UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
RAPHAEL RICON DE OLIVEIRA
Regulação epigenética do neogene Qua-Quine Starch durante o desenvolvimento de
Arabidopsis thaliana e o impacto no metabolismo de amido
CAMPINAS 2015
RAPHAEL RICON DE OLIVEIRA
Regulação epigenética do neogene Qua-Quine Starch durante o desenvolvimento de
Arabidopsis thaliana e o impacto no metabolismo de amido
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Doutor em Genética e Biologia Molecular na área de Genética Vegetal e Melhoramento.
Orientador: PROF. DR. MICHEL GEORGES ALBERT VINCENTZ
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO RAPHAEL RICON DE OLIVEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. MICHEL GEORGES ALBERT VINCENTZ.
CAMPINAS 2015
COMISSÃO EXAMINADORA
Membros Titulares:
Prof. Dr. Michel Georges Albert Vincentz (Orientador)
Prof. Dr. Juan Armando Casas-Mollano
Prof. Dr. Marcio Alves Ferreira
Profa. Dra. Camila Caldana
Prof. Dr. Jörg Kobarg
Membros Suplentes:
Prof. Dr. Paulo Cavalcanti Gomes Ferreira
Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira
Profa. Dra. Katlin Brauer Massirer
A Ata da Defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora consta no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
Hoje tenho a convicção de que não somos um ponto discreto, mas parte de uma linha contínua e por vezes emaranhada. Essa tese não seria possível sem essa percepção, sem o pensamento focado nas pessoas que amo e no ideal de mundo melhor. Algumas pessoas entendem essa mensagem e caminham ao seu lado. Com essas pessoas gostaria de compartilhar essa conquista e agradecer pela companhia. Começo agradecendo ao professor Michel pela apresentação do empolgante tema e pela orientação. Agradeço à FAPESP, assim como à população do estado de São Paulo, pelo financiamento do projeto. Aos membros da banca e também aos colegas de laboratório pela disponibilidade, discussões e conhecimentos compartilhados. A toda estrutura da Universidade Estadual de Campinas, funcionários e professores. Em especial, agradeço minha esposa Thaís, pela paciência, companheirismo, conselhos e carinho em todos os momentos durante esses últimos anos. Aos meus avós pelas posturas corajosas e exemplos de garra perante as adversidades impostas pela vida. A minha mãe, uma fonte de ideias e bondade que irá sempre me inspirar. Ao meu pai, pelo exemplo de fortaleza e tranquilidade. Aos meus irmãos e amigos (talvez não haja distinção entre essas duas palavras e incluo os cachorros Churrasco e Pinga nesse grupo) pelo prazer da convivência e boas risadas para sempre guardadas no coração. Termino agradecendo a todos os envolvidos de alguma forma nessa aventura e reforço o que não pode ser descrito, numa tentativa tosca de descrever algo que apenas pode ser sentido, minha gratidão.
RESUMO
Metilação do quinto carbono da citosina do DNA é uma marca epigenética que pode afetar a expressão gênica. A regulação de perfis de metilação é importante para o desenvolvimento normal das plantas sendo crítica para o silenciamento de transposons, imprinting, gametogênese e o desenvolvimento inicial do embrião. Entretanto, como metilações de sequências regulatórias em cis afetam a interação entre o DNA e fatores em trans associados ao desenvolvimento para modular a expressão gênica é ainda pouco compreendida. Qua-Quine Starch (QQS) é um gene órfão de Arabidopsis thaliana que existe sob diversas formas
epialélicas estavelmente herdadas e com níveis de expressão correlacionados inversamente com os níveis de metilação em seu promotor e 5’UTR. Por meio de análises da expressão do gene marcador GUS sob o controle da sequência do promotor e da região 5’UTR de QQS em linhagens transgênicas de Arabidopsis, inferimos o potencial de expressão de QQS nos vários órgãos e várias fases do desenvolvimento. A atividade GUS foi detectada em meristemas, folhas jovens de roseta e no pólen onde uma reprogramação epigenética deste gene foi descrita. Epialelos contrastantes de QQS apresentaram expressão diferencial ao longo do desenvolvimento. O epialelo QQS metilado (QQSme) possui diferenças marcantes de expressão entre folhas, tecidos da inflorescência e fruto, enquanto o epialelo demetilado
Col*3-2 apresenta uma expressão mais homogênea entre esses vários órgãos. Estes resultados
indicam que o grau de metilação das sequências regulatórias de QQS interage com fatores associados ao desenvolvimento para estabelecer o perfil de expressão deste gene. A expressão de QQSme aumenta durante o processo de envelhecimento das folhas e foi correlacionada a uma demetilação no lócus. Levantamos a hipótese de que o perfil de metilação de QQSme poderia sofrer uma reprogramação durante o desenvolvimento das folhas a partir do meristema vegetativo. Tal reprogramação poderia ocorrer de maneira ativa, mediada pela DNA glicosilase ROS1, ou passiva, como consequência da ausência ou falha do mecanismo de manutenção do padrão de metilação durante ciclos de replicação celular. De acordo com isso, mostramos que expressão de QQSme é baixa em amostras enriquecidas com células meristemáticas e aumenta gradativamente com a idade das folhas e uma redução dos níveis de metilação de QQSme foi observada em folhas mais velhas. Em alguns órgãos foram encontradas variações nos níveis de expressão de QQS não correlacionadas a variações nos níveis de metilação. Assim, os resultados também mostram que além da metilação outros fatores trans associados ao desenvolvimento são necessários para modular a expressão de
QQS. O processo de demetilação de QQSme em folhas velhas não é totalmente dependente de ROS1. Porém, os níveis e padrão de expressão de QQS em mutantes ros1 são diferentes de plantas wild-type e uma análise da expressão de QQS numa população F2 resultante da autofecundação de um híbrido entre wild-type e o mutante ros1-4 revelaram que ROS1 aparentemente regula a expressão global de QQS. Dessa forma, as metilações do DNA parecem atuar como sinalizadores de sítios de ligação para fatores trans e ROS1 pode ser importante para regular e/ou definir estados epialélicos de QQS. Além disso, durante o desenvolvimento reprodutivo a expressão de QQS é detectada no pólen e correlaciona com a demetilação ativa de seu lócus mediada por DEMETER reforçando o fato de que QQS é um alvo de DNA glicosilases. Durante o desenvolvimento vegetativo QQSé descrito como um regulador negativo do metabolismo de amido. De acordo com isso, verificamos que plantas carregando epialelos QQS contrastantes acumulam diferentes quantidades de amido.
