LÍDIA LEONIZE RODRIGUES MATIAS
EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA ISOLADO DE SEMENTES DE
TAMARINDO NANOENCAPSULADO SOBRE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS EM RATOS WISTAR SUPERALIMENTADOS COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO
NATAL/RN 2019
EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA ISOLADO DE SEMENTES DE
TAMARINDO NANOENCAPSULADO SOBRE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS EM RATOS WISTAR SUPERALIMENTADOS COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Orientador (a): Profª. Dra. Ana Heloneida de Araújo
Morais Co-orientador (a): Profª. Dra. Thais Souza Passos
NATAL/RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Matias, Lídia Leonize Rodrigues.
Efeito do inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo nanoencapsulado sobre parâmetros bioquímicos em ratos Wistar superalimentados com dieta de alto índice glicêmico / Lídia Leonize Rodrigues Matias. - 2019.
83f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2019.
Orientadora: Ana Heloneida Araújo de Morais. Coorientadora: Thaís Souza Passos.
1. Inibidor de protease - Dissertação. 2. Encapsulamento - Dissertação. 3. Superalimentação - Dissertação. 4. Digestibilidade - Dissertação. 5. Glicemia de jejum - Dissertação. 6. Perfil lipídico - Dissertação. I. Morais, Ana Heloneida Araújo de. II. Passos, Thaís Souza. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 66.097.8:643.645.6 Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA ISOLADO DE SEMENTES DE
TAMARINDO NANOENCAPSULADO SOBRE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS EM RATOS WISTAR SUPERALIMENTADOS COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada em 31 de julho de 2019.
Profª. Drª Karine Cavalcanti Mauricio de Sena Evangelista Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Ana Heloneida de Araújo Morais Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Orientador (a)
Profª Drª. Vivian Nogueira Silbiger
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Membro Interno
Profª Drª. Maira Conceição Jerônimo de Souza Lima Universidade Potiguar – UnP
Dedico este trabalho a mim, nada melhor que amor próprio.
pela força e consolo quando eu achava que não iria conseguir, afinal: “Tudo Posso Naquele que me fortalece” Filipenses 4:13
À minha família, especialmente aos meus pais pela dedicação, apoio incondicional e suporte durante toda essa caminhada difícil, mas, ao mesmo tempo, gratificante. Às minhas avós Lydia e Leonize pelo carinho e apoio sempre. E aos meus familiares
que me apoiaram e torceram por mim nessa jornada.
À minha orientadora, Profª. Drª Ana Morais, pela oportunidade concedida, confiança, todo o acolhimento, amor, paciência, e os ensinamentos que foram de grande valia para
minha vida profissional.
À minha co-orientadora, Profª. Drª Thais Passos, obrigada por haver aceitado essa missão, por todos os ensinamentos sábios e, ainda, por compartilhar um pouco dessa
paixão pela nanotecnologia.
À Prof.ª Karla Suzanne, por toda a preocupação e o incentivo constante nessa caminhada intelectual.
À Amanda, Mayara, Luana e Isaiane, sem vocês, essa jornada não seria a mesma. A amizade de vocês, as conversas, a companhia e pelo apoio, tudo isso foi fundamental.
Ao Grupo NutriSbioativoS, pelo trabalho árduo compartilhado, pelos momentos descontraídos e pelo companheirismo em especial Izael, Beatriz Luz, Fabiana Coimbra,
Ana Júlia, Vanessa, Rafael, Anny, Camila e Grazi.
Às alunas de iniciação científica, Ana Gomes, Tatiana, Gerciane, Luiza, Carla por toda dedicação e contribuição.
Às amizades preciosas construídas nesses dois anos: Josi e Keith, por todo apoio, carinho e cumplicidade.
Ao Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB), em especial Profº Dr. Elizeu pela parceria exitosa fazendo com que esse trabalho fosse
concretizado.
Ao Departamento de Morfologia (DMOR), especialmente aos Profº Dr. Pedro e a Profª Drª Christina por todo o apoio, conhecimento compartilhado e disponibilidade durante
as análises finais.
À Central Analítica, Núcleo de Petróleo e Gás (NUPEG), especialmente a técnica Cristiane por todo o apoio durante as análises.
Estrutural de Materiais, Instituto de Química e Física.
À UnP, especialmente ao Sr. Manoel, Mayra, Tarcísio e aos alunos de Medicina Veterinária e Nutrição por toda a colaboração, a paciência e a disponibilidade. À minha banca de Qualificação, ao Prof. Dr.Francisco Canindé e a Profª Drª Isabel
Amado, que participaram, com maestria, desse momento ímpar.
Ao INL, especialmente ao Dr. Lorenzo Pastrana, Drª Catarina Gonçalves, pela receptividade e o conhecimento compartilhado, por todos os ensinamentos que vão além
de uma vida profissional.
Aos integrantes da equipe do Food Processing Group (FPG): Alexandra, Gabi, Arlete, Kiki, Arthur, Vasco, Marta, Dr. Pablo, Dr. Miguel Ângelo, Miguel Xavier, Catarina,
Mariana, Cátia, Sara pelo carinho, companheirismo, receptividade e ensinamentos. Aos que, assim como eu, estavam vivendo uma experiência de internacionalização: Luz
América, Niara, Brenda Luna, Vitória. Obrigada por toda ajuda. Foi maravilhoso compartilhar essa jornada com vocês durante minha permanência enriquecedora em
Portugal.
À minha família estrangeira Bárbara Bosio e Leandro Fragoso pela amizade e pelo apoio incondicional.
A todos os que deram um toque mais que especial nessa jornada de internacionalização, com palavras de incentivo cruzando o meu caminho de uma forma positiva, descontraída e inesquecível: Luana, Patrícia, Guilherme, Jordan, Cesar, Alice, Vinicius,
Luz Letícia, Niara, Luana Pinheiro, Luciane Amorim e Kaline.
À Nathália, Anna Larissa e Mariana Mesquita, por haver compartilhado comigo o desafio da seleção para a pós-graduação. Vocês foram essenciais.
Às minhas amigas nutris, Luana, Cínthia, Luana, Mayara Cristina e Mariana, pela amizade, apoio, incentivo e por sempre torcerem por mim.
À Jéssica Queiroz, Amanda Medeiros e Mayara de Paula. Em meio ao desespero, vocês estavam ali presentes e sempre com palavras de estímulo e descontração.
Aos meus amigos Ariane, Rodrigo, Guilherme, Bárbara, Antônio, Fabiana, Amanda, Nayana e Iana por acreditarem, torcerem e vibrarem por mim.
Às minhas amigas queridas Lana, Thamy, Mariza, Ana Carolina e Rafa, pela carinho e amizade sempre. Vocês foram fundamentais nessa jornada.
Às minhas amigas queridas Thayane, Lívia, Larissa e Waleska, Yandra, Yannye, Evellyn por todas as orações, carinho e palavras de conforto.
À turma de mestrado, por esses anos de convivência, cada um, obviamente com seus desafios e idiossincrasias.
A toda equipe do PPGNUT, pelo apoio e parceria durante esse período.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código de Financiamento 001– e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CnPq) pelo apoio financeiro durante esses anos, para levar a efeito o
presente trabalho.
A todos que participaram direta e indiretamente para a construção dessa obra acadêmica.
