Filogenia molecular e a delimitação taxonômica das espécies do gênero Stalachtis Hübner, 1818

I

Luiza de Moraes Magaldi

Filogenia Molecular e a Delimitação Taxonômica das

Espécies do Gênero Stalachtis Hübner, 1818

CAMPINAS 2015

V

A

Gostaria de agradecer ao meu orientador, o Prof. André Freitas, por ter me orientado desde a iniciação científica com muita paciência e empenho, me ensinando com entusiamo sobre as borboletas e sobre a ciência. Essa empolgação pela ciência me contagiou e permitiu que eu gostasse muito mais dela. Também gostaria de agradecer minha Co-orientadora a Profa. Ana Maria Espin, que também me acolheu no seu laboratório desde a iniciação científica, permitindo que eu aprendesse os mistérios da genética molecular.

Quero agradecer também a todos os meus colegas do LABBOR, agradeço ao Lucas Kaminski, que me apresentou as Stalachtis, me ensinou sobre a história natural desses borboletas, além de sempre me incentivar a pensar e ir além. Agradeço a Noemy Seraphim por ter sido uma ótima professora e me ensinado desde a alinhar as sequências até as análises filogenéticas. Quero agradecer também ao Eduardo Barbosa que me ensinou as técnicas de dissecção de genitálias das borboletas. A Tamara Aguiar, que montou todas as Stalachtis coletadas para essa dissertação. A Karina Silva-Brandão, que também me ensinou sobre as técnicas moleculares e me ajudou desde a minha iniciação. Além deles, quero também agradecer aos colegas do laboratório que coletaram

Stalachtis e outras borboletas para mim: Luísa Mota, Poliana Felix, Junia Yasmin, Jessie

Pereira, Danilo Ribeiro, Ana Kristina Silva, Mario Alejandro, André Tacioli, Cristiano Iserhard e ao Renato Rogner. E ao Scott Carrara que me ajudou no laboratório e me deixou ensinar um pouquinho do que eu aprendi para ele.

Agradeço a todos do LABGEA, a Rosangela Rodrigues, por pacientemente ter me ensinado desde a iniciação as técnicas moleculares e sempre me auxiliar com as dúvidas e problemas que surgiram nesse caminho. Aos colegas que também me ensinaram e me ajudaram Luana Bergamo, Daniel Paulo, Rogério Gonçalves e a Ana Carolina Junqueira. A Ana Claudia Lessinger e ao projeto Brbol.

Aos professores Olaf Mielke e Mirna Casagrande que me receberam no museu de lepidópteros em Curitiba, e a todos os alunos que me acolheram por lá. A curadora Blanca Huertas e ao curador John Chainey por permitir que eu examinasse os indivíduos de

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publicaram suas fotos no Flickr, que tiraram fotos de Stalachtis por toda a América do Sul e deixaram eu utilizar os seus registros. Aos coletores que me doaram borboletas para essa dissertação: Diego Dolibaina, Márcio Uehara-Prado, Keith Wilmott, Mauro Costa, Gustavo Acácio, Elias Araújo e ao Prof. Brown.

Agradeço aos membros da pré-banca e banca, que com suas sugestões valiosas para essa dissertação enriqueceram o meu conhecimento, Prof. Sérgio Reis, Prof. Marcelo Duarte, a Karina Silva-Brandão, e ao Simeão Moraes.

Muito importantes para essa dissertação também, foram os meus amigos e familiares, que sempre me apoiaram e incentivaram eu a avançar na minha jornada científica. Quero agradecer ao Matheus Jardim, por sempre me apoiar, me amar e cuidar de mim todos os dias. Agradeço imensamente aos meus pais, Helena e Cezar, que desde pequena me ensinaram e se esforçaram para que eu chegasse aqui. Aos meus irmãos, Cézar e Victor, por estarem comigo sempre. E a toda a minha família, desde os meus queridos avós, tios e tias e meus primos. Todos vocês fazem parte de mim e me ajudaram muito. Aos meus amigos, que sempre me trouxeram ajuda e alegria, Veridiana Jardim, Amanda Eid, Henrique Calado, João Garbelloto, Adriano Messias, Hans Müller, Hugo Alvarez, Natália Angeluzzi, Lucas Monteiro, Gustavo Angeluzzi, Vinicius Amaro, João Preturlan e todos os amigos do FAM.

