UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

EFEITOS DA INIBIÇÃO DA ENZIMA NADPH OXIDASE SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO E A SÍNTESE DE OXIDO NÍTRICO EM CAMUNDONGOS

INFECTADOS PELO Plasmodium berghei

ANA CAROLINA MUSA GONÇALVES UBERTI

Belém – Pará 2014

ANA CAROLINA MUSA GONÇALVES UBERTI

AVALIAÇÃO TEMPORAL DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA

ENZIMA NADPH OXIDASE SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO, A

SÍNTESE DE OXIDO NÍTRICO E A INDUÇÃO DA PARASITEMIA EM

CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO Plasmodium berghei

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário.

Belém – Pará 2014

Dados Internacional de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema de Biblioteca da UFPA

_______________________________________________________ Uberti, Ana Carolina Musa Gonçalves,

Efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase sobre o estresse oxidativo e a síntese de oxido em camundongos infectados pelo Plasmodium berghei / Ana Carolina Musa Gonçalves Uberti – 2014.

Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, 2014.

1. Malária. 2. Estresse oxidativo. 3. NADPH-oxidase. 4. Óxido Nítrico. 5. Superóxido. 6. Plasmodium berghei.

ANA CAROLINA MUSA GONÇALVES UBERTI

AVALIAÇÃO TEMPORAL DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA ENZIMA NADPH OXIDASE SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO, A SÍNTESE DE OXIDO NÍTRICO E A INDUÇÃO DA PARASITEMIA EM CAMUNDONGOS INFECTADOS

PELO Plasmodium berghei

Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador:

Prof. Livre-Docente Sandro Percário

Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo ICB/UFPA

Banca examinadora: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela Laboratório de Farmacodinâmica ICS/UFPA

Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Laboratório de Tecnologia Biomolecular ICB/UFPA

Prof. Dr. Flávio de Vasconcelos Laboratório de Toxicologia ICS/UFPA

Prof. Dr. José Luis Fernandes Vieira Laboratório de Toxicologia

ICS/UFPA

Profa. Dra. Marcela Pinhel (Suplente) Laboratório de Estudos e Nutrigenômica

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP

“O conhecimento nos faz responsáveis” Che Guevara

“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível” Charles Chaplin

DEDICO ESTE TRABALHO

Ao meus pais, Aparecido e Fátima, pessoas maravilhosas que sempre me incentivaram a correr atrás dos meus sonhos, apoiando e orientando-me em todas as horas de medos (fraquezas) e ansiedade, que souberam ser compreensivos e tolerantes, ensinando-me com tanta sabedoria a confiar em minha intuição. Obrigada por serem meus melhores amigos, o meu suporte, a minha fortaleza, a minha inspiração!! A Vocês, meu “Bem” mais precioso, os responsáveis por eu vencer mais uma importante etapa da minha vida, não há Muito Obrigada que agradeça... Sem palavras para expressar o quanto são maravilhosos!!!!

Ao meus avós, Jamal e Clarinda, que pegaram na minha mão quando criança, e me ensinaram os primeiros passos no saber... Que sempre admiraram e oraram por mim, motivando-me com palavras carinhosas a seguir em frente, e nunca desistir. Sem dúvida, sou um pouquinho de cada um de vocês.

Aos meus irmãos, Vitor e Ana Flávia, que amo tanto e que torcem muito pelo meu sucesso... Saibam que ser a irmã mais velha, nos impõem muitas responsabilidades e a maior delas é tentar ser de forma humilde mas sincera um referencial positivo na vida de Vocês!! Obrigada por acreditarem e me apoiarem sempre.... esta vitória também é para Vocês!!

Ao meu marido Rafael, que veio como um presente belo de Deus em minha vida!!! Você me ensinou muito, com seu exemplo de superação e sucesso não só profissional, mas especialmente pessoal.... Ao seu lado, concretizei mais um sonho (doutorado), mas propiciaste a minha vida algo de importância espiritual, agradeço-lhe por me aproximar ainda mais de Deus, me apresentando a Doutrina Espírita, que me fez (e faz) refletir diariamente em como ser um Ser Humano melhor!!! Obrigada meu Amor por dividir comigo momentos de correria, onde a paciência e a tolerância para com meu estresse foram sem dúvida muito importante ao nosso bom relacionamento e amadurecimento pessoal, tudo isso graças ao seu Amor, ao bom senso e ao companheirismo me dedicado. Obrigada por tanto carinho dispensado nestes momentos de desespero (de estudante), me mostrando sempre que sou e posso ser ainda mais forte, encarando os meus obstáculos de frente. Por fim, obrigada pela família maravihosa que formamos, e pelo presente tão abençoado de ser Mãe, cujo o fruto já cresce (27 semanas) dentro de meu ser: a Ana Lis!!!

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da Vida, pela oportunidade concedida, em especial por esta conquista... enfim por estar sempre ao meu lado!!!

Aos meus pais, Aparecido e Fátima, que além de me darem a vida, me deram a sabedoria de viver, a paciência de esperar, a força para vencer e a coragem para me re-erguer. Que me dão amor incondicional. Que foram e ainda são exemplos de pessoas virtuosas para mim!

Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras pessoas para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto pode mudar a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso.

Ao meu orientador, Prof. Livre-Docente Sandro Percário, docente do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará e responsável pelo LAPEO – Laboratório de Pesquisa em Estresse Oxidativo, por me receber em seu grupo de pesquisa com as portas abertas, após breve entrevista, e acreditou em meu potencial. Um Ser Humano de raríssima índole, verdadeiro exemplo de determinação e de liderança a ser alcançado; meu muito obrigada pelo incentivo, apoio, orientação e compreensão ofertado, foi muito importante aprender com o Senhor. Obrigada pela confiança e dedicação incessante na minha formação.

Ao Laboratório de Pesquisa em Estresse Oxidativo – LAPEO, local onde desenvolvi toda minha pesquisa, desde o levantamento bibliográfico até as etapas laboratoriais. Não me esquecendo das reuniões científicas que enriqueciam meus conhecimentos a cada semana.

Aos Prof. Dr. José Luis, Profa. Dra. Liliam e Prof. Dr. Flávio, por colocar a disposição o Laboratório de Toxicologia, bem como suas experiências.

À chefia do Biotério de Criação e Manutenção do Instituto de Ciências Biológicas – ICB da UFPA, em especial ao amigo e colaborador Reginaldo, pelo apoio e orientações sobre questões burocráticas, éticas e experimentais.

A equipe de manutenção do biotério do ICB, em especial ao Sr. Amarildo e Marcelinho, que estiveram sempre presentes oferecendo o auxilio necessário e dedicação durante todo o experimento, além de um convívio alegre e carismático.

Aos estagiários graduandos da área da saúde, Taiana, Íngride, Bruna, Breno, Everton, Thaigo Leite, Jean, Jaciara, Jone, Victor, Marcelle, Iane, Rosian, João

Clauder, Langela e Luan pelo auxílio e motivação em aprender mais para também ensinar.

