOPO (Invitrogen, EUA), conforme instruções do fabricante. Após transformação de

Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, EUA), quimicamente competente, a seleção

das bactérias transformadas foi feita em meio Luria-Bertani – LB – ágar com 100 µg/mL de ampicilina.

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A presença e a orientação dos insertos foram verificadas por PCR de colônia, com os oligonucleotídeos iniciadores msp2F (inserto) e pTrcHis reverse (vetor), no caso de msp2, e msp1aF (inserto) e pTrcHis reverse, para msp1a.

No Instituto de Biologia Molecular do Paraná, os fragmentos clonados foram seqüenciados em ambas as direções, pelo método de dideoxi, em seqüenciador automático capilar (modelo ABI 3100, Applied Biosystems). Para tanto, foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores Xpress e pTrcHis reverse (Invitrogen, EUA).

A expressão dos genes foi feita em caldo LB com 100 µg/mL de ampicilina, após a adição de 1 mM de isopropil-tio-β-D-galactopiranosídeo – IPTG – e incubação por seis horas a 37°C, sob agitação (250 rpm).

A purificação das proteínas recombinantes foi realizada por cromatografia de afinidade, usando resina de agarose-níquel (ProBond Purification Kit, Invitrogen, EUA), segundo instruções do fabricante. Utilizou-se o protocolo de purificação híbrido, com lise celular e ligação das proteínas recombinantes em condições desnaturantes, seguidas de eluição em condições não desnaturantes, visando à renaturação protéica.

As amostras das culturas para as proteínas MSP1a e MSP2 recombinantes, bem como das frações purificadas, foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% com dodecil sulfato de sódio – SDS –, seguido de coloração com azul brilhante de Coomassie.

A antigenicidade das proteínas MSP1a e MSP2 recombinantes foi testada por

Western blot com soros de bovinos imunes contra A. marginale de diferentes

regiões do Brasil. Um Western blot com MSP2 recombinante e o anticorpo monoclonal – AcMo – ANAO70A2, específico para MSP2 (McGuire et al., 1984), também foi realizado.

Para a padronização dos ELISAs, diluições ótimas de MSP1a e MSP2 recombinantes, soros e conjugado foram determinados pela avaliação de seis soros de bovinos negativos para anticorpos contra A. marginale, e seis soros de bovinos positivos para anticorpos contra a riquétsia, por imunofluorescência indireta – IFI. O procedimento a seguir foi selecionado por apresentar as maiores diferenças nas densidades ópticas – Dos – entre os soros positivos e negativos.

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Placas de 96 poços (Greiner Bio One, ref. 655001) foram adsorvidas com 10 ηg/poço de MSP1a recombinante ou 5,7 ηg/poço de MSP2 recombinante, diluídas em salina fosfatada de Dullbelcco – DPBS –, pH 7,2, por quatro horas, a 4ºC. As placas foram bloqueadas com 100 µL/poço de soro eqüino livre de γ-globulinas a 5%, diluído em tampão fosfato com 0,1% de tween (PBST), pH 7,2, por 60 minutos, a 37ºC. Após três lavagens com PBST, 100 µL/poço dos soros controle e testes, diluídos em PBST a 1:600, foram incubados por 60 minutos a 37ºC. As placas foram então lavadas cinco vezes com PBST, e 100 µL/poço da anti-IgG de bovino marcada com peroxidase (Sigma, ref. A-7414), diluídos em PBST, foram adicionados aos poços. As placas foram incubadas por 30 minutos a 37ºC e, após cinco lavagens com PBST, 50 µL/poço do

cromógeno/substrato OPD (Sigma)/ H₂O₂ foram adicionados. As reações foram paradas após dez minutos, pela adição de H₂SO₄ (2,5 N) e os resultados obtidos em leitor Bio-Tek EL-800, com filtro de 490 ηm.

Os pontos de corte para os dois ensaios foram determinados segundo

metodologia descrita por Frey et al. (1998), com intervalo de confiança de 99%, utilizando12 soros negativos para anticorpos contra A. marginale.