E por fim, não menos importantes, as borboletas Stalachtis que se tornaram parte da minha vida acadêmica, que permitiram eu fazer essa dissertação, estudar e entender um pouco mais sobre a vida e sua evolução.

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R

O gênero Stalachtis pertence à família Riodinidae e apresenta borboletas aposemáticas com padrões alares miméticos. Essas borboletas ocorrem desde o Panamá até o sudeste do Brasil, sendo restritas à região Neotropical. As suas lagartas comem plantas da família Simaroubaceae com fitoquímicos tóxicos e de sabor amargo, sugerindo que as borboletas de Stalachtis possam ser impalatáveis. Nesse trabalho é proposta uma filogenia para Stalachtis com base em marcadores moleculares – um gene mitocondrial (COI) e três genes nucleares: GAPDH, CAD e o RPS5. Foi investigada a distribuição geográfica das espécies do gênero Stalachtis e também foram delimitadas com base em evidências moleculares, biogeográficas e morfológicas. As análises de distância genética aqui utilizadas – Neighbor-Joining, rede de haplótipos, distância genética – mostraram padrões similares que levam as mesmas conclusões. As três análises filogenéticas feitas – Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana – recuperaram o gênero Stalachtis como monofilético (separado do grupo irmão Protonymphidia senta) e produziram topologias iguais no que se refere as relações internas do gênero. Os 100 indivíduos amostrados de Stalachtis se organizaram em 11 clados bem definidos e com alto valor de probabilidade posterior e de bootstrap, que podem ser atribuídos a 10 espécies diferentes. Todos os indivíduos se separam formando dois grandes clados irmãos. O primeiro clado inclui S. phegia + Stalacthis susanna stat. rev.. O segundo clado inclui todas as espécies restantes, com S. lineata aparecendo como grupo irmão das restantes. Estas outras se organizam em dois clados irmãos: 1) S. halloweeni + S.

phaedusa (uma relação inesperada porém congruente com os padrões alares), e 2) S. euterpe, grupo irmão de S. magdalena, Stalacthis terpsichore stat. rev., S. calliope e uma

nova espécie não descrita. A espécie revalidada Stalachtis susanna, apresenta várias características distinguíveis da espécie irmã S. phlegia, desde o padrão alar, caracteres na genitália masculina e números cromossômicos diferentes. Junto a isso, as análises moleculares propostas mostram essas espécies como entidades distintas (clados bem definidos nas filogenias, alta distância genética, rede de haplótipos desconectadas). Adicionalmente, temos as evidências biogeográficas, sendo S. phlegia uma espécie relacionada com a Floresta Amazônica e Cerrado, e S. susanna com a Mata Atlântica. Interessantemente, no clado de S. magdalena, os indivíduos se separaram em dois clados

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distintos e com alto suporte, mas não foi encontrada nenhuma evidência morfológica que sugira que existam duas espécies distintas. Essa divisão no DNA mitocondrial pode ter sido causada por: uma barreira no fluxo gênico; pela existência de duas espécies crípticas; ou pela seleção do genoma mitocondrial por parasitas citoplasmáticos. A segunda espécie aqui revalidada é S. terpsichore, que apresenta características morfológicas (genitália masculina e padrão alar) e dados genéticos que a definem como uma espécie válida. Além das espécies revalidadas, foram obtidos dados moleculares para a descrição de uma nova espécie de Stalachtis do Equador que apresenta diferenças genéticas e morfológicas de S. calliope. Não foi encontrada estruturação genética ou geográfica entre as subespécies amostradas, sugerindo que as subespécies atuais não são unidades evolutivas distintas.

IX

A

Stalachtis genus belongs to the Riodinidae family, these butterflies have

aposematic wings with mimetic patterns. They can be found from Panama to the southeast of Brazil, being restricted to the Neotropics. Their caterpillars eat Simaroubaceae plants with toxic phytochemicals and bitter taste, suggesting that