ABSTRACT
DNA methylation of the fifth carbon of cytosine is an epigenetic mark that may affect gene expression. The regulation of methylation profiles is important for normal plant development being critical for transposon silencing, imprinting, gametogenesis and early embryo development. However, how methylation of cis regulatory sequences affect the interaction between DNA and developmental associated trans factors to modulate gene expression is poorly understood. Qua-Quine Starch (QQS) is an orphan gene of Arabidopsis thaliana which
exhibits several epiallelic forms stably-inherited and their expression levels correlate inversely with the methylation levels at the promoter and 5’UTR. Through the expression analyses of the GUS reporter gene under the control of a QQS promoter sequence and QQS 5’UTR in Arabidopsis transgenic lines, we inferred the potential of QQS expression in various organs and at several developmental stages. The GUS activity was detected in meristems, young rosette leaves and pollen where an epigenetic reprogramming of this gene has been described. Contrasting QQS epialleles presented different expression patterns during development. The methylated QQS epiallele (QQSme) showed more pronounced expression differences between leaves, inflorescence tissues and fruit, whereas the demethylated Col*3-2 epiallele presented a more homogeneous expression between this various organs. These results indicate that the methylation level of QQS cis regulatory sequence interacts with developmental-related factors to establish the expression profile of this gene. QQSme expression increases during aging of leaves and was correlated with demethylation. We hypothesized that the QQSme methylation profile could be reprogrammed during leaf development starting from the shoot apical meristem. Such process could be controlled by the DNA glycosilase ROS1, or be passive, as a consequence of the absence or failure in the maintenance mechanisms of the methylation pattern during cell replication. Accordingly, we showed that the QQSme expression is low in samples enriched in meristematic cells and increases progressively with leaf aging and reduction of QQSme methylation levels was observed in older leaves. In some organs, QQS expression variations not correlated with variation in the methylation levels were found. Thus, the results indicate that in addition to DNA methylation developmental associated trans factors are also necessary to modulate QQS expression. The demethylation process of QQSme in old leaves is not totally dependent upon ROS1. However, the levels and pattern of QQS expression in ros1 mutants are different from those in wild-type plants and the analysis of a segregating F2 population coming from selfing
of a hybrid between the wild-type and ros1-4 mutant revealed that ROS1 regulates the global expression level of QQS. Therefore, DNA methylation seems to act as traffic lights of binding sites to the trans factors and ROS1 may be important to regulate and/or define QQS epiallelic states. Furthermore, during the reproductive development the expression of QQS is detected in the pollen and correlates with the active demethylation of its locus mediated by DEMETER, which reinforces the fact that QQS is a target of DNA glycosilases. During vegetative development QQS has been described as a negative regulator of starch metabolism. We verified that plants carrying contrasting QQS epialleles accumulate different starch quantities.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5’UTR: região não traduzida da extremidade 5’ do RNA mensageiro
CTAB: cetyltrimethylammonium bromide DEPC: diethylpyrocarbonate
epiRILS: Epigenetic recombinant inbred lines mC: methylated cytosine
McrBC: endonuclease capaz de clivar DNA contendo citosina metilada PcG: Polycomb Group
Pol: RNA polimerase
QQS:GUS: regiões promotora e 5’UTR de QQS fusionadas ao gene repórter GUS
QQSme: epialelo de QQS contendo altos níveis demetilação de DNA qRT-PCR: quantitative real-time polymerase chain reaction
RdDM: RNA-directed DNA methylation RNAi: RNA de interferência
ros1-4: mutante para DNA glicosilase ROS1 SAM: Shoot Apical Meristem
siRNA: small interfering RNA TE: Transposable Elements TF: Transcription Factors
TFBS: Transcription Factors Binding Sites TrxG: Trithorax Group
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 13
O que é epigenética? ... 13
Mecanismos de regulação epigenética ... 16
Importância das metilações do DNA para o desenvolvimento e adaptação vegetal ... 27
QQS, um gene órfão e provocador ... 30
OBJETIVO ... 33
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34
Manuscrito “Developmental expression pattern of QQS is influenced by DNA methylation: involvement of ROS1 and impact on starch metabolism”. ... 34
Material suplementar do manuscrito ... 66
CONCLUSÃO ... 81
PERSPECTIVAS ... 82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 84
ANEXOS ... 93
Anexo I – Primeira página do artigo publicado “An efficient method for simultaneous extraction of high-quality RNA and DNA from various plant tissues” ... 93
Anexo II – Declaração de Bioética e Biossegurança... 94
INTRODUÇÃO
O que é epigenética?
No início do século XX as disciplinas biologia do desenvolvimento e genética eram estudadas separadamente. A grande pergunta vigente na época entre os pesquisadores dessas áreas era como uma célula (zigoto) contendo o mesmo material genético poderia dar origem a diferentes tipos celulares durante o desenvolvimento para formar o organismo. A solução conceitual desta questão foi dada por Conrad Hal Waddington que imaginou a existência de um mecanismo além ou acima dos genes controlando a leitura da sequência codificada no DNA (Waddington, 1942). Tal mecanismo originaria produtos gênicos e funções variáveis entre as células determinando o desenvolvimento e o fenótipo. Assim, ele foi o primeiro a associar as duas disciplinas em questão cunhando o termo epigenética, que significa literalmente acima (epi) da genética, se referindo à clássica teoria da epigenesis proposta por Aristóteles para explicar o desenvolvimento do organismo a partir de um embrião indiferenciado (Aristotle, 1979).
Originalmente, o termo epigenética foi cunhado por Waddington para se referir ao “estudo dos mecanismos causais pelos quais os genes que compõem o genótipo trazem à tona efeitos fenotípicos” (Waddington, 1942). Essa definição traz a essência do que é epigenética, a conexão entre genótipo e fenótipo como um fenômeno que modifica o resultado final de um lócus ou cromossomo sem mudar a sequência do DNA subjacente (Goldberg et al., 2007). Assim, Waddington previu que a diferenciação celular seria um fenômeno epigenético amplamente governado pelo contexto, tais como, informações fornecidas pelos genes, comunicações entre células e sinais do ambiente (Goldberg et al., 2007; Kinoshita e Jacobsen, 2012), e usou a metáfora das “paisagens epigenéticas” para ilustrar essa ideia (Waddington, 1957). Tais paisagens montanhosas representam o percurso de uma célula ao longo do desenvolvimento o que leva a diferentes destinos celulares (Fig. 1A). A superfície dessas paisagens seria distorcida por fatores epigenéticos, além dos genes e suas interações, formando vales e morros atrativos para a célula e resultando em estados fenotípicos, um processo que foi chamado de canalização (Fig. 1B).
Figura 1. Paisagem epigenética descrita por Waddington (1957). A) Paisagens
montanhosas representando os possíveis percursos de uma célula indiferenciada (esfera na figura) durante o desenvolvimento o que leva a diferentes destinos celulares ou diferenciação. B) Canalização, processo no qual a superfície da paisagem é distorcida por fatores epigenéticos, genéticos e suas interações (pontos e linhas interligadas na figura) formando os vales e morros atrativos para a célula e representando os estados fenotípicos. Figuras modificadas de Waddington, 1957.
Com o avanço das pesquisas surgiram outras definições para o termo epigenética, sendo este um motivo de grande debate dependendo da área em que é empregado (Hollyday, 2006). Pesquisadores das áreas de biologia do desenvolvimento e câncer costumam dar ênfase ao critério da herdabilidade mitótica, por considerarem a fidelidade do fenótipo celular após a divisão uma questão crítica para diferenciação de tecidos (Sweatt et al., 2013). Assim, preferem definir epigenética como o estudo de alterações na atividade gênica herdáveis mitótica e/ou meioticamente que não podem ser explicadas por mudanças na sequência de DNA (Russo et al., 1996). Entretanto, o termo epigenética também é utilizado para descrever processos não herdáveis, por exemplo, modificações transientes de histonas, e por isso pode ser definido num sentido mais amplo como a adaptação estrutural de regiões da cromatina para registrar, sinalizar ou manter estados de atividade alterados (Bird, 2007). O tema comum entre essas definições é a existência de um mecanismo para armazenar e perpetuar uma memória ao nível celular (Sweatt et al., 2013), sendo a definição de Russo et al. (1996) mais amplamente aceita.
Fisicamente, alterações epigenéticas são marcas químicas no DNA ou histonas que contribuem para compactação, estruturação, organização e atividade da cromatina. Dentre essas marcas, uma das mais importantes e estudadas é a metilação, sendo a ligação covalente
de um grupo metil (-CH3), principalmente encontrada no quinto carbono da citosina no caso do DNA, ou em aminoácidos específicos formando caudas no caso de histonas (Fig. 2). Entretanto, metilações também são observadas em adenina e no domínio globular de histonas. Tais marcas alteram a força de ligação entre DNA e histonas que formam o nucleossomo, bem como a interação entre histonas e nucleossomos, participando na compactação da cromatina (Sarma e Reinberg, 2005; Klose e Bird, 2006; Kouzarides, 2007). Além disso, as metilações são reconhecidas por fatores associados à transcrição e remodelação da cromatina e regulam a acessibilidade em lócus específicos do DNA (Schuettengruber et al., 2007; Zemach e Grafi, 2007). Dessa maneira, enquanto o genoma é definido pelo conjunto de genes codificados pelo DNA, o epigenoma é definido pela soma das histonas associadas à cromatina com o padrão de metilação do DNA, que definem a estrutura tridimensional dentro do núcleo e interconecta os genes ao ambiente (Fig. 2; Sweatt et al., 2013).