“Se a princípio a ideia não é absurda, então não há esperança para ela”
BIOQUÍMICOS EM RATOS WISTAR SUPERALIMENTADOS COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO
RESUMO
Estudos revelam os benefícios do Inibidor de Tripsina isolado das sementes de Tamarindo (Tamarindus indica L.) (ITT), melhorando diversos parâmetros bioquímicos em ratos Wistar. Entretanto, buscam-se alternativas para intensificar o efeito do ITT, por meio da encapsulação, permitindo, assim, uma liberação controlada e potencialização do efeito bioativo. Neste estudo, investigou-se o efeito do ITT nanoencapsulado em quitosana e proteína do soro do leite isolada (EQPI) nos parâmetros bioquímicos (glicemia, insulina e perfil lipídico) em ratos Wistar superalimentados com dieta de alto índice glicêmico (HGLI), além de avaliar a estabilidade in vitro do EQPI diante de condições fisiológicas do trato gastrointestinal (TGI). As nanopartículas foram sintetizadas por nanoprecipitação utilizando solução aquosa contendo quitosana, proteína do soro de leite isolada e ITT (2:2:1 p/p/p) (EQPI) e sem ITT (2:2 p/p) (QPI). Os nanoencapsulados foram caracterizados, principalmente, quanto à morfologia (MEV) e tamanho de partícula (Difração a laser). Foram avaliados também quanto à estabilidade em face das condições do trato gastrointestinal in vitro, sendo realizadas nas fases oral, gástrica e intestinal, e monitorada por meio da atividade antitríptica e do perfil proteico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). As nanopartículas foram administradas in vivo por gavagem (12,5 mg / kg de EQPI e 10,0 mg / kg de QPI) em ratos Wistar superalimentados com dieta HGLI e investigados quanto aos parâmetros bioquímicos e análise histopatológica dos pâncreas. EQPI e QPI apresentam formatos esféricos, superfícies lisas e aglomeração e, respectivamente, diâmetro médio de 117,4 nm (24,1) e 123,9 (11,3), e índice de polidispersão de 0,370 (0,004) e 0,225 (0,013). Os resultados obtidos em condições que simulam a digestibilidade mostraram que o EQPI manteve a atividade antitríptica em 95,5%, na fase gástrica, enquanto o ITT (controle) foi hidrolisado, perdendo completamente a atividade e pico proteico característico observado por CLAE. Considerando a presença das enzimas intestinais, EQPI e ITT foram susceptíveis às condições do ensaio, como confirmado por CLAE. Em ratos Wistar superalimentados com dieta HGLI, EQPI e QPI reduziram significativamente a glicemia e o HOMA IR, e somente o EQPI aumentou o HDL-c (p <0,05). Em relação à histopatologia do pâncreas, o EQPI obteve melhores resultados quanto ao reparo tecidual e aspectos relacionados à normalidade e funcionalidade do órgão. Assim, foi possível mostrar que a nanoencapsulação promoveu maior proteção do ITT, na condição desejada, e melhora dos parâmetros bioquímicos relacionados à Síndrome Metabólica (SM), utilizando uma baixa concentração de ITT.
Palavras-chave: Inibidor de protease. Encapsulamento. Superalimentação; Digestibilidade. Glicemia de jejum. Perfil lipídico.
RATS OVERFEED WITH HIGH GLYCEMIC INDEX DIET ABSTRACT
Studies have shown the benefits of Trypsin Inhibitor isolated from Tamarind seeds (Tamarindus indica L.) (TTI), which improves several biochemical parameters in Wistar rats. However, alternatives are sought to intensify the effect of TTI, through encapsulation, which allows a controlled release and potentialize the bioactive effect. In this study, we investigated the impact of nanoencapsulated TTI on chitosan and whey protein isolate (ECW) on biochemical parameters (glycemia, insulin and lipid profile) of Wistar rats overfeed with high glycemic index diet (HGLI), in addition to evaluating the in vitro stability of the ECW against the physiological conditions of the gastrointestinal tract (GIT). The nanoparticles were synthesized by nanoprecipitation using an aqueous solution containing chitosan, whey protein isolate and TTI (2: 2: 1 w/w/w) (ECW) and without ITT (2: 2 w/w) (CW). The nanoencapsulates were mainly characterized by morphology (SEM) and particle size (Laser Diffraction). They were also evaluated for stability to in vitro gastrointestinal tract conditions being performed in the three phases, oral, gastric and intestinal, and monitored by antitrypsin activity and High-Efficiency Liquid Chromatography (HPLC). The nanoparticles were administered in vivo by gavage (12.5 mg/kg of ECW and 10.0 mg/kg of CW) in Wistar rats overfeed with HGLI diet and investigated for biochemical parameters and histopathological analysis of the pancreas. ECW and CW have spherical shapes, smooth surfaces and agglomeration and, respectively, mean diameter of 117.4 nm (24.1) and 123.9 (11.3), and polydispersity index of 0.370 (0.004) and 0.225 (0.013).The results obtained in conditions simulating digestibility showed that ECW maintained the antitrypsin activity in 95.5% in the gastric phase, whereas the TTI (control) was hydrolyzed, completely losing the activity and characteristic protein peak observed by HPLC. In the presence of intestinal enzymes, ECW and TTI were susceptible to assay conditions, as confirmed by HPLC. In Wistar rats overfeed with HGLI diet, ECW and CW significantly reduced glycemia and HOMA IR, and only ECW increased HDL-c (p <0.05). Regarding the histopathology of the pancreas, ECW obtained better results regarding tissue repair and aspects related to organ normality and functionality. It was possible to show that the nanoencapsulation promoted better protection of the TTI in the desired condition and improvement of the biochemical parameters related to the Metabolic Syndrome, using a low TTI dosage.
Keywords: Protease inhibitor. Encapsulation. Overfeeding. Digestibility. Fasting glucose. Lipid profile.
FIGURA 1. Fluxograma sumarizando a obtenção do ITT.
FIGURA 2. Fluxograma sumarizando cada fase da digestão realizada no teste de estabilidade em condições fisiológicas in vitro simulando o trato gastrointestinal. FIGURA 3. Perfil cromatográfico e Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS- PAGE) da F2 de sementes de tamarindo por Cromatografia de Afinidade Tripsina-Sepharose CNBr 4B.
FIGURA 4. Caracterização das nanoformulações QPI (controle) e EQPI obtidas pela técnica de nanoprecipitação.
FIGURA 5. Estimativa de 50% de atividade antitríptica de ITT e EQPI (IC50).
FIGURA 6. Perfil cromatográfico dos produtos de digestão de ITT nas Fases Oral, Gástrica e Intestinal por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
FIGURA 7. Perfil cromatográfico dos produtos de digestão de EQPI e QPI por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
FIGURA 8. Perfil lipídico em ratos Wistar superalimentados com dieta HGLI e submetidos a diferentes tratamentos.
FIGURA 9. Parâmetros bioquímicos em ratos Wistar superalimentados com dieta HGLI e submetidos a diferentes tratamentos.
FIGURA 10. Micrografia da histopatologia do pâncreas em coloração Hematoxilina e Eosina (HE).
TABELA 1. Concentrações de ITT e das nanopartículas em cada nas fases digestiva avaliada.
TABELA 2. Distribuição dos grupos de ratos Wistar e suas respectivas dietas.
TABELA 3. Valores de referência de parâmetros bioquímicos em ratos Wistar machos, adultos, eutróficos aclimatados no biotério da UnP/Brasil, janeiro de 2019.
TABELA 4. Atividade antitríptica (%) do ITT e do EQPI nas condições que simulam as condições do trato gastrointestinal in vitro.
