ACHADOS PULMONARES E CEREBRAIS

O comprometimento pulmonar e/ou cerebral que se observa na malária grave, pode resultar de inúmeros fatores, porém a presença do estresse oxidativo tem sido amplamente estudada, já que a síntese excessiva de RL promove danos celulares, bem como alteração na permeabilidade vascular (Gillrie et al., 2007; Lau, 2013).

Complicações como a malária cerebral (MC), apresentam patogênese complexa, caracterizada como um estado de coma e que está associado às manifestações neurológicas resultantes do dano endotelial e sequestro de eritrócitos parasitados na microcirculação cerebral. Muitas alterações morfológicas, como modificações na barreira hematoencefálica (BHE) e dano neuronal, já foram

identificadas nos portadores da MC (Turner, 1997; Sanni et al., 1999; Medana et al., 2002).

Pouco se sabe a respeito da participação do complexo enzimático NOX na fisiopatogenia desta síndrome, embora a participação da ERO na MC já tenha sido relatada (Sanni et al., 2012). No entanto, a excessiva e inapropriada produção de ERO pode contribuir para o dano tecidual, agredindo as células endoteliais que por sua vez, podem comprometer a BHE, provocando o agravamento da doença. Nesse sentido, o edema cerebral, assim como o pulmonar, parece determinar o quadro patológico da malária grave (Lopes, 1987). No entanto, o aumento da pressão intracraniana é que, aparentemente, confere ao edema cerebral maior risco de morte. Tal anormalidade é advinda de um conjunto de fatores que atuam a fim de eliminar a infecção mesmo sem que haja a passagem do microrganismo para o tecido cerebral (Robbins, 1991).

Dentre as fontes do estresse oxidativo na doença, uma das principais vias de produção de RL é realizada pela NOX, presente não apenas nos fagócitos, mas também em outros tecidos como as células vasculares, sintetizando fisiologicamente O2-• em baixos níveis por longos períodos de tempo, ou em altos níveis em resposta à infecções (Rabelo et al., 2010).

Apesar da NOX fagocítica ter sido primeiramente descrita, há escassas pesquisas sobre o envolvimento desta na infecção malárica. Ao contrário dos inúmeros estudos que investigam o papel da NOX endotelial em outras patologias. De fato, o conhecimento acerca da relação do complexo enzimático NOX e o desbalanço redox (estresse oxidativo), se deve principalmente aos estudos relacionados à doenças cardiovasculares (Dusting et al.,2005; Rabelo et. al, 2010).

Para avaliar a participação das ERO nas alterações oxidativas da malária em camundongos tratados e não tratados com Apocinina foram avaliados indicadores de estresse oxidativo, especificamente da peroxidação de lipídios, como as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico.

No presente estudo, os resultados encontrados para TBARS nos pulmões dos grupos A e C, apresentaram considerável diminuição, quando comparados aos grupos B e D (não infectados pelo P. berghei), mostrando entre outras diferenças pontuais, a observada entre os grupos A vs. D no 15º (p<0,001), o que nos faz pensar, que o uso da apocinina possa diminuir os níveis de TBARS. Este dado

sugere que a produção de O2.- _{pela NOX seja uma fonte importante de estresse} oxidativo na doença (Figura 15; Tabelas 5-7).

No entanto, mesmo mostrando algumas diferenças estatísticas iniciais, estas não se sustentaram, pois são observações isoladas, o que não representa significado biológico, ou seja, estes dados mostram que a apocinina diminuiu a produção de TBARS neste modelo, o que sugere, diferentemente do afirmado acima, que a síntese de superóxido pela atividade macrofágica (e portanto pela NOX) não seja um mecanismo importante para o estresse oxidativo do hospedeiro na malária.

Do mesmo modo, as concentrações de TBARS cerebrais mostraram comportamento semelhante para todos os grupos estudados, mostrando valores dentro do limiar de normalidade, referido em nosso grupo de estudo D. Esses resultados sugerem que a produção de superóxido, pelo menos no parênquima cerebral não desenvolve papel importante no desenvolvimento e na patogênese da malária, ou, ainda, que a apocinina não tenha sido capaz de atravessar a BHE.

Dessa forma, os achados do presente estudo discordam os dados encontrados por Kleniewska et al. (2013), que avaliou a influência da apocinina na peroxidação lipídica utilizando a técnica TBARS em homogeneizados de coração de ratos, nos quais o uso do inibidor da NOX provocou uma diminuição significativa nos níveis de TBARS.

Além do superóxido, há outras moléculas que desempenham papel importante durante a infecção malárica. Dentre estas, destaca-se o NO que apresenta grande importância na manutenção da parede vascular (Rabelo et. al, 2010), mas que por ser um RL, na presença do O2-•, reage extremamente rápido, formando a ânion peroxinitrito (ONOO-•), um agente pro-inflamatório altamente reativo (Dusting et al., 2005). No entanto, seu envolvimento nos acometimentos cerebrais ainda continua obscuro, não se conhendo se o problema advém das concentrações insuficientes do mesmo atuando diretamente, via radical livre, na eliminação do parasita, e por este motivo, conferindo sobrevida ao parasita (Gramaglia et al., 2006), ou se óxido nítrico em altas concentrações é o responsável pelo edema cerebral (Favre et al., 1999; Maneerat et al., 2000).

