Chromogranin A ELISA

Chromogranin A

ELISA

Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa de

Cromogranina A humana em soro e plasma humanos (EDTA).

RE53971

96

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

1.

APLICAÇÕES

Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa de Cromogranina A humana em soro e plasma humanos (EDTA).

2.

SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO

A cromogranina A é uma proteína ácida, de 49 kDa, que consiste em 439 aminoácidos codificados no cromossoma 14. A cromogranina A foi identificada em vários tecidos endócrinos normais e neoplásicos. Ficou comprovado que um nível elevado de cromogranina A em circulação seria um marcador para tumores de origem neuroendócrina. No entanto, a utilização clínica mais significativa da cromogranina A está relacionada com o procedimento de diagnóstico em pacientes com feocromocitoma. Segue-se um breve resumo da potencial utilização de cromogranina A.

1. Um marcador muito sensível (83%) e altamente específico (96%) na avaliação de suspeita ou presença de feocromocitoma. Os medicamentos normalmente usados no diagnóstico ou tratamento do feocromocitoma têm pouco efeito no nível plasmático da cromogranina A. Isto significa que é uma grande vantagem medir a cromogranina A em vez de medir as catecolaminas.

2. Para determinar a origem de um tumor. Um nível elevado de cromogranina A indica que o tumor tem origem nos tecidos neuroendócrinos.

3. Os tumores endócrinos não produzem as suas hormonas específicas, por exemplo, o carcinoma de células C negativo para calcitonina, mas positivo para cromogranina A; o carcinoma de células zero; o carcinoma de células beta; o carcinoma de paratiroide.

3.

PRINCÍPIO DO TESTE

O ensaio utiliza a técnica “sanduíche” de dois locais com dois anticorpos selecionados que se ligam a diferentes epítopos de cromogranina A humana.

Os padrões e os controlos do ensaio e as amostras do paciente são adicionados diretamente aos poços de microtitulação da microplaca que foi revestida com um anticorpo policlonal cromogranina A. Após o primeiro período de incubação, o anticorpo na parede do poço de microtitulação captura a cromogranina A humana na amostra e as proteínas não ligadas em cada poço de microtitulação são removidas na lavagem. Depois, adiciona-se a cada poço de microtitulação um anticorpo monoclonal de cromogranina A humano marcado com peroxidase de rabanete (HRP) e forma-se então uma “sanduíche” de “anticorpo monoclonal – anticorpo policlonal de cromogranina A humana”.

O anticorpo monoclonal não ligado é removido na fase de lavagem subsequente. Para a deteção deste imunocomplexo, o poço é então incubado com uma solução de substrato numa reação cronometrada e depois medida num leitor espectrofotométrico de microplacas.

A atividade enzimática do imunocomplexo ligado à cromogranina A na parede do poço de microtitulação é diretamente proporcional à quantidade de cromogranina A presente na amostra. É gerada uma curva padrão ao representar-se graficamente a absorvância versus a concentração respetiva de cromogranina A humana para cada padrão num ajuste ponto por ponto, da escala cúbica ou da curva de 4 parâmetros. A concentração da cromogranina A humana nas amostras de teste é determinada diretamente a partir desta curva padrão.

4.

AVISOS E PRECAUÇÕES

1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.

2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.

3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.

4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.

5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.

com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.

8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.

9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.

10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.

5.

ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE

O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.

A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 °C.

6.

RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS

Plasma (EDTA), Soro

Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria. Prefere-se usar plasma EDTA.

Sangue total deve ser coletado em tubos de centrífuga contendo anticoagulante e centrifugado após a colheita (10 minutos a 850-15000 g).

Armazenamento: TA (18-25°C)  -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente.

Evitar armazenamento a 2-8°C

Estabilidade: 72 h 6 meses

Para envio, as amostras devem ser congeladas (Dióxido de carbono) ou à temperatura ambiente (18-25° C).

7.

MATERIAIS FORNECIDOS

Quantidade Símbolo Componente

1 x 12 x 8 MTP Microplaca _{Pronto a usar. Tiras separáveis. Revestida com anticorpo contra cromogranina A}

humana.

1 x

5 x 0.5 mL CAL A-E LYO

Padrão A-E liofilizado

Contêm: cromogranina A humana, ASB, estabilizantes, não azida, conservantes livre do mecúrio. Para concentrações exactas consultar etiquetas dos frascos ou o certificado CQ.

1 x 2 x 0.5 mL

CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO

Controlo 1+2 liofilizado

Contêm: cromogranina A humana, ASB, estabilizantes, não azida, conservantes livre do mecúrio. Intervalos aceitáveis ver etiquetas dos frascos ou certificado QC.

1 x 12 mL ENZCONJ Conjugado Enzimático _{Pronto a usar. Contêm: anticorpo contra cromogranina A humana (monoclonal)}

conjugado com HRP numa matriz de proteína estabilizada.