Aos amigos especiais da Iniciação Científica: Rafael Quadros, Mayani Ribeiro e Aline Barbosa, pela amizade e dedicação sempre prontos a ajudar; do Mestrado: Daniele Ribeiro, Marcela Figueiredo, Maria do Céu Souza e Thiago Vilhena pela presença e auxílio sempre que eu necessitava de apoio; e do Doutorado: à Paula Costa Laurindo, ao Danilo Reymão, à Amanda Soares e à Michelli Ferreira, que me ensinaram e colaboraram na realização deste trabalho de forma ímpar, estando ao meu lado até mesmo aos finais de semana (dia de eutanásia), mas principalmente pela amizade, força, atenção e companheirismo ao longo dessa jornada.

Todos Vocês foram de importância extrema no meu aprendizado!!

Não poderia deixar de agradecer de forma mais que especial a quem dividiu seu sonho comigo, a minha amiga Paula Costa Laurindo, que o saber da minha possibilidade em mudar de cidade, permitiu que eu desenvolvesse parte da sua tese de doutorado, dividindo comigo responsabilidades tão grandes, mas acima de tudo, acreditando que tudo daria certo, não medindo esforços a me auxiliar! Muito obrigada Amiga, não sou muito boa com as palavras, e Você sempre me faz chorar, mas saiba que sou imensamente grata por tudo!

A minhas amigas que moram longe Dra. Marcela Pinhel, Ma. Maysa Araújo, Dra. Patrícia Lopes pela linda amizade iniciada desde o início da minha formação científica, ou mesmo à minha grande amiga pessoal Paula Porto e Rosilene Muraro, agradeço a Vocês pelo carinho incentivador e motivacional, sem contar altas horas de desabafos, as alegrias e tristezas compartilhadas quando algo não saia como esperávamos.

Ao Laboratório do Instituto de neurociências da UFPA pelo fornecimento da cepa do Plasmodium berghei.

Ao estatístico Rogério Santos pela ajuda na realização das análises estatísticas, competência e paciência.

As instituições de fomento e pesquisa, em especial a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida e concomitante incentivo, imprescindíveis para a execução desse trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 10

LISTA DE TABELAS E QUADROS 14

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 16

RESUMO 18

ABSTRACT 19

1. INTRODUÇÃO 20

1.1 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA 23

1.2 AGENTE ETIOLÓGICO E CICLO BIOLÓGICO DA MALÁRIA 25

1.3 PATOGENIA DA MALÁRIA 28

1.4 RADICAIS LIVRES E O ESTRESSE OXIDATIVO 31

1.4.1 Malária e o Estresse Oxidativo 33

1.4.1.1 Fontes de Estresse Oxidativo 34

1.4.1.2 Óxido Nítrico e a Malária 38

1.5 SISTEMA NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTÍDEO

FOSTATO OXIDASE – NADPH oxidase / NOX

40

1.5.1 Malária e a NOX 42

1.5.1.1 Apocinina – Inibidor da NOX 43

1.6 OBJETIVOS 46

1.6.2 Objetivos Específicos 46

2 MATERIAL E MÉTODOS 47

2.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO 47

2.1.1 Grupos Experimentais 48

2.2 INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS 50

2.3 INIBIÇÃO DA NOX – TRATAMENTO COM APOCININA 50

2.3.1 Preparo e administração da Solução de Apocinina 50

2.3.2 Determinação do Consumo de Líquidos 51

2.4 DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA 51

2.5 EUTANÁSIA E OBTENÇÃO DE AMOSTRAS 52

2.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PULMÃO E CÉREBRO 53

2.7 DOSAGEM DE SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO

TIOBARBITÚRICO (TBARS)

53

2.7.1 Preparo de Reagentes 54

2.7.1.1 Ãcido Tiobarbitúrico 54

2.7.1.2 Solução Padrão de MDA 54

2.7.2 Procedimento Técnico 54

2.7.3 Curva Padrão do TBARS 55

2.8 DOSAGEM DE NITRATOS E NITRITOS PARA

QUANTIFICAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO

57

2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 58

3 RESULTADOS 59

3.2 SOBREVIDA 61

3.3 DOSAGENS PULMONARES 63

3.3.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 63

3.3.2 Nitritos e Nitratos 66

3.3.3 Estudos de Correlação em Amostras Pulmonares 69

3.3.3.1 Correlação TBARS e Nitritos e Nitratos 69

3.3.3.2 Correlação TBARS e Parasitemia 71

3.3.3.3 Correlação entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia 72

3.4 DOSAGENS CEREBRAIS 74

3.4.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 74

3.4.2 Nitritos e Nitratos 77

3.4.3 Estudos de Correlação em Amostras Cerebrais 81

3.4.3.1 Correlação TBARS e Nitritos e Nitratos 81

3.4.3.2 Correlação TBARS e Parasitemia 83

3.4.3.3 Correlação entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia 84

4 DISCUSSÃO 85

4.1 ACHADOS PULMONARES E CEREBRAIS 88

5 CONCLUSÕES 93

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94

APÊNDICES 108

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mapa de risco da malária por Município de infecção (Brasil, 2011).

24

Figura 2: Ciclo evolutivo do Plasmodium. A) Ciclo Hepático (A e B – Ciclo esquizogônico; B) Ciclo hemático; C) Ciclo esporogônico. 1) Esporozoíto; 2) Merozoítos sanguíneos; 3) Penetração de merozoítas nas hemácias; 4) Esquizonte; 5) Esquizonte maduro; 6) Gametócitos; 7) Gametócitos maduros (microgametócito e macrogametócito); 8) Microgametócito exoflagelado; 9) Oocineto; 10) Oocisto; 11) Esporozoítos. (Adaptado de CDC, 2010).

27

Figura 3: Sistema antioxidante enzimático. O2●- = radical superóxido; H2O2 = peróxido de hidrogênio; O2= oxigênio; H2O = água; H+ _{= cátion} hidrogênio; GSH = Glutationa reduzida; GSSH = Glutationa oxidada; GSH-Px = Glutationa peroxidase; SOD = Superóxido dismutase.

33

Figura 4. Representação esquemática da cadeia de transporte de elétrons da mitocondria (CTE) e o acoplamento e desacoplamento da fosforilação oxidativa. Os substratos NADH e FADH2 reduzido são oxidados, com a passagem dos elétrons pelos complexos enzimáticos da CTE e o bombeamento dos prótons (H+_{) para dentro do espaço} intermembranar das mitocôndrias, formando um grande potencial de membrana mitocondrial conhecida como força motriz protônica. A energia perdida pelos prótons reentra na matriz mitocondrial através da ATP sintase (A) e é usada para geração de energia de ATP a partir de ADP. Os prótons também pode voltar a entrar na matriz por meio das proteínas de desacoplamento (U), tal como UCP2, sem a produção de ATP (Fariss et al., 2005).

34

FIGURA 5: Reações de Haber-Weiss e Fenton. (1) Reação de Haber Weiss: O radical ânion superóxido (O2•-) reage com o peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de metais de transição, para produzir radicais hidroxila (HO•), íons hidroxila (HO-_{) e oxigênio (O2). (2) Reação} de Fenton: O peróxido de hidrogênio (H2O2) é ionizado na presença de íons ferrosos, levando à produção de radicais hidroxila (OH•) e íons hidroxila (HO-_{). O íon ferroso (Fe}+2_{) sofre oxidação, sendo liberado na} forma de íon férrico (Fe+3_).