Para determinação dos parâmetros de qualidade dos ELISAs, foram utilizados soros de bovinos negativos para anticorpos contra A. marginale pela IFI, oriun-dos do município de Bagé, RS, e de bezerros mantioriun-dos no isolamento da Embrapa Gado de Corte. Também foram utilizados soros de bovinos naturalmen-te infectados com A. marginale dos Estados de Mato Grosso do Sul e Goiás, bem como de bezerros experimentalmente infectados com a riquétsia (isolado Zona da Mata-PE), mantidos no isolamento da Embrapa Gado de Corte, positivos para anticorpos pela IFI. Foram determinados os seguintes parâmetros, expressos em percentuais, segundo Coggon et al. (1993): sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e precisão.

As prevalências de anticorpos contra A. marginale foram determinadas pelos dois testes com 583 amostras de soros de bovinos de três mesorregiões do Estado de Pernambuco (Metropolitana do Recife, Agreste e Mata). As amostras foram obtidas de 16 rebanhos com aptidão leiteira ou mista, criados de forma intensiva e semi-intensiva, com fenótipos predominantemente de Girolando, e alguns das raças Holandesa e Pardo Suíço.

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Na avaliação quantitativa da concordância entre os ELISAs com MSP1a e MSP2, determinou-se o índice kappa (Kramer & Feinstein, 1981). Às amostras com resultados discordantes entre os dois ELISAs, foi aplicado o teste exato de Fischer. Já as diferenças nas taxas de prevalências de anticorpos contra A.

marginale entre mesorregiões de Pernambuco foram analisadas pelo teste de

Qui-quadrado.

Resultados e Discussão

As amplificações de msp1a e msp2 por PCR, como esperado, resultaram em fragmentos de cerca de 626 e 1.211 pb, respectivamente (Fig. 1).

Fig. 1. Amplificação por PCR de msp1a e msp2 de isolado brasileiro

(Pernambuco-Zona da Mata) de Anaplasma marginale. Linhas - 1: marcador 1 kb plus (Invitrogen); 2: fragmento de msp1a; 3: fragmento de msp2.

Foto: Flábio Ribeiro de Araújo

As seqüências dos dois fragmentos clonados apresentaram alinhamentos significativos, usando o programa Blastx (base de dados nr), com seqüências de MSP2 (No_{de acesso: AAL26275, e-value 10}-178_{) e MSP1 (N}o_{de acesso}

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A indução de msp1a e msp2 com IPTG resultou em bandas protéicas de aproxi-madamente 33 e 42,2 kDa, respectivamente, as quais foram purificadas por cromatografia de afinidade com resina de agarose/níquel (Fig. 2 e 3). A MSP1a recombinante foi parcialmente solúvel, enquanto que MSP2 recombinante foi completamente insolúvel. A expressão máxima ocorreu com 4-6 horas de indução.

Fig. 2. Expressão de msp1a de isolado brasileiro (Pernambuco-Zona da Mata) de

Anaplasma marginale. Linhas – 1: Escherichia coli TOP10 transformada com pTrcHis-TOPO/msp1a sem indução com IPTG; 2: indução por 2 h com IPTG; 3: indução por 4

h com IPTG; 4: indução por 6 h com IPTG; 5: fração solúvel; 6: fração insolúvel; 7: MSP1a recombinante purificada.

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Fig. 3. Expressão de msp2 de isolado brasileiro (Pernambuco-Zona da Mata) de

Anaplasma marginale. Linhas – 1: Escherichia coli TOP10 transformada com pTrcHis-TOPO/msp2 sem indução com IPTG; 2: indução por 2 h com IPTG; 3: indução por 4 h

com IPTG; 4: indução por 6 h com IPTG; 5: fração solúvel; 6: fração insolúvel; 7: MSP2 recombinante purificada.

As proteínas MSP2 e MSP1a, transferidas para membrana de nitrocelulose, reagiram com soros de bovinos positivos para anticorpos contra A. marginale, de diferentes regiões do Brasil. A MSP2 recombinante também reagiu com AcMo ANAO70A2.