1 x 30 mL ASSAYBUF Tampão de Reacção _{Pronto a usar. Contêm:tampão fosfato, ASB.}

1 x 30 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem Concentrado (30x)

Contêm: tampão fosfato, não azida conservantes livre do mecúrio.

1 x 12 mL TMB SUBS Solução de Substrato TMB _{Pronto a usar. Contêm: TMB (tetramethylbenzidine) peróxido de hidrogénio estabilizado.}

1 x 12 mL TMB STOP Solução de Paragem TMB _{Pronto a usar. Contêm: 0.5 M H}

8.

MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS

1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 0-20 µL; 10-100 µL; 100-1000 µL

2. Vortex

3. Agitador orbital (350-450 rpm)

4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente

5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm

(comprimento de onda de referência 600-650 nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada

8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro

9.

NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO

1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.

2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.

3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.

4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem.

5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.

6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços.

7. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.

8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.

10.

INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE

10.1. Preparação de Componentes liofilizados Componente

Diluir / dissolve

r

Diluente Observações Armazenam

ento Estabilidade CAL A-E LYO

CONTROL 1+2 LYO

com 0.50 mL

agua bidest.

Deixar repousar 15 min. Misturar sem fazer espuma.

 -20°C (Alíquotas)

Data Validade Evitar congelar-descongelar

repetidamente.

10.2. Preparação de componentes concentrados Diluir /

As amostras de que se suspeite conterem concentrações mais elevadas que o maior padrão têm que ser diluídas com Tampão de Reacção.

11.

PROCEDIMENTO DO ENSAIO

1. Pipetar 15 μL de cada Padrão, Controlo e amostra para os respectivos poços da Microplaca. 2. Pipetar 200 µL de Tampão de Reacção para cada poço.

3. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a TA (18-25°C) num agitador orbital a

350-450 rpm. Manter afastado luz solar directa.

4. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 5 x com 350 µL de Solução de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.

5. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.

6. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a TA (18-25°C) num agitador orbital a

350-450 rpm. Manter afastado luz solar directa.

7. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 5 x com 350 µL de Solução de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.

8. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem

deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem.

9. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço.

10. Incubar 20 min a TA (18-25°C) num agitador orbital a 350-450 rpm. Manter afastado luz solar

directa.

11. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB a cada poço.

Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo.

12. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência:

600-650 nm) nos 10 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.

12.

CONTROLO DE QUALIDADE

Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões e controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o ensaio não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais.

No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade de reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem.

13.

CÁLCULO DE RESULTADOS

Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Recomendamos o uso da curva de 4 parâmetros próprios para o controle e cálculo da amostra do paciente. Outros programas de ajuste de curva, como Point-to-Point, Log-Log, Log-Linear, etc. pode dar uma recuperação linear pobres.Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado).

Curva de Calibração Típica

(Exemplo. Não usar para cálculos!)

Padrão ng/mL DO Média A 0.0 0.110 B 19.2 0.184 C 75 0.400 D 203 1.064 E 660 2.465

Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.

No caso de amostras diluídas os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente.

14.

INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.

15.

VALORES ESPERADOS

Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores:

Chromogranin A Concentração: < 100 ng/mL > 100 ng/mL 400.000 ng/mL amostras positivas/testadas: 67 5 1

Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.

16.

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.

17.

DESEMPENHO

Precisão Média (ng/mL) CV (%)

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 1 Amostra 2 Intra-Ensaio 28.24 59.81 2.9 3.7 Inter-Ensaio 41.91 82.74 7.28 3.06

Sensibilidade Analítica

(Limite de Detecção)

Média do Sinal (Padrão Zero) + 2SD

(como lido a partir da curva padrão) 2 ng/mL

Linearidade

Intervalo (ng/mL) Diluição em Série até Intervalo (%) 52.2 – 932.7 1/ 16 83 - 106 Sem inibição da formação do complexo anticorpo-antigénio detectada até 1 000 000 ng/mL

Recuperação Recuperação media após adição de reforço: 98

% Intervalo: 91 – 121 %

18.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO

1. Pirker RA, Pont J, Pöhnl R, Schütz W, Griesmacher A, Müller MM. Usefulness of chromogranin A as a marker for detection of relapses of carcinoid tumours. Clin Chem Lab Med 1998;36:837-40.

2. Kimura N, Miura W, Noshiro T, Mizunashi K, Hanew K, Shimizu K, et al. Plasma chromogranin A in pheochromocytoma, primary hyperparathyroidism and pituitary adenoma in comparison with catecholamine, parathyroid hormone and pituitary hormones. Endocr J 1997;44:319-27.

3. Hendy GN, Bevan S, Mattei MG, Mouland AJ. Chromogranin A. Clin Invest Med 1995;18:47-65.

4. Deftos LJ. Chromogranin A: its role in endocrine function and as an endocrine and neuroendocrine tumor marker. Endocrine Reviews: 1991;12:181-7

Chromogranin A ELISA 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 1 10 100 1000 (ng/mL) (OD)

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD

In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

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