UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE EMBRIOLOGIA, BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA CURSO DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Bernardo Perin Cima
ANÁLISE GENÉTICA E EPIDEMIOLÓGICA DOS POLIMORFISMOS 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187 A/G DA 3’UTR DO GENE HLA-G EM PACIENTES COM
CÂNCER DO COLO DO ÚTERO E CÂNCER DE MAMA
Florianópolis 2019
Bernardo Perin Cima
ANÁLISE GENÉTICA E EPIDEMIOLÓGICA DOS POLIMORFISMOS 14 pb In/Del, 3142 G/C e 3187 A/G DA 3’UTR DO GENE HLA-G EM PACIENTES COM CÂNCER
DO COLO DO ÚTERO E CÂNCER DE MAMA
Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em Ciências Biológicas - Licenciatura do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Licenciado em Ciências Biológicas
Orientadora: Profª. Dra. Yara Costa Netto Muniz Coorientadora: Dra. Emily Bruna Justino Ribeiro
Florianópolis 2019
Bernardo Perin Cima
ANÁLISE GENÉTICA E EPIDEMIOLÓGICA DOS POLIMORFISMOS 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187 A/G DA 3’UTR DO GENE HLA-G EM PACIENTES COM
CÂNCER DO COLO DO ÚTERO E CÂNCER DE MAMA
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de Licenciado em Ciências Biológicas e aprovado em sua forma final pelo Curso de Ciências
Biológicas.
Local, 29 de Novembro de 2019.
________________________ Prof. Dr. Carlos Roberto Zanetti
Coordenador do Curso Banca Examinadora:
________________________ Profª. Dra. Yara Costa Netto Muniz
Orientadora
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Profª. Dra. Norma Machado da Silva
Avaliadora
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Drª. Alice Heidrich Prompt
Avaliadora
AGRADECIMENTOS
Assim como meu homônimo Bernardo de Chartres, entendo que somos apenas anões alçados aos ombros de gigantes. Se podemos ver tanto ou tão longe, não é pela acuidade de nosso olhar ou pela superioridade de nossa altura, mas porque somos elevados por aqueles que vieram antes de nós e construíram, de forma coletiva, a ciência que nos sustenta hoje. Portanto, gostaria de agradecer aos gigantes que me carregam e a todos aqueles que contribuem de alguma forma para que possamos olhar cada vez mais longe.
O meu mais sincero e especial agradecimento à Profa. Dra. Yara Costa Netto Muniz, minha orientadora, professora, chefe e exemplo em tudo que faz, certamente uma das gigantes em quem nos apoiamos. Agradeço por estar sempre, literalmente, de portas abertas, pela confiança, pela infinita paciência e por todos os ensinamentos ao longo dos anos, não apenas sobre Genética, mas sobre a vida. Tuas aulas e tuas palestras são como música, daquelas que não cansamos de ouvir.
Agradeço a minha coorientadora Dra. Emily Bruna Justino por ter feito minha introdução ao laboratório, ensinando-me todas as técnicas utilizadas nesse trabalho e por toda a disponibilidade, mesmo quando longe, para resolver qualquer problema, por menor que fosse.
Agradeço a todos os amigos que fiz ao longo da graduação, em especial à minha formidável amiga Iara, quem mais me tolerou ao longo de todo esse processo, esteve ao meu lado no laboratório, no estágio, nas aulas, nas palestras, nos eventos, nas festas e, principalmente, nos revigorantes cafés, sem os quais nenhum de nós teria chegado até aqui. Agradeço toda a parceria, as risadas e as ―duras‖, mas principalmente a presença: é sempre reconfortante saber que temos alguém com quem dividir as conquistas, mas principalmente as quedas.
Agradeço a todos os colegas de laboratório que fizeram e fazem do LAPOGE um local tão alegre e acolhedor, principalmente às queridas, atenciosas, solícitas e autênticas Mari e Clisten, pela amizade, pelos ensinamentos e pela disponibilidade em ajudar a qualquer momento e em qualquer coisa, sendo fundamentais para a realização deste trabalho.
Agradeço à Profa. Dra. Juliana Dal-Ri Lindenau por todo o amparo na bioestatística que, para mim, foi a parte mais difícil de todo o trabalho e pela paciência em ensinar a mesma coisa uma centena de vezes. Seus conhecimentos e sua disponibilidade foram essenciais para a elaboração deste trabalho.
Agradeço à Universidade Federal de Santa Catarina, corpo docente, direção, administração e servidores que contribuem com a educação de todos que escolhem o Curso de Ciências Biológicas e a profissões de Biólogo e Professor, certamente duas das profissões mais nobres de todas.
Agradeço aos órgãos de financiamento de pesquisa e extensão PIBIC, PROGRAD, PROEX e à Fundação de amparo à pesquisa e inovação de Santa Catarina (FAPESC), pela concessão dos recursos destinados à aquisição de equipamentos e reagentes (FAPESC / PPSUS (2015TR41);
Agradeço às integrantes da banca avaliadora, Profa. Dra. Norma Machado da Silva, Dra. Alice Heidrich Prompt e Dra. Bibiana Sgorla de Almeida, que se dispuseram a avaliar e contribuir com sugestões para melhorar este trabalho.
Agradeço a todas as mulheres que aceitaram participar deste estudo, principalmente às pacientes com câncer de mama e câncer do colo do útero. Espero que possamos sempre avançar na luta contra o câncer através da pesquisa e da informação, ajudando todas as futuras pacientes que se encontrarem nessa luta.
Agradeço ao Hospital Universitário, aos médicos Braulio Leal Fernandes, Renato Salermo Wilkens e Daniella Serafin Couto Vieira pelo auxílio na coleta das amostras, bem como ao Hospital Universitário da UFSC (HU) e demais funcionários desta instituição. À Dra Renata Toscano Simões e Instituto de Ensino e Pesquisa – IEP, Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, pela colaboração inestimável, concedendo as amostras. À Istéfani Luciene Dayse da Silva, Lorena Mendes Maia; Cinthya Regina de Medeiros Borém, Kênia Cristina Magalhães e a todos que de forma direta ou indireta auxiliaram na concretização deste trabalho.
Agradeço aos meus amigos de toda a vida pelas visitas, pelas risadas, pelas viagens, pelos churrascos e por me aturarem em meus extremos, de qualquer forma sei que sempre posso contar com vocês a bordo da aventura ou com uma frase nada motivacional para os momentos mais difíceis. ―Um amigo leal ri de suas piadas mesmo quando elas não são tão boas e simpatiza com seus problemas mesmo quando eles não são tão maus‖. Tenho muito orgulho e vibro com cada conquista de vocês.
Agradeço a meu irmão Daniel por sempre estar tentando melhorar todos a seu redor. Aprendi demais contigo durante todo esse processo e sigo aprendendo. Obrigado pela parceria e pelas risadas, seja de perto, seja de longe. Sei que sempre posso recorrer a ti.
Por fim, agradeço a meus pais Ricardo e Diana pelo exemplo que são como pessoas, pelo apoio, por todas as condições que me deram e dão, sem nunca medir esforços, permitindo que eu possa focar em minha formação e educação, sei que sou um privilegiado. Obrigado.