A despeito da existência de uma região central em MSP2, que compreende epitopos variáveis, inclusive em isolados brasileiros (Oliveira et al., 2003), essa proteína apresenta extremidades N e C terminais conservadas (French et al., 1999). Da mesma forma, MSP1a apresenta, em sua extremidade N terminal, domínios repetitivos em número variável, e uma região C terminal conservada (Allred et al., 1990). As proteínas recombinantes utilizadas neste trabalho incluem domínios conservados, o que se reflete no reconhecimento delas por

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soros de bovinos positivos para anticorpos contra A. marginale de diferentes regiões do Brasil.

Os resultados relativos à sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo, e precisão dos ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes estão demonstrados na Tabela 1. Os testes apresentaram desempenhos idênticos.

Tabela 1. Desempenhos dos ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes na detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale.

MSP1a recombinante Positivo Negativo Total 106 (a+b) 90 (c+d) 196 (a+b+c+d) 0 (b) 89 (d) 89 (b+d)

Total

Positivo

106 (a) 1 (c) 107 (a+c)

Negativo

Estado de infecção dos bezerros

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ELISA

MSP2 recombinante Positivo Negativo Total 106 (a+b) 90 (c+d) 196 (a+b+c+d) 0 (b) 89 (d) 89 (b+d) 106 (a) 1 (c) 107 (a+c) (1) _{Determinado por imunofluorescência indireta.}

De acordo com Coggon et al. (1993):

Sensibilidade: a / (a+c) x 100 = 99% para ambos os testes Especificidade: d / (b+d) x 100 = 100% para ambos os testes

Valor preditivo positivo: a / (a+b) x 100 = 100% para ambos os testes Valor preditivo negativo: d / (c+d) x 100 = 98,9% para ambos os testes Precisão: (a+d) / (a+b+c+d) x 100 = 99,5% para ambos os testes

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As sensibilidades dos ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes foram elevadas (99% para ambos os testes), situando-se entre o ELISA indireto com antígeno bruto (100%) (Madruga et al., 2000) e o ELISA competitivo com MSP5 recombinante e anticorpo monoclonal – AcMo – ANAF16C1 (96%) (Torioni de Echaide et al., 1998) para detecção de anticorpos contra A.

marginale. As sensibilidades ligeiramente inferiores dos ELISAs com MSP1a e

MSP2 recombinantes perante o ELISA com antígeno bruto provavelmente foi por maior diversidade de epitopos encontrados neste último.

Também nos ELISAs houve reconhecimento de MSP1a e MSP2 recombinantes por soros de bovinos de diferentes regiões do Brasil (Goiás e Mato Grosso do Sul, isolados heterólogos; Pernambuco Zona da Mata, isolado homólogo) com alta sensibilidade, refletindo a conservação de domínios em ambas as proteínas. Com relação à especificidade (100% em ambos os testes), os ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes apresentaram resultados superiores aos encontra-dos no ELISA indireto com antígeno bruto (94%) (Madruga et al., 2000) e ao ELISA competitivo (95%) (Torioni de Echaide et al., 1998).

A superioridade na especificidade dos ELISAs com MSP1a e MSP2

recombinantes perante o ELISA com antígeno bruto foi, provavelmente, por ausência de contaminação com proteínas de eritrócitos, as quais são apontadas como causas de reações falso-positivas em ELISAs que utilizam antígeno bruto, pela reação com anticorpos antieritrócitos nos soros testados (Barry et al., 1986).

A especificidade inferior do ELISA competitivo (95%) com relação aos ELISAs com MSP1a e MSP2 (100%) foi, provavelmente, por presença de proteína de ligação à maltose – PLM – fusionada à MSP5 naquele teste. Reações com anticorpos anti-PLM residuais nos soros podem bloquear a ligação do AcMo ANAF16C1 à MSP5 (Torioni de Echaide et al., 1998). Essa proteína não está presente nos ELISAs indiretos com MSP1a e MSP2 recombinantes, os quais apresentam, além de alta sensibilidade e especificidade, as vantagens de prescin-direm de anticorpos monoclonais e da etapa de adsorção prévia dos soros. A concordância de resultados entre os ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes está demonstrada na Tabela 2.