ABESO - Associação Brasileira para o Estudo de Obesidade e da Síndrome Metabólica BApNa - Nbenzoyl-DL -arginine- p –nitroanilida
CCK – Colestocinina
CEUA - Comitê de Ética do Uso de Animais
CLAE - Cromatografia Eletrônica de Alta Eficiência CT - Colesterol Total
DAD - Diode Array Detector DM1 - Diabetes melittus tipo 1 DM2 - Diabetes melittus tipo 2 DP – Desvio Padrão
EFSA - European Food Safety Authority
EQPI- O ITT encapsulado com quitosana e proteína do soro do leite isolada FDA - Food and Drug Administration
FEG - Field Emission Gun
FTIR - Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier GLP-1 - Peptídeo glucagon tipo 1 (Glucagon like peptide 1)
HGLI – Dieta de Alto Índice Glicêmico HNE - Anti-neutrofílica elastase
HDL - Lipoproteínas de Alta Densidade (High Density Lipoproteins)
HOMA IR - Modelo de Avaliação da Homeostase de Resistência a Insulina (Homeostasis Aodel assessment of Insulin Resistence)
HOMA β - Modelo de Avaliação da Homeostase de células β (Homeostasis Aodel assessment of β cells)
IC50 - Concentração de Inibidor que reduz atividade em 50% (Concentration of inhibitor required to produce 50% inhibition)
KdA - Quilodalton
LDL- Lipoproteínas de Baixa Densidade (Low Density Lipoprotein) MEV- Microscopia Eletrônica de Varredura
MCP-1 – Proteina Quimiotática de Monócitos (Monocyte Chemoattractant Protein-1) OID - Obesidade Induzida por Dieta
PAGE – Gel de Poliacrilamida (Polyacrilamide Gel Electrophoresis) pH- potencial Hidrogeniônico
QPI – Nanopartículas de Quitosana e Proteina do Soro do Leite Isolada RI - Resistência à Insulina
RPM – Rotação por minuto
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio (Sodium Dodecyl Sulfate) SIF - Fluido Simulador Intestinal (Intestinal Simulator Fluid) SGF - Fluido Simulador Gástrico (Gastric Simulator Fluid) SM – Síndrome Metabólica
SSF - Fluido Simulador Salivar (Saliva Fluid Simulator) TFA - Ácido Aceticotrifluórico
TNF- α - Fator de Necrose Tumoral α (Tumor Necrosis Factor-α)
TTG - Tolerância à Glicose com Sobrecarga TZDs - Tiazolidionas
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 18 2. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ... 21 3. OBJETIVO ... 22 3.1 OBJETIVO GERAL ... 22 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 22 4 . REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23
4.1 ALIMENTAÇÃO E RISCOS METABÓLICOS ... 23
4.2 TRATAMENTOS MEDICAMENTOSOS E NATURAIS ... 28
4.3 ENCAPSULAMENTO ... 33
4.4 MODELOS IN VITRO E IN VIVO ... 36
5. METODOLOGIA ... 38
5.1 OBTENÇÃO DO ITT ... 38
5.2 OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PURIFICADA E PROTEÍNA DO SORO DO LEITE ISOLADA COM ITT (EQPI) E SEM ITT (QPI) . 39 5.3 CARACTERIZAÇÃO DO MATERIAL ENCAPSULADO ... 40
5.4 ESTABILIDADE EM CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS DO TRATO GASTROINTESTINAL ... 42
5.5 EFEITO DO EQPI EM RATOS WISTAR SUPERALIMENTADOS ... 45
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 48
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 50
6.1 OBTENÇÃO DO ITT ... 50
6.2 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ... 51
6.3 ESTABILIDADE EM CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS DO TRATO GASTROINTESTINAL ... 55
6.5 HISTOPATOLOGIA DOS PÂNCREAS DOS RATOS WISTAR ... 63
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 68
REFERÊNCIAS ... 69
1. INTRODUÇÃO
A alimentação inadequada, bem como o alto índice glicêmico das dietas, influencia, diretamente, no estado nutricional, e está diretamente relacionada aos riscos referentes ao desenvolvimento de doenças crônicas não-transmissíveis, por exemplo: as cardiovasculares, dislipidemias, Diabetes melittus tipo 2 (DM2), obesidade, Síndrome Metabólica (SM) e certos tipos de câncer como de fígado, estômago e pâncreas 1-5.
O tratamento atual da obesidade e suas complicações inclui três eixos principais: modificação comportamental (como mudanças nos hábitos alimentares), terapia farmacológica e cirurgia bariátrica. As medidas de estilo de vida saudável devem ser promovidas por todos os indivíduos como prevenção primária, secundária e terciária para sobrepeso ou obesidade e complicações associadas6,7. Contudo, a combinação de terapia medicamentosa e intervenção no estilo de vida pode produzir maior perda de peso, comparada à intervenção apenas no estilo de vida e, consequentemente, impactando positivamente em complicações metabólicas associadas à obesidade 6,8.
Nos últimos anos, o Food and Drug Administration (FDA) aprovou vários medicamentos para o tratamento em longo prazo da obesidade nos Estados Unidos. Entretanto, grande parte promove efeitos adversos no sistema nervoso central8,9. Portanto, a busca por novos fármacos é crescente, especialmente, por moléculas naturais, cujo potencial bioativo ainda é pouco explorado10,11. Nessa perspectiva, sobressaem os estudos com moléculas contendo propriedades bioativas de interesse para o combate das alterações metabólicas relacionadas às dietas inadequadas, tais como: o sobrepeso, a obesidade e as complicações associadas.
Concernente à DM2, os recursos medicamentosos são utilizados em um segundo momento da terapêutica, quando não é possível controlar as concentrações glicêmicas com dietas e exercícios físicos. Entre os agentes medicamentosos disponíveis para a terapia do diabetes incluem-se insulina e hipoglicemiantes12. As alterações metabólicas, advindas das altas concentrações da glicemia, podem, também, estar associadas à presença de outros fatores como a Resistência à Insulina (RI); nesse caso, são mais apropriadas às drogas anti-hiperglicemiantes, que irão melhorar a atuação da insulina endógena, com melhor controle5.
A proteína de soro de leite é uma fonte rica em peptídeos bioativos, os quais despertam interesse devido à capacidade de desempenhar um papel dietético, como hipoglicemiante, além de auxiliar no tratamento de doenças crônicas. Esses peptídios
apresentam a habilidade de atravessar a barreira gastrointestinal, e modular funções do organismo relacionadas aos sistemas nervoso, imunológico, cardiovascular e gastrointestinal 13,14.
A quitosana é um biopolímero catiônico obtido com base na desacetilação da quitina presente, principalmente, em cascas de crustáceos e exoesqueleto de insetos15, trazendo diversas propriedades biológicas de destaque para aplicações biomédicas (biocompatibilidade, biodegradabilidade, agente cicatrizante, e homeostático)16. Contudo, a quitosana é, também, capaz de aumentar a estabilidade de proteínas e peptídeos para aplicações específicas17.
Os inibidores de proteases são exemplos de proteínas que demonstram diversas propriedades, tais como antifúngica, antibacteriana, anti-inflamatória,e anticancerígena. Além disso, promove efeitos na coagulação e alergias pulmonares, e efeito sacietogênico18. O inibidor de tripsina isolado da semente de tamarindo (Tamarindus indica L.), denominado ITT, foi estudado por Ribeiro et al.19 e Carvalho et al.20, que investigaram o efeito em ratos Wistar eutróficos, em que não foram observadas alterações nas concentrações de glicose, colesterol total (CT), lipoproteínas de baixa densidade (LDL-c), lipoproteínas de alta densidade (HDL-c) e triglicerídeos. Em ratos com SM, foi constatada a redução de triglicerídeos e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-c), e redução na concentração média de glicose, porém não de forma significativa (p>0,05).
Dessa forma, buscam-se alternativas para potencializar o efeito dessas biomoléculas e, nesse contexto, a técnica de encapsulação pode promover a proteção de substâncias bioativas em função de fatores extrínsecos (temperatura, luz, pH, presença de oxigênio), além de proporcionar liberação controlada em local específico, e, ainda, intensificar o efeito biológico21. As nanopartículas (< 100 nm), a base de inibidores de proteases, quitosana e proteína do soro do leite isolada, têm-se apresentado de forma eficaz, promovendo estabilidade e eficiência no transporte e liberação 22-24.
Estudos constatam que nanopartículas à base de proteína do soro do leite isolada possuem boas propriedades nutricionais e funcionais, conseguindo reter compostos bioativos com sucesso. Ademais, podem ser facilmente digeridas no sistema digestivo e liberar o bioativo25. Já as nanopartículas de quitosana são consideradas naturais de excelentes propriedades biológicas, físico-químicas, antimicrobianas, antioxidante26, além de apresentar capacidade de reduzir a glicose, colesterol total,
triglicerídeos, quando comparada à quitosana comercial (50 a 190 kDa), devido ao menor peso molecular, facilitando a absorção dos oligossacarídeos de quitosana. Além disso, a quitosana pode ser modificada para alterar propriedades como solubilidade, mucoadesão, aumentar a eficiência de encapsulação de proteínas e peptídeos17.
Queiroz et al.27 obtiveram nanopartículas a base de ITT, quitosana e proteína do soro do leite isolada e observaram que a combinação entre os agentes encapsulantes foi essencial para proteger e garantir melhores resultados inibitórios contra a tripsina. Adicionalmente, Costa 28 mostrou que essa mesma nanoformulação não apresentou sinais de toxicidade in vitro e in vivo, sugerindo uma aplicação segura dessas partículas.