―Nem tudo que reluz é ouro. Nem todos que vagueiam estão perdidos.‖
RESUMO
O câncer é um problema de saúde pública mundial, sendo registradas, em 2018, 9,6 milhões de mortes por câncer em todo o mundo. Excetuando-se o câncer de pele não melanoma, o câncer de mama e o câncer do colo do útero são, respectivamente, o primeiro e o terceiro tipo de câncer mais frequente na população feminina. O gene HLA-G está localizado no complexo principal de histocompatibilidade e apresenta função de escape da imunovigilância. A região 3’ não traduzida do gene apresenta alto grau de variações nucleotídicas, como os polimorfismos 14 pb In/Del (rs1704), +3142 G/C (rs1063320) e +3187 A/G (rs9380142). Os alelos 14 pb Del, +3142 C e +3187 G estão associados a maior estabilidade do mRNA e, consequentemente, maiores níveis de expressão da molécula de HLA-G. Desta forma, esses polimorfismos podem estar associados ao desenvolvimento e capacidade de invasão das células cancerígenas devido ao escape da imunovigilância. Tendo em vista o papel do HLA-G e de sua expressão ser alterável pela variabilidade dos três loci citados, o objetivo do trabalho foi verificar a associação dos polimorfismos com o desenvolvimento das doenças em um estudo caso-controle, bem como dos dados epidemiológicos como a presença ou ausência de infecção por HPV, hábito tabagista e histórico familiar. A amostra do câncer de mama foi composta por 98 pacientes diagnosticadas com carcinoma ductal invasivo e 101 pacientes controle sem evidência da doença. A amostra do câncer do colo do útero foi formada por 37 pacientes diagnosticadas com lesão invasiva do colo do útero e 52 mulheres sem lesão ou histórico da doença. Foi realizado teste de qui-quadrado exato para as variáveis do grupo caso, entretanto não foram encontrados valores de p significativo, demonstrando homogeneidade entre os grupos. Por regressão logística foi observado um resultado significativo para a combinação haplotípica DCADGG, indicando um caráter protetivo quanto ao câncer de mama (p=0,024). Por regressão de Poisson observamos uma razão de prevalência de 3,914 para a presença de HPV em pacientes com câncer de mama em relação aos pacientes controles (p>0,001). Em conclusão, esse estudo indica que a presença de HPV é um fator que influencia no desenvolvimento do câncer do colo do útero, enquanto a combinação haplotípica DCADGG tem uma influência protetiva em relação ao desenvolvimento do câncer de mama.
ABSTRACT
Cancer is a worldwide public health problem, with a record of 9.6 million cancer deaths all over the world in 2018. Apart from non-melanoma skin cancer, breast cancer and cervical cancer are, respectively, the first and third most common cancers in the female population. The HLA-G gene is located in the main histocompatibility complex and has immunovigilance escape function. The untranslated 3’ region of the gene shows a high degree of nucleotide variation, such as 14 bp In/Del (rs1704), +3142 G/C (rs1063320) and +3187 A/G polymorphisms (rs9380142). The 14 bp Del, +3142 C and +3187 G alleles are associated with increased mRNA stability and, consequently, higher levels of HLA-G molecule expression. Thus, these polymorphisms may be associated with the development and invasiveness of cancer cells due to the escape of immunovigilance. Considering the role of HLA-G and its expression being changeable by the variability of the three loci, the objective of this work was to verify the association of the polymorphisms with the disease development in a case-control study, as well as epidemiological data such as the presence or absence of HPV infection, smoking and family history. The breast cancer sample consisted of 98 patients diagnosed with invasive ductal carcinoma and 101 control patients with no evidence of the disease. The cervical cancer sample consisted of 37 patients diagnosed with invasive cervical injury and 52 women without injury or history of the disease. Exact chi-square test was performed for the case group variables, however no significant p values were found, demonstrating homogeneity between the groups. Logistic regression showed a significant result for the DCADGG haplotype combination, indicating a protective character for breast cancer (p=0.024). Poisson regression showed a prevalence ratio of 3.914 for the presence of HPV in breast cancer patients compared to control patients (p>0.001). In conclusion, this study indicates that the presence of HPV is a factor that influences the development of cervical cancer, while the haplotypic combination DCADGG has a protective influence on the development of breast cancer.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Concentração e volume dos reagentes e soluções utilizados na PCR. ... 29 Tabela 2 - Concentrações e volumes utilizados na reação de eletroforese. ... 30 Tabela 3 – Concentrações e volumes dos reagentes e soluções utilizados na purificação das amostras... ... 31 Tabela 4 – Concentração e volume dos reagentes e soluções utilizados na reação de sequenciamento... 32 Tabela 5 – Concentrações e volumes dos reagentes e soluções envolvidos na reação de precipitação dos fragmentos. ... 32 Tabela 6 – Frequências alélicas e genotípicas e equilíbrio de Hardy-Weinberg nos loci 14pb
In/Del, +3142G/C e +3187A/G nos grupos caso e controle do câncer de mama e do câncer do
colo do útero. ... 36 Tabela 7 – Distribuição do hábito tabagista e histórico familial entre os genótipos nos loci
14pb In/Del, +3142G/C e +3187A/G e valor de p para o teste de qui-quadrado nos grupos
casos e controles da amostra de câncer de mama. ... 38 Tabela 8 - Distribuição do hábito tabagista e histórico familial nos loci 14pb In/Del,
+3142G/C e +3187A/G entre os genótipos e valor de p para o teste de qui-quadrado nos
grupos casos e controles da amostra de câncer do colo do útero... 38 Tabela 9 – Cálculos de associação entre a presença de HPV e o desenvolvimento do câncer do colo do útero. ... 39 Tabela 10 - Frequências genotípicas dos loci 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187 A/G para presença ou ausência de infecção por HPV e valor de p para o teste de qui-quadrado exato em indivíduos caso da amostra de câncer do colo do útero. ... 40 Tabela 11 - Frequências genotípicas dos polimorfismos 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187
A/G nas variáveis anatopatológicas (TNM e Grau de Bloom) e valor de p para o teste de
qui-quadrado exato para o câncer de mama. ... 41 Tabela 12 - Cálculos de associação entre a presença das combinações haplotípicas e o desenvolvimento do câncer de mama. ... 43 Tabela 13 - Cálculos de associação entre a presença das combinações haplotípicas e o desenvolvimento do câncer do colo do útero. ... 43
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática da composição de uma mama normal com vista frontal e lateral... ... 16 Figura 2 – Representação esquemática do colo do útero normal e de suas partes. ... 18 Figura 3 - Os estágios da progressão no desenvolvimento do câncer do colo do útero. ... 19 Figura 4 – Localização e disposição nas classes I, II e III dos genes que compõem o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) no braço curto do cromossomo 6 (6p.21.2); em amarelo, o locus HLA-G, alvo do presente estudo. ... 21
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Adenina
ACS Sociedade Americana de Câncer, do inglês American Cancer Society BRCA1 Gene câncer de mama 1, do inglês Breast Cancer 1
BRCA2 Gene câncer de mama 2, do inglês Breast Cancer 2
C Citosina
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CEPSH Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade
Federal de Santa Catarina
CN Controle Negativo
CNS Conselho Nacional de Saúde
Del Deleção
DES Dietilestilbestrol
DNA Ácido desoxirribonucleico, do inglês desoxyribonucleic acid dNTP Desoxirribonucleotídeos trifosfatados, do inglês deoxynucleotide
triphosphates
EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg et al. ―e outros‖, do latim et alii
F Nome dado à direção jusante, do inglês Forward G Guanina
gDNA DNA Genômico
HIV Vírus da Imunodeficiência Adquirida, do inglês
human immunodeficiency virus
HLA Antígeno Leucocitário Humano, do inglês Human Leukocyte Antigen HPV Papilomavírus humano, do inglês human papilomavirus
HU Hospital Universitário Professor Polydoro Ernani de São Thiago
HW Hardy-Weinberg
IARC International Agency for Research on Cancer In Inserção
InDel Inserção e deleção
INCA Instituto Nacional de Câncer José de Alencar LAPOGE Laboratório de Polimorfismos Genéticos MgCl² Cloreto de magnésio
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade, do inglês Major
Histocompatibility Complex
mL Militros mM Milimolar
mRNA RNA mensageiro
miRNA Micro RNA
NCI Instituto Nacional de Câncer, do inglês National Cancer Institute ng Nanogramas
OMS Organização Mundial da Saúde
OPAS Organização Pan-Americana de Saúde OR Odds Ratio
pb Pares de base
PCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês Polymerase Chain Reaction
R Nome dado à direção montante, do inglês Reverse RNA Ácido ribonucleico, do inglês Ribonucleic Acid
RP Razão de Prevalência
RPM Rotações por minuto
SAP Fosfatase Alcalina de Camarão, do inglês Shrimp Alkaline Phosfatase SNP Polimorfismo de nucleotídeo único, do inglês Single-Nucleotide
Polymorphism
TBE Tris/Borato/EDTA
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
UTR Região Não Traduzida, do inglês Untranslated Region V Voltagem
µL Microlitro ºC Grau Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15 1.1 CÂNCER... 15 1.2 CÂNCER DE MAMA ... 16 1.2.1 FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER DE MAMA ... 17 1.3 CÂNCER DO COLO DO ÚTERO ... 18 1.3.1 FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER DO COLO DO ÚTERO ... 19 1.4 COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE (MHC) ... 20 1.5 GENE HLA-G:ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO G ... 21 2 JUSTIFICATIVA ... 23 3 OBJETIVOS ... 25 3.1 OBJETIVO GERAL ... 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 25 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 27 4.1 ASPECTOS ÉTICOS ... 27 4.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 27 4.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO (GDNA)... 28 4.4 GENOTIPAGEM DA REGIÃO 3’ NÃO TRADUZIDA GENE HLA-G ... 29 4.5 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ... 29 4.6 ELETROFORESE ... 30 4.7 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS ... 31 4.8 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO ... 31 4.9 PRECIPITAÇÃO DOS FRAGMENTOS SEQUENCIADOS ... 32 4.10 SEQUENCIAMENTO DAS AMOSTRAS ... 33 4.11 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS ... 33 4.12 TRATAMENTO DOS DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 33 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 45
REFERÊNCIAS ... 47 ANEXOS... ... 53
15 1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER
Câncer é o nome genérico dado a um conjunto de doenças que têm em comum a proliferação descontrolada de células e a capacidade de invadir tecidos adjacentes ao de sua origem. Normalmente, novas células surgem e se multiplicam conforme a necessidade do organismo. Quando as células ficam velhas ou danificadas, elas sofrem o processo de apoptose (morte celular programada) e novas células tomam seu lugar. No entanto, se esse processo não ocorre e as células passam a ignorar os sinais de controle negativo da divisão celular e da ativação da morte celular, essas se tornam cada vez mais alteradas e seguem multiplicando-se de forma descontrolada, originando assim o que chamamos de tumores ou neoplasias. Os tumores malignos (ou invasivos), ou seja, aqueles cujas células apresentam capacidade para invadir tecidos adjacentes, são o que chamamos de câncer (NATIONAL CANCER INSTITUTE – NCI, 2015).