Stalachtis butterflies can be unpalatable. In this paper, we propose a phylogeny for Stalachtis based on molecular markers - one mitochondrial gene (COI) and three nuclear

genes: GAPDH, CAD and RPS5. We investigated the geographic patterns of the species, and delimited this species based on molecular, morphological and biogeographic evidence. The genetic distance analysis used here - Neighbor-Joining, Minimum Spanning network, COI genetic distance - showed similar patterns that lead to the same conclusions. Three phylogenetic hypotheses were made - Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inference – and they recovered the Stalachtis genus as monophyletic (separated from the sister group Protonymphidia senta) and produced the same topologies regarding the internal relationships between species. The 100 sampled individuals of Stalachtis organized into 11 clades with high posterior probability and bootstrapping, corresponding to 10 different species. All individuals are divided into two major sister clades. The first clade includes S. phegia + Stalacthis susanna stat. rev.. The second clade includes all other species, with S. lineata as a sister group to the other. These others are organized into two sister clades: 1) S. halloweeni + S. phaedusa (an unexpected relationship but congruent with the wing patterns), and 2) S. euterpe, sister group of S. magdalena, S. terpsichore stat. rev., S. calliope and a new undescribed species. The revalidated species Stalachtis susanna has several distinguishable characteristics from the sister species S. phlegia, such as the wing pattern, characters of male genitalia and different chromosome numbers. Furthermore, the molecular analysis proposals show these species as distinct entities (well-defined clades in the phylogeny, high genetic distance and disconnected haplotypes network). Additionally, we have the biogeographic evidence, because S. phlegia is more related to the Amazon and the Cerrado, and S.

susanna with the Atlantic Forest. Interestingly, the S. magdalena individuals are divided

into two distinct clades with high support, but we did not find morphological evidence to corroborate that there are two distinct species. This division in mitochondrial DNA may

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have been caused by a barrier in gene flow; the existence of two cryptic species; or by the selection of mitochondrial genome by cytoplasmic parasites. The second species revalidated S. terpsichore, presented morphological characters (male genitalia and wing patterns) and genetic data that define it as a valid species. In addition to the revalidated species, molecular data were collected to describe a new species of Stalachtis from Ecuador, which has genetic and morphological differences from the S. calliope. There was no genetic or geographical evidences that suggests structure between the subspecies sampled from the Stalachtis species, suggesting that these current subspecies are not distinct evolutionary units.

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L

I

Figura I-1. Desenho adaptado de Harvey (1987) da asa de Stalachtis susanna com a

nomenclatura proposta por Miller (1970). ... 16

Figura I-2. Fotos de vouchers utilizados representando as espécie do gênero Stalachtis. ... ...17

Figura I-3. Filogenias para o gênero Stalachtis, primeiro a classificação de Stichel (1910-1911) e o segundo apresentando a hipótese filogenética de Hall (2006)... 18

Figura II-1. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para a região barcode...34

Figura II-2. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para a segunda metade do gene COI...35

Figura II-3. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear CAD...36

Figura II-4. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear GAPDH...37

Figura II-5. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear RPS5...38

Figura II-6. Análise de “Minimum spanning network” para a região barcode (gene COI)...42

Figura II-7. Análise de “Minimum spanning network” para a segunda metade do gene COI...43

Figura II-8. Análise de “Minimum spanning network” para o gene RPS5...44

Figura II-9. Análise de “Minimum spanning network” para o gene GAPDH...45

Figura II-10. Análise de “Minimum spanning network” para o gene CAD...46

Figura II-11. Distâncias genéticas baseadas nas sequências para a região barcode...47

Figura II-12. Boxplots para as distâncias genéticas, baseados nas sequências para a região barcode...48

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Figura II-13. Árvore consenso das árvores mais parcimoniosas, baseada nos dados concatenados de três genes (COI, RPS5 e GAPDH)...54 Figura II-14. Árvore de Máxima Verossimilhança, baseada nos dados concatenados de três genes (COI, RPS5 e GAPDH)...55 Figura II-15. Inferência bayesiana feita a partir dos dados de 3 genes (COI, GAPDH e RPS5)...56 Figura II-16. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos previamente identificados como Stalachtis calliope...59 Figura II-17. Caracteres morfológicos diagnósticos das espécies S. calliope e S. terpsichore...59 Figura II-18. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos de S. lineata...60 Figura II-19. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos previamente identificados como Stalachtis phlegia...60 Figura II-20. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos de S. phaedusa.61 Figura II-21. Distribuição geográfica encontrada para o gênero Stalachtis...64 Figura II-22. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis susanna e S.

phlegia...65

Figura II-23. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis lineata...66 Figura II-24. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis phaedusa e S.

halloweeni...67

Figura II-25. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis euterpe...68 Figura II-26. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis magdalena....69 Figura II-27. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis calliope, S.