Diante do exposto, a combinação quitosana e proteína do soro do leite isolada pode ser um veículo interessante a ser investigado quanto ao efeito nas atividades biológicas quando utilizados como agentes encapsulantes do Inibidor de Tripsina Isolado do Tamarindo (ITT). Portanto, ressalta-se a importância do presente estudo que avaliou in vitro a estabilidade do ITT nanoencapsulado, diante das condições fisiológicas do trato gastrointestinal, e, o efeito sobre a glicemia, insulina e perfil lipídico em ratos Wistar superalimentados com dieta de alto índice glicêmico.
2. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
O ganho de peso e as condições associadas, tais como: Resistência à Insulina (RI), DM2, dislipidemia e esteatose hepática, culminando com a Síndrome Metabólica (SM), representam grandes desafios para a ciência básica e para a pesquisa clínica. Dessa forma, constata-se que a existência de modelos experimentais apropriados é crucial para estudos sobre a patogênese e terapia desses complexos distúrbios metabólicos29.
Desse modo, estudos têm proposto tratamentos mais naturais para doenças crônicas não transmissíveis provenientes de um estilo de vida inadequado. Entre essas alternativas destacam-se os inibidores de proteases presentes naturalmente em animais, plantas e micro-organismos. Assim, destacam-se as proteínas das sementes do tamarindo, as quais possuem efeito na redução do peso e saciedade 20,21. Além dos inibidores, incluem-se biomoléculas como quitosana e proteína do soro do leite isolada, as quais apresentam propriedades funcionais no tratamento de alterações metabólicas13,14,17,30.
Dessa forma, buscam-se alternativas para potencializar o efeito dessas biomoléculas e, neste contexto, uma opção é o nanoencapsulamento que consiste no aprisionamento do material ativo pelo agente encapsulante, com o objetivo de aumentar a estabilidade e a manutenção da viabilidade do agente ativo, considerando que esse promove proteção quanto aos fatores extrínsecos, tais como: luz, presença de oxigênio, variação de pH, umidade, calor. Além disso, proporciona maior estabilidade, potencializa o efeito da molécula encapsulada e controla a liberação31.
Portanto, o presente estudo visa responder a seguinte pergunta: “O ITT encapsulado com quitosana e proteína do soro do leite isolada (EQPI) apresenta estabilidade in vitro diante das condições fisiológicas do trato gastrointestinal e, apresentam seus efeitos biológicos potencializados em relação aos parâmetros bioquímicos avaliados em ratos Wistar superalimentados?”
3. OBJETIVO 3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar in vitro a estabilidade de nanopartículas a base de quitosana e proteína do soro do leite isolada com o Inibidor de Tripsina do Tamarindo (ITT), frente às condições fisiológicas do trato gastrointestinal e, o efeito em ratos Wistar superalimentados com dieta de alto índice glicêmico e carga glicêmica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter o ITT com base nas sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.). Produzir e caracterizar nanopartículas de ITT encapsuladas com quitosana e
proteína do soro do leite isolada (EQPI).
Investigar a estabilidade in vitro do EQPI referente às condições fisiológicas do trato gastrointestinal.
Determinar o efeito do EQPI sobre o perfil lipídico, glicemia de jejum e insulina em ratos Wistar superalimentados com dieta de alto índice glicêmico e carga glicêmica.
Avaliar a morfologia histológica dos pâncreas dos ratos Wistar superalimentados com dieta de alto índice glicêmico e carga glicêmica.
4 . REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 ALIMENTAÇÃO E RISCOS METABÓLICOS
A literatura atual tem apresentado evidências que apontam alguns componentes da dieta como determinantes na indução de efeitos adversos ao organismo, enquanto outros são importantes na prevenção e no controle de determinadas disfunções orgânicas. Portanto, o conhecimento quanto aos hábitos alimentares e aos fatores associados de segmentos específicos de diferentes populações tem recebido atenção especial em inúmeros estudos 32,33.
O índice glicêmico de alimentos sobressai entre os segmentos da alimentação moderna mais estudada e tem recebido especial atenção, por estar sendo recomendado como critério para a escolha de alimentos de origem dos carboidratos. Nesse contexto, cabe, ainda, destacar a carga glicêmica, que é o produto do índice glicêmico e o total de carboidratos disponíveis em uma determinada quantidade de alimentos34.
As dietas hiperglicídicas contêm ingredientes altamente calóricos e saborosos, entretanto esse tipo de alimento possui uma relação direta não só com a hiperglicemia, mas também com a lipogênese35. Essa relação culmina no desenvolvimento de RI, DM2, dislipidemias e no acúmulo de gordura corporal. Assim, essas dietas têm sido utilizadas como estratégia nos estudos de causa-efeito relacionados aos hábitos alimentares, obesidade e distúrbio associados a essa doença 29,36,3736.
Estudos em ratos utilizando dietas hiperglicêmicas demonstraram que estas têm sido capazes de provocar modificações no metabolismo glicídico e lipídico desses animais, mesmo sem mudanças no peso21. Porém, pela relação direta entre o consumo desse tipo de dieta e o surgimento de doenças, especialmente a obesidade, tem havido um maior interesse dos pesquisadores visando esclarecimentos quanto a essas relações, e assim propor formas de prevenção e combate às complicações como, RI e consequente DM2, dislipidemias e SM29,36.
4.1.1 Alimentos de alto índice glicêmico e sua relação com RI e DM2
Os componentes dietéticos mais determinantes na glicemia são os carboidratos presentes na dieta, que alteram as concentrações glicêmicas de acordo com a quantidade e tipo de carboidratos ingeridos; isso define o seu índice glicêmico. É
consensual que uma dieta de alto índice glicêmico, além de aumentar o peso corporal, contribui para o aumento das concentrações de glicemia em jejum, podendo contribuir para a deficiência da secreção insulínica pelas células pancreáticas. Isso ocorre devido à quantidade de insulina secretada ser determinada com base na concentração de glicose, contribuindo, assim, para o desenvolvimento da resistência insulínica38-40.
A RI ocorre quando a ação da insulina não é suficiente para manter as concentrações glicêmicas normais. Em ocorrência de hiperglicemia, o pâncreas produz uma alta quantidade de insulina como mecanismo de compensação para alcançar o equilíbrio, alterando tecidos e órgãos, sendo a mais importante manifestação clínica o defeito das células β pancreáticas e a diminuição da secreção da insulina. Ademais, a RI potencializa a lipólise dos triglicerídeos do tecido adiposo, aumentando os ácidos graxos livres que inibem o efeito antilipolítico da insulina, resultando no estímulo à lipólise 30,41.
Ademais, a RI também pode intensificar o aumento da pressão arterial que se relaciona aos outros componentes da SM por diversos mecanismos. Esses incluem a reabsorção de sódio, a expansão de volume intravascular, a ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona e do sistema nervoso simpático, a secreção de angiotensinogênio pelo tecido adiposo e a própria RI 41,42.
As medidas menos invasivas e de maior relevância clínica, para o diagnóstico da RI, são glicemia de jejum e insulinemia de jejum. Assim, fatores como alteração da glicemia devem ser estudados, visto que a RI é um prognóstico para o aparecimento de DM2, tendo em vista que indivíduos com obesidade, possivelmente possuem RI e podem também apresentar com alterações metabólicas41.
Distúrbios metabólicos, provenientes da dieta inadequada, estão associados ao maior risco para o desenvolvimento das complicações do DM2, pelo aumento precoce do risco de doenças cardiovasculares e aterosclerose43,44. A homeostase da glicose em jejum depende do balanço entre a produção pelo fígado e a utilização nos tecidos musculares, adiposo e hepático, os quais são insulino dependentes, como também nos tecidos insulino independentes (cérebro e rins)45. Portanto, o diagnóstico é baseado na detecção da hiperglicemia; para isso, são utilizados diferentes tipos de exames para o diagnóstico, por exemplo: a glicemia casual, glicemia de jejum, teste de tolerância à glicose com sobrecarga de 75 g em duas horas (TTG) e, destacando-se como padrão ouro, hemoglobina glicada43.