O câncer é considerado uma doença de etiologia complexa e, portanto, apresenta causa multifatorial relacionada a fatores internos e externos ao organismo. Os fatores internos considerados no desenvolvimento do câncer podem ser mutações e polimorfismos genéticos que alterem mecanismos normais como o de controle do ciclo celular, níveis hormonais que acentuem os sinais de proliferação celular e condição imunológica que diminua a capacidade de reconhecimento e/ou eliminação de células alteradas. Além disso, fatores externos que promovem aumento na taxa de mutação, diminuem resposta imunológica e/ou aceleram a taxa de divisão celular devem ser considerados, como tabagismo, alcoolismo, alimentação nutricionalmente desequilibrada, exposição à radiação, agentes químicos e organismos infecciosos como os vírus. Ambos os tipos de fatores, internos e externos, são importantes e a relação entre eles deve ser considerada no desenvolvimento de células tumorais (INSTITUTO NACIONAL DE CANCER - INCA, 2018).
De acordo com a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC, do inglês
International Agency for Research on Cancer), no ano de 2018 foram registrados 18,1
milhões de novos casos de câncer e 9,6 milhões de mortes por câncer em todo o mundo, 70% destas em países de média e baixa renda. (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE - OMS, 2018). Para o Brasil, estima-se a ocorrência de 600 mil novos casos de câncer para o biênio
16
2018-2019, sendo 59.700 novos casos de câncer de mama e 16.370 novos casos de câncer do colo do útero (INCA, 2018).
1.2 CÂNCER DE MAMA
O termo ―câncer de mama‖ refere-se aos tumores malignos que se originam de células do tecido mamário, como representado na Figura 1. O câncer pode iniciar nos lóbulos, onde estão as glândulas que produzem o leite, ou, na maioria dos casos, se iniciar nos ductos, que são os canais por onde o leite é transportado dos lóbulos para o mamilo. Mais raramente, o câncer de mama pode começar em outros tecidos como o estroma (BARNARD; BOEKE; TAMIMI, 2015; BREASTCANCER.ORG, 2018).
Figura 1 - Representação esquemática da composição de uma mama normal com vista frontal e lateral.
Fonte: AMERICAN CANCER SOCIETY - ACS, 2016
O câncer de mama é hoje um relevante problema de saúde pública mundial. Excetuando-se o câncer de pele não melanoma, o câncer de mama é o segundo tipo mais frequente no mundo e o mais frequente entre mulheres. Foram estimados 2,1 milhões de novos casos de câncer de mama e 627 mil óbitos decorrentes da doença para 2018 (BRAY, 2018).
17 No Brasil, como dito anteriormente, as estimativas de incidência de câncer de mama para o ano de 2019 são de 59.700 casos novos, o que representa 29,5% dos cânceres em mulheres, excetuando-se o câncer de pele não melanoma. Em 2016, ocorreram 16.069 mortes de mulheres por câncer de mama no país (HEBERG et al., 2019; INCA, 2018).
Homens não têm as mamas desenvolvidas, porém, tal como as mulheres, possuem tecido mamário e podem desenvolver câncer nessa região. O câncer de mama em homens é uma doença rara: apenas 1% do total de cânceres de mama. Tomando como base essa proporção, o número estimado de incidência dessa neoplasia no Brasil, para 2019, seria de aproximadamente 600 novos casos (INCA, 2018; SANGUINETTI, 2016).
1.2.1 FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER DE MAMA
Os dois principais fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de mama são ser do sexo feminino e possuir idade avançada (ANOTHAISINTAWEE et al., 2013; TORRE et al., 2015; NCI, 2019). Assim como muitas outras doenças, o risco aumenta conforme o aumento da idade. Cerca de dois terços dos casos de câncer de mama ocorrem em mulheres de 55 anos ou mais (BREASTCANCER.ORG, 2019).
O tabagismo é um fator que vem sendo estudado ao longo dos anos, com resultados contraditórios quanto ao aumento do risco para câncer de mama. Atualmente, há evidência de que ele aumenta o risco desse tipo de câncer (INCA, 2018; HEBERG et al., 2019).
Mulheres eurodescendentes são levemente mais propensas a desenvolver câncer de mama do que mulheres afrodescendentes. Entretanto, em mulheres com menos de 45 anos, é mais comum a doença acometer mulheres afrodescendentes do que mulheres eurodescendentes. Mulheres afrodescendentes tem maior probabilidade de morrer por câncer de mama em qualquer idade (ABDULRAHMAN; RAHMAN, 2012). Um dos possíveis fatores envolvidos é o acesso à saúde. Nas regiões com índice de desenvolvimento humano baixo, como a África Oriental, mais de 70% das pacientes com câncer de mama foram diagnosticadas em fases mais avançadas da doença, enquanto regiões mais desenvolvidas como a Europa e os EUA, mulheres são mais frequentemente diagnosticadas em estágios iniciais da doença (ACS, 2019).
Quanto ao histórico familial, pessoas com familiares de primeiro grau (mãe, irmã, filha) com câncer de mama possuem um risco maior de desenvolverem a doença. Nesses casos, o risco de desenvolver a doença dobra. Tendo dois parentes de primeiro grau
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diagnosticados com câncer de mama, a chance de desenvolver a doença é cinco vezes maior (NCI, 2019). A causa genética mais comum relacionada ao câncer de mama são as mutações herdadas nos genes BRCA1 e BRCA2. Em células normais, esses genes participam na produção de proteínas que atuam no reparo do DNA. Alterações nesses genes podem levar ao crescimento anormal de células e, posteriormente, ao câncer (WINTERS et al., 2017; ACS, 2019).
Além desses, também são considerados fatores de risco: alcoolismo, obesidade, falta de atividade física regular, nuliparidade, uso de métodos contraceptivos que utilizam hormônios, terapia hormonal após a menopausa e radiação ionizante (ACS, 2019).