35

Figura 6: A) Sequência de eventos que ocorrem na síndrome de isquemia e reperfusão (SIR). B) Integração da SIR com a reação de Haber-Weiss. Legenda: ATP=Trifosfato de adenosina; ADP=Difosfato de adenosina; AMP= Monofosfato de adenosina; Ca+2_{= íon cálcio; O2=} Oxigênio; O2•-=Radical Superóxido; H2O2 = peróxido de hidrogênio; OH = íon hidroxila; OH• = Radical Livre Hidroxila; H2O = Água (Adaptado de

Percário et al., 2008).

FIGURA 7: Estrutura da NOX fagocítica. A gp91phox é o ligante do NADPH com função transportadora de elétrons na NOX ativa. A Produção de O2•- extracelular ocorre pela redução de um elétron do O2 via gp91phox, usando nicotinamida adenina dinucleotídeo fostato reduzida – NADPH (Adaptado de Dusting et al., 2005).

40

Figura 8: A) O complexo enzimático NADPH oxidase (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase – NOX) nos neutrófilos consiste em duas subunidades de membrana do citocromo b558: a subunidade p22phox _{e gp91}phox_{/NOX2, e três co-fatores citosólicos} (p67phox_{, 47} phox _{e p40}phox_{) além de uma GTPase Rac 2, necessários} para o metabolismo oxidativo. B) Agregação do complexo NADPH oxidase em fagócitos A Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzida (NADPH) serve como substrato para a redução do O2 em O2•-, que é rapidamente transformado em H2O2 espontaneamente ou pela superóxido dismutase – SOD (Bedard & Krause, 2007).

41

Figura 9: Molécula de Apocinina (Ximenes et al., 2007) 44

Figura 10: Molécula de Diapocinina (Ximenes et al., 2007) 45

Figura 11: Curva padrão das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS).

56

Figura 12: Curva Padrão do Óxido Nítrico. 57

Figura 13: Progressão temporal da parasitemia de camundongos infectados com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Apo + (Grupo A): Grupo tratado com o inibidor da NOX (Apocinina); Apo - (Grupo C): Grupo não tratado com Apocinina (Controle).

59

Figura 14: Percentual de sobrevida de camundongos infectados com o

Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho) tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (roxo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).

61

Figura 15: Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

(TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei

,

ingestão de água).

Figura 16: Concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).

67

Figura 17: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Nitritos e Nitratos (NN) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.

70

Figura 18: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e percentual de Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.

71

Figura 19: Correlações entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.

72

Figura 20: Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com

P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).

Figura 21: Concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).

78

Figura 22: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Nitritos e Nitratos (NN) em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo P. berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.

82

Figura 23: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e percentual de Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.

83

Figura 24: Correlações entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Quadro 1 – Distribuição de grupos de animais de acordo com o tempo de infecção.

50

Quadro 2 – Número de hemácias a serem contadas a partir de uma estimativa inicial da parasitemia.

53

Quadro 3 – Protocolo de Diluições do padrão de malondialdeido (MDA) para curva padrão

60

Tabela 1 – Evolução da parasitemia dos camundongos infectados com o Plasmodium berghei submetidos e não submetidos ao tratamentos com Apocinina de acordo com os dias de infecção.

60

Tabela 2 – Valores de p# _{para as comparações entre os tempos de} cada grupo para Parasitemia.

60

Tabela 3 – Valores de p# _{para as comparações entre os grupos a cada} tempo para Parasitemia.

62

Tabela 4 – Percentual de sobrevida de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

64

Tabela 5 – Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

65

Tabela 6 – Comparação dos valores de p# _{entre os tempos de cada} grupo para níveis de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o P. berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

65

Tabela 7 – Comparação dos valores de p# _{entre os grupos a cada} tempo para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em pulmão de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

65

Tabela 8 – Concentração de Nitritos e Nitratos (NN) nos pulmões de camundongos infectados com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

Tabela 9 – Comparação dos valores de p# _{entre os tempos de cada} grupo para níveis de Nitritos e Nitratos (NN) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

67

Tabela 10 – Comparação dos valores de p# _{entre os grupos a cada} tempo dos Nitritos e Nitratos (NN) em pulmão de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

68

Tabela 11 – Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

75

Tabela 12 – Comparação dos valores de p# _{entre os tempos de cada} grupo para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

76

Tabela 13 – Comparação dos valores de p# _{entre os grupos a cada} tempo para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em cérebros de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

76

Tabela 14 – Concentração de Nitritos e Nitratos (NN) produzidos nos cérebros de camundongos infectados com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

78

Tabela 15 – Comparação dos valores de p# _{entre os tempos de cada} grupo para Nitratos e Nitritos (NN) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina

79

Tabela 16 – Comparação dos valores de p# _{entre os grupos a cada} tempo para Nitratos e Nitritos (NN) em cérebros de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ACT Combinações com Derivados de Artemisina ATP Trifosfato de Adenosina

Ca++ _{Íon Cálcio}

cNOS Óxido Nítrico Sintase Constitutiva

CPH Complexo Principal de Histocompatibilidade CTE Cadeia de Transporte de Elétrons

EO Estresse Oxidativo

ERN Espécies Reativas de Nitrogênio ERO Espécies Reativas de Oxigênio

FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo oxidada FADH2 Flavina Adenina Dinucleotídeo reduzida

Fe Ferro

Fe2+ _{Cátion Ferroso} Fe3+ _{Cátion Férrico}

G6PD Glicose-6-Fosfato Desidrogenase

H+ _Hidrogênio

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

Hb Hemoglobina

HO- _{Íon hodroxila} HO2- _{Hidroperoxila} IFN-γ Interferon Gama IL-1 Interleucina 1 IL-6 Interleucina 6

iNOS Óxido Nítrico Sintase induzível IPA Incidência Parasitária Anual LDL Lipoproteína de Baixa Densidade LT Linfócito T

MC Malária Cerebral MDA Malondialdeído MPO Mieloperoxidase

NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Hidreto NADP+ _{Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato}

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida NK Células Natural Killer

NO Óxido Nítrico NO2 Nitrito

NO3 Nitrato

NOS Óxido Nítrico Sintase

NOX Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase O2 Oxigênio Molecular

O2•- Radical Ânion Superóxido OH• Radical Hidroxila

OMS Organização Mundial da Saúde ONOO- _{Peroxinitrito}

PDGF Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta R•- Radical Alquila

RL Radical Livre ROO•- Radical peroxila

SIM Sistema de Informação sobre Mortalidade SIR Síndrome de Isquemia e Reperfusão SOD Superóxido Dismutase