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Tabela II-1. Dados de coleta dos indivíduos de Stalachtis utilizados...22 Tabela II-2. Lista dos primers desenhador por Wahlberg & Wheat (2008)...26 Tabela II-3. Distâncias genéticas calculadas para a região barcode...48

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S

FILOGENIA MOLECULAR E DELIMITAÇÃO DAS ESPÉCIES DO GÊNERO STALACHTIS HÜBNER,1818 (LEPIDOPTERA:RIODINIDAE) ... 19

INTRODUÇÃO ... 19

MATERIAL E MÉTODOS ... 21

Amostragem taxonômica ... 21

Técnicas moleculares ... 24

Análises de distância genética ... 27

Análises filogenéticas ... 28

Estudo dos padrões alares ... 29

Distribuição geográfica das espécies ... 29

RESULTADOS ... 29

Marcadores moleculares: análises exploratórias ... 30

Árvores de Distâncias genéticas (NJ) ... 31

Rede de haplótipos - “Minimum spanning network” ... 39

Distâncias genéticas para o Barcode ... 47

Análises filogenéticas ... 53

Relações internas do gênero Stalachtis ... 53

Padrões alares ... 57

Distribuição geográfica ... 62

DISCUSSÃO ... 71

Filogenia do gênero Stalachtis ... 71

O uso de marcadores moleculares para a delimitação taxonômica das espécies do gênero Stalachtis ... 75

CONCLUSÃO GERAL ... 80

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“It is paradoxical, yet true, to say, that the more we know, the more ignorant we become in the absolute sense, for it is only through enlightenment that we become conscious of our limitations. Precisely one of the most gratifying results of intellectual evolution is the continuous opening up of new and greater prospects.” - Nikola Tesla

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INTRODUÇÃO GERAL

A família Riodinidae

Dentre as sete famílias de borboletas reconhecidas, Riodinidae é uma das mais diversas em morfologia de adultos e imaturos, incluindo grande diversidade de formas e tamanhos (algumas das menores borboletas conhecidas são riodinídeos) e de coloração das asas (Stichel 1910–1911, d’Abrera 1994). Muitas espécies apresentam manchas metálicas nas asas (douradas ou prateadas), por isso receberam o nome metalmarks em inglês. Uma característica visível de alguns riodinídeos é a redução das pernas anteriores nos machos, similar às borboletas da família Nymphalidae (Hall 2004).

A família Riodinidae possui uma grande riqueza de espécies, sendo a segunda maior família de borboletas, somente menor que Nymphalidae (Heppner 1991, Robbins 1993). No entanto, ainda é a menos conhecida e estudada entre as famílias de borboletas, apesar do recente aumento de interesse nesse grupo (Kaminski 2008, Hall & Harvey 2002, Allen 2010, Callaghan 2010). Possivelmente, essa falta de conhecimento se deve à dificuldade na identificação de muitos grupos com taxonomia ainda pouco estudada. Outro fator importante é a dificuldade de detectar as espécies de Riodinidae, pois muitas são pouco abundantes e erráticas no tempo e espaço, além de geralmente possuírem um pequeno tamanho, dificultando a sua observação (Harvey 1987).

Apesar de ser distribuída em quase todos os continentes, a família Riodinidae é essencialmente Neotropical, região onde ocorrem mais de 1.300 espécies, ou seja, cerca de 95% da riqueza da família (DeVries 1997, Callaghan & Lamas 2004). A história natural e a biologia da maioria das espécies ainda são desconhecidas (Hall et al. 2004, Kaminski 2008), todavia, a taxonomia e a sistemática de Riodinidae têm sido mais estudadas nas últimas décadas (Harvey 1987, Callaghan & Lamas 2004, Hall 2005, Penz & DeVries 2006, Siewert et al. 2014).