1.3 CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
O câncer do colo do útero, também conhecido como câncer cervical, é o terceiro mais frequente na população feminina e a quarta causa de morte de mulheres por câncer no Brasil (INCA, 2016), sendo a principal causa de morte por câncer entre mulheres que vivem em países em desenvolvimento (THULER, 2008). No Brasil, as estimativas são de 16.370 novos casos em 2018. Em 2016, ocorreram 5.847 óbitos decorrentes da doença (INCA, 2018). Essa doença desenvolve-se progressivamente, transformando-se de células normais para células pré-cancerígenas e posteriormente em câncer. A doença ocorre na parte cervical do útero, ou seja, no colo uterino, como demonstrado na figura 2 (ACS, American Cancer Society, 2016).
Figura 2 – Representação esquemática do colo do útero normal e de suas partes.
19
A doença tem sua origem em lesões na junção escamo-colunar, podendo envolver as células escamosas externas, as células glandulares internas, ou ambas. As lesões tornam-se um câncer quando as células apresentam capacidade invasiva, rompendo a membrana basal e adentrando ao estroma cervical, como representado na Figura 3 (NCI, National Cancer Institute, 2018; ALBERTS, 2010).
Figura 2 - Os estágios da progressão no desenvolvimento do câncer do colo do útero.
Fonte: Alberts, 2010.
1.3.1 FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
O câncer do colo do útero é uma doença de etiologia complexa em consequência de suas causas multifatoriais, dentre elas a infecção por papilomavírus humano (HPV), o uso prolongado de tabaco e ser exposto ao composto dietilestilbestrol (DES) que, entre 1940 e 1971, era administrado a mulheres grávidas nos Estados Unidos na esperança de evitar aborto espontâneo. Além disso, fatores como dar à luz muitas crianças em curto espaço de tempo, o uso de contraceptivos hormonais por tempo prolongado, tabagismo, imunossupressão pelo Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV), início da vida sexual precoce ou ter muitos parceiros sexuais, sem os cuidados necessários, histórico familiar em parentes de primeiro grau e transplante de órgãos facilitam os fatores de risco e agentes infecciosos citados (HILLEMANNS et al., 2016; ACS, 2017).
20
A causa primária das lesões precursoras e do câncer do colo do útero é a infecção assintomática, persistente ou crônica, por um ou mais tipos de HPV de alto risco (carcinogênicos ou oncogênicos). Os tipos de HPV 16 e 18, considerados de alto risco, são responsáveis por 7 em cada 10 casos de câncer do colo do útero notificados no mundo. É relevante ressaltar que o HPV é a infecção sexualmente transmitida mais comum em todo o mundo (OPAS, Organização Pan-Americana de Saúde, 2016). Entretanto, na maioria dos casos, a infecção é prontamente combatida e regride, não progredindo para um processo invasor (CORDEIRO et al., 2017).
1.4 COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE (MHC)
Considerando o que foi dito anteriormente sobre os cânceres serem doenças que apresentam em comum a capacidade de proliferação celular desordenada e capacidade de invasão de tecidos diferentes do tecido de origem, é possível relacionar o desenvolvimento e escape tumoral com falhas na resposta imune.
Transplantes de órgãos e enxertos de pele entre pessoas não aparentadas geralmente resultam em rejeições imunes. Em contraste, transplantes entre irmãos gêmeos idênticos geralmente são aceitos, resultados que indicam a capacidade do sistema imunológico em distinguir células exógenas e/ou alteradas. Experimentos mostraram que as rejeições de tecidos não-próprios são controladas por um conjunto complexo de macromoléculas de superfície celular chamadas antígenos de histocompatibilidade. O mais importante destes antígenos de histocompatibilidade são as proteínas do complexo principal de histocompatibilidade, ou, MHC (do inglês Major Histocompatibility Complex), como demonstrado na Figura 4 (SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M.J., 2008).
Em seres humanos, o MHC, onde está contido o sistema de antígeno leucocitário humano (HLA - do inglês Human Leukocyte Antigen), está envolvido na identificação de antígenos não-próprios e na ativação do sistema imunológico (HILDESHEIM; WANG, 2002; CHATTOPADHYAY, 2011). Portanto, a modificação dessas moléculas em células cancerígenas, como nos casos do câncer de mama e do colo do útero, assim como células infectadas por vírus como o HPV, é um dos mecanismos que gera escape da imunovigilância, de modo que estas células não são reconhecidas pelo sistema imune (DONG et al., 2010; GHADERI et al., 2001).
21 Figura 4 – Localização e disposição nas classes I, II e III dos genes que compõem o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) no braço curto do cromossomo 6
(6p.21.2); em amarelo, o locus HLA-G, alvo do presente estudo.
Fonte: Adaptado de Mehra; Kaur (2003). 1.5 GENE HLA-G: ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO G
O gene HLA-G faz parte da classe I do MHC humano, classificado como não clássico ou Ib. Ele possui oito éxons, que codificam uma sequência sinal, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático. O éxon 6 codifica o domínio transmembranar e o éxon 7 a cauda citoplasmática. Transcritos de mRNA produzem até 7 isoformas da molécula de HLA-G (HLA-GIMENES et al., 2014). O HLA-HLA-G possui função de escape da imunovigilância do organismo (ROUAS-FREISS et al., 2005)
As regiões reguladoras do HLA-G, 3’UT (região 3’ não traduzida, do inglês 3’
untransled region) e 5’URR (região 5’ regulatória a montante, do inglês upstream regulatory region) apresentam um alto grau de variações nucleotídicas quando comparada à região
codificadora (DONADI et al., 2011). Para a 3’UTR, esses sítios variáveis podem implicar diretamente na regulação da expressão pós-transcricional do HLA-G, visto que muitos desses polimorfismos estão envolvidos com a estabilidade do mRNA (CASTELLI et al., 2014). A 3’UTR possui 17 polimorfismos descritos até o momento e neste trabalho foram considerados três polimorfismos. Um polimorfismo de presença (inserção ou In) ou ausência (deleção ou
Del) de um fragmento de 14 pb (14 pb InDel) e dois polimorfismos de nucleotídeo único
(SNP – do inglês Single-Nucleotide Polymorphism), o +3142 G/C e o +3187 A/G. Esses são os três polimorfismos mais estudados para o HLA-G, sendo o 14 pb InDel o primeiro descrito
22
e, devido ao fato de termos diferentes resultados publicados quando à sua expressão molecular, objeto de estudo de uma revisão sistemática com metanálise (ALMEIDA et al., 2018), além dele, foram estudados funcionalmente o +3142 G/C e o +3187 A/G (TAN et al., 2007; VEIT; CHIES, 2009), onde os diferentes níveis de expressão de HLA-G foram associados à instabilidade do mRNA, com a degradação do mRNA por microRNAs ou por ambos mecanismos (DONADI et al., 2010; CASTELLI et al., 2014).
O polimorfismo 14 pb In/Del (rs1704) localiza-se no éxon 8, na região 3’UTR do
HLA-G e sua inserção (In) está associada à baixa produção de mRNA (HVIID et al., 2003,
2006). Contudo, a inserção dos 14 pares de base também foi associada à modificações no processo de splicing (processamento do mRNA envolvido no processo de remodelação da molécula, remoção dos introns e união dos exons), resultando em um mRNA menor e mais estável (CLEMENTS, et al. 2005). No entanto, o aumento da estabilidade do mRNA não compensa a baixa produção de HLA-G, associada à inserção dos 14 pb (CASTELLI et al., 2014). O alelo de deleção (Del) do 14 pb está associado com produção de níveis mais altos de HLA-G (HARRISON et al., 1993; ROUSSEAU et al., 2003).
O polimorfismo +3142 G/C (rs1063320) foi descrito como sítio de ligação para determinados miRNA, com o alelo G tendo maior afinidade aos miRNA, sendo que estes desestabilizam o mRNA e reduzem a taxa de tradução. Assim, essa ligação, nesse alelo, pode ter relação com os níveis de expressão da molécula (TAN et al., 2007). Quanto ao SNP +3187
A/G (rs9380142), este foi relacionado com a degradação e estabilidade do mRNA, sendo o
alelo G associado a um aumento da produção de HLA-G. Os mecanismos envolvidos nesses processos ainda não estão totalmente elucidados (DONADI et al., 2011).