TBA Ácido Tiobarbitúrico TCD4+ _{Linfócitos TCD4}+

TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa

RESUMO

A malária constitui uma das mais importantes doenças parasitárias negligenciadas e apresenta-se bastante difundida no mundo. A resposta à infecção causada pelos plasmódios manifesta-se primariamente pelo mecanismo de defesa natural do organismo hospedeiro com envolvimento dos fagócitos e, consequentemente, produção de grande quantidade de espécies reativas do oxigênio (ERO), tais como o radical superóxido por ação da enzima NADPH oxidase (Nox) durante a explosão respiratória realizada pelos fagócitos. Com o objetivo de avaliar os efeitos da inibição das enzimas Nox sobre o estresse oxidativo associado à malária causada pelo Plasmodium berghei, foram utilizados 230 camundongos divididos em 4 grupos: A = infectados com P. berghei e submetidos à inibição da NOX, B = submetidos à inibição da Nox, C= infectados com P. berghei e D = não infectados e sem uso do inibidor da Nox. Cada grupo foi subdividido em 5 subgrupos que foram submetidos à eutanásia após 24h, 5, 10, 15 ou 20 dias após o início do estudo. A inibição do complexo enzimático NADPH oxidase foi realizada com 1,5mM de apocinina em água potável e se iniciou cinco dias antes do período de estudo, sendo mantida diariamente até o dia de eutanásia dos animais, quando foram obtidos o cérebro e os pulmões doas animais para avaliação da peroxidação lipídica por meio das substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e determinação dos metabólitos do óxido nítrico, através da quantificação de nitritos e nitratos (NN), bem como o sangue total para avaliação da parasitemia. Os resultados encontrados mostram que o grupo A (6,67%) apresentou menor sobrevida do que o grupo C (20%), sugerindo que o estresse oxidativo possa ter um papel protetor na malária, uma vez que quando houve diminuição da produção de superóxido, observou-se menor sobrevida. No entanto, não foram observadas relações entre o tratamento com a apocinina e os níveis de TBARS ou NN. Os resultados apresentados sugerem ainda que, embora a inibição da NADPH oxidase tenha diminuído a sobrevida, o uso dessa substância não promoveu alterações significativas no perfil oxidativo nas amostras pulmonares e cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei e, portanto, a síntese de radicais superóxido não seja um componente importante do estresse oxidativo do hospedeiro frente à infecção pelos plasmódios.

Palavras chaves: Malária, Estresse Oxidativo, Superóxido, NADPH-oxidase, Óxido Nítrico, Superóxido, Plasmodium berghei.

ABSTRACT

Malaria is one of the most important neglected parasitic diseases and is quite widespread in the world. The response to the infection caused by plasmodium is manifested primarily by natural defense mechanism of the host organism with involvement of phagocytes and, consequently, the production of large quantities of reactive oxygen species (ROS), such as the superoxide radical by the action of the enzyme NADPH oxidase (Nox) during phagocytes’ respiratory burst. With the objective to evaluate the effects of the inhibition of Nox enzymes on the oxidative stress associated with Plasmodium berghei malaria, 230 mice were divided into 4 groups : A = infected with P. berghei and subjected to inhibition of Nox, B = subjected to inhibition of Nox, C = infected with P. berghei, and D = not infected and with no inhibition of Nox. Each group was subdivided into 5 subgroups that underwent euthanasia after 24h, 5, 10, 15 or 20 days after the beginning of the study. The inhibition of the NADPH oxidase enzyme complex was performed with 1.5mM of apocinin in drinking water and began five days before the period of study, being maintained daily until the day of euthanasia of the animals, when brain and lungs were obtained the for evaluation of lipid peroxidation by means of the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and determination of nitric oxide metabolites through the quantification of nitrites and nitrates (NN), as well as the whole blood for evaluation of parasitemia. The results show that group A (6.67%) had lower survival than the group C (20%), suggesting that oxidative stress may have a protective role in malaria, once that when there was a decrease in the production of superoxide, lower survival was observed. However, no relationships were observed between the treatment with apocinin and TBARS levels or NN. The presented results suggest that, although the inhibition of NADPH oxidase has decreased the survival rate, the use of this substance did not promote significant changes in oxidative profile in lung and brain samples in mice infected with P. berghei and, therefore, the synthesis of superoxide radicals is not an important component of the host’s oxidative stress against plasmodium infection.

Key words: Malaria, Oxidative Stress, Superoxide, NADPH -oxidase, Nitric Oxide, Plasmodium berghei.

1 INTRODUÇÃO

A malária constitui uma das mais importantes doenças parasitárias de regiões tropicais e subtropicais e apresenta-se bastante difundida no mundo (Tobón et al., 2006; França et al., 2008; Parise, 2009; Garcia et al., 2010). É uma doença frequentemente associada aos viajantes que estiveram nas áreas endêmicas (Garcia et al., 2010), caracterizada por desencadear acessos periódicos de febres intensas que debilitam profundamente os acometidos.

A infecção é causada por um hematozoário intracelular do gênero Plasmodium e é transmitida ao homem por vetores, representados pelos mosquitos fêmeas do gênero Anopheles infectadas (França et al., 2008; Parise, 2009).

Segundo informações do Ministério da Saúde, a incidência da malária no Brasil concentra-se atualmente na região Amazônica (99,8% dos casos; Brasil, 2010a; Brasil, 2013), que é por isto considerada área endêmica para malária (Parisi, 2009; Brasil, 2010b), em função de seus múltiplos fatores biológicos, ecológicos, geográficos e sociais (Brasil, 2010b). Além disso, a intensa e desordenada ocupação das periferias das grandes cidades, o desmatamento para extração de madeira, criação de gado, agricultura e assentamentos, atividades não autorizadas pelos órgãos competentes, contribuem para o aumento da transmissão da doença (Brasil, 2013).

Apesar de se ter observado um declínio na média do número de casos no ano de 2011 em todo o país (266.348 casos), quando comparados ao ano de 2000 - que foi de 615.247 casos(Brasil, 2013) - este índice é de extrema preocupação, especialmente em doentes infectados com o Plasmodium faciparum, responsável por cerca de 20% dos casos na região Amazônica, cuja tendencia é ainda crescer visto que a resistência à droga da terapia aumentou (Brasil, 2012).

De fato, já existem cepas do Plasmodium falciparum resistentes aos medicamentos usados atualmente, tais como a cloroquina (França et al., 2008) e artemisinina (Silva, 2011; Gomes, 2011). No entanto, os fatores que levam a essa resistência ainda não são bem conhecidos, devido à ausência na compreensão completa dos mecanismos de ação do parasita no organismo humano, ou seja, sobre a fisiopatogenia da doença.

Nas últimas décadas, diversos pesquisadores vêm estudando o envolvimento de agentes oxidantes alterando o equilíbrio redox em diversos processos

fisiopatológicos (Gutierrez et al., 2010), bem como na malária (Pablón et al., 2002; Huber et al., 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al., 2004; Wilmanski et al., 2005; Kumar et al., 2005; Jaramillo et al., 2005; Sohail et al., 2007).

Em relação ao equilíbrio redox no organismo humano frente à infecções parasitárias, um fator importante é a relação parasita-hospedeiro, uma vez que a intensidade da patogenicidade vai decorrer do desequilíbrio deste balanço, reflexo das concentrações locais das espécies pró e antioxidantes produzidas pelo hospedeiro e pelo parasita. Este desequilíbrio promove o estresse oxidativo, quando a ação antioxidante é deficiente ou inibida, ou por meio da produção de radicais pelo hospedeiro com o intuito de debelar a infecção (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007).