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Tabela 2. Concordância entre os ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes de isolado brasileiro (Pernambuco-Zona da Mata) de Anaplasma marginale, usando soros de três mesorregiões do Estado de Pernambuco.

MSP2+ MSP2

−−−−−

Total 526 57 583 10 55 65

Total

MSP1a+

516 2 518

MSP1a

−−−−−

ELISA

Dos 583 soros analisados, 571 apresentaram resultados idênticos em ambos os testes (MSP1a+/MSP2+ ou MSP1a–/MSP2–), correspondendo a uma concor-dância de 97,9%, com índice kappa de 0,89. No entanto, com relação aos resultados discordantes, pôde-se verificar que no ELISA com MSP1a recombinante, houve uma ocorrência significativamente maior de resultados negativos (P=0,039), o que pode ser resultado de uma sensibilidade um pouco mais baixa ou de uma especificidade um pouco mais alta deste ELISA. Entretan-to, tal diferença é de baixa magnitude e não implica em uma clara vantagem de um teste sobre o outro, já que a concordância entre ambos os ensaios foi alta. As prevalências de anticorpos contra A. marginale em bovinos de três

mesorregiões do Estado de Pernambuco estão demonstradas na Tabela 3. Pelos resultados das prevalências de anticorpos contra A. marginale, obtidas nos ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes, as mesorregiões de Recife e Zona da Mata foram classificadas como de estabilidade enzoótica para anaplasmose, com prevalências superiores a 75%. Já a mesorregião do Agreste foi classificada como de instabilidade enzoótica para anaplasmose, já que as prevalências foram abaixo de 75%.

Essas diferenças na situação epidemiológica da anaplasmose entre mesorregiões podem ser explicadas pelas distintas condições climáticas. As mesorregiões Metropolitana do Recife e da Mata apresentam clima tropical úmido, enquanto a região do Agreste representa uma área de transição entre a faixa litorânea, com clima tropical úmido, e vastos pediplanos sertanejos (caatingas) de clima semi-árido (Pernambuco..., 2005). Desta forma, as condições climáticas na última mesorregião são menos favoráveis ao desenvolvimento do carrapato Boophilus

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Tabela 3.

Prevalências de anticorpos contra

Anaplasma marginale

em bovinos de três mesorregiões do Estado de

Pernambuco, determinadas pelos ELISAs com MSP1a e MSP2 recombinantes. Recife Mata Agreste Total

308 130 80 518 95,1 (a) 87,2 (b) 72,7 (c) 88,9 % N o de soros analisados 95,7 (a) 89,9 (b) 74,5 (c) 90,2 310 134 82 526 Mesorregião 324 149 110 583 N o de soros positivos N o de soros positivos %

ELISA MSP1a recombinante

ELISA MSP2 recombinante

Obs.: Taxas seguidas por letras distintas na mesma coluna são estatisticamente diferentes pelo teste do Qui-quadrado, ao nível

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As prevalências para cada mesorregião não diferiram estatisticamente entre os ELISAs com MSP1a e MSP2. Essa evidência, associada à alta concordância entre os ELISAs, demonstra que ambos os testes podem ser utilizados para estudos epidemiológicos, os quais são importantes na escolha das medidas de controle da anaplasmose mais adequadas, tais como imunização ou controle da população de carrapatos.

Conclusão

Os testes ELISA com MSP1a e MSP2 recombinantes apresentaram bons desem-penhos, sendo passíveis de utilização em estudos epidemiológicos para detecção de anticopos contra A. marginale em bovinos.

Agradecimentos

À Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul – Fundect – e ao Conselho Nacional de Desen-volvimento Científico e Tecnológico – CNPq.

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