23 2 JUSTIFICATIVA
Excetuando-se o câncer de pele não melanoma, o câncer de mama é o segundo mais frequente do mundo e o mais frequente entre as mulheres, enquanto o câncer do colo do útero é o terceiro mais frequente na população feminina e a principal causa de morte por câncer em mulheres que vivem em países em desenvolvimento. Desta forma, ambas as doenças representam um problema de saúde pública a nível mundial e, tratando-se de doenças multifatoriais, é necessário o estudo dos fatores genéticos e ambientais associados às patologias.
Considerando o papel do HLA-G no escape da imunovigilância e o fato de sua expressão poder ser influenciada por polimorfismos presentes na região regulatória 3’UT, em especial o 14 pb, o +3142 G/C e o +3187 A/G, torna-se pertinente a análise da variabilidade desses polimorfismos do gene relacionados ao câncer de mama e ao câncer do colo do útero, de forma a esclarecer as causas genéticas associadas à patologia, assim como estabelecer dados para uma melhor compreensão dos mecanismos que geram maior agressividade e escape tumoral. Somado a isso, os dados epidemiológicos associados aos diferentes graus de lesões e polimorfismos, buscando uma melhor compreensão das influências ambientais e dos hábitos de vida das pacientes, podendo, no futuro, utilizar essas informações como biomarcadores para diagnósticos e opções terapêuticas.
25 3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Verificar a associação de três polimorfismos (14 pb In/Del, 3142 G/C e 3187 A/G) localizados na região 3’ não traduzida (3’UTR) do gene HLA-G e de seus dados epidemiológicos ao câncer de mama e câncer do colo do útero.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Calcular as frequências alélicas e genotípicas dos três polimorfismos, 14 pb
In/Del, 3142 G/C e 3187 A/G em dois grupos caso, pacientes que apresentam câncer de mama
e câncer do colo do útero e em mulheres dos grupos controle;
2. Verificar a aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg;
3. Calcular a associação entre os alelos e genótipos e dados epidemiológicos e a presença de câncer de mama ou câncer do colo do útero;
4. Inferir os haplótipos formados pelos três polimorfismos e calcular as frequências haplotípicas e de combinações haplotípicas;
5. Calcular a possível associação dos haplótipos com as doenças do estudo.
27 4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ASPECTOS ÉTICOS
A coleta das amostras das pacientes com câncer do colo do útero para avaliação dos polimorfismos do gene HLA-G foi realizada previamente a este estudo e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte (protocolo número 036/2009), como exigido pela legislação brasileira, conforme as resoluções CNS nº 196/96 e 304/00 do Conselho Nacional de Saúde, sobre Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos.
O uso das amostras controle e amostras de câncer de mama foi aprovado em projeto, coordenado pela Profa. Dra. Yara Costa Netto Muniz, intitulado ―Câncer de Mama: busca de miRNA que controlam a expressão de HLA-G, uma molécula imunorreguladora, como biomarcador para diagnósticos e opções terapêuticas‖. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina (CEPSH-UFSC), no parecer n° 922.167, de 07 de dezembro de 2014.
4.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Para o câncer de mama, o estudo foi realizado utilizando amostras biológicas (DNA) de 98 pacientes diagnosticadas com carcinoma ductal invasivo, atendidas no Hospital Universitário Professor Polydoro Ernani de São Thiago – Universidade Federal de Santa Catarina (HU – UFSC). Para o grupo controle, foram utilizadas 101 amostras (DNA) de mulheres sem histórico da doença e nem evidências da patologia em estudo.
As amostras das pacientes e grupo controle (sangue periférico) haviam sido coletadas em estudo anterior, seu DNA extraído e armazenados no Banco de Amostras do Laboratório de Polimorfismos Genéticos (LAPOGE – UFSC), coordenado pela Profa. Dra. Ilíada Rainha de Souza, após explicação do projeto e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexos A e B).
Os dados familiais e epidemiológicos das mulheres foram obtidos por entrevistas realizadas com questionários estruturados (Anexos C e D). Além dos dados disponíveis nos questionários, foram considerados os dados coletados nos prontuários das pacientes, incluindo
28
dados clínicos, patológicos e laboratoriais que foram utilizados nas análises de associação ao câncer de mama (Banco de Dados LAPOGE – UFSC).
As amostras de câncer de mama foram classificadas de acordo com seu estadiamento, classificação que reflete a taxa de crescimento e extensão da doença, além do tipo de tumor e sua relação com o paciente. Para este trabalho foi utilizado o sistema preconizado pela União Internacional Contra o Câncer (UICC), denominado Sistema TNM de Classificação de Tumores Malignos. O sistema baseia-se nas características do tumor primário (T), características dos linfonodos do órgão onde o tumor primário está localizado (N) e a presença ou ausência de metástases distantes (M). Todos estes parâmetros são graduados e posteriormente agrupados em combinações pré-estabelecidas, sendo distribuídos em estádios que variam de I a IV (INCA, 2019). Neste trabalho foram utilizados apenas tumores classificados no sistema TNM de I a III.
Para o câncer do colo do útero, o grupo caso foi composto por 37 pacientes diagnosticadas com lesão invasiva do colo do útero, sendo as amostras coletadas junto ao Ambulatório de Ginecologia Oncológica do Centro de Especialidades Médicas da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte e 52 pacientes sem evidências ou histórico da doença para compor o grupo controle.
As pacientes que aceitaram participar da pesquisa assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e responderam a um questionário. A coleta sanguínea e de esfregaço cérvico-vaginal foi realizada por um médico responsável. Do prontuário foram obtidos os resultados de biópsias e dados relativos ao estadiamento do tumor (Anexos E e F).
Para o grupo controle também foi assinado, para cada paciente, um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). As amostras coletadas foram armazenadas no Banco de Amostras do Laboratório de Polimorfismos Genéticos (LAPOGE - UFSC) e as informações das mulheres, como dados epidemiológicos e familiais, foram obtidos através de entrevistas com questionários estruturados (ANEXOS G e H).
4.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO (GDNA)
As extrações de gDNA foram realizadas em projetos anteriores. Para as amostras sanguíneas das pacientes foi utilizado o protocolo modificado de Salting out (HIGUCHI; OCHMAN, 1989) (Anexo I). Para as amostras de esfregaço, foi utilizado o kit QIAmp® DNA Blood mini kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha) seguindo as recomendações do fabricante. E no
29 que se refere às amostras da população controle, o método Salting Out, descrito por Miller e colaboradores (1988) e modificado posteriormente por Lahiri & Nurnberger (1991). (Anexo II).
O gDNA extraído de cada amostra foi quantificado por espectrofotometria de massa, de modo a verificar a concentração e o grau de pureza e foram feitas alíquotas de uso de 20ng/mL.
4.4 GENOTIPAGEM DA REGIÃO 3’ NÃO TRADUZIDA GENE HLA-G
Para a genotipagem dos polimorfismos 14 pb In/Del (rs1704), +3142 C/G (rs1063320) e +3187 A/G (rs9380142) da 3’UTR do gene HLA-G, foi realizada uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - do inglês, Polymerase Chain Reaction), de forma a amplificar a região de interesse, utilizando iniciadores que a flanqueiam, descrito por CASTELLI e colaboradores (2010). Os produtos resultantes do protocolo de amplificação por PCR foram submetidos ao processo de purificação das amostras e posterior sequenciamento (CASTELLI et al, 2010).
4.5 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
As concentrações e volumes dos reagentes e soluções necessários para execução da reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction), para uma amostra, estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1 – Concentração e volume dos reagentes e soluções utilizados na PCR.
Reagentes e Soluções Concentração Volume
Água ultrapura Mili-Q® - 15,4 µL
dNTPs 0,1 mM 0,25 µL
MgCl2 Platinum 1,4 mM 0,75 µL
Tampão de PCR Platinum® 5,0 mM 2,5 µL
Primer Forward (F) 0,2 µM 0,5 µL
Primer Reverse (R) 0,2 µM 0,5 µL
Taq DNA Polymerase Platinum® 0,5 U/µL 0,1 µL
DNA 20,0 ng/µL 5,0 µL
Total 25,0 µL
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Os primers utilizados na amplificação da 3’ UTR do HLA-G foram: Primer Forward
(5’ TGTGAAACAGCTGCCCTGT 3’) e Primer Reverse (5’
TCTTCTGATAACACAGGAACTTC 3’).