Figura 2. Metilação do DNA e histonas. As metilações do quinto carbono da citosina DNA ou de histonas são marcas epigenéticas que contribuem para formação da cromatina e influenciam a atividade dos genes ao longo do desenvolvimento e em resposta a sinais ambientais. Figura modificada de http://commonfund.nih.gov/epigenomics/figure.
Mecanismos de regulação epigenética
Análises do perfil global de metilação do genoma (metiloma) de Arabidopsis indicaram que 6-7% das citosinas são metiladas e ocupam cerca de 20% das regiões cromossômicas (Cokus et al., 2008; Lister et al., 2008). As metilações ocorrem em três diferentes contextos de sequência, CG, CHG e CHH (onde H é igual a A, T ou C), distribuídas principalmente em regiões hererocromáticas ricas em transposons e elementos repetitivos (Fig. 3). Além disso, as metilações também afetam cerca de um terço dos genes ocorrendo em 5% das sequências promotores e em 20-30% das regiões transcritas, chamada de corpo do gene (Zhang et al., 2006; Zilberman et al. 2007). Em geral, a metilação no corpo dos genes apresenta um padrão bell shape ausente nas extremidades 5’e 3’o que sugere interferência na expressão e seleção negativa (Zhang et al., 2006; Zilberman et al. 2007).
Dois padrões principais de metilação são observados em plantas. Um deles é caracterizado por altos níveis de metilação em todos os contextos de sequência ocorrendo principalmente em transposons e genes localizados em regiões heterocromáticas, enquanto o outro é caracterizado por metilações do tipo CG no corpo de genes localizados em regiões eucromáticas (Feng e Jacobsen, 2011). Esses padrões estão relacionados a funções distintas, pois, o primeiro está associado à repressão transcricional constituindo o principal mecanismo de controle da atividade de transposons para garantir a integridade do genoma (Zemach et al., 2010). Já o segundo está associado à ativação da expressão ao invés de silenciamento devido sua preferência por genes moderada ou constitutivamente expressos (Zilberman et al., 2007). De acordo com isso, plantas mutantes para enzimas envolvidas na regulação da metilação apresentam reativação transcricional e aumento da atividade de elementos transponíveis (Zhang and Jacobsen, 2006; Slotkin and Martiessen, 2007; Slotkin et al., 2009; Zemach et al., 2010). Análises recentes do metiloma de outras espécies revelaram a mesma tendência sugerindo conservação da função da metilação entre as angiospermas (Regulski et al., 2013; Zhong et al., 2013; Schmitz et al., 2013). Entretanto, as proporções e distribuição das metilações ao longo do genoma variam de acordo com a espécie, em geral, aumentando com o tamanho do genoma em consequência da maior quantidade de elementos transponíveis (Fig. 3; Mirouze e Vitte, 2014). Isso evidencia que a organização do genoma e a composição de elementos repetitivos e de transposição modelam em parte o metiloma e vice-versa.
Figura 3. Perfis de metilação do DNA em diferentes espécies de angiospermas. A)
Porcentagem de metilcitosinas presentes no genoma de diferentes espécies em cada contexto de sequência, CG, CHG, CHH (H = A, T ou C). Os valores foram calculados em relação ao número total de citosinas em cada contexto. B) Distribuição das metilcitosinas nos diferentes contextos ao longo do cromossomo 3 e 12 de Arabidopsis thaliana e Oriza sativa japonica, respectivamente. C) Densidade de elementos repetitivos nos mesmos cromossomos apresentados em B. Em A. thaliana, a região de maior pico corresponde ao centrômero. Figuras modificadas de Mirouze e Vitte, 2014.
Marcas epigenéticas podem ser colocadas e remodeladas durante a determinação do destino e identidade celular servindo como um sistema de armazenamento da informação para perpetuar essa identidade ao longo da vida. Em plantas, o padrão de metilação do DNA é inicialmente estabelecido sobre transposons e sequências repetitivas em todos os contextos pela atividade de novo da DNA metiltransferase DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE2 (DRM2) em uma via conhecida como RNA-directed DNA
methylation (RdDM; Matzke et al., 2009). A RdDM é uma via complexa e não totalmente
compreendida que envolve diversas enzimas sendo elas, principalmente, componentes da maquinaria de RNA interferente (RNAi), metiltransferases e remodeladores de cromatina (Fig. 4; Pikaard et al. 2012; Matzke e Mosher, 2014). O modelo canônico proposto por Pikaard et al. (2012) e adaptado por Matzke e Mosher (2014) para via RdDM descreve que, inicialmente, transcritos gerados por RNA polimerase IV (Pol IV) são sintetizados em RNAs de fita dupla (dsRNAs) pela enzima RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDR2) com o auxílio do remodelador de cromatina CLASSY 1 (CLSY1). Os dsRNAs são processados em pequenos RNAs de 24 nucleotídeos (siRNAs) pela enzima DCL3
(DICER-LIKE3) no citoplasma e metilados em sua extremidade 3’ pela enzima HUA ENHANCER 1 (HEN1). Uma das fitas metiladas de siRNA é incorporada a ARGONAUTA 4 (AGO4) e o complexo reimportado para o núcleo, onde reconhece por complementariedade transcritos recém originados pela RNA polimerase V (Pol V). AGO4 é recrutada para o locus por meio de interações com regiões da subunidade maior de Pol V e KOW DOMAIN-CONTAINING TRANSCRIPTION FACTOR 1 (KTF1). A enzima RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1 (RDM1), capaz de se ligar a fita simples de DNA (Gao et al., 2010), conecta AGO4 com DRM2 que, por sua vez, catalisa a metilação de novo do DNA.
Outras enzimas também participam da via RdDM. Por exemplo, SUVH2 e SUVH9 se ligam ao DNA metilado e contribuem para o recrutamento de Pol V (Johnson et
al., 2014; Liu et al., 2014). Já a transcrição pela Pol V é promovida pela ação do complexo
DDR, constituído pelas enzimas DEFECTIVE IN RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1 (DRD1), que ajuda na separação das fitas de DNA e, RDM1 e DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING 3 (DMS3) que auxiliam na estabilização do lócus (Zhong et al., 2012). Além disso, transcritos Pol V auxiliam o posicionamento dos nucleossomos por se ligarem ao complexo INVOLVED IN DE NOVO 2/IDN2 PARALOGUE (IDN2/IDP) que, por sua vez, interage com o complexo remodelador da cromatina SWI/SNF e, assim, influenciam na formação da heterocromatina (Fig. 4; Finke et al., 2012; Zhu et al., 2013). Metilações do DNA interagem com histonas modificadas em um mecanismo auto-regulatório que garante o reforço das marcas epigenéticas e a estrutura da cromatina (Bernatavichute et
Figura 4. Modelo canônico da via RdDM (RNA-directed DNA methylation). O modelo
apresenta a via RdDM para metilação de novo de regiões específicas do DNA. A via conta com diversas enzimas e uma complexa rede de interações. Em resumo, o modelo descreve que transcritos gerados pela Pol IV são copiados em RNA fita dupla pela enzima RDR2 e processados em pequenos RNAs de 24 nucleotídeos (siRNAs) pela enzima DCL3 (painel da esquerda). Uma das fitas do siRNA é incorporada a AGO4 e o complexo se liga por complementariedade a transcritos recém originados pela Pol V. RDM1 conecta AGO4 a DRM2 que, por sua vez, catalisa a metilação de novo do DNA qualquer contexto de sequência (painel do meio). Transcritos da Pol V auxiliam o posicionamento dos nucleossomos por se ligarem ao complexo IDN2/IDP que interage com o complexo remodelador da cromatina SWI/SNF e, assim, influenciam na formação da heterocromatina (painel da direita). Maiores detalhes das enzimas envolvidas e suas funções estão disponíveis no texto. Figura modificada de Matzke e Mosher, 2014.