Há, também, o modelo de Avaliação da Homeostase, mais conhecido como índice HOMA, que representa uma das alternativas à técnica de avaliação da RI, no caso do HOMA IR ou o funcionamento das células pancreáticas, considerando o HOMA β. O HOMA IR fornece uma medida indireta da RI, ao avaliar a insulina endógena e a glicemia em condições de homeostase e jejum. O HOMA β, por refletir atividade do pâncreas, pode, em conjunto com HOMA IR auxiliar no diagnóstico da DM246. Essas constatações, também, extrapolam para os modelos experimentais, pois, segundo King e Bowe et al.47, os modelos animais estão sendo cada vez mais usados para elucidar os mecanismos subjacentes ao DM1 e DM2. Assim, a capacidade de estudar a homeostase da glicose in vivo tornou-se uma ferramenta essencial no diagnóstico da diabetes, seja do tipo 1 ou 2, sendo, portanto essencial nas decisões terapêuticas.
No tratamento do DM2, os recursos medicamentosos são utilizados em um segundo momento da terapêutica, quando não é possível controlar as concentrações glicêmicas com dietas e exercícios físicos. Entre os agentes medicamentosos disponíveis para a terapia do diabetes, estão incluídos insulina e hipoglicemiantes. Porém, espécies vegetais vêm sendo citadas na literatura como adjuvantes no tratamento da DM2, atuando tanto no tratamento da doença em si, como atenuando os sintomas e possíveis consequências48.
4.1.2 Alimentos de alto índice glicêmico e a relação com a dislipidemia
O processo biológico em que os carbonos provenientes de carboidratos (glicose, frutose, lactose etc.) das dietas de alto índice glicêmico são transformados em lipídios (ácidos graxos) é chamado de lipogênese 35. Dietas de alto índice glicêmico estimulam a lipogênese, processo desencadeador do desenvolvimento de dislipidemias pelo aumento da expressão de enzimas lipogênicas. A acetil-CoA, proveniente da via glicolítica, é o substrato desse processo, enquanto a glicose plasmática, pelo fato de agir no processo de liberação de insulina, um dos importantes fatores hormonais, afeta a lipogênese e estimula a captação da glicose pelas células adiposas, sugerindo possíveis alterações no perfil lipídico. Alguns estudos sugerem que dietas hiperglicídicas podem gerar hipertrigliceridemia, reduzir a concentração de lipoproteína de alta densidade-colesterol (HDL-c) e, favorecer a formação de partículas pequenas e densas de lipoproteína de baixa densidade-colesterol (LDL-c)37.
Já a dislipidemia, definido como desequilíbrio dos componentes lipídicos na corrente sanguínea, exerce um papel fundamental no desenvolvimento de doenças cardiovasculares49. De acordo com a Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose50 pode ser classificada segundo aspectos genótipos, devido a mutações genéticas, ou fenótipos também conhecido como bioquímico, a qual considera alterações nos valores de CT, LDL-C, TG e HDL-C e compreende quatro classificações principais: a hipercolesterolemia isolada que apresenta elevação isolada do LDL-C (≥ 160 mg/dL); a hipertrigliceridemia isolada que compreende na elevação isolada dos TGs (≥ 150 mg/dL ou ≥ 175 mg/dL em jejum) e, reflete o aumento do número e/ou do volume de partículas ricas em TG, como VLDL, LDL e quilomícrons; hiperlipidemia mista, a qual apresentam valores aumentados de LDL-C (≥ 160 mg/dL) e TG (≥ 150 mg/dL ou ≥ 175 mg/dL em jejum); e HDL-c baixo que apresenta a redução do HDL-c (homens < 40 mg/dL e mulheres < 50 mg/dL) isolada ou em associação ao aumento de LDL-c ou de TG.
Outro elemento relevante nas dislipidemias são as apolipoproteínas B encontradas nas lipoproteínas LDL-c e lipoproteína de muito baixa densidade-colesterol (VLDL-c). A concentração dessas lipoproteínas aumenta de acordo com a quantidade de gordura abdominal e, a presença delas, em altas concentrações, potencializa o risco cardiovascular51. O excesso de gordura corporal contribui para o acúmulo de lipídeos nos tecidos, principalmente no tecido adiposo, músculos, fígado e células ß pancreáticas, o que parece induzir as alterações bioquímicas52.
Os ácidos graxos livres, oriundos do tecido adiposo excessivo, são conduzidos ao fígado e músculos para ser metabolizados. No fígado, existe um limite de oxidação desses ácidos, portanto, os restantes são esterificados em VLDL-c, aumentando a concentração de triglicerídeos plasmáticos. Todavia, o HDL-c e o LDL-c ficam ricos em triglicerídeos, e em seguida, sofrem lipólise. Nesse caso, a concentração de HDL-c diminui devido à eliminação mais rápida, enquanto as moléculas de LDL-c tornam-se menores e mais densas. Esse processo é potencializado pela RI, visto que a hiperglicemia estimula a síntese hepática de triglicerídeos53.
4.1.3 Alimentos de alto índice glicêmico e sua relação com obesidade e SM
A SM é um dos maiores desafios para a saúde pública por estar relacionada, segundo a NCEP- ATP III a associação de pelo menos três critérios: circunferência da
cintura >88cm para mulheres ou >102cm para homens; HDLc 150 mg/dL; pressão arterial com valores de corte considerando 130/85mmHg; e glicemia de jejum >110mg/dL54. Já, Conforme a Associação Brasileira para o Estudo de Obesidade e da Síndrome Metabólica (Abeso)55, a SM é definida com pelo menos dois critérios referentes a glicemia de jejum ≥100 mg/dl , PAs ≥130 ou PAd ≥85mmHg, triglicérides ≥150mg/dl HDL <40mg/dL para homem e <50mg/dL para mulheres.
Diante do exposto, a SM é a um importante risco para doença cardiovascular (DCV) e o consumo de uma alimentação rica em açúcares e alimentos refinados, pobres em carboidratos complexos e fibras, contribuem para as alterações na composição corporal, principalmente o aumento da gordura, podendo promover o desenvolvimento da SM56.
Outros fatores, tais como: predisposição genética, sedentarismo, tabagismo, ganho ponderal progressivo, padrão alimentar inadequado, envelhecimento, estado inflamatório e alterações hormonais podem, também, ter um efeito causal na SM49,56. A obesidade tem sido associada a complicações metabólicas, a qual a dislipidemia, as doenças cardiovasculares e DM2 possuem um papel preponderante57.
O aumento da prevalência de SM no mundo está claramente associado ao aumento da obesidade e do estilo de vida sedentário. Ademais, diversos fatores agregam-se a esses, intensificando os riscos metabólicos e, o estresse psicossocial também influencia no desenvolvimento e manutenção da síndrome5,54. Segundo Abeso55, o risco de doenças metabólicas na vida adulta é maior naqueles indivíduos que apresentaram obesidade na infância. A obesidade é fortemente associada à alteração no perfil lipídico devido à grande quantidade de ácidos graxos livres que é liberada, contribuindo, assim, para a dislipidemia aterogênica. Nessa condição, ocorre o aumento da síntese e a secreção da fração VLDL-c pelo estímulo da esterificação no fígado; da hipertrigliceridemia plasmática; do aumento da quantidade de LDL-c; e da diminuição do HDL-c30.
É fato que, os adipócitos secretam citocinas, capazes de influenciar outros fatores de risco metabólicos, como adiponectina, interleucina-6 (IL-6), o fator de necrose tumoral α (TNF-α), resistina, leptina, angiotensinogênio, e o inibidor do ativador de plasminogênio do tipo 1, que interferem na sinalização intracelular, comprometendo a função endotelial e o metabolismo pós pandrial 31,58,59. Além disso, o adipócito secreta substâncias como o monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1),
que induz a atração de macrófagos. Essas células são cruciais na produção de citocinas, que se infiltram no estroma do tecido adiposo abdominal, contribuindo para a exacerbação e perpetuação do processo inflamatório crônico. Esses marcadores inflamatórios são mais acentuados na gordura visceral60.
Dessa forma, recomenda-se que o excesso de peso e, especialmente, do tecido adiposo típico, na obesidade, seja o alvo principal do tratamento da SM25, visto que a perda de peso otimiza o perfil lipídico, reduz a pressão arterial e a glicemia, além de melhorar a sensibilidade à insulina61.