Pouco se sabe sobre o envolvimento do estresse oxidativo na infecção malárica. Os mecanismos precisos de seu envolvimento ainda são incertos: alguns autores sugerem um papel protetor, enquanto outros alegam uma relação com a fisiopatologia da doença (Potter et al., 2005). De fato, alguns estudos sugerem que a geração de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) e Nitrogênio (ERN) associado ao estresse oxidativo, desempenha um papel crucial no desenvolvimento de complicações sistêmicas causada pela malária (Keller et al., 2004).

A produção de algumas ERO, como os radicais superóxido (O2-_{) e a} hidroperoxila (HO-_{2) ocorre a partir do metabolismo do oxigênio molecular (O2), que é} potencializada na presença de metais, como o ferro (Fe), liberada durante o estágio eritrocítico do plasmódio (Ferreira & Matsubara, 1997; Kumar et al., 2005; Lyaweh & Onigbinde, 2009; Circu & Aw, 2010).

Outro radical livre que parece estar envolvido na doença é o Óxido Nítrico (NO; Pablón et al., 2002; Huber et al. 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al. 2004, Pino et al., 2005), cuja produção é mediada por citocinas, em especial pelo Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e pelo Interferon Gama (INF-γ), que ativam as enzimas responsáveis por sua produção, denominadas Óxido Nítrico Sintases (NOS; Moncada et al., 1991; Marletta, 1993).

O papel do NO na malária ainda é controverso, apesar de apresentar ação citotóxica e citostática contra microrganismos, parasitas e células tumorais, geralmente vem acompanhado de grande produção de ERO (Pfeilschifter et al.,

2003; Shirley, 2005). Há autor que afirme que o acometimento cerebral da doença seja uma consequência da produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas, enquanto outro defende a sugestão de que a malária cerebral (MC) decorra de uma baixa biodisponibilidade deste gás (Favre et al., 1997; Gramaglia et al., 2006).

Entre as diferentes fontes de produção de radicais livres (RL) na malária, destaca-se a atividade da família de proteínas Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato Oxidase (NADPH oxidase, ou NOX), observadas na imunidade inespecífica, pela ação dos fagócitos durante a invasão dos plasmódios e na sua eliminação (Bedard & Krause, 2007; Brown & Griendling, 2009). Esta enzima pode, portanto, participar dos mecanismos fisiopatológicos que cursam com a doença, uma vez que produzem ERO não como subproduto, mas como principal produto do seu sistema enzimático. Por isso, tem recebido atenção especial nos últimos anos, uma vez que a sua relação com o desequilíbrio redox e a patogênese de inúmeras doenças ainda é pouco conhecida (Lassègue & Clempus, 2003; Geiszt, 2006; Brown & Griendling, 2009).

O esclarecimento da correlação entre as vias de produção de RL e o comportamento da patogenia da malária, motiva a realização de muitos estudos, o que justifica este trabalho, pois auxiliará no melhor entendimento a respeito da fisiopatogenia das doenças infecciosas como a malária, bem como pode possibilitar avanços no tratamento e/ou prevenção da malária (The malERA Consultative Group, 2011).

O presente estudo pesquisou a importância da NOX como fonte de estresse oxidativo na malária e avaliou os efeitos que sua inibição provocou sobre marcadores da peroxidação lipidíca e sobre a síntese do NO e os correlacionou com a progressão da parasitemia.

1.1 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a malária ou paludismo é a doença tropical infectocontagiosa que mais causa problemas sociais e econômicos no mundo (Barata, 1995; WHO, 2009). Em 2010, estima-se que ocorreram 219 milhões de casos de malária em todo o mundo (WHO, 2012). Entretanto, foi observada uma redução no número de mortes de 985.000 no ano de 2000 para 660.000, no ano de 2010, sendo que a República Democrática do Congo e a Nigéria assumem mais de 40% do total mundial de mortes (WHO, 2012).

Contudo, os dados disponíveis sobre a ocorrência de malária são bastante imprecisos. Entre os 99 países em que ocorreu a transmissão da malária em 2011, 58 países apresentaram informação completa e consistente sobre os casos de paludismo, mas estes representam apenas 15% dos casos mundiais estimados. Por outro lado, nos outros 41 países, em que se calcula ocorrerem 85% dos casos de malária, há necessidade de reforçar a vigilância, a fim dos programas poderem identificar e dirigir recursos para as populações mais necessitadas, bem como responder aos surtos da doença e avaliar os impactos das medidas de controle (WHO, 2012).

Na América do Sul, a transmissão de malária ocorre nos países que abrangem a Floresta Amazônica - Brasil, Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Peru, Suriname e Venezuela, sendo o Brasil responsável pelo maior número de casos (PAHO, 2002).

No Brasil, os graus de risco para adoecer de malária são classificados de acordo com a Incidência Parasitária Anual (IPA), que expressa o número de exames positivos de malária por mil habitantes em determinado espaço geográfico, no ano considerado (Brasil, 2010a). As áreas são classificadas como alto risco (IPA ≥50/1.000 hab.), médio risco (IPA entre 10 e 49/1.000 hab.) e baixo risco (IPA ≤10/1.000 hab.). Em 2011, 45 municípios do Brasil foram classificados como alto risco (todos localizados na região Amazônica), 82 com médio risco e 370 de baixo risco, de acordo com o representado no mapa da figura 1 (Brasil, 2013).

A malária é transmitida no Brasil por três espécies de parasitos: o Plasmodium vivax, o P. faciparum e o P. malarie. Dados epidemiológicos recentes sugerem que as espécies P. vivax e P. falciparum são responsáveis por mais de

95% dos casos, sendo que destes, o P. vivax pode causar 80% dos casos no Brasil, uma vez que esta espécie tem distribuição mais ampla nos trópicos, zonas subtropicais e zonas temperadas (WHO, 2010; Garcia et al., 2010, Brasil, 2010b; Brasil, 2013).

Figura 1: Mapa de risco da malária por Município de infecção (Brasil, 2011).

A distribuição da malária no Brasil está frequentemente associada às categorias consideradas como áreas especiais de transmissão, tais comoas áreas de acampamentos agrários; as áreas indígenas, os garimpos, bem como à abertura de grandes rodovias e construção de hidroelétricas (Parisi, 2009).

Até 2009, a maioria dos casos de malária na Região Amazônica ocorria em assentamentos. A partir desse ano, nota-se um aumento do numero de casos em áreas indígenas, as quais já vinham apresentando tendência de crescimento, com crescimento de 142,8% no ano 2011 em relação ao ano de 2003. Por outro lado, houve redução no número de casos em todas as áreas, quando comparados o ano de 2011 com 2010 (Brasil, 2013).

A mortalidade por malária no Brasil em 2011 (69 óbitos), registrados no Sistema de Informação sobre Mortalidade do Ministério da Saúde (SIM), representou

uma redução de 71,8% em relação ao ano de 2000 (245 óbitos), porém os dados sobre o número de óbitos por espécies são incompletos, verificando ainda nesse ano que na maior proporção de óbitos (43,5%) não consta a informação sobre a espécie causadora, sendo que somente 37,7% foram informados como óbitos causados por P. vivax e 18,8% por P. falciparum (Brasil, 2013).