Após estabelecimento, o padrão de metilação nos contextos simétricos CG e CHG é mantido de maneira semiconservativa e independente de siRNAs durante os ciclos subsequentes de replicação celular (Fig. 5; Law e Jacobsen, 2010). As enzimas responsáveis por esse processo são chamadas de metiltransferases de manutenção. Elas atuam na fita de DNA hemimetilada de maneira preferencial em cada contexto restabelecendo as modificações presentes em uma das fitas para a fita recém-formada. No contexto simétrico CG, a perpetuação da metilação é realizada pela METHYLTRANSFERASE1 (MET1; Kankel et al., 2003) em um processo que depende da remodelação da cromatina mediada por DECREASED IN DNA METHYLATION1 (DDM1) para acesso ao DNA (Zemach et al., 2013). A manutenção das metilações CG em plantas também requer a atividade de proteínas da família Variant In Methylation (VIMs; Liu et al. 2007; Kraft et al., 2008). VIMs se ligam preferencialmente ao DNA hemimetilado in vitro e possuem domínios SET- e
RING-associated (SRA) que estão relacionados ao reconhecimento de metilcitosinas (Yao et al.,
2012). Assim, foi sugerido que VIMs atuem no recrutamento de MET1 para sítios CG, uma vez que MET1 não apresenta um módulo de ligação a metilcitosinas (Shook e Richards, 2014). VIMs e MET1 regulam a transcrição de alvos similares indicando fortemente que VIMs regulam a expressão genica exclusivamente atuando como cofatores de MET1 (Shook e Richards, 2014).
Já no contexto CHG, a metilação é mantida pela enzima CHROMOMETHYLASE 3 (CMT3; Cao e Jacobsen, 2002) e no contexto CHH, que não conta com simetria de sequência, a manutenção depende de siRNAs e da via RdDM para seu reestabelecimento de novo (Chan et al., 2005). Entretanto, estudos recentes indicam que metilação CHH também pode ser mantida na ausência de siRNAs pela ação da enzima CHROMOMETHYLASE 2 (CMT2). As ações de CMT2 e CMT3 (CMTs) são favorecidas pela metilação da lisina 9 da histona H3 (H3K9me; Zemach et al., 2013; Stroud et al., 2014) catalisada pela metiltransferase SUVH4, também conhecida como KRYPTONITE (KYP; Jackson et al., 2002). SUVH4 por sua vez é recrutada para cromatina pelas metilações CHG e CHH (non-CG) evidenciando um mecanismo auto-regulatório positivo entre metilação de histonas e metilação do DNA para manutenção de marcas epigenética (Du et al., 2012; Stroud
et al., 2014). Além disso, tem sido demonstrado que múltiplas metiltransferases e enzimas
relacionadas contribuem para preservação da metilação nos três contextos de sequência, atuando de maneira auto-regulatória e reforçando a atividade umas das outras (Zemach et al., 2013; Stroud et al., 2013).
Figura 5. Manutenção dos padrões de metilação nos três contextos de sequência após replicação celular. Após replicação do DNA, as fitas filhas hemimetiladas são alvo da ação
das metiltransferases de manutenção que restabelecem as marcas na nova fita sintetizada. As metilações de citosinas no contexto simétrico CG e CHG são mantidas por MET1 e CMT3, respectivamente, enquanto metilações CHH, que não contam com a simetria de sequência, são restabelecidas de novo pela DRM2 e a via RdDM. Outras enzimas também participam desse processo conforme descrito em maiores detalhes no texto. Figura modificada de Teixeira e Colot, 2010.
A metilação do DNA é considerada uma marca epigenética mitótica e meióticamente estável, entretanto, níveis reduzidos são observados durante a gametogênese e embriogênese de plantas e animais, demonstrando que o perfil de metilação pode ser reprogramado (Law e Jacobsen, 2010). Atuando em oposição aos mecanismos de estabelecimento e manutenção da metilação no DNA, existem mecanismos de demetilação que moldam de forma dinâmica escapes epigenômicos e permitem a expressão de genes (Feng
et al., 2010). Tais processos são importantes, por exemplo, para imprinting parental e reseting
de marcas epigenética adquiridas ao longo da vida. A perda de metilação pode ocorrer passivamente, por replicação celular na ausência ou deficiência de vias de manutenção, ou ativamente pela remoção de citosinas metiladas realizada por enzimas específicas (Zhu et al, 2009; Law e Jacobsen, 2010).
Em plantas, a demetilação ativa é promovida pela atividade de DNA glicosilases associadas à via de reparo de bases excisadas (Zhu, 2009). DEMETER (DME) e REPRESSOR OF SILENCING1 (ROS1) são os membros fundadores da família de DNA glicosilases encontradas em A. thaliana (Choi et al., 2002; Gong et al., 2002), que também incluem DML2 e DML3 (Fig. 6A; Penterman et al., 2007a). As DNA glicosilases são enzimas bifuncionais que removem citosinas metiladas e causam uma quebra na fita de DNA (Agius et al., 2006). Essa lacuna no DNA é catalisada pelas AP endonucleases APE1L e ZDP, gerando uma extremidade 3’-OH que permite a atividade de uma DNA polimerase e ligase ainda desconhecidas para incorporação da nova citosina (Fig. 6B; Li et al. 2015c). APE1L e ROS1 interagem in vitro e co-localizam in vivo, sugerindo fortemente a formação de complexos que coordenam suas atividades (Li et al., 2015c). De acordo com isso, os mutantes
ros1 e rdd (o triplo mutante ros1, dml2 e dml3), assim como ape1l e zdp, apresentam aumento
da metilação em todos os contextos de citosinas, um fenômeno descrito como hipermetilação (Gong et al., 2002; Agius et al., 2006; Penterman et al., 2007a; Li et al. 2015c).
DME e ROS1 apresentam papeis biológicos distintos, sendo DME preferencialmente expresso na célula central do gametófito feminino e na célula vegetativa do pólen (Choi et al., 2002; Schoft VK et al., 2011), enquanto ROS1 é expresso em quase todos os tecidos vegetais (Gong et al., 2002). Em Arabidopsis, DME demetila o alelo maternal de genes imprintados no endosperma, por exemplo, FWA (FLOWERING WAGENINGEN), MEA (MEDEA) e FIS2 (FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED 2), entre outros (Hsieh et al., 2009; Ikeda, 2012). Essa demetilação é necessária para expressão do alelo maternal e o desenvolvimento normal do embrião, já que mutantes dme resultam na letalidade da semente
(Choi et al., 2002). Entretanto, estudos recentes indicam que a função basal de DME seja a reativação de transposons em células companheiras tanto do gametófito feminino quanto masculino (Calarco et al., 2012; Ibarra et al., 2012). Esse mecanismo atuaria como um sistema imune para ativar a produção de siRNAs e reforçar o silenciamento de transposons nos gametas. As demais DNA glicosilases também parecem contribuir nesse processo (Calarco et al., 2012).
Em contrapartida, ROS1 atua na demetilação de regiões que flanqueiam os genes evitando a dispersão da metilação a partir de transposons próximos e um possível silenciamenteo ocasional (Penterman et al., 2007b; Zhu et al., 2007). DML2 e DML3 atuam no mesmo sentido, mas ficam à margem de ROS1 uma vez que são bem menos expressos (Zhu et al., 2009). Diversos estudos indicam que a demetilação ativa ocorre em loci eucromáticos e seria um mecanismo para equilibrar a ação da via RdDM (Penterman et al., 2007b; Zhang e Zhu, 2012; Matzke e Mosher, 2014). De acordo com isso, muitos componentes da via RdDM estão desregulados em mutantes ros1 e, analogamente, mutantes relacionados a RdDM apresentam expressão reduzida de ROS1 (Zhang e Zhu, 2012). Recentemente, foi revelado que RdDM e ROS1 interagem para balancear os níveis de metilação do epigenoma (Lei et al., 2015; Williams et al., 2015). Estes trabalhos mostraram que as vias de RdDM e de demetilação ativa atuam fortemente em transposons próximos ao lócus de ROS1 e que a expressão de ROS1 é promovida pela metilação e antagonizada por demetilação, em contraste a maioria dos alvos típicos metilados (Fig. 6C). Dessa forma, o lócus de ROS1 funciona como um reostato epigenético sintonizando a atividade de demetilação em resposta a alteração dos níveis de metilação para, assim, garantir a estabilidade do genoma. Também foi demonstrado que essa expressão de ROS1 sensível a metilação é conservada em outras espécies, sugerindo ser uma característica importante para adaptação (Williams et al., 2015).