Os riodinídeos apresentam uma grande diversidade ecológica (Callaghan 1982). Junto com a família irmã Lycaenidae (Campbell et al. 2000, Heikkilä et al. 2012) são as únicas borboletas que possuem lagartas capazes de interagir com formigas (mirmecofilia) (Fiedler 1991, Pierce et al. 2002, Kaminski 2008). As lagartas de um modo geral produzem secreções açucaradas que atraem as formigas, enquanto que as formigas protegem as

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lagartas de inimigos naturais. Essa associação mutualística com as formigas é muito benéfica para as lagartas, e existem muitas adaptações envolvidas nessa interação, como a presença de papilas vibratórias que produzem som (DeVries 1990, 1991). A mirmecofilia ocorre principalmente em espécies da tribo Nymphidiini (Riodininae), sendo encontrada em cerca de 30% das espécies da subfamília Riodininae (DeVries 1997).

Já existem algumas hipóteses filogenéticas para Riodinidae (Harvey 1987, Campbell & Pierce 2003, Saunders 2010), porém as relações não estão ainda totalmente esclarecidas dentro da família. Atualmente, são reconhecidas três subfamílias em Riodinidae: Riodininae, Euselasiinae e Nemeobiinae; sendo Riodininae a que possui a maior riqueza (Hall 2004). Atualmente, Riodininae está dividida em sete tribos, entre elas a tribo Stalachtini, composta apenas pelo gênero Stalachtis (= Nerias Boisduval, 1836) Hübner 1818 (Callaghan & Lamas 2004, Hall 2006). Mesmo assim, o status da tribo Stalachtini provavelmente será alterado, já que alguns estudos moleculares mais recentes mostram que Stalachtis está dentro da tribo Nymphidiini (Saunders 2010, Seraphim et al. in prep.).

O gênero Stalachtis

Stalachtis é um gênero de borboletas que ocorre na América Central e do Sul,

sendo portanto restrita à região Neotropical. Todas as espécies do gênero Stalachtis apresentam padrões aposemáticos, e participam de anéis miméticos com outras espécies de borboletas (Seitz 1916–20, D'Abrera 1994). O gênero possui sete espécies descritas atualmente (Callaghan & Lamas 2004), entretanto já foram reconhecidas até 10 espécies dentro de Stalachtis. Isso demonstra uma certa incerteza taxonômica, em especial no caso de espécies previamente sinonimizadas por Stichel (1910-11) e Callaghan & Lamas (2004).

Bates em 1861, propôs uma subfamília dentro de Erycinidae, chamada Stalachtinae. A característica que definia essa subfamília era a presença de uma “pupa não achatada inferiormente, firmemente fixadas pela cauda em uma posição inclinada, sem cinta”, entretanto o próprio Bates em 1868 descobriu que esses caracteres não eram informativos para a classificação taxônomica das subfamílias em Riodinidae (Hall 2006). E mais recentemente, Callaghan (1985) mostrou que a pupa de Stalachtis susanna possui sim uma cinta.

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Já a tribo Stalachtini foi definida por Stichel (1910-11), que inclui apenas o gênero

Stalachtis, assim como Bates (1861). Stichel definiu duas seções dentro do grupo, sendo

a primeira chamada “Adiorati” e dividida em dois subgrupos assim constituídos: 1) S.

calliope (Linnaeus, 1758) e S. magdalena Westwood, 1851; e 2) S. phlegia (Cramer, 1779), S. susanna (Fabricius, 1787) (que foi sinonimizada com S. phlegia) e S. euterpe (Linnaeus,

1758). A segunda seção foi denominada “Diaphanes”, e incluia S. phaedusa (+ S. zephyritis (Dalman, 1823), sinonimizada com S. phaedusa) e S. lineata (Guérin-Méneville, [1844]).

Em 1987, Harvey definiu uma sinapomorfia para a tribo: a presença de um tufo de cerdas longas em torno da margem posterior do oitavo segmento abdominal nos machos (muitas vezes também presente nas fêmeas). Foi sugerido que essas cerdas modificadas tenham uma função de defesa, pois são presentes tanto em machos quanto fêmeas (Müller 1877, Hall & Harvey 2002), entretanto não foram feitos estudos aprofundados sobre essas cerdas ou suas funções em Stalachtis. Hall e Harvey em 2002 mostraram a presença de escamas androconiais pretas na face dorsal das asas posteriores dos machos da sub-espécie Stalachtis phaedusa zephyritis (Dalman,1823), as escamas androconiais têm função de liberar odores ou ferômonios que modificam o comportamento das fêmeas (Hall 2002).