Nos últimos anos, Manaus e Porto Velho apresentaram extensas áreas de aglomerados urbanos em regiões periféricas, importantes locais de propagação da infecção devido ao intenso fluxo de pessoas procedentes de outros municípios em busca de oportunidades de trabalho ou necessidades comerciais. Esses municípios concentraram 26,9% e 22,9% dos casos de malária da Região Amazônica nos anos de 2003 e 2004 (Parisi, 2009).

O Estado do Pará é um dos que apresenta maior morbidade da doença (Mascarenhas et al., 2005) e de acordo com a coordenação Estadual de Malária, 70% dos casos acontecem em áreas rurais (SESPA, 2011). Em Belém, 51% dos 650 casos autóctones de malária notificados no ano de 2004 foram procedentes da ilha de Cotijuba (Região Metropolitana da grande Belém; Renault et al., 2007).

1.2 AGENTE ETIOLÓGICO E CICLO BIOLÓGICO DA MALÁRIA

Os agentes etiológicos da malária são os protozoários do gênero Plasmodium. As cinco espécies associadas à malária humana são: P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi (Brasil, 2010b; Singh & Daneshvar, 2010).

O ciclo de vida dos protozoários do gênero Plasmodium está dividido entre o hospedeiro vertebrado e o inseto vetor (França et al., 2008). O ciclo assexuado do Plasmodium ocorre no homem e denomina-se ciclo esquizogônico, enquanto que o ciclo sexuado ocorre dentro do intestino delgado do vetor (França et al., 2008; Garcia, 2010; CDC, 2010a).

Os vetores da infecção são as fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles, sendo o Anopheles darlingi a espécie mais importante no Brasil (Saraiva et al, 2009), cujos criadouros principais são depósitos de água limpa, quente, sombreada e de baixo fluxo, muito comuns na Amazônia brasileira (Brasil, 2010b).

A inoculação das formas infectantes do Plasmodium ocorre durante o repasto sanguíneo, momento em que os esporozoítos presentes em suas glândulas

salivares ganham a corrente sanguínea do hospedeiro e rapidamente invadem as células do fígado, dando início ao ciclo exo-eritrocítico primário, também conhecido como o ciclo pré-eritrocítico (França et al., 2008; Garcia, 2010) ou esquizogonia tecidual (Garcia, 2010; Brasil, 2010c).

O desenvolvimento do parasito nas células do fígado requer aproximadamente uma semana para o P. falciparum e P. vivax e cerca de duas semanas para o P. malariae. Pode-se observar a esquizogonia secundária ou latente nas infecções por P. vivax e P. ovale, na qual alguns parasitos permanecem em repouso no fígado para apresentam desenvolvimento lento de alguns dos seus esporozoítos ou, até mesmo, em um momento posterior (Garcia, 2010). Seja qual for o caso, haverá a formação dos hipnozoítos (do grego hipnos, sono), formas latentes do parasito no hepatócito responsáveis pelas recidivas da doença, que ocorre meses ou anos após a infecção inicial (Brasil, 2010c).

É importante diferenciar recaída verdadeira de uma recrudescência. A primeira refere-se a uma situação na qual a infecção eritrocítica é eliminada e ocorre uma recidiva depois por causa de uma nova invasão das hemácias pelos merozoitos do fígado (antigas formas latentes: hipnozoítos), o que teoricamente ocorre apenas nas infecções por P vivax e P ovale; e a segunda refere-se a uma situação na qual a infecção não é eliminada das hemácias pelo sistema imunitário ou por terapia e o número de parasitas nas hemácias começa a aumentar novamente com sintomas clínicos subsequentes. Neste caso, o fenômeno de recrudescência pode ocorrer nas infecções causadas por todas as espécies de Plasmodium (Garcia, 2010).

Nas células hepáticas, os protozoários diferenciam-se em forma ovais ou arredondadas denominadas criptozoítos, que em seguida sofrem multiplicação assexuada resultando em milhares de novos parasitas (merozoítos) que eclodem na ruptura de cada hepatócito (Bernan, 2004; Vale et al., 2005; França et al., 2008; Garcia, 2010; CDC, 2010a).

Ao final do ciclo tecidual, os esquizontes rompem os hepatócitos, liberando milhares de merozoítos na corrente sanguínea. Cada merozoíto invade um eritrócito, onde passa por mais uma etapa de multiplicação, produzindo de 12 a 16 merozoítos por esquizonte (glóbulo vermelho contaminado), iniciando assim a segunda fase do ciclo chamada esquizogonia sanguínea, fase em que são observados os sintomas da doença. Durante um período que varia de 48 a 72 horas, o parasito se desenvolve no interior da hemácia até provocar a sua ruptura, liberando novos

merozoítos que irão invadir novas hemácias (Figura 2; França et al., 2008; Brasil, 2010c).

Figura 2- Ciclo evolutivo do Plasmodium. A) Ciclo Hepático (A e B – Ciclo esquizogônico; B)

Ciclo hemático; C) Ciclo esporogônico. 1) Esporozoíto; 2) Merozoítos sanguíneos; 3) Penetração de merozoítos nas hemácias; 4) Esquizonte; 5) Esquizonte maduro; 6) Gametócitos; 7) Gametócitos maduros (microgametócito e macrogametócito); 8) Microgametócito exoflagelado; 9) Oocineto; 10) Oocisto; 11) Esporozoítos (Adaptado de CDC, 2010).

As manifestações clínicas da malária, febres e calafrios, também referidas como o paroxismo malárico, são associadas com a ruptura sincronizada dos eritrócitos infectados (França et al., 2008). Inicialmente, no ciclo sanguíneo o parasito sofre uma série de transformações morfológicas, mas sem divisão celular, até chegar à fase de esquizonte, quando se divide e origina novos merozoítos que serão lançados na corrente sanguínea após a ruptura do eritrócito (Brasil, 2010c).

A maior parte dos merozoítos liberados na eclosão dos esquizontes invade outros eritrócitos dando origem a outros esquizontes. Alguns, todavia, após um

período de replicação assexuada se diferenciam em formas sexuadas masculinas e femininas chamadas de microgametócitos e macrogametócitos, respectivamente, que amadurecem sem divisão celular e tornam-se infectantes aos mosquitos (França et al., 2008; Brasil, 2010c).

Os gametócitos permanecem na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado até serem ingeridos por uma fêmea do Anopheles durante o repasto sanguíneo. Uma vez dentro do intestino delgado do mosquito, estes sofrem rápida divisão celular, produzindo 8 microgametas flagelados cada um, os quais fertilizarão os macrogametas formando assim os oocinetos (macrogametas fecundados). Os oocinetos atravessam a parede do intestino e formam cistos em sua parte exterior, chamados de oocistos. Em poucos dias os oocistos sofrem o processo de esporogenia e se rompem liberando centenas de esporozoítos que, eventualmente, migrarão para as glândulas salivares do mosquito, prontos para serem injetados em outro hospedeiro vertebrado (França et al., 2008).