Figura 6. DNA glicosilases e mecanismos de funcionamento. A) Esquema mostrando a
estrutura dos genes que compõem a família de DNA glicosilases (DMLs) de Arabidopsis
thaliana. Regiões retangulares correspondem aos éxons e linhas aos introns. Éxons azuis
codificam o domínio helix–hairpin–helix, rosa e amarelo codificam outros domínios conservados enquanto pretos domínios não conservados entre as DMLs. Os locais de inserção de T-DNA ros1–3, ros1–4, ros1–5, dml2–1, e dml3–1 são indicados pelos triângulos. Figura modificada de Penterman et al., 2007a. B) Esquema mostrando a via de demetilação ativa. Nesse modelo ROS1 é bifuncional removendo citosina metilada e clivando o sítio abásico do esqueleto de DNA por meio da β ou βδ eliminação. Esse processo resulta numa lacuna com terminação PUA ou fosfato (P) em uma das fitas de DNA que é catalisada por APE1L or ZDP e substituída por uma hidroxila (-OH). Assim, essa lacuna pode ser preenchida por uma citosina não metilada pela ação de uma DNA polymerase e DNA ligase ainda não identificadas (representadas por “?” na figura). Figura modificada de Li et al., 2015c. C) Esquema mostrando que a regulação de ROS1 por metilação do DNA atua como um reostato epigenético. O esquema resume o papel de RdDM e ROS1 no lócus de ROS1 (auto-regulação) e em um outro alvo genômico metilado. Ao contrário de genes típicos, cuja diminuição dos níveis de metilação está relacionada ao aumento de expressão, a demetilação no lócus de ROS1 reduz sua própria expressão antagonizando a via RdDM. Isso garante que um balanço das atividades de metilação e demetilação seja mantido no genoma. Os símbolos “+” e “-”
denotam um efeito positivo e negativo respectivamente na expressão dos genes. Figura modificada de Williams et al., 2015.
Todas as DNA glicosilases contém uma região N-terminal rica em lisina sendo demonstrado em ROS1 que essa região é necessária para ligação ao DNA e ocorre de maneira independente da metilação (Ponferrada-Marin et al., 2010; Ponferrada-Marin et al., 2012). A hipermetilação dos mutantes ros1 e rdd ocorre em loci específicos, não sendo observado alterações substanciais nos níveis globais (Penterman et al., 2007a; Lister et al., 2008), o que sugere a atuação de mecanismos direcionando as DNA glicosilases (Zhu et al., 2007; Zhu, 2009). Em mutantes de Arabidopsis para as polimerases Pol IV e V, a produção de siRNAs heterocromáticos de 24 nucleotídeos é reduzida, coincidindo com maiores níveis de metilação em alguns loci correspondentes (Mosher et al., 2008). Isso indica que esse tipo de siRNA guia a demetilação ativa e que Pol IV e V estão envolvidas nesse processo (Zhu, 2009). De acordo com isso, foi descrita uma associação de ROS1 com ROS3, uma enzima RNA-binding envolvida na demetilação ativa e capaz de incorporar siRNAs que reconheceriam regiões do DNA por complementariedade (Zheng et al., 2008). Mecanismos similares têm sido descritos em animais, no qual siRNAs direcionados ao promotor parecem ativar a expressão de certos genes (Janowski et al., 2007). Este processo foi relacionado à demetilação e referido como
RNA-directed DNA demethylation (Zhu, 2009). Interessantemente, siRNAs também são
necessários para atividade RdDM, reforçando que mecanismos de metilação e demetilação compartilham componentes e estão estreitamente relacionados.
Embora seja bem estabelecida a interdependência entre metilação do DNA e transcrição (Zhang et al., 2006; Zilberman et al., 2007), como as metilações afetam a acessibilidade de fatores de transcrição (FTs) ao DNA é um tema pouco compreendido. Ainda não se sabe quando a alteração da metilação é causa ou consequência da alteração da expressão (Teixeira e Colot, 2009; Medvedeva et al., 2014). Se as metilações são a causa, então poderiam afetar diretamente a afinidade de FTs aos seus sítios de ligação ou, alternativamente, atrair fatores remodeladores de cromatina interferentes. Se a metilação é uma consequência da transcrição, então modificações da cromatina poderiam reduzir o acesso dos FTs e da maquinaria de transcrição ao DNA, e a metilação serviria para fixar o estado da cromatina (Medvedeva et al., 2014). Nesse caso, a metilação do DNA seria acumulada passivamente como resultado da ausência de ligação de FTs (Wang et al., 2012) ou
diretamente pelo recrutamento de DNA metiltransferases por proteínas associadas a modificações de histonas específicas (Vire et al., 2006).
Estudos recentes mostram que a ação direta e seletiva das metilações do DNA prevenindo a ligação de FTs é restrita a poucos exemplos e, ao invés disso, as metilações parecem atuar como sinalizadores atraindo complexos ativadores ou repressores (Medvedeva
et al., 2014; Li et al., 2015b). Nesse contexto, Methyl-Binding Proteins (MBPs) são descritas
como proteínas que interpretam a metilação do DNA e controlam a expressão de genes por atraírem fatores remodeladores da cromatina (Zemach e Grafi, 2007, Baubec et al., 2013). Em
Arabidopsis são encontradas 13 MBPs com diferentes funções (Zemach e Grafi, 2007).
MBD7, por exemplo, é descrita como um fator anti-silenciamento que reconhece sítios CG metilados e se associa a proteínas chamadas Increased DNA Methylation (IDMs) para facilitar a demetilação do lócus por ROS1 (Fig. 7A; Qian et al., 2012; Qian et al., 2014; Lang
et al., 2015).
Além disso, metilações do DNA regulam a metilação de histonas em um processo inter-relacionado e auto-regulatório necessário para reforço das marcas epigenéticas e que também afeta a transcrição (Cedar e Bergman, 2009; Rose e Klose, 2014; Ito et al., 2015). Conforme mencionado anteriormente, CMTs, responsáveis pela manutenção das metilações CHG e CHH (non-CG), são recrutadas ao lócus pela marca H3K4me e, de maneira recíproca, SUVH4, responsável por metilar H3K4, é atraída por metilações non-CG (Du et al., 2012; Stroud et al., 2014). Outros exemplos de modificações de histona incluem a trimetilação da lisina 27 da histona H3 (H3K27me3) adicionada por complexos do grupo Polycomb (PcG; Reddington et al. 2013) e trimetilação da lisina 4 da histona H3 (H3K4me3) adicionada por complexos do grupo Trithorax (trxG; Klymenko e Muller, 2004). H3K27me3 e H3K4me3 estão envolvidas no silenciamento e ativação transcricional, respectivamente (Schwartz e Pirrotta, 2007; Schuettengruber et al., 2011).
Recentemente foi descrito um modelo que pode explicar como FTs interagem com modificações de histona para promover a transcrição (Fig. 7B; Song et al., 2015). Nesse modelo, FTs induzíveis são capazes de recrutar o complexo trxG para o lócus atraindo outros fatores e formando o complexo COMPASS que, por sua vez, facilita a interação das metiltransferases com a histona H3 gerando H3K4me3 e permitindo a transcrição pela polimerase II (Pol II). De acordo com isso, diversos grupos de FTs e non-coding RNA parecem recrutar proteínas dos complexos PcG e trxG (Pu e Sung, 2015). Além disso,
COMPASS é conhecido por facilitar a formação do complexo de pré-iniciação (PIC) e gerar H3K4me3 durante a elongação da transcrição (Ding et al., 2012), sendo essa modificação associada a atividade de Pol II (Cedar e Bergman, 2009). Assim, esse modelo juntamente com outros dados explica em parte a inter-relação previamente observada entre metilação do DNA, metilação de histonas e a expressão gênica (Li et al., 2008; Cedar e Bergman, 2009).