4.2 TRATAMENTOS MEDICAMENTOSOS E NATURAIS
O aumento da prevalência da obesidade, consequentemente, das doenças crônicas não transmissíveis e suas complicações têm intensificado as buscas por novos tratamentos, considerando a importância na maioria dos casos, da combinação entre medicamentos para perda de peso, além da intervenção no estilo de vida, em especial na alimentação6,8. Vários medicamentos podem ser recomendados para o tratamento da obesidade. No entanto, para a grande maioria tem sido relatado aspectos negativos associados ao uso7,9.
Entre essas drogas, a sibutramina, um inibidor de recaptação de serotonina, foi retirada do mercado europeu e americano devido a um estudo que relatou um aumento do risco de infarto não letal em pacientes com doença cardiovascular preexistente. O orlistat — outra droga popularmente conhecida no tratamento da obesidade — é um inibidor da lipase pancreática, reduzindo, assim, a digestão e a absorção intestinal de gorduras. A flatulência, a esteatorreia e a incontinência fecal, causada pelo orlistat, são as principais causas da descontinuação do tratamento. O liraglutido é um agonista do GLP-1 (Glucagon-like peptide-1), utilizado no tratamento da diabetes, mas também reduz a ingestão aguda de alimentos, a fome subjetiva e, retarda o esvaziamento gástrico. No entanto, aparentemente, esses resultados estão ligados a efeitos colaterais, como náuseas, vômitos e dor abdominal8,9.
Já para RI e DM2, o tratamento na maioria dos casos envolve o uso de medicamentos, cujas escolhas vão depender dos valores das glicemias de jejum e pós-prandial, da hemoglobina glicada, do peso, da idade, e de complicações e doenças associadas. Ainda, as possíveis interações com outros medicamentos, reações adversas e as contraindicações deverão ser analisadas. Com a glicemia inferior a 150 mg/dL, estão
indicados os medicamentos que não promovam aumento na secreção de insulina, principalmente, se o paciente apresentar obesidade. Entretanto, quando a glicemia de jejum for superior a 150 mg/dL, mas inferior a 270 mg/dL, a indicação da monoterapia antidiabética oral dependerá do predomínio entre resistência ou insulino-deficiência 5,61.
Na maioria das vezes, é verificada, no início clínico do DM2, a presença de obesidade, hipertrigliceridemia, HDL-c baixo, hipertensão arterial, entre outros estigmas observados na SM. Eles indicam a presença de RI e, nesse caso, são mais apropriadas às drogas anti-hiperglicemiantes, que irão melhorar a atuação da insulina endógena, com melhor controle metabólico, evitando ganho ponderal. Em caso de perda de peso e hiperglicemia, revela a deficiência de insulina, nessa circunstância, os medicamentos secretagogos devem ser os mais indicados (sulfonilureias ou glinidas). Para pacientes com glicose de jejum normal ou próximo do normal, mas com hemoglobina glicada acima do normal, está indicado o uso de fármacos que atuem na glicemia pós-prandial (acarbose ou glinidas)5.
Ademais, nos casos de dislipidemias, o medicamento vai depender dos valores constituintes do perfil lipídico, considerando peso, idade e complicações associadas62. Segundo Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose 50, os valores de referência para perfil lipídico adequado para adultos, homens, maiores de 20 anos em jejum são: CT <190 mg/dL; HDL-c >40 mg/dL; Triglicerídeos < 150 mg/dL; LDL-c: 100 mg/dL a 130 mg/dL: Não HDL-c: 130 mg/ dL a 160 mg/dL. Os valores de LDL- c e não HDL-c citados são os sugestivos para alvos terapêuticos, devendo levar em consideração tendo em vista o risco de cada indivíduo.
Tratando-se de dislipidemias, as estatinas devem ser consideradas como medicamentos de primeira escolha no tratamento dos casos de SM, devido à existência de maiores evidências relacionando-as à redução da morbimortalidade cardiovascular. Esse medicamento inibe a HMG-CoA redutase, reduzindo a síntese de colesterol e aumentando a expressão hepática dos receptores da LDL-c e, consequentemente, a captação dessa lipoproteína e das VLDL-c pelo hepatócito40,41. Entretanto, estudos apresentam que os medicamentos mais utilizados para o tratamento de diversas alterações metabólicas relacionadas aos parâmetros bioquímicos, como tiazolidionas (TZDs) e fibratos, os quais causam efeitos indesejáveis como a hepatoxicidade,
portanto, pesquisas com composto bioativos se destacam buscando o desenvolvimento de novos biofármacos 63,64.
Portanto, faz-se necessária a realização de novos estudos sobre o desenvolvimento de tratamentos para alterações metabólicas, para minimizar o quadro crítico consequente. Para traçar novas estratégias, o modelo animal torna-se ideal para esses estudos, considerando o controle metabólico mais preciso, e as implicações éticas que são impostas pelos estudos com humanos.
4.2.1 Quitosana
A quitosana é um polímero, com carga positiva, apresentando diversas propriedades biológicas de destaque para aplicações biomédicas como biocompatibilidade, biodegradabilidade, agente cicatrizante, e homeostático)16. Sua obtenção ocorre por meio da desacetilação da quitina e pode ser encontrada em cascas de crustáceos e exoesqueleto de insetos15. Sua estrutura pode ser modificada para alterar propriedades, tais como: solubilidade, mucoadesão e estabilidade, para aplicações específicas, sobressaindo a presença de grupos primários de amina (-NH2), os quais fornecem um local de reação para modificação química (reações com sulfatos, citratos e fosfatos)65 para alcançar várias aplicações farmacêuticas. Isso pode aumentar a estabilidade e eficiência de encapsulação de fármacos ou compostos bioativos66.
Além disso, estudos apontam que esse biopolímero (quitosana de baixo peso molecular e oligossacarídeos de quitosana) apresenta potencial clínico para reduzir a glicemia em ratos com diabetes induzida; capacidade in vitro para se ligar à gordura devido à presença de grupos amino (carregados positivamente), que interagem com os grupos carboxila de ácidos graxos e sais biliares (carregados negativamente), aumentando a excreção nas fezes e reduzindo os triglicerídeos no soro67.
Polímeros biodegradáveis, por exemplo, a quitosana são estudados, principalmente, como sistemas de liberação controlada de princípios ativos, estabilização de moléculas biológicas como proteínas, peptídeos ou material genético durante o encapsulamento17. A carga positiva da quitosana ajuda a estabelecer uma forte interação com moléculas carregadas negativamente, podendo ou não alterar sua atividade26,68.
As nanopartículas de quitosana, descritas pela primeira vez em 1994 por Ohya et al., apresentam características da quitosana e as propriedades das nanopartículas, como efeito de superfície e interface, tamanho pequeno e efeitos de tamanho quântico69. São consideradas materiais naturais, ecologicamente correto, com excelentes propriedades físico-químicas, antimicrobianas, antioxidante e biológicas 26. Além disso, possuem excelente bioatividade sem danos aos seres humanos70.
Seo et al.71 mostraram que nanopartículas apresentam melhora quanto aos parâmetros bioquímicos, quando comparada a quitosana comercial. Tal fato é justificado devido seu menor peso molecular, o que facilita a absorção dos oligossacarídeos de quitosana, produzidos por meio da hidrólise.
Zhang et al.72 observaram que nanopartículas de quitosana formulada apresentaram efeito hipolipidêmico potencializado, promovendo uma redução na acumulação de lipídios no fígado de ratos alimentados com dieta rica em gordura comparado aos que receberam quitosana comercial. Isso pode estar relacionado à maior superfície de contato das nanopartículas de quitosana, aumentando a interação com os lipídios e promovendo o aumento da excreção nas fezes.
De acordo com Al-Zahraa et al.73, formulações à base de quitosana apresentam maior capacidade de resistir ao metabolismo de primeira passagem, aumentando biodisponibilidade do bioativo encapsulado, quando este polímero é utilizado como agente encapsulante.
4.2.2 Proteína do Soro do Leite Isolada
A proteína de soro de leite — fonte rica de peptídeos bioativos — podem desempenhar um papel dietético, e, ainda, auxiliar no tratamento de doenças crônicas. Além disso, desperta grande interesse em função das propriedades bioativas relacionadas à presença de peptídeos, os quais apresentam a habilidade de atravessar a barreira gastrointestinal e modular funções do organismo relacionadas aos sistemas nervoso, imunológico, cardiovascular e gastrointestinal13,14.