O período de incubação na infecção malárica varia de 9 a 40 dias após a picada do mosquito infectado, dependendo do número de parasitos inoculados, da espécie do Plasmodium e da imunidade do hospedeiro, podendo, contudo, a doença se manifestar vários meses (para o P. vivax e o P. malarie; Brasil, 2010c) ou eventualmente anos, depois da infecção (França et al., 2008; Parise, 2009; Brasil, 2010c).

1.3 PATOGENIA DA MALÁRIA

A fisiopatologia da doença está relacionada ao ciclo de vida do parasita no organismo hospedeiro, ocorrendo a manifestação dos sinais clínicos da doença no final do estágio eritrocitário, onde ocorre rompimento simultâneo de um grande número de hemácias, com consequente liberação de merozoítos e de pirógenos, tais como o pigmento hemozoína, que é capaz de estimular monócitos/macrófagos e induzir a liberação das citocinas TNF-α e Interleucina 1 (IL-1; Garcia et al., 2010).

A crise aguda da malária caracteriza-se por episódios de febres precedidos de calafrios e seguidos de intensa sudorese (Parise, 2009; Brasil, 2010c), que estão intimamente relacionados com a duração do ciclo esquizogônico, com o número de plasmódios em desenvolvimento e com o período de incubação (Brasil, 2006).

As manifestações clínicas da doença também podem ser relacionadas com a hemólise intravascular e consumo de glicose pelo parasita. A intensidade dos sintomas está relacionada à carga parasitária e liberação de citocinas (Suh et al., 2004).

A proteção do hospedeiro contra uma infecção está ligada a uma complexa interação entre mecanismos imunes inatos e adquiridos (Smith et al., 2002). Na primeira linha de defesa do organismo contra a malária, células como macrófagos, células Natural Killer (NK), células dendríticas e os linfócitos T (LT) são apontadas como as mais importantes (Stevenson & Riley, 2004; Wykes et al., 2007).

A resposta imune adaptativa aos parasitas da malária no estágio sanguíneo depende tanto da resposta celular, quanto do mecanismo mediado por anticorpos (Gillman et al., 2004). O Plasmodium utiliza, em especial, a variabilidade genética como estratégia para se evadir do sistema imune do hospedeiro (Gardner et al., 2002), por isso a reposta imune protetora não é exclusivamente efetiva e várias são as causas: a estrutura dos antígenos e sua considerável diversidade dificulta a resposta imune, a localização intracelular do parasita e ausência de moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) nos eritrócitos concorrem para que estes proporcionem um meio relativamente favorável ao crescimento do plasmódio, influenciando a sobrevivência do parasita e a transmissão ao vetor (Smith et al., 2002).

A gravidade da doença depende da espécie de plasmódio presente e do estado imunológico do hospedeiro (Suh et al., 2004; Brasil, 2006). As infecções causadas por P. vivax, P. ovale e P. malariae são geralmente mais brandas do que as causadas por P. falciparum, nas quais o período de incubação é mais curto, a evolução da doença mais rápida e a gravidade da doença geralmente maior, uma vez que este parasita penetra todos os eritrócitos, sejam células maduras ou jovens (Suh et al., 2004).

Ademais, na infecção pelo P. falciparum, observa-se um aumento da viscosidade dos eritrócitos, promovida pelos trofozoítos que se multiplicam durante a fase esquizogônica sanguínea, provocando modificações na superfície da célula parasitada, que possibilita a sua adesão à parede endotelial dos capilares. Este aumento da viscosidade é conhecido como fenômeno de citoaderência, e já foi relatado como um possível mecanismo de defesa do parasito, pois evitaria a sua passagem pelo baço e sua consequente destruição (Luse et al, 1971).

Este fenômeno parece ser o principal responsável pela obstrução de vasos sanguíneos, sendo comumente observado nos capilares renais (o que justifica a ocorrência de insuficiência renal aguda nos portadores da doença e que normalmente se torna crônica devido às crises sucessivas de malária), nos capilares pulmonares (que pode provocar transudação alveolar) e nos capilares cerebrais, sendo que a malária cerebral é a forma mais comum de coma e morte nas crianças infectadas (Braga et al, 2005; Phiri et al, 2009).

Há quatro espécies de Plasmodium (Plasmodium berghei, Plasmodium yoelii, Plasmodium chabaudi e Plasmodium vinckei) causadores da malária de roedores que são amplamente usados nos estudos experimentais, pois apresentam um quadro clínico semelhante à infecção por espécies do gênero Plasmodium em humanos (Carlton et al., 2002).

O Plasmodium berghei é ideal para o estudo dos casos de malária grave, pois além de conter sequencias genômicas muito semelhantes a do P. falciparum (http://www.sanger.ac.uk/Projects/P_berghei/), exibem lesões em órgãos como pulmões, cérebro, fígado e baço (Panet et al, 2007).

A imunidade para malária em uma diversidade de hospedeiros, inclusive humanos, é marcadamente espécie-parasita, linhagem e variante específica. No entanto, um grau de resistência-cruzada é relatado em alguns casos (Mota et al., 1998; Gardner et al., 2002). Neste sentido, diante de tamanha complexidade a respeito da patogenia da malária, faz-se necessário a busca de respostas que possibilitem seu melhor entendimento, atraves da realização de estudos sobre o o envolvimento das vias de regulação redox, tais como o estresse oxidativo (EO) e o aumento das defesas antioxidantes pelo hospedeiro (Silva, 2011), ou ainda a expressão de citocinas diversas, como IFN-γ e TNF-α (Good & Doolan, 1999; D’Ombrain et al., 2008; Robinson et al., 2009).

1.4 RADICAIS LIVRES E O ESTRESSE OXIDATIVO

Os Radicais livres (RL) são átomos ou moléculas altamente instáveis e reativos, que contém número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica, ou seja, são espécies químicas reativas que possuem elétrons não pareados nos orbitais mais externos e no intuito de captar um elétron para obter estabilidade, reagem com qualquer biomolécula, sendo necessário apenas que estas biomoléculas existam na proximidade do local de formação do radical livre (Halliwell & Gutteridge, 2007).

Estas espécies químicas podem ser formadas em meio de reações de óxido-redução, isto é, ou cedem o elétron não-pareado, oxidando-se, ou recebem outro, reduzindo-se, bem como por fissão homogênea de uma ligação química (Ferreira & Matsubara, 1997; Halliwell & Gutteridge, 2008). Entretanto, RL não é o termo ideal para designar algumas destas moléculas, uma vez que algumas não apresentam elétrons não-pareados em sua última camada, mas são importantes para o metabolismo oxidativo, constituindo as espécies reativas tóxicas derivadas do oxigênio e do nitrogênio (ERTON; Halliwell & Gutteridge, 2008).

Estas moléculas recebem este nome por serem em sua maioria derivadas do metabolismo do oxigênio ou do nitrogênio, além de serem consideradas as principais espécies químicas relacionadas a mecanismos patogênicos em humanos e animais (Halliwell & Gutteridge, 2007).