Fig. 7. Modelos de interação entre fatores em trans e marcas epigenéticas. A) Esquema
mostrando a função anti-silenciamento de MBD7 e IDMs em um lócus metilado. Inicialmente, MBD7 se liga a metilação (1) e recruta proteínas IDM para o lócus (2). IDM1 acetila caudas de histonas facilitando acesso de ROS1 (3) que, por sua vez, previne a hipermetilação e silenciamento gênico (4). Figura modificada de Lang et al., 2015. B) Esquema mostrando um modelo hipotético para o envolvimento de fatores de transcrição e modificações de histona. Durante a formação do complexo de pré-iniciação (PIC), fatores de transcrição específicos (FT) e gerais (GTFs) são recrutados para o promotor juntamente com proteínas de ligação TATA-box (TBP) e mediadores. Ao mesmo tempo, FTs interagem com componentes do complexo COMPASS (Ash2, WDR5a e RbBP5) para facilitar sua interação com metiltransferases de histona e o domínio carboxyl-terminal (CTD) da polimerase II (Pol II). Tal interação promove a trimetilação da lisina 4 da histona H3 (H3K4me3) no promotor do gene que está relacionada a alongamento da transcrição (representado por “+1” na figura). Figura modificada de Song et al., 2015.
Importância das metilações do DNA para o desenvolvimento e adaptação vegetal
O desenvolvimento apropriado dos organismos depende de uma rede intrincada e precisa de regulação da expressão gênica. A metilação do DNA, por sua vez, interfere na transcrição sendo assim também importante para definição de identidades celulares e coordenação do desenvolvimento (Zilberman et al., 2007; Zhang et al., 2010). De acordo com isso, mutantes para enzimas relacionadas à regulação epigenética apresentam múltiplas anormalidades (Fig. 8A; Zhang e Jacobsen, 2006) e linhagens isogênicas de plantas com epigenoma variante (Epigenetic recombinant inbred lines ou epiRILs) respondem diferencialmente a estímulos ambientais (Cortijo et al., 2014).
Além disso, foram descritos diversos exemplos em que versões de genes metilados (epialelos) afetam características morfológicas. Em Linaria vulgaris, o aumento dos níveis de metilação do gene Lcyc, um ortólogo de CYCLOIDEA, reprime sua expressão modificando a simetria das flores (Fig. 8B; Cubas et al. 1999). No melão (Cucumis melo L.), alterações epigenéticas no promotor de CmWIP1 influencia na determinação sexual das flores (Martin et al., 2009). FLOWERING LOCUS WAGENINGEN (FWA) não é expresso durante o desenvolvimento vegetativo, entretanto, perdas de metilação no promotor induzem sua expressão e atrasam o florescimento de Arabidopsis (Soppe et al., 2000; Fujimoto et al., 2011). Muitas variações epialélicas naturais têm sido descritas relacionadas ao florescimento (Fornara et al. 2010; Andres e Coupland 2012), além de outras afetando características agronômicas, tais como, amadurecimento e produção de vitamina E no fruto de tomate (Zhong et al., 2013; Quadrana et al., 2014). Assim, os dados sugerem que mudanças fenotípicas causadas por alterações na metilação de DNA poderiam contribuir para processos adaptativos.
Fig. 8. Alterações epigenéticas afetam características morfológicas de plantas. A) Duplos
mutantes para enzimas envolvidas em vias regulatórias da metilação do DNA, por exemplo, met1/cmt3 e drm1/met, apresentam múltiplas anormalidades durante o desenvolvimento. Figura modificada de Zhang e Jacobsen, 2006. B) Variação da simetria floral em Linaria
vulgaris (pelórico) causada pelo aumento dos níveis de metilação de Lcyc e consequente
repressão de sua expressão. Figura modificada deCubas et al, 1999.
Diferente de mamíferos, cujo padrão de metilação do DNA é apagado e restabelecido de novo durante a gametogênese e embriogênese, em plantas as metilações são em grande parte mantidas através da meiose (Feng et al., 2010). Plantas se desenvolvem a partir de meristemas que estabelecem suas linhagens germinais tardiamente e, dessa maneira, alterações epigenéticas adquiridas ao longo da vida podem ser memorizadas e herdadas (Henderson e Jacobsen, 2007). Entretanto, a descoberta de que siRNAs estão envolvidos na correção de perdas acidentais da metilação (Teixeira et al., 2009), bem como remetilações observadas no epigenoma de epiRILs (Johannes et al., 2009; Reinders et al., 2009), revelou que nem todas as alterações epigenéticas são mantidas, pois alguns loci são remetiláveis enquanto outros podem permanecer alterados e originar epialelos.
Análises em A. thaliana revelaram que, no decorrer das gerações, as taxas de alteração espontânea na metilação do DNA são 1.000 vezes maiores do que mutações genéticas (Becker et al. 2011; Schmitz et al. 2011). Entretanto, a taxa de alteração epigenética herdável em grupos de citosinas (Differential Methylated Regions ou DMRs), funcionalmente mais relevantes do que individuais (Weigel e Colot, 2012), são similares às taxas de mutações na sequência de DNA (Becker et al. 2011; Schmitz et al. 2011). De qualquer forma, uma vez que as DMRs afetam a expressão e podem ser estavelmente herdadas, esses dados indicam que a variação epigenética pode ser selecionada e ter um papel adaptativo similar às variações genéticas. Tais modificações epigenéticas são frequentemente revertidas e os epialelos formados estão associados à produção de siRNAs, o que sugere a participação de metiltrasferases e DNA glicosilases atuando dinamicamente no controle das metilações (Matzke e Mosher, 2014; Lei et al., 2015; Williams et al., 2015).
Enzimas envolvidas no controle da metilação são responsivas a estresses modelando o epigenoma e regulando a expressão de genes (Sahu et al., 2013; Le et al., 2014). Por exemplo, plantas de Arabidopsis infectadas por patógenos apresentam regiões
diferencialmente metiladas referentes a genes requeridos para resistência (Dowen et al., 2012). De acordo com isso, mutantes relacionados à via de regulação da metilação de DNA, tais como, met1, ago4, polV e ros1, têm apresentado diferenças na resistência ou susceptibilidade à infecção (Yu et al., 2013). Em geral, a ativação ou repressão desses genes está envolvida com a regulação de transposons inseridos em regiões vizinhas. Certo nível da atividade de transposons é mantido pela ação das DNA glicosilases, sugerindo um efeito positivo em processos de adaptação a estresses (Zhu et al., 2009; Mirouze e Vitte, 2014). Dessa forma, o controle dinâmico das metilações de DNA é interpretado como um mecanismo importante para manter o epigenoma variável e adaptável, capaz de responder de maneira rápida e eficiente a sinais do ambiente durante o desenvolvimento (Kooke et al., 2015).
O impacto das modificações epigenéticas no desenvolvimento de plantas cultivadas sob condições de estresse é complicado de ser estudado, principalmente porque grande parte da variação fenotípica se deve a variação genética entre populações naturais (Kooke et al., 2015). Entretanto, análises de diferentes populações de epiRILs têm revelado que a variação epigenética contribui para variações morfológicas sendo essas características altamente herdáveis (Johannes et al., 2009; Reinders et al., 2009; Latzel et al., 2012; Zhang et
al., 2013). Recentemente foi demonstrado por Cortijo et al. (2014) que regiões
diferencialmente metiladas atuam como loci epigenéticos de traços quantitativos (Epigenetic
quantitative trait loci ou epiQTL) e são responsáveis pela maioria da variação herdável no
tempo de florescimento e tamanho da raíz observada entre epiRILs. Importantemente, nesse mesmo trabalho também foi demonstrado que os efeitos fenotípicos não são causados por inserções de transposons indicando ser um efeito da própria diferença de metilação do DNA. De acordo com isso, genes metilados e não próximos a transposons apresentam maior variação da expressão quando perdidas as metilações do que genes não metilados (Zilberman
et al., 2007). Isso indica que variação da metilação do DNA pode causar variação fenotípica,
sendo uma característica herdável e selecionável.