As proteínas do soro são geralmente comercializadas em três formas: concentrado proteico de soro de leite, proteína de soro de leite isolada e proteína de soro de leite hidrolisada74. O concentrado contém gordura e lactose, junto com às proteínas
essenciais (29-89%)75; o hidrolisado é a forma semi-digerida da proteína; e o isolado é constituído por 90% de proteína76.
Nesse contexto, a proteína do soro do leite isolada, além de apresentar atividades como antitumoral, anticâncer, imunomodulação, anti-hipertensiva76, se destaca por apresentar uma mistura de proteínas (β-lactoglobulina, α-lactoalbumina, albumina do soro bovino, glicomacropeptídeo, imunoglobulinas, lactoferrina e outras) obtidas por meio da precipitação da caseína durante a produção de derivados lácteos (queijo, iogurte)77. Essas proteínas são digeridas, rapidamente, pelo trato gastrointestinal, resultando em altas concentrações pós-prandiais de aminoácidos (leucina, isoleucina, valina, lisina e treonina) que podem agir como secretagogos de insulina, melhorando a homeostase da glicose, responsável, também, por uma atividade antidiabética78.
No contexto de nanotecnologia, nanopartículas de proteína do soro do leite isolada possuem boas propriedades nutricionais e funcionais e, podem reter compostos bioativos com sucesso, além da capacidade de auxiliar no tratamento de doenças crônicas. Uma outra vantagem é a digestão dessas partículas pelo sistema digestivo, que é mais facilitada, liberando o composto bioativo encapsulado em condições ácidas tendo em vista a hidrolise da proteína do soro do leite isolada da fase gástrica, que segue, posteriormente às condições alcalinas como as do intestino delgado25.
4.2.3 INIBIDORES DE TRIPSINA DAS SEMENTES DE TAMARINDO Os inibidores de proteases são proteínas, capazes de controlar a atividade de proteases, ligando-se as enzimas e inativando-as. Os inibidores de tripsina apresentam, como papel principal a atividade inibitória da enzima tripsina. Eles estão presentes na natureza, sendo comuns em diversos alimentos, destacando-se, como fonte, as sementes do fruto tamarindo19.
Fook et al.79 purificaram um inibidor de protease da semente de tamarindo com 14,4 kDa que apresentou atividade antineutrofílica elastase (HNE), importante para o tratamento de doenças que apresentam hiperatividade neutrofílica. Já Araujo et al.15 purificara e caracterizaram um inibidor de tripsina presente na semente de tamarindo que apresentou massa molecular de 20 kDa. Esse inibidor foi testado in vitro e in vivo quanto sua atividade bioinseticida contra Ceratitis capitata (mosca da fruta) e Callosobruchus maculatos (caupi gorgulho).
Ainda relacionado aos inibidores de tripsina em sementes de tamarindo, estudos publicados pelo grupo de pesquisa, Nutrição e Substâncias Bioativas aplicada à Saúde (NutriSBioativoS), mostraram que o ITT atua reduzindo o consumo alimentar, tanto em ratos Wistar eutróficos quanto nesses animais, apresentando obesidade e suas complicações19,20,80. Entretanto, em animais com obesidade, o ITT foi capaz de reduzir TG, VLDL-c e TNF-α20 e leptina80,independente da redução do peso corporal.
Considerando a propriedade sacietogênica, antidislipidêmica e anti-inflamatória comprovada do ITT19,20,80 e, da crescente busca por opções seguras e eficazes para o tratamento adjuvante das mais diversas alterações metabólicas, uma alternativa que se mostra eficaz é o encapsulamento do ITT, visando à maior estabilidade e eficiência. Destaca-se que, no estudo de Medeiros et al.81, o ITT foi purificado e caracterizado, fornecendo informações essenciais e inovadoras para uma biomolécula de provável aplicação biotecnológica e promissora como candidata ao encapsulamento.
Queiroz et al.27 obtiveram o ITT nanoencapsulado (EQPI) com a combinação de dois agentes encapsulantes, a quitosana purificada e proteína do soro do leite isolada. As nanopartículas apresentavam formato esférico, com superfície lisa, de tamanho aproximado de 100 nm, características que garantiram ao inibidor em questão uma maior estabilidade da atividade antitríptica, quando comparada a atividade inibitória do ITT não encapsulado. Essa molécula é, portanto, uma excelente candidata aos estudos experimentais que visam à melhora de parâmetros bioquímicos relacionados às alterações metabólicas, provocadas por dietas inadequadas. Adicionalmente, Costa 28 revelou, em seu estudo, que a mesma nanoformulação não apresentou sinais de toxicidade in vitro e in vivo, sugerindo uma aplicação segura dessas partículas.
4.3 ENCAPSULAMENTO
O encapsulamento configura uma técnica que, apesar do alto custo, permite o desenvolvimento de formulações em que um conteúdo é protegido e a sua liberação pode ser modificada, com o objetivo de atuar num determinado local por um determinado tempo a uma velocidade específica, além de potencializar o efeito das substâncias encapsuladas82,83. Além disso, essa técnica visa proporcionar uma maior estabilidade e manutenção da viabilidade do agente ativo, considerando que esse promove proteção em relação a vários fatores extrínsecos83. Esse método promove a
formação de novos materiais com diferentes escalas de tamanho, como micropartículas entre 1 a 100 µm, e nanopartículas, na faixa de 1 a 100 nm 84. Entretanto, destaca-se que o termo “nano” pode ser utilizado para materiais produzidos para uma finalidade ou função específica, não se limitando à escala de tamanho determinada em estudos com nanopartículas85.
O encapsulamento sobressai como mecanismo para imobilizar macromoléculas, incluindo as proteínas. No que diz respeito às nanopartículas, essas têm se apresentado de forma eficaz para inibidores de proteases, mostrando estabilidade e eficácia no transporte e liberação dessas moléculas, não obstante os escassos estudos 27,83,86,87.
Existem vários métodos que permitem o encapsulamento, sendo esses classificados pelas suas características. Entre os físico-quimicos, estão: a coacervação ou separação por fase orgânica; envolvimento lipossômico; pulverização em agente formador de reticulação, entre outros. Entre os métodos químicos, destacam-se a polimerização interfacial e a inclusão molecular. Já os métodos físicos são, principalmente, o spray drying, spray coating, spray chilling, extrusão88.
A nanoprecipitação consiste em um método físico-químico proposto por Fessi et al.89, caracterizado pela solubilização do ativo em água (ou em um solvente miscível em água), contendo o agente encapsulante e um tensoativo. Posteriormente, ocorre a homogeneização dessa solução a um não-solvente, que irá promover a precipitação das partículas no sistema. As nanopartículas são obtidas como suspensão coloidal, formada quando as duas fases são homogeneizadas sob agitação moderada90. Dessa forma, conforme Galindo-Rodriguez et al.91, o processo de formação das nanopartículas pode ser caracterizado devido às interações entre solvente, água-polímero e solvente-água-polímero. Portanto, a nanoprecipitação possui, como vantagens, fácil reprodutibilidade, alta eficiência de encapsulação e o baixo consumo de energia 89,92.
Ao longo dos anos, os sistemas de liberação controlada promovidos por nanopartículas e micropartículas revelaram um enorme potencial em aplicações médicas e farmacêuticas93. Esses sistemas têm sido amplamente utilizados para administração de drogas, polipeptídeos, proteínas, vacinas, ácidos nucleicos. Em relação aos sistemas de liberação por meio de nanopartículas, eles apresentam vantagens notáveis como passar pelos menores vasos capilares em função de seu volume mínimo; evitar a depuração por
fagócitos, prolongando a duração do seu efeito na corrente sanguínea; penetrar nas células e no espaço dos tecidos para chegar a órgãos-alvo; podem apresentar propriedade de liberação controlada devido a fatores como biodegradabilidade, pH, íon e / ou sensibilidade à temperatura dos materiais. Além disso, podem melhorar a utilidade de drogas e reduzir efeitos colaterais tóxicos94.