Repetindo o comportamento encontrado para as concentrações de TBARS pulmonares e cerebrais, os níveis de nitratos e nitritos detectados nos pulmões foram muito semelhantes em todos os grupos estudados, e mesmo apresentando

algumas diferenças estatísticas pontuais, estas não são observadas quando comparamos os grupos A vs. C, B vs. D, ou A vs. D.

Já a análise das concentrações de nitritos e nitratos encontradas no cérebro revelou um crescimento progressivo exibido pelo grupo D, o qual não recebeu tratamento com inibidor da NOX e não estava infectado pelo P. berghei, assim como o grupo C também mostrou crescimento progressivo, porém até o 15° dia, diminuindo suas concentrações na sequência do estudo. Quando comparamos o grupo B vs. D, verifica-se um decréscimo em suas concentrações até o 10° dia, com diferença estatística entre estes (p= 0,043), o que também foi observado para o grupo A vs. C, que exibiu o mesmo comportamento no 15° dia (p=0,022). Contudo, estas diferenças pontuais não representam significado biológico, pois não se reproduzem ao longo do tempo.

Portanto, esperava-se encontrar maior disponibilidade de NO após inibição da NOX, já que em patologias onde há ativação da NOX, tal como ocorre na malária, o aumento extracelular de O2•- favorece o sequestramento do NO e leva ao aumento da produção de peroxinitrito e de dano celular, além de diminuir a biodisponibilidade do NO (Rabelo et al., 2010).

Nas análises entre TBARS e NN pulmonares, foi encontrada correlação negativa moderada e significante para o Grupo C (r= -0,54; p= 0,0004), grupo infectado com o P. berghei, mas não tratado com a apocinina. Como os demais grupos, e em especial o Grupo A, não apresentaram correlações significantes, pode- se inferir que a apocinina não tenha exercido influência na síntese de NO durante a malária. Entretanto, a correlação TBARS vs. NN encontrada para o Grupo C se desfaz pelo uso da apocinina, conforme constatado pela ausência de correlação significante para o Grupo A, sugerindo que a inibição da NOX tenha diminuído a síntese de superóxido e, consequentemente, impedido o sequestro do NO. Ademais, para as amostras cerebrais não se encontrou correlação significante em nenhum grupo estudado.

As correlações pulmonares realizadas entre TBARS e parasitemia mostraram moderada correlação negativa significante para o Grupo A (r= -0,49; p= 0,0012) e também para Todos os Grupos (r= -0,38; p= 0,0006), e embora o grupo C tenha apresentado apenas tendência a diferença (r= -0,30; p= 0,06), o que significa que, assim como para as outras comparações, quanto maior as concentrações de TBARS, menores as porcentagens de parasitemia encontrada, ou seja, os dados do

presente estudo concordam com os achados anteriores de que o estresse oxidativo atua como fator protetor para o hospedeiro na infecção pelo P. berghei. Pode-se inferir mais ainda, neste caso, que a via de produção de ERO pela NOX não é um componente importante no estabelecimento do EO pulmonar.

Já as correlações cerebrais entre TBARS e parasitemia, apesar da correlação negativa moderada significante encontrada para todos os grupos (r= -0,48; p< 0,0001), assim como no grupo C (r= -0,64; p< 0,001), o grupo A não apresentou correlação, sugerindo que a inibição da NOX, tenha alterado este efeito de correlação anteriormente observado no grupo não tratado com apocinina (C), diferentemente dos dados observados nos pulmões.

Por último, não foi estabelecido correlações entre Nitritos e Nitratos e a parasitemia em ambos os tecidos, porem observa-se através do comportamento do estudo de correlação do grupo C, que os resultados são inversamente proporcionais, enquanto que para o grupo A, ocorreu inversão no comportamento destes resultados, demostrando valores inversamente proporcionais, ou seja, quanto mais parasitas circulantes, menores são os níveis de NN encontrados. Portanto, a diminuição de síntese de ERO pela inibição da via NADPH oxidase, não comprometeu a formação do EO, confirmando os dados de TBARS pulmonar e a parasitemia.

Embora, nossos resultados tenham sido consistentes em não mostrar diferenças significantes nos níveis de TBARS e NN em decorrência da inibição da NOX pela apocinina, ainda é cedo para que se possa afirmar que o superóxido não tenha participação importante como mecanismo primário de defesa do hospedeiro frente à infecção pelos plasmódios, fazendo-se necessário o desenvolvimento de estudos complementares.

Não obstante, os resultados de parasitemia mostram que o estresse oxidativo revela-se, de fato, como mecanismo protetor para o hospedeiro, corroborando com outros estudos que também discutiram a participação de moléculas do estresse oxidativo na proteção contra malária grave (Yeo et al, 2007; 2008; Brown et al, 2009, Dhangadamajhi et al, 2009).

5 CONCLUSÃO

Os resultados apresentados sugerem que, embora a inibição da NADPH oxidase, via tratamento com o inibidor Apocinina, tenha diminuído a sobrevida, o uso dessa substância não promoveu alterações significativas no perfil oxidativo nas amostras pulmonares e cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei.

O uso da apocinina não promoveu alterações significantes sobre a evolução da parasitemia durante 20 dias após a infecção pelo P. berghei.

Não foram encontradas correlações significantes entre TBARS e Parasitemia. A síntese de radicais superóxido por ação da NOX aparentemente não é um componente importante do EO na malária.