Plantas mutantes de vias relacionadas à metilação do DNA apresentam variações morfológicas pleiotrópicas suprimidas em plantas selvagens, indicando que a metilação é capaz de regular a plasticidade fenotípica (Zhang e Jacobsen, 2006; Mirouze e Paszkowski, 2011). Por plasticidade fenotípica entende-se a habilidade de um genótipo para expressar fenótipos alternativos em diferentes ambientes (Schlichting, 1986). Essa característica
governada por variações do epigenoma tem sido interpretada como uma compensação ao modo de vida séssil das plantas e importante para adaptação às condições ambientais oscilantes e variáveis (Feng e Jacobsen, 2011). Assim, a metilação do DNA tem sido interpretada como um fator atenuante da variação morfológica e, quando desregulada, poderia ser valiosa para melhoramento do desempenho em condições desfavoráveis (Mirouze e Paszkowski, 2011). De acordo com isso, estados hipometilados induzidos aumentam a sensibilidade de resposta do genoma ao ambiente, como observado para epiRILs, e por serem herdáveis essas características poderiam ser alvo de seleção (Zhang et al., 2013).
Entretanto, mecanismos de reforço da metilação do DNA são descritos em meristemas para silenciamento da transcrição via RdDM indicando que modificações epigenéticas em tecidos somáticos sejam mais comuns do que em células germinativas (Baubec et al., 2014). Isso sugere que alterações na metilação do DNA podem participar na adaptação local e momentânea, mas não seja fixada, pois, poderia ser desnecessária em outros contextos. Detalhes de como é memorizada essa variação epigenética adquirida ao longo do desenvolvimento e herdada transgeneracionalmente são aspectos ainda pouco compreendidos. Tais modificações, quando recorrentes, poderiam ocorrer diretamente em linhagens germinais ou, alternativamente, gerar pequenos RNAs migratórios a partir da região induzida (tecidos somáticos) para meristemas, formando um conduite de informação conforme proposto por Dowen et al. (2012). De qualquer modo, variação na metilação do DNA claramente afeta a expressão de genes em populações naturais e, existem indicações de que isso possa ser predominante para genes recentes originados de novo (Silveira et al. 2013).
QQS, um gene órfão e provocador
O estudo de mutantes de Arabidopsis thaliana para enzimas relacionadas à via RdDM revelou a existência de alguns loci candidatos ao controle epigenético (Kurihara et al., 2008). Um desses lócus, identificado como At3g30720, foi caracterizado contendo o gene
Qua-quine Starch (QQS) que codifica uma proteína de 59 aminoácidos sem domínios
catalíticos ou motifs estruturais descritos e que está envolvida no metabolismo de amido (Li et
al., 2009). QQS não apresenta homologia com qualquer sequência de outros organismos
sendo, portanto, considerado um gene órfão. Genes órfãos são definidos como genes com sequências codificadoras de proteínas novas e únicas a uma espécie ou táxon (Gollery et al.,
2006), sendo por isso também chamados de genes espécie-específicos, genes novos ou neogenes. Essa classificação inclui genes recém-formados a partir de sequências não gênicas, bem como, descendentes de genes ancestrais cujas sequências mudaram além da capacidade de reconhecimento, mas rejeita genes transferidos horizontalmente e genes duplicados que assumiram novas funções (Arendsee et al., 2014). Posteriormente, foi demonstrado que QQS é regulado epigenéticamente, pois, sua expressão está inversamente correlacionada aos seus níveis de metilação de DNA e, além disso, que é propenso à variação epialélica natural sugerindo participação em processos adaptativos (Silveira et al. 2013).
A estrutura de QQS é formada por três éxons e dois introns inseridos um na região 5’UTR e outro na região codificadora e as metilações se distribuem principalmente na região promotora e 5'UTR sendo ausente na região traduzida (Fig. 9; Lister et al., 2008; Cokus et al., 2008). Uma notável característica de sua vizinhança cromossômica são os múltiplos pseudogenes e transposons homólogos a família CACTA-like, gypsi-like e retroelementos, revelando seu posicionamento em uma ilha heterocromática (Fig. 9). A região cromossômica que cerca QQS parece ter sido um sítio de alta atividade de transposons durante a evolução e, como esperado, é altamente metilada (Lister et al., 2008). A expressão de QQS varia durante o desenvolvimento e em condições de estresse, além de mutantes para genes de enzimas envolvidas em processos de metilação e entre acessos naturais, estando sempre correlacionada a alteração dos níveis de metilação (Hruz et al., 2008; Li et al., 2009; Seo et al., 2011; Silveira et al. 2013). As diferenças de expressão não são relacionadas a mutações na sequência de DNA ou em fatores em trans ou a atividade de transposons vizinhos, sugerindo que a regulação se deve a variações na metilação do DNA (Silveira et al. 2013).
Fig. 9. Localização, estrutura e distribuição de metilações do DNA de QQS. O esquema mostra o posicionamento de QQS em uma ilha heterocromática do cromossomo 3 de
Arabidopsis thaliana (acesso Columbia-0) repleta de transposons e repetições. A estrutura de QQS é formada por três éxons e dois íntrons, inseridos um na região 5’UTR e outro na região
codificadora. As metilações de citosinas estão distribuídas na região promotora e 5'UTR e ausentes na região transcrita e 3’UTR. Metilações no contexto CG estão representadas por traços vermelhos, enquanto CHH e CHG, por traços azuis e verdes, respectivamente. Pequenos RNAs (siRNAs) de diferentes tamanhos e o número de cópias encontradas de cada região também estão presentes na figura (setas). Setas vermelhas representam siRNAs de 24 nucleotídeos (nt), enquanto setas verdes e azuis, siRNAs de 22-23 nt e 20-21 nt, respectivamente. Figura modificada de Silveira et al., 2013.
A existência de epialelos naturais de QQS sugere que regulações epigenéticas atuantes sobre o lócus são bastante flexíveis e versáteis, embora não se saiba o quanto estes epialelos influenciam no vigor ou adaptação da planta. Entretanto, diversos trabalhos mostram que a função de QQS durante o desenvolvimento vegetativo é regular o metabolismo de amido. Li et al. (2009) foi a primeira a demonstrar a correlação inversa entre a expressão de
QQS e acúmulo de amido nas folhas de Arabidopsis. Outros trabalhos confirmaram essa
associação e mostraram que QQS é afetado por condições de estresse impactando o crescimento das plantas. Por exemplo, sob condições de frio uma isoforma do fator de transcrição IDD14 é ativada diminuindo a expressão de QQS e, assim, a quantidade de amido aumenta para maior eficiência do desenvolvimento durante noites frias (Seo et al., 2011). A expressão de QQS também é afetada por patógenos como Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) sendo correlacionada a demetilação ativa do loci (Dowen et al., 2012). Além disso, recentemente foi descrito que mutantes para ARA6, uma proteína que intermedia o tráfego a partir dos endossomos para membrana plasmática, é responsável pela homeostase de amido e açúcar por meio da regulação de QQS e tais plantas apresentam resistência a Pst (Tsutsui et
al., 2015).
Esses resultados indicam que QQS integra uma diversa gama de estresses bióticos e abióticos para sintonizar o desenvolvimento vegetal, contribuindo para adaptação e constituindo um modelo para estudos de genes órfãos conforme sugerido por Arendsee et al. (2014). Além disso, QQS continua apresentando funções quando transferido para outras espécies distantes como a soja, sendo sugerida uma interação com parceiros e vias
conservadas (Li e Wurtele, 2014). De fato, foi demonstrado recentemente por Li et al. (2015a) que que a proteína QQS é capaz de se ligar ao regulador transcricional NF-YC4 (Nuclear factor Y, subunit C4) conservado entre eucariotos e, assim, regular processos metabólicos que afetam o particionamento de carbono e nitrogênio entre proteínas e carboidratos modulando a composição de folhas e sementes de Arabidopsis e soja (Glycine max). Dessa forma, QQS é um gene que apresenta características únicas e extremamente provocadoras para uma série de questões relevantes a biologia.