Em todas as PCR foi utilizado um controle negativo de amplificação (CN) com água ultrapura ao invés de gDNA, para assegurar a ausência de contaminação dos reagentes por gDNA exógeno.
As amostras foram amplificadas em um termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, 30 ciclos de 95°C por 45 segundos (desnaturação), 56°C por 45 segundos (hibridização dos iniciadores) e 72°C por 60 segundos (extensão); e uma etapa de extensão final de 72°C por 7 minutos (CASTELLI et al., 2010).
4.6 ELETROFORESE
Os reagentes e soluções, com suas concentrações e volumes necessários para a execução da eletroforese, estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2 - Concentrações e volumes utilizados na reação de eletroforese.
Reagentes e soluções Concentração Volume
Agarose 1% 0,2 g
Tampão TBE (Tris/Borato/EDTA) 0,5X 20,0 mL
Solução carreadora - 0,5 µL
GelRed®: 20X 0,5 µL
Produto amplificado - 2,0 µL
Total 24,0 uL
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
Após o processo de amplificação dos fragmentos de DNA, foi realizada eletroforese em gel de agarose 1% a 100 V por 30 minutos. As amostras foram aplicadas individualmente em solução contendo 2,0 µL de produto amplificado em 0,5 µL de solução carreadora e 0,5 µL de GelRed®. A solução carreadora é composta por 0,025 g de azul de bromofenol, 4 g de sacarose e 10 mL de água destilada.
31 De modo a confirmar o êxito do método de amplificação, foi feita a captura de imagem da fluorescência do corante GelRed® pelo fotodocumentador DNR-Bio-Imaging
System MiniBIS PRO no software GelCapture©.
4.7 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
Os reagentes e soluções, com suas concentrações e volumes necessários para a purificação das amostras, estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3 – Concentrações e volumes dos reagentes e soluções utilizados na purificação das amostras.
Reagentes e Soluções Concentração Volume
Exonuclease I 10 U/ µL 0,5 µL
Fosfatase Alcalina de Camarão 1 U/ µL 0,5 µL
Produto amplificado - 9,0 µL
Total 10,0 µL
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
Para que ocorresse a degradação da parte excedente de iniciadores envolvidos na PCR, os produtos resultantes foram submetidos à enzima Exonuclease I (Exol, Healthcare®) e à Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP, do inglês Shrimp Alkaline Phosfatase, GE Healthcare®). O procedimento consistiu em adicionar 0,5 µL de cada enzima a 9,0 µL do produto da região de interesse amplificado. Em seguida, as amostras contendo as misturas foram colocadas em um termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems), a 37ºC por 60 minutos e 75ºC por 15 minutos.
4.8 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
Seguidamente ao processo de purificação das amostras, foi realizada a reação de sequenciamento, utilizando o reagente BigDye® e o iniciador reverso. Para a reação, foram adicionados em cada poço de placas de 96 poços (meia borda, Greiner®): 5 pM de iniciador reverso, 1 µL de fluoróforo (corante) BigDye® , 1,5 µL de Tampão de BigDye® Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems®), 0,5 µL do produto de PCR purificado e 6 µL de água, totalizando 10 µL no total. Após esse processo, as amostras foram colocadas em um termociclador na seguinte condição: desnaturação inicial a 96°C por 10 segundos, 30
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ciclos de: 95°C por 10 segundos (desnaturação), 50°C por 5 segundos (hibridização) e 60°C por 4 minutos (extensão).
Os reagentes e soluções, com suas concentrações e volumes necessários para a execução da reação de sequenciamento, estão descritos na Tabela 4.
Tabela 4 – Concentração e volume dos reagentes e soluções utilizados na reação de sequenciamento.
Reagentes e Soluções Concentração Volume
Água Ultrapura - 6,0 µL Primer Reverse 5 pM 0,5 uL Corante BigDye® - 1,0 µL Tampão BigDye® 5X 1,5 µL Produto amplificado e purificado - 0,5 µL Total 10,0 µL
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
4.9 PRECIPITAÇÃO DOS FRAGMENTOS SEQUENCIADOS
Os reagentes e soluções, com suas concentrações e volumes necessários para a execução da reação de precipitação dos fragmentos, estão descritos na Tabela 5.
Tabela 5 – Concentrações e volumes dos reagentes e soluções envolvidos na reação de precipitação dos fragmentos.
Reagentes e Soluções Concentração Volume
Solução de Acetato de Sódio/EDTA 125 mM 2,5 µL
Etanol Absoluto 100% 25,0 µL
Etanol 70% 70% 150,0 µL
Produto da reação de
sequenciamento - 10,0 µL
Total 187,5 µL
33 Quanto ao processo de precipitação das amostras, após a reação de sequenciamento, foi adicionado em cada poço da placa de 96 poços amostras contendo: 2,5 µL de acetato de sódio/EDTA e 25 µL de etanol absoluto. A placa foi selada e centrifugada a 4000 RPM (Rotações por minuto) (Centrifugue 5804R, Eppendorf®) por 45 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido por inversão após a centrifugação. Foi adicionado em cada poço 150 µL de etanol 70% e as amostras foram centrifugadas a 4000 RPM por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, novamente o sobrenadante foi removido por inversão e a placa deixada durante a noite à temperatura ambiente e protegida da luz, para a completa evaporação do etanol.
4.10 SEQUENCIAMENTO DAS AMOSTRAS
Para o sequenciamento, foi adicionado, em cada poço contendo as amostras pós-reação de sequenciamento e precipitação, 10 µL de Formamida Hi-Di (Invitrogen®). A placa foi centrifugada a 800 RPM (Centrifugue 5804R, Eppendorf®) por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, foi feito o processo de desnaturação em termociclador Veriti Thermal
Cycler (Applied Biosystems) com as amostras, a 95ºC durante 20 minutos. Após
desnaturação, a placa foi colocada no sequenciador ABI 3130 (Applied Biosystems®).
4.11 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS
As variações presentes na 3’UTR do gele HLA-G de interesse do trabalho são a
Inserção/Deleção (In/Del) de 14 pb (rs1704) e os polimorfismos de nucleotídeo único +3142 G/C (rs1063320) e +3187 A/G (rs9380142). Esses pontos de variação foram genotipados com
o software SeqMan® através da interpretação de cromatogramas.
4.12 TRATAMENTO DOS DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os cálculos das frequências alélicas e genotípicas e o cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) foram realizados com o programa GENEPOP® (RAYMOND; ROUSSET, 1995), versão 4.2 (disponível em http://genepop.curtin.edu.au).
Os cálculos de associações dos polimorfismos e haplótipos com a suscetibilidade genética ao câncer de mama e ao câncer do colo do útero foram realizados por regressão
34
logística através do software SPSS versão 20 (SPSS Inc. Released 2009. PASW Statistics for Windows, Version 20.0. Chicago: SPSS Inc.) Para os dados clínicos, como HPV, hábito tabagista e histórico familiar, foi realizada regressão de Poisson. O cálculo de qui-quadrado para inferir diferenças significativas entre os grupos também foi realizado no SPSS.
As análises de associação dos polimorfismos e haplótipos foram feitas com base no indicador de Odds ratio (OR) ou razão de chances e adotando-se um Intervalo de Confiança (IC) de 95% e considerando-se p = 0,05 como o valor limite, de modo a determinar o aumento das chances de determinado resultado devido à presença de um fator de risco.
Enquanto que as análises de associação dos dados epidemiológicos foram realizadas com base no indicador de razão de prevalência (RP), que mede a prevalência da condição de interesse no grupo caso em relação à prevalência no grupo controle. Para essa análise foram consideradas as características epidemiológicas da amostra como idade, hábito tabagista, presença de HPV e histórico familiar.
A inferência dos haplótipos foi realizada no PHASE (STEPHENS; SMITH; DONNELLY, 2001), foram consideradas as inferências com valor igual ou superior a 95%.