Desta forma, as nanopartículas podem fornecer maior e melhor funcionalidade quando administradas em menor quantidade em relação ao material convencional, sendo esses aspectos os mais visados pela nanotecnologia95. Assim, para garantir a qualidade e integridade do material encapsulado produzido, são necessárias algumas análises de caracterização do material encapsulado. Entre elas, a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) tem sido bastante utilizada, permitindo a avaliação da morfologia do material, fornecendo informações em relação à superfície, tamanho físico das partículas e características físicas gerais, permitindo um resultado rápido sobre a proteção do núcleo e homogeneidade do material obtido96.
A Difração a Laser produz informações referentes quanto à distribuição de diâmetro, sendo um método baseado no ângulo formado após a incidência de luz sobre partículas dispersas. Partículas menores dispersam os feixes de laser em ângulos menores, enquanto as partículas maiores dispersam em ângulos maiores97,98. Além disso, também fornece informações sobre o índice de polidispersão, que é essencial para avaliar se a distribuição do tamanho das partículas no meio disperso apresenta-se homogênea ou heterogênea; isso irá refletir, diretamente, na estabilidade do material99.
Outra técnica seria a Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), que analisa transições moleculares de estados vibracionais ou rotacionais de baixa energia (4000 a 400 cm–1). As ligações químicas apresentam frequências de vibração específicas, que correspondem aos níveis de energia da molécula, permitindo a identificação de grupos funcionais97. No entanto, além dos estudos de caracterizações relacionados aos aspectos físicos e químicos, também se faz importante analisar a estabilidade da partícula encapsulada, considerando a provável aplicação.
Desse modo, o tamanho de partícula, a distribuição das cargas superficiais (Potencial Zeta), a distribuição da massa molar do polímero, o teor do ativo e o pH são, geralmente, os parâmetros físico-químicos que podem ser utilizados para monitorar a estabilidade de nanopartículas28,89. No entanto, as principais limitações são: a agregação
das partículas, a estabilidade química do agente ativo, e liberação antecipada deste, sendo ideal o estudo prévio do comportamento do material em condições semelhantes às que serão aplicadas ou administradas28.
4.4 MODELOS IN VITRO E IN VIVO
Modelos in vitro, simuladores das condições fisiológicas do trato gastrointestinal, são utilizados como opções para compreender o comportamento e a biodisponibilidade de nutrientes por meio da simulação do processo de digestão que ocorre em três fases: oral, gástrica e intestinal. Nesses modelos, também são considerados fatores como pH, temperatura, presença de enzimas digestivas e sais, tempo de digestão, além de outros99,100.
Diferentes formas de hidrólise enzimática alteram as características das proteínas e podem influenciar a geração subsequente de potenciais peptídeos bioativos101. Além disso, esses peptídeos precisam ser resistentes à degradação por proteases gastrointestinais, a fim de serem capazes de exercer a função biológica após serem absorvidos no epitélio intestinal e, distribuídos pela corrente sanguínea. Assim, a digestão simulada de proteínas, utilizando enzimas gastrointestinais é, frequentemente, usada e fundamental para determinar a bioacessibilidade e a disponibilidade de peptídeos bioativos29,102.Os modelos experimentais in vivo são muito utilizados como base das pesquisas. Os animais roedores têm sido os mais utilizados pelos centros de pesquisa e são importantes para estudos científicos em várias áreas por apresentarem características genéticas e fisiológicas semelhantes às dos seres humanos 103.
De acordo com Nascimento et al.104, modelos animais proporcionam condições mais adequadas em estudos que envolvem pesquisas relacionadas às alterações metabólicas, visto que promovem um controle mais efetivo dos componentes que estão envolvidos nesses distúrbios, além de fornecerem condições melhores para compreensão da fisiopatologia e tratamento. Sabendo que as dietas hiperglicídicas provocam mudanças, especialmente, na glicemia de jejum, essas podem apresentar um papel fundamental na ocorrência de alterações metabólicas em modelo animal20.
Em modelos animais, quanto aos valores e concentrações de referência de normalidade para parâmetros bioquímicos em roedores, existe uma enorme variedade, especialmente, em linhagens provenientes de pais não consanguíneos 105. Desse modo, os experimentos devem ser conduzidos utilizando estratégias para reduzir as
variabilidades individuais, como uniformização e estratificação do grupo, ajuste de medidas, aclimatização e controle ambiental e nutricional. Assim, o ideal para estabelecer uma comparação com as condições experimentais é utilizar animais sadios no biotério em que se realizarão os estudos, visando à obtenção de valores de referência adequados às condições daqueles animais102.
Considerando a linhagem Wistar, essa é susceptível à obesidade induzida por dieta (OID) e à resistência à insulina com variações individuais29, uma vez que, é proveniente de pais não consanguíneos. Entretanto, dependendo do tipo de OID, essa linhagem apresenta fenótipos de obesidade e distúrbios metabólicos completamente diferentes, como observado no estudo de Bortolin et al.106, no qual destacam a importância da seleção da dieta para esses fins. Dessa forma, a escolha da dieta e do modelo experimental parece ser extremamente importante para o sucesso de experimentos que visam avaliar novas biomoléculas promissoras para o tratamento de distúrbios metabólicos, provocados por dietas inadequadas.
Existem alguns estudos que indicam uso de fitoterápicos para o tratamento de diabetes, sendo alguns utilizados como antidiabéticos e, quando avaliados, demonstraram ter atividade hipoglicemiante e possuir constituintes químicos capazes de ser utilizados como modelos para novos agentes 107-109. Tendo em vista a obesidade como alvo principal no tratamento das mais diversas alterações no metabolismo de macronutrientes, os inibidores de tripsina têm também se destacado com uma alternativa no tratamento adjuvante da obesidade e suas complicações 110.
Dessa forma, ressalta-se a importância de estudos referentes à administração de nanopartículas a base de quitosana e proteína isolada do soro do leite, bem como em relação com ITT, considerando investigar os efeitos em modelo in vitro, do ponto de vista de digestibilidade e estabilidade diante de condições fisiológicas que simulem o trato gastrointestinal, bem como avaliar a influência nos parâmetros bioquímicos em ratos Wistar.
5. METODOLOGIA
O presente estudo aborda uma pesquisa experimental, descritiva com abordagem quantitativa em modelo animal superalimentado com dieta HGLI para avaliação do efeito de EQPI sobre aspectos in vitro e in vivo.
5.1 OBTENÇÃO DO ITT
O processo de obtenção do inibidor de tripsina de tamarindo foi realizado segundo Carvalho et al.20 no Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB) do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
As sementes foram descascadas para obtenção do cotilédone, o qual foi moído em triturador refrigerado (TE 631/2 Tecnal) à 6 °C para obter uma farinha com granulação fina padronizada (40 mesh). Posteriormente, o material foi homogeneizado em tampão Tris-HCl (pH 7,5) na proporção 1:10 (p/v). A solução foi submetida à agitação constante com auxílio de um agitador magnético por 3 horas à temperatura ambiente, sendo, em seguida, centrifugado (10.000 x g /30 minutos a 4 °C) e filtrado para obtenção do extrato bruto.
Posteriormente, o extrato bruto foi precipitado, utilizando sulfato de amônio nas faixas de saturação 0% - 30%, 30% - 60% e 60% - 90%, sob agitação constante em agitador magnético a temperatura ambiente. Após cada etapa, as frações obtidas permaneceram a 4 °C por 20 horas e, posteriormente, foram centrifugadas (10.000 x g / 30 minutos a 4 °C). Os precipitados foram suspensos em tampão Tris-HCl (50 mM, pH 7,5) e submetidos à diálise em água destilada (45mL de amostra /4L de tampão), utilizando membranas com poro de 14 kDa, por 20 horas, sendo novamente dialisados em tampão Tris-HCl por mais 20 horas (45mL de amostra /4L de tampão).
As frações obtidas foram denominadas F1 (0%-30%), F2 (30%-60%) e F3 (60%-90%) e armazenadas em freezer a -20 °C e avaliadas quanto à atividade inibitória da tripsina, utilizando como substrato Nbenzoyl-DL -arginine- p –
nitroanilida (BApNa / 1,25 Mm)111 Após a realização do teste de atividade inibitória para tripsina, a fração com maior atividade foi submetida à Cromatografia de Afinidade em coluna de tripsina-Sepharose (10 cm X 1,5 cm) com tampão Tris-HCl (pH 7,5) para isolamento do inibidor. O pico proteico não retido na coluna foi eluido