Outra característica que diferencia as Stalachtis de outros riodinídeos ocorre nas asas posteriores, as veias Rs e a M1 se iniciam unidas na célula discal, enquanto que na maioria dos riodinídeos essa veias são separadas (Harvey 1987, Bates 1868, Stichel 1910– 11). A figura I-1 (adaptada de Harvey, 1987) mostra o padrão de venação alar de S.

susanna. Entretanto, essa característica também ocorre em Hamearinae e nos gêneros Corrachia (Corrachiinae) e Styx (Styginae), grupos de riodinídeos filogeneticamente

distantes de Stalachtis, por isso presume-se que esse caráter em Stalachtis seja uma homoplasia (Harvey 1987).

As lagartas de Stalachtis são gregárias e se alimentam de plantas da família Simaroubaceae (Callaghan 1985), entretanto na literatura já surgiram registros de outras plantas hospedeiras, tais como Sapotaceae (Harvey 1987) e Andira sp. (Leguminosae) (Callaghan 1985), porém esses registros possivelmente são má identificação taxonômica da planta hospedeira (Kaminski, com. pess.). As plantas da família Simaroubaceae apresentam fitoquímicos tóxicos e de sabor amargo (Alves 2014), sugerindo que as lagartas de Stalachtis podem ser impalatáveis. Kaminski et al. (in prep.), encontraram

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evidências de mirmecofilia em Stalachtis phlegia e Stalachtis lineata, enquanto que Callaghan em 1985 não encontrou formigas junto com os indivíduos de Stalachtis phlegia

susanna. Não existem informações sobre mirmecofilia para outras espécies do gênero.

Entretanto, é importante ressaltar que muitas das borboletas da tribo Nymphidiini são mirmecófilas (DeVries 1997), e essa seria uma característica em comum entre Nymphidiini e Stalachtini (considerendo-se que Stalachtini é parte de Nymphidiini).

Callaghan em 1985 verificou que as lagartas de S. susanna sem alimento empuparam antes do tempo esperado e quando os adultos emergiram eram menores do que aqueles que tiveram acesso normal ao alimento. Esse fenômeno pode explicar a grande variação no tamanho de borboletas adultas encontradas no gênero, sendo que indivíduos “anões” já foram encontrados para a maioria das espécies, e até nomeados (como S. susanna pygmaea descrita por d’Almeida 1922).

Hall e Willmott (2000) fizeram um estudo sobre a alimentação de borboletas adultas Riodinidae no Equador. Nele, as borboletas estudadas do gênero Stalachtis apresentaram a maior área alar por volume do tórax entre todos os riodinídeos. Essa alta proporção está relacionada com borboletas que voam devagar, como já foi descrito para

Stalachtis phlegia susanna (Callaghan 1986), e que provavelmente tem uma menor taxa

metabólica enquanto voam. Em geral, esse grupo de borboletas vive no sub-bosque e não possuem grandes áreas territoriais. Além disso, essa alta taxa área alar: volume torácico está relacionada com os riodinídeos aposemáticos ou miméticos como:

Ithomiola (incertae sedis), Themone (Riodinini), Pheles (Riodinini), Xynias, Mesene

(Symmachiini), e Stalachtis (Stalachtini).

A figura I-2 apresenta exemplares das espécies de Stalachtis obtidas para ilustrar a diversidade de padrões alares encontrados dentro do gênero. Atualmente são reconhecidas 7 espécies no gênero com suas 19 subespécies (Callaghan & Lamas 2004, Warren et al. 2013), o tipo do gênero foi definido por Hemming (1967) que escolheu

Stalachtis phaedusa (Hübner, [1813]):

Stalachtis Hübner, 1818  Nerias Boisduval, 1836

Stalachtis calliope (Linnaeus, 1758) (Papilio)

5  eugenia (Cramer, 1777) (Papilio)  f. crocota Stichel,1911

 f. terpsichore Seitz, 1917  f. melini Bryk, 1953

Stalachtis calliope bicoler Staudinger, [1887]  calliope var. bicolor Staudinger, 1888

Stalachtis calliope voltumna Stichel, 1911  f. picturata Stichel, 1911

Stalachtis magdalena (Westwood, [1851])

Stalachtis magdalena magdalena (Westwood, [1851]) Stalachtis magdalena cleove Staudinger, 1888

Stalachtis phlegia (Cramer, 1779) (Papilio)

Stalachtis phlegia phlegia (Cramer, 1779) (Papilio)