35 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Quanto à caracterização dos grupos caso e controle, a amostra constituiu-se de 288 mulheres divididas entre as duas doenças estudadas. Para o câncer de mama, o grupo caso foi composto por 98 pacientes diagnosticadas com carcinoma ductal invasivo e o controle por 101 pacientes sem evidência da doença, enquanto que para o câncer do colo do útero foram 37 pacientes com lesão invasiva e 52 mulheres sem lesão.
As amostras de câncer de mama foram classificadas de acordo com o hábito tabagista, histórico familial, estadiamento TNM do tumor e Grau de Bloom. O hábito tabagista foi dividido entre mulheres que se declararam como fumantes ou ex-fumantes e mulheres que nunca fumaram ao longo da vida. Considerou-se presença de histórico familial para as pacientes que tiveram casos de câncer de mama na família apenas em parentes de primeiro grau.
Enquanto para as amostras de câncer do colo do útero foram utilizadas as variáveis histórico familial, hábito tabagista e presença ou ausência de infecção por HPV. A divisão do hábito tabagista e do histórico familial seguiu os mesmos critérios utilizados para o câncer de mama. Esses resultados encontrados e a comparação com a literatura serão apresentados nessa sessão.
A inferência dos haplótipos foi realizada no PHASE (STEPHENS; SMITH; DONNELLY, 2001), no qual foram inferidos 6 haplótipos para o câncer de mama e controle (DCA, DCG, DGA, DGG, ICA e IGA), e para o câncer do colo do útero são descritos 5 haplótipos no grupo caso (DGA, DGG, ICA, ICG e IGA) e 4 no controle (DGA, ICA, ICG e
IGA), ambos considerando 95% de presença na amostra analisada, bem como suas
combinações haplotípicas. Os resultados das combinações haplotípicas serão apresentados ao fim desta sessão.
As frequências alélicas e genotípicas dos três loci analisados, 14pb In/Del,
+3142G/C e +3187A/G, para os quatro grupos amostrais, câncer de mama e controle, colo do
útero e controle, bem como os valores de p observados no teste do equilíbrio de HW, encontram-se na Tabela 6. Pode-se verificar que todos os polimorfismos de caso e controle, em ambas as doenças, se encontram em equilíbrio de HW. As análises de associação de alelos e genótipos, entre os grupos caso e controle, para ambas as doenças, não apresentaram resultados significativos (dados não mostrados).
36
Tabela 6 – Frequências alélicas e genotípicas e equilíbrio de Hardy-Weinberg nos loci 14pb
In/Del, +3142G/C e +3187A/G nos grupos caso e controle do câncer de mama e do câncer do
colo do útero. Loci
Câncer de mama Câncer do colo do útero Caso n (%) Controle n (%) Caso n (%) Controle n (%)
14 pb In/Del EHW (p) 0,427 1,000 0,519 0,259 Alelos I 105 (53,6%) 118 (58,4%) 34 (53,1%) 42 (40,4%) D 91 (46,4%) 84 (41,6%) 30 (46,9%) 62 (59,6%) Genótipos II 23 (23,5%) 17 (16,8%) 8 (25,0%) 11 (21,2%) ID 45 (45,9%) 50 (49,5%) 18 (56,3%) 20 (38,5%) DD 30 (30,6%) 34 (33,7%) 6 (18,8%) 21 (40,4%) +3142 G/C EHW (p) 0,682 0,426 0,483 1,000 Alelos G 108 (55,1%) 109 (54,0%) 43 (67,2%) 58 (55,8%) C 88 (44,9%) 93 (46,0%) 21 (32,8%) 46 (44,2%) Genótipos GG 31 (31,7%) 27 (26,7%) 15 (46,9%) 17 (32,7%) GC 46 (46,9%) 55 (54,5%) 13 (40,6%) 24 (46,2%) CC 21 (21,4%) 19 (18,8%) 4 (12,5%) 11 (21,2%) +3187 A/G EHW (p) 0,612 0,090 0,613 0,693 Alelos A 141 (71,9%) 142 (70,3%) 50 (78,1%) 78 (75,0%) G 55 (28,1%) 60 (29,7%) 14 (21,9%) 26 (25,0%) Genótipos AA 52 (53,1%) 46 (45,5%) 20 (62,5%) 30 (57,7%) AG 37 (37,7%) 50 (49,5%) 10 (31,3%) 18 (34,6%) GG 9 (9,2%) 5 (5,0%) 2 (6,2%) 4 (7,7%)
Fonte: Elaborada pelo autor, 2019.
Observando a tabela é possível notar que o alelo I encontra-se em maior frequência nos grupos controle de câncer de mama (58,6%), do que em caso (53,6%). Contudo para câncer do colo do útero está mais frequente nos casos (53,1%), sendo que este último vai de encontro com a literatura. É descrito que o alelo I do 14 pb foi associado com níveis menores de HLA-G solúvel (PORAS et al., 2017), prejudicando a função de escape imunológico exercida pela molécula de HLA-G (ROUAS-FREISS et al., 2005), sendo desfavorável para o desenvolvimento das doenças.
37 O alelo C do locus +3142 diminui a afinidade entre microRNAs e seus sítios de ligação na região 3’ do HLA-G, aumentando a produção da molécula de HLA-G (VEIT; CHIES, 2009), sendo assim favorável para o desenvolvimento das neoplasias. Contudo, tanto no câncer de mama quanto no câncer do colo do útero, o alelo C está mais frequente nos grupo controles (46% e 44,2%, respectivamente).
Para o +3187 A/G, o alelo G foi associado com um aumento da produção de HLA-G (DONADI et al., 2011), o que contribuiria para o escape da imunovigilância, tendo em vista as funções atribuídas a HLA-G (ROUAS-FREISS et al., 2005). Enquanto que o alelo A é relacionado com a diminuição da estabilidade do mRNA (Yie et al., 2008). Percebe-se, no entanto, uma frequência maior do alelo A nos dois grupos casos, (71,9%) para o câncer de mama e (78,1%) para o câncer do colo do útero, quando comparada com os grupos controle (70,3% e 75%, respectivamente).
). O câncer do colo do útero está muito relacionado com a presença de infecção por HPV, no entanto, pode ter um fator hereditário relacionado com a condição de algumas mulheres serem menos capazes de combaterem essa infecção (ACS, 2017).
Enquanto que o hábito tabagista é um fator estudado com resultados contraditórios ao longo dos anos, ele é atualmente reconhecido pelo IARC como um agente carcinogênico, entretanto com limitada evidência de aumento do risco de câncer de mama em humanos (IARC, 2019). Quando se fala na relação entre tabagismo e câncer do colo do útero, o tabaco diminui significativamente a quantidade e função das células de Langherans, que são responsáveis pela defesa do tecido epitelial, onde localizam-se as células escamosas do colo do útero (DE MELO et al., 2009), de onde originam-se 9 em cada 10 casos da doença (ACS, 2016).
A Tabela 7 apresenta a frequência do hábito tabagista e histórico familial, para cada genótipo dos 3 loci analisados no presente trabalho, nos indivíduos do grupo caso que compõem a amostra do câncer de mama. Verifica-se que não houve diferenças significativas entre os grupos. Desta forma, não foi encontrada associação dessas características com os genótipos. Contudo, é possível verificar que o genótipo +3187 GG foi o que apresentou maior diferença entre os grupos fumantes (77,8%) e não fumantes (22,2%) e presença (88,9%) e ausência (11,1%) de histórico familial.
38
Tabela 7 – Distribuição do hábito tabagista e histórico familial entre os genótipos nos loci
14pb In/Del, +3142G/C e +3187A/G e valor de p para o teste de qui-quadrado nos grupos
casos e controles da amostra de câncer de mama.