As ERTON (também chamadas de ERO e/ou ERN) representam uma família diversa de moléculas envolvidas em processos fisiológicos e fisiopatológicos. São geradas durante uma sequência de reações conhecida por estresse oxidativo, em que há um aumento no consumo não mitocondrial de oxigênio, provocado pela ativação da NADPH oxidase, a qual reduz o oxigênio a ânion superóxido (BABIOR, 1999; QUINN et al., 2006).

O ânion superóxido é o precursor primário das ERO, que podem ser divididas em: radicais livres de oxigênio – espécies altamente instáveis e de vida curta – como o ânion superóxido (O2•-), oxigênio singlete (1_{O2), radical hidroxila (OH}•_{) e radicais} mais estáveis e oxidantes não-radicalares como o ácido hipocloroso (HOCl), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ozônio (O3; BABIOR, 1999; QUINN et al., 2006).

Além deste, ainda há outros exemplos de ERO como o radical alquila (R•-) e radicais peroxila (ROO•-), NO e peroxinitrito (ONOO- _{ou O=NO; Halliwell & Gutteridge, 2008).}

Tais ERO são formadas continuamente durante o metabolismo celular e pode-se encontra-las nos diversos sistemas biológicos, tais como nas mitocôndrias, peroxissomas, citoplasma e membrana de células, retículo endoplasmático, fagócitos, lisossomas e na presença de metais de transição, como o ferro e cobre que facilitam sua formação (Ferreira & Matsubara, 1997).

Fisiologicamente, as ERTON estão envolvidas como efetoras ou subprodutos em diversos processos, tais como na produção de energia, regulação do crescimento, sinalização intercelular e síntese de substâncias. No entanto, quando ocorre uma produção aumentada de radicais livres em detrimento da capacidade fisiológica de defesa antioxidante, ocorre o desequilíbrio da sinalização e controle redox, caracterizando o estado de EO, no qual a agressão celular se torna eminente, e pode ser evidenciada através de danos aos ácidos nucléicos, proteínas, carboidratos e lipídeos (Jones, 2006; Percário et al., 2000).

Dessa forma, encontram-se relacionadas à várias patologias, tais como, câncer, hipóxia, artrite, doenças cardiovasculares, choque hemorrágico, doenças inflamatória e desordens neurológicas, assim como no envelhecimento celular (Ferreira & Matsubara, 1997; Barreiros et al., 2006; Vasconcelos et al., 2007; Gutierrez et al., 2010).

As ERTON também fazem parte dos mecanismos intermediários das moléstias que envolvem isquemia, inflamação, trauma, efeitos da radiação ionizante e hiperóxia (Halliwell & Gutteridge, 1986). Mesmo nas moléstias onde as ERO não são a causa primária de lesão, elas são importantes porque toda destruição celular libera ferro, o qual catalisa a geração do OḢ•_{, sendo capaz de iniciar a peroxidação} lipídica e geralmente resultando na destruição das membranas celulares das células vizinhas e na propagação do dano celular (Ferreira & Matsubara, 1997).

Adicionalmente, as interações parasita-hospedeiro são bastante complexas e promovem constante mudança no delicado equilíbrio redox, uma vez que tanto os parasitas como o hospedeiro são capazes de produzir oxidantes e antioxidantes (Uhlemann et al., 2004).

Os antioxidantes compreendem sistemas distintos que auxiliam o organismo a se defender da agressão causada pelos radicais livres (moléculas oxidantes). Didaticamente estes sistemas são divididos em três: enzimático (Figura 3), as

moléculas pequenas e as proteínas queladoras de metais (Halliwell & Gutteridge, 2007).

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Figura 3: Sistema antioxidante enzimático. O2●- = radical superóxido; H2O2 = peróxido de

hidrogênio; O2= oxigênio; H2O = água; H+ = cátion hidrogênio; GSH = Glutationa reduzida;

GSSH = Glutationa oxidada; GSH-Px = Glutationa peroxidase; SOD = Superóxido dismutase.

1.4.1 Malária e o Estresse Oxidativo

A resposta à infecção causada pelos plasmódios manifesta-se primariamente pelo mecanismo de defesa natural do organismo hospedeiro com envolvimento de fagócitos (macrófagos ativados e neutrófilos). Estes, por sua vez, geram grande quantidade de ERTON (O2•-, H2O2, dentre outras) e enzimas hidrolíticas, ocasionando um desequilíbrio entre a formação de espécies oxidantes e a atividade dos antioxidantes, desencadeando o EO, um importante mecanismo do hospedeiro humano em resposta a infecções microbianas em geral (Ferreira & Matsubara, 1997).

A participação do O2•- é observada em inúmeras doenças. A produção aumentada de O2•- relaciona-se com aterosclerose, esclerose múltipla e hipertensão (Glabinski et al. 1993; Cangemi et al., 2007; Lavi et al., 2007; Custodis et al., 2008), contribuindo para o início de eventos pró-inflamatórios. A disfunção endotelial também se relaciona com o aumento da produção de O2•- (Cangemi et al., 2007; Chan et al., 2007). Alguns autores também discutem o papel do O2•- no clearence de alguns parasitas como Toxoplasma gondii (Murray et al., 1979), Leishmania donovani (Haidaris & Bonvetere, 1982) e Trypanossoma cruzi (Maugeri & Cazzulo, 2004; Souza, 2008).

Nesse sentido, estudos têm sido realizados no intuito de relacionar o envolvimento dos RL, através do EO, à resposta imunológica e a patogenia da malária (Good & Doolan, 1999; Pino et al., 2005 Becker et al., 2004; Gillman et al., 2004; Moreira, 2010; Silva, 2011).

1.4.1.1 Fontes de Estresse Oxidativo

Uma das fontes geradoras de ERO observado fisiologicamente em indivíduos sadios é a fosforilação oxidativa que ocorre na mitocôndria cujo processo metabólico envolve a síntese de adenosina trifosfato (ATP) a partir da energia liberada pela cadeia de transporte de elétrons (CTE) na cadeia respiratória. Em condições normais a produção de ATP mitocondrial se dá devido ao fluxo intermitente de elétrons possibilitados pelos derivados reduzidos do ácido tricarboxílico (Nicotinamida adenina dinucleotídeo hidreto – NADH e Flavina Adenina Dinucleotídeo reduzida – FADH2). Dessa forma, cerca de 1% do oxigênio consumido para a formação de água (reduzido simultaneamente com quatro elétrons) é convertido em O2•- (redução incompleta do oxigênio com apenas um elétron), resultado de um fluxo inconstante de elétrons (Figura 4; Fariss et al., 2005).

Figura 4. Representação esquemática da cadeia de transporte de elétrons da mitocondrial (CTE) e o acoplamento e desacoplamento da fosforilação oxidativa. Os substratos NADH e FADH2 reduzido são oxidados, com a passagem dos elétrons pelos complexos enzimáticos da CTE e o bombeamento dos prótons (H+_{) para dentro do espaço intermembranar das mitocôndrias, formando} um grande potencial de membrana mitocondrial conhecida como força motriz protônica. A energia perdida pelos prótons reentra na matriz mitocondrial através da ATP sintase (A) e é usada para geração de energia de ATP a partir de ADP. Os prótons também podem voltar a entrar na matriz por meio das proteínas de desacoplamento (U), tal como UCP2, sem a produção de ATP (Fariss et al., 2005).