OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PURIFICADA E

O processo de encapsulamento foi realizado em triplicata de acordo com Luque-Alcaraz et al.114 adaptada por Queiroz et al. 27 no Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TECBIOFAR) do Departamento de Farmácia da UFRN e, no Laboratório de Análises de Alimentos, no Departamento de Nutrição da UFRN.

Foi utilizada uma razão 1:2:2 (p/p/p) e 1:1 (p/p) para obtenção de nanopartículas de quitosana e proteína do soro do leite isolada com (EQPI) e sem ITT (QPI), respectivamente. A etapa de purificação da quitosana se deu com base em Kumari et al.87 com modificações propostas por Queiroz et al.27.

As soluções aquosas, contendo os agentes encapsulantes, foram preparadas separadamente, sendo a solução da proteína do soro do leite isolada submetida à agitação magnética à temperatura ambiente por 40 minutos. E a solução contendo quitosana purificada segundo Queiroz et al.27 foi submetida inicialmente a pH 3.0, utilizando ácido acético (PA) e, solubilizada por 90 minutos a 50°C, sendo, posteriormente, o pH elevado a 5,5, utilizando NaOH (6 M). Por fim, as soluções preparadas foram homogeneizadas por 40 minutos à temperatura ambiente. As amostras com ITT foram acrescidas com o inibidor, e novamente solubilizada sob agitação magnética por 15 minutos à temperatura ambiente.

O etanol absoluto (10 °C), contendo Tween 80 (0,10%), foi utilizado para promover a precipitação das partículas. A precipitação de EQPI e QPI em etanol foi realizada sob a ação do ultradispersor (Ultraturrax IKA®) a 17.500 rpm por 5 minutos.

O precipitado da dispersão obtida foi separado em centrífuga Excelsa 4, Modelo 280, (10 minutos, 35840 x g, 10 °C), o qual foi novamente disperso em etanol absoluto (1:4 p/v) e deixado em overnight (aproximadamente 16 horas) sob refrigeração, para promover a desidratação. Posteriormente, a dispersão foi filtrada utilizando papel de filtro qualitativo e, o ITT encapsulado, retido no papel de filtro, foi congelado em freezer a -30 ºC e, posteriormente, submetido à liofilização a temperatura de -42 °C e pressão igual a 10-3 mbar 28.

5.3 CARACTERIZAÇÃO DO MATERIAL ENCAPSULADO 5.3.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A análise se deu no Laboratório de Caracterização Estrutural de Materiais do Departamento de Engenharia de Materiais da UFRN. Visando determinar a morfologia dos materiais obtidos, bem como o seu tamanho físico, nanopartículas de EQPI e QPI, foram dispersas em acetona e, posteriormente, gotejado em placa de silício fixada em fita de carbono. As partículas dispersas foram averiguadas em diversos aumentos, utilizando alto vácuo e tensão de 2 kV, com auxílio do microscópio eletrônico de varredura Zeiss Auriga com fonte de elétrons do tipo FEG.

5.3.2 Difração a Laser

A determinação do tamanho de partícula foi realizada no Núcleo de Petróleo e Gás (NUPEG) do Departamento de Engenharia Química- Centro de Tecnologia da UFRN, segundo a metodologia de Queiroz et al.27 com modificações. 5,5 mg de cada nanoformulação foram dispersos em 4 mL de acetona, separadamente, sob agitação magnética durante 2 minutos e, em seguida, foram adicionados 4 mL de formaldeído e, novamente, agitada por mais 30 minutos, para promover a desaglomeração das partículas. Após esse tempo, a dispersão foi filtrada com auxílio de papel filtro qualitativo.

Para mensurar o diâmetro e o índice de polidispersão (IP), o material retido no papel de filtro foi disperso em 4 mL de água, e adicionado em cubeta de quartzo e analisados em NanoBrook ZetaPlus Zeta Potential Analyzer, software Brookhaven Instruments – ZetaPALS particle sizing. A análise foi realizada em triplicata.

5.3.4 Espectroscopia no Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) Essa caracterização ocorreu na Central Analítica do Instituto de Química da UFRN, onde a proteína do soro do leite isolada, a quitosana purificada, o Tween 80 e o ITT, bem como as nanopartículas de EQPI e QPI foram adicionados, separadamente, a brometo de potássio (KBr), sendo macerados e prensados para formação de pastilhas. Em seguida, tiveram suas transmitâncias verificadas em um intervalo de infravermelho médio de 400 a 4000 cm-¹ _{em espectrômetro (Shimadzu, modelo FTIR-8400S, série} IRAFFINITY-1, software IRSOLUTION, versão 1.60), com número de varredura de 32 e resolução 4 cm1.

5.3.5 Eficiência de incorporação e IC50 (Concentração Inibitória para 50%) do EQPI

Essa análise foi efetivada no Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB) do Departamento de Bioquímica da UFRN, conforme Queiroz et al.27.

Por se tratar de um inibidor de tripsina, a quantidade EQPI foi estipulada conforme a metodologia proposta por Kakade et al.111, para determinação da atividade antitríptica da proteína. Inicialmente, foi determinada a inibição da tripsina (%) utilizando quantidades de ITT iguais a 0,2; 0,4; 0,7; 1,1; 1,4; 2,8 mg. O percentual de

inibição para tripsina obtido em cada uma dessas concentrações foi utilizado para construção de uma curva IC50 por teste de probabilidade estimado por meio de uma regressão probit com as concentrações de ITT transformadas em base de log 10 e a frequência de resposta como sendo o percentual de inibição. Esse dado foi processado no software IBM SPSS Statistic 20.

A quantidade de ITT, responsável por 50% da atividade antitríptica, utilizada foi estabelecida tendo em vista os resultados da IC50. No mesmo ensaio de inibição, foi observado que 1,4 mg de ITT a quantidade que apresentou 100% de inibição da tripsina. Portanto, a quantidade de EQPI, utilizada para determinar 50% da atividade antitríptica, foi proporcional a sua composição de 1:4 (ITT: agentes encapsulantes), sendo utilizado 7.0 mg de EQPI, considerando que apresenta 1,4 mg de ITT e 5,6 mg do agente encapsulante, utilizando também as quantidades 2,1; 3,5; 5,5; 7,0; 14,0 mg para a determinação da quantidade para obter 50% de atividade inibitória, recorrendo ao mesmo cálculo estatístico realizado com ITT. Deve-se ressaltar que a avaliação foi realizada com QI e agentes encapsulantes (quitosana purificada e proteína isolada do soro do leite).

Para a eficiência de encapsulamento, inicialmente, o EQPI foi solubilizado em água, agitado em vórtex por 1 minuto e centrifugado (56000 x g/ 5 minutos a 37ºC) sendo o sobrenadante retirado para realização do ensaio antitrípitico. O ensaio foi realizado em triplicata e, para o QPI utilizou-se o tampão Tris-HCl. Assim, após a obtenção desses resultados, a eficiência de incorporação foi determinada, segundo Kumari et al.100, com base na fórmula abaixo:

Eficiência de incorporação (%) = (inibidor nas partículas / total de inibidor utilizado) × 100.

5.4 ESTABILIDADE EM CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS DO TRATO