Tabagismo Histórico Familiar
Loci Genótipo Fumantes Não
fumantes p Presença Ausência p
14 pb In/Del II 11 (47,8%) 12 (52,2%) 0,508 15 (65,2%) 8 (34,8%) 0,960 ID 17 (37,8%) 28 (62,2%) 28 (68,3%) 13 (31,7%) DD 15 (50%) 15 (50%) 21 (70%) 9 (30,0%) +3142 C/G GG 15 (48,4%) 16 (51,6%) 0,835 20 (64,5%) 11 (35,5%) 0,882 CG 19 (41,3%) 27 (58,7%) 29 (69,0%) 13 (31%) CC 9 (42,9%) 12 (57,1%) 15 (71,4%) 6 (28,6%) +3187 A/G AA 20 (38,5%) 32 (61,5%) 0,112 33 (64,7%) 18 (35,3%) 0,322 AG 16 (43,2%) 21 (56,8%) 23 (67,6%) 11 (32,4%) GG 7 (77,8%) 2 (22,2%) 8 (88,9%) 1 (11,1%)
Fonte: Elaborado pelo autor, 2019.
Na Tabela 8 encontram-se as frequências genotípicas e os valores de p para o teste de qui-quadrado exato do hábito tabagista e histórico familial para o grupo caso de câncer do colo do útero. Pode-se perceber que não houve nenhum valor significativo para a análise. Assim, da mesma forma que para o câncer de mama, verifica-se que não houve associação dessas características com os genótipos em câncer do colo do útero.
Tabela 8 - Distribuição do hábito tabagista e histórico familial nos loci 14pb In/Del,
+3142G/C e +3187A/G entre os genótipos e valor de p para o teste de qui-quadrado nos
grupos casos e controles da amostra de câncer do colo do útero.
Tabagismo Histórico Familiar
Loci Genótipo Fumantes Não
fumantes p Presença Ausência p
14 pb In/Del II 2 (22,2%) 7 (77,8%) 0,166 3 (33,3%) 6 (66,7%) 0,331
39 DD 0 (0,0%) 7 (100%) 5 (71,4%) 2 (28,6%) +3142 C/G GG 2 (13,3%) 13 (86,7%) 0,595 7 (46,7%) 8 (53,3%) 1,000 CG 3 (15,8%) 16 (84,2%) 9 (47,4%) 10 (52,6%) CC 0 (0,0%) 3 (100%) 2 (66,7%) 1 (33,3%) +3187 A/G AA 3 (15,0%) 17 (85,0%) 1,000 8 (40,0%) 12 (60,0%) 0,246 AG 2 (20,0%) 8 (80,0%) 5 (50,0%) 5 (50,0%) GG 0 (0,0%) 2 (100%) 2 (100%) 0 (0,0%)
Fonte: Elaborada pelo autor, 2019.
A ausência de dados significativos nessas associações (Tabelas 7 e 8) pode ser resultado do baixo tamanho amostral, devido à estratificação em diversos subgrupos.
O câncer do colo do útero é a doença mais frequentemente relacionada ao HPV. Embora a maioria das infecções por HPV se curem sozinhas, há risco de que a infecção se torne crônica e lesões pré-cancerosas causadas pela presença do vírus evoluam para um câncer invasivo do colo do útero (OPAS, 2019). Assim a presença dessa infecção foi analisada.
Na Tabela 9, podemos visualizar os resultados do teste de associação em relação à presença da infecção por HPV e do desenvolvimento do câncer do colo do útero. No teste, foi obtida uma razão de prevalência de 3,914 de presença de câncer do colo do útero nas pacientes infectadas por HPV em relação às pacientes que não apresentam infecção pelo vírus. O valor de p menor do que 0,001 indica a fidelidade do teste.
Tabela 9 – Cálculos de associação entre a presença de HPV e o desenvolvimento do câncer do colo do útero.
HPV N (%) RP IC p
Presença 31 (52,5%) 3,914 1,894-8,088 >0,001
Ausência 28 (47,5%) 1 - -
Fonte: Elaborada pelo autor, 2019.
Considerando que quase todos os casos da doença podem ser atribuídos à infecção pelo vírus (BOSCH et al., 2002), os resultados dos testes de associação para a presença da
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infecção por HPV e o desenvolvimento do câncer do colo do útero vai ao encontro da literatura.
A Tabela 10 mostra a distribuição da variável HPV entre os polimorfismos dos três
loci estudados, além dos respectivos valores de qui-quadrado em pacientes com câncer do
colo do útero. Há uma ausência de valores significativos de p, indicando que não houve associação entre os grupos presença e ausência de infecção por HPV com os genótipos analisados. Tal resultado pode ser devido ao baixo número de amostras, em ambos os grupos.
Tabela 10 - Frequências genotípicas dos loci 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187 A/G para presença ou ausência de infecção por HPV e valor de p para o teste de qui-quadrado exato em
indivíduos caso da amostra de câncer do colo do útero. HPV
Loci Genótipo Presença Ausência p
14 pb In/Del II 4 (66,7%) 2 (33,3%) 0,329 ID 16 (80,0%) 4 (20,0%) DD 6 (100%) 0 (0,0%) +3142 C/G GG 9 (75,0%) 3 (25,0%) 0,579 CG 14 (82,4%) 3 (17,6%) CC 3 (100%) 0 (0,0%) +3187 A/G AA 13 (81,2%) 3 (18,8%) 1,000 AG 8 (88,9%) 1 (11,1%) GG 2 (100%) 0 (0,0%)
Fonte: Elaborada pelo autor, 2019.
Conforme dito anteriormente, o Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos baseia-se na extensão anatômica da doença. Esses parâmetros são geralmente agrupados em combinações pré-estabelecidas, distribuídas em estágios que geralmente variam de I a IV. O crescimento do estágio expressa o nível de evolução do tumor e dos linfonodos comprometidos (INCA, 2019). Nessa amostra, encontramos os agrupamentos em estágios I, II e III.
No câncer de mama, o grau histológico da doença indica o grau de diferenciação tumoral e é estabelecido por meio de uma avaliação semiquantitativa das características morfológicas do tumor (ELSTON; ELLIS, 2002). O Grau de Bloom, ou Grau de Elston-Elis,
41 é uma combinação entre o grau histológico com o sistema Nottingham, sendo o sistema de classificação mais utilizado para determinar o grau tumoral em casos de câncer de mama. Esse sistema gera uma classificação separada em I, II e III, onde o menor grau indica um câncer de crescimento mais lento e com menor probabilidade de disseminação, enquanto um grau mais alto indica um crescimento mais rápido e com maior probabilidade de disseminação (RAKHA et al., 2008).
Na Tabela 11, encontramos as frequências do estadiamento TNM e do Grau de Bloom nos genótipos dos loci 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187 A/G, além dos valores obtidos através do teste de qui-quadrado exato, onde podemos perceber que não houve associações significativas entre os polimorfismos e as características analisadas em câncer de mama. Foi possível observar que para a variável TNM houve uma maior frequência dos alelos protetivos (14 pb I, +3142 G e +3187 A) (PORAS et al., 2017; ROUAS-FREISS et al., 2005; VEIT; CHIES, 2009; Yie et al., 2008) nos indivíduos classificados com o menor grau. Novamente, em consequência da subestruturação da amostra, reduzindo o tamanho amostral em cada subgrupo.
Tabela 11 - Frequências genotípicas dos polimorfismos 14 pb In/Del, +3142 G/C e +3187
A/G nas variáveis anatopatológicas (TNM e Grau de Bloom) e valor de p para o teste de
qui-quadrado exato para o câncer de mama.
TNM Grau de Bloom
Loci Genótipo I II III p I II III p
14 pb II 4 (36,4%) 3 (21,4%) 2 (28,6%) 0,669 4 (17,4%) 15 (26,8%) 4 (14,3%) 0,664 ID 5 (45,5%) 5 (35,7%) 4 (57,1%) 6 (46,9%) 26 (46,4%) 13 (46,4%) DD 2 (18,2%) 6 (42,9%) 1 (14,3%) 4 (28,6%) 15 (26,8%) 11 (39,3%) +3142 G/C GG 6 (54,5%) 4 (28,6%) 2 (28,6%) 0,485 6 (42,9% 18 (32,1%) 7 (25,0%) 0,384 CG 2 (36,4%) 5 (37,5%) 4 (57,1%) 4 (28,6%) 25 (44,6%) 17 (60,7%) CC 1 (9,1%) 5 (37,5%) 1 (14,3%) 4 (28,6%) 13 (23,2%) 4 (14,3%)