A taxa de produção de transcritos num certo lócus é determinada pela interação entre reguladores em trans e suas sequências alvo em cis. Entretanto, a capacidade de interação entre esses fatores cis e trans depende do perfil estrutural da cromatina que é influenciada por marcas epigenéticas, tais como, a metilação do DNA (Zilberman et al., 2007). Em plantas superiores, uma correlação estreita entre metilação e silenciamento da transcrição foi estabelecida (Law e Jacobsen, 2010). Porém, o quanto e como as metilações do DNA afetam a expressão de genes ainda é um aspecto pouco relatado e compreendido.
A expressão de QQS está sob controle epigenético e apresenta um padrão de regulação específico ao longo do desenvolvimento e em resposta a alterações do ambiente. Portanto, QQS poderia funcionar como um sensor e ser usado como um modelo para melhor entendimento da interação entre mecanismos de controle epigenético e sinais do desenvolvimento/ambiente que regulam a expressão gênica. A regulação epigenética é considerada atualmente um importante aspecto da interação entre genótipo e ambiente para definir o fenótipo. Estudar como esses tópicos interagem é essencial para compreender o funcionamento dos genomas e para programas de melhoramento vegetal mais refinados.
OBJETIVO
Estudar como os perfis de metilação de citosinas no promotor e região 5’UTR de epialelos Qua-Quine Starch (QQS) são alterados no decorrer do desenvolvimento contribuindo para estabelecimento do padrão de expressão deste gene e os efeitos sobre o acúmulo de amido.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Manuscrito “Developmental expression pattern of QQS is influenced by DNA methylation: involvement of ROS1 and impact on starch metabolism”.
Oliveira, RR1; Viana, AJC1; Matiolli, CC1; Silveira, AB2; Vincentz, M1.
1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Campinas, São Paulo, Brazil.
2
Ecole Normale Supérieure, Institut de Biologie (IBENS), Paris, France.
Abstract
Cytosine methylation (mC) is an epigenetic mark that affects gene expression. In plants, the
developmentally induced re-programming of mC profiles is critical for transposon silencing and gene expression regulation. Yet, the extent to which and how the changes of mC pattern may be modulated during vegetative development is poorly understood. Qua-Quine Starch (QQS) is an orphan gene of Arabidopsis thaliana which present several spontaneous stably-inherited epialleles and their expression levels correlate inversely with the mC levels in the promoter and 5’UTR. We show that the mC level in QQS epialleles modulates its expression during vegetative development. The QQS expression was increased in leaf and correlated with a demethylation which is not associated with the action of the DNA glycosilase ROS1. Genetic analysis using ros1-4 plants, which carry a strongly methylated QQS epiallele, showed that ROS1 is necessary to define QQS expression level, most likely, by regulating directly the methylation status of QQS. Plants carrying contrasting QQS epialleles showed different starch contents in agreement with its described function. Together, this data offer insights into how mC modulates gene expression during plant development and how QQS epialleles could be formed and affect starch metabolism.
Introduction
Cytosine-5 methylation (mC) is an epigenetic mark associated with transcriptional regulation, in most cases promoting silencing of transcription (Law and Jacobsen, 2010). In plants, mC is associated with heterochromatin formation necessary to control the activity of transposable elements (TEs) that could threaten genome integrity and influences expression of nearby genes (Goll and Bestor, 2005; Feng and Jacobsen, 2011). Development of all organisms is dependent on an intricate and precise regulation of gene expression which is interdependent of mC profiles (Zilberman et al., 2007; Zhang et al., 2010). Accordingly, multiple abnormalities are observed in mutants for enzymes involved in regulatory pathways of DNA methylation (Zhang and Jacobsen, 2006). Moreover, the developmentally induced re-programming of mC profiles are critical for gene imprinting in the germline and for early embryo development (Choi et al., 2002; Hsieh et al., 2009; Ibarra et al., 2012). However, how mC at cis regulatory sequences interacts with trans factors to modulate gene expression and vegetative development is not well known.
How mC interacts with transcription has been widely debated and a main issue is related to whether altered gene expression is a cause or a consequence of mC (Teixeira and Colot, 2009; Medvedeva et al., 2014). If mC is the cause of gene repression, then mC may directly affect the affinity of transcription factors (TFs) towards their binding sites (TFBSs) or, alternatively, attract remodeling chromatin factors, such as, methylation-binding proteins (MBPs) or Polycomb (PcG) factors (Schuettengruber et al., 2007; Li et al., 2015c) which affect chromatin accessibility. If mC is the consequence, then chromatin modification reduce the access of TFs and transcriptional machinery to the DNA and mC serves to fix this repressed state of the chromatin. In this later case, mC could accumulate passively as a result of the absence of TF binding (Wang et al., 2012) or direct DNA methyltransferase recruitment by associated PcG protein (Vire et al., 2006). However, mC of TBFS preventing TF binding does not appear to be a general transcriptional regulatory mechanism since very few cases have been described (Medvedeva et al., 2014; Li et al., 2015b). Instead, mC at genes seems to acts largely as traffic-lights at TBFS attracting mainly repressor but also activator complexes such as MBPs and PcG factors (Medvedeva et al., 2014).
The regulation of mC levels is a dynamic process involving pathways that are dedicated to the incorporation or excision of methylated cytosines (Law and Jacobsen., 2010). In plants, the mC is found in all contexts of sequence (CG, CHG or CHH, where H = A, T or
C). This mC is established by the de novo DNA metiltransferase DRM2 through a pathway known as RdDM (RNA-directed DNA methylation), which is guided by 24 nt siRNA (Matzke et al., 2009). Then, posteriorly, the mC patterns are maintained in a semi-conservative manner during DNA replication by the action of the DNA methyltransferases, which present variable affinities depending on the mC sequence context (Teixeira and Colot, 2010). In the asymmetric CHH context, mC is maintained by RdDM and also CMT2 (Henderson and Jacobsen, 2007; Zemach et al., 2013).
DNA methylation can be also excised by active mechanisms or lost passively (Law and Jacobsen, 2010). Passive demethylation occurs in the absence of DNA methyltransferases during DNA replication, whereas active demethylation occurs via DNA glycosilases able to excise mC independent of the sequence context and important to avoid genome hypermethylation and protect genes near to heterochromatic regions (Zhu, 2009; Feng et al., 2010). DEMETER (DME) and REPRESSOR OF SILENCING1 (ROS1) are the major active demethylation players found in Arabidopsis thaliana and show distinct biological roles (Penterman et al., 2007). DME is required for gene imprinting during gametogenesis whereas ROS1 acts at specific loci during vegetative development ( Morales-Ruiz et al., 2006). A relationship between RdDM and ROS1 was described showing that the regulation of mC levels is at a dynamic equilibrium (Lei et al., 2015; Williams et al., 2015) which partly explains the interplay between methylation and demethylation processes. In agreement, ros1 mutant plants accumulate hypermethylation at specific loci throughout the genome (Gong et al., 2002; Agius et al., 2006; Zhu et al., 2007).
Plants present high plasticity along development, probably, to compensate for their sessile lifestyle and the necessity to deal with frequent environmental alterations. Recently, isogenic Arabidopsis thaliana lineages with different epigenomes, were shown to respond differently along development to environmental changes suggesting that epigenetic components modulate plant developmental plasticity and contribute to local adaptation (Turck and Coupland 2014; Cortijo et al., 2014; Kooke et al., 2015). In general, it has been demonstrated that global induced hypomethylation states increases plant sensibility to environmental conditions and cause phenotypic variation that, in turn, could be inherited and selected contributing to plant adaptation (Cortijo et al. 2014; Kooke et al. 2015; Dubin et al. 2015). Accordingly, multiples aspects of development, such as, morphology, vernalization and flowering, stress responses and others, are direct or indirectly regulated by epigenetic marks (Feng and Jacobsen, 2011). However, the developmental variation was only revealed