Stalachtis phlegia nocticoelum Seitz, 1917

Stalachtis phlegia phlegetontia (Perty, 1833) (Acraea)  phlegia f. irion Seitz, 1917

 phlegia coronis Stichel, 1929

Stalachtis phlegia susanna (Fabricius, 1787) (Papilio)  meriana (Eschscholtz, 1821) (Mechanitis)

 ab. pygmaea d’Almeida, 1922

Stalachtis phlegia venezolana Seitz, 1917 Stalachtis euterpe (Linnaeus, 1758) (Papilio)

Stalachtis euterpe euterpe (Linnaeus, 1758) (Papilio)

Stalachtis euterpe adelpha Staudinger, 1888 Stalachtis euterpe latefasciata Staudinger, 1888 Stalachtis phaedusa (Hübner, [1813]) (Nëreis [sic])

Stalachtis phaedusa phaedusa (Hübner, [1813]) (Nëreis [sic])

Stalachtis phaedusa duvalii (Perty, 1833) (Heliconius)  phaedusa var. egaensis H. W. Bates, 1861

Stalachtis phaedusa exul Seitz, 1917

Stalachtis phaedusa phaloe Staudinger, [1887]  phaedusa f. vidua Stichel, 1916

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Stalachtis phaedusa trangeri Schaus, 1928

Stalachtis phaedusa zephyritis (Dalman, 1823) (Papilio)  margarita (C. Felder & R. Felder, 1865) (Nerias)

 evelina Butler, 1870

Stalachtis lineata (Guérin-Méneville, [1844]) (Nerias)  trailii Butler, 1877

 f. boyi Stichel, 1925

Stalachtis halloweeni Hall, 2006

Em vermelho estão as sinonímias.

Hall (2006) propôs uma hipótese filogenética para o gênero com base em caracteres morfológicos de asa e genitália masculina. Neste trabalho, S. phlegia foi sugerida como sendo espécie irmã de todas as outras, devido as características da genitália e da asa consideradas plesiomórficas. Adicionalmente, S. calliope e S.

magdalena foram consideradas espécies irmãs com base na similaridade de padrão alar

e das genitálias masculinas. As espécies Stalachtis euterpe, S. phaedusa e S. lineata foram agrupadas em um clado com base também no padrão alar (o padrão raiado), com S.

phaedusa e S. lineata consideradas espécies irmãs por apresentarem esse padrão mais

similar. Finalmente, S. halloweeni foi posicionada como grupo irmão do clado acima. Baseado nessa hipótese, Hall (2006) definiu três grupos dentro de Stalachtis: 1) o “grupo

phlegia”, constituído apenas por S. phlegia; 2) o “grupo calliope”, para S. calliope e S. magdalena; e 3) o “grupo euterpe”, constituído por S. halloweeni, S. euterpe, S. phaedusa

e S. lineata. Para efeitos de comparação, a figura I-3 mostra dois cladogramas um representando a organização de Stichel (1910-1911) e outro para a hipótese de Hall (2006).

Stalachtis e o Mimetismo

Em 1862, H. W. Bates publicou um artigo clássico sobre mimetismo, no qual ele demonstrou a semelhança nos padrões de coloração ou em voo, entre borboletas

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amazônicas não aparentadas. Neste estudo, foi sugerido que algumas borboletas poderiam imitar os padrões de coloração de outras espécies que tivessem características desagradáveis (impalatáveis), sendo que as primeiras enganariam assim seus predadores, ganhando uma vantagem óbvia sobre as não imitadoras (menor taxa de predação). Assim o mimetismo seria uma adaptação dos organismos ao ambiente que permitiria uma maior sobrevivência, mostrando como a seleção natural pode agir selecionando caracteres morfológicos adaptativos (Joron 2008).

Ainda que muitos estudos sobre o mimetismo batesiano tenham sido realizados após Bates, poucos estudos de campo conseguiram efetivamente demonstrar a proteção que o mimetismo batesiano confere contra predadores (Jeffords et al. 1979). Por outro lado, muitos estudos mostraram que predadores que experimentaram modelos impalatáveis aprendem a evitar mímicos palatáveis (Brower 1958, Platt et al. 1971). Um ponto importante é que a eficiência do mimetismo batesiano é dependente da abundância dos modelos e mímicos, sendo que o mímico deve ser mais raro que o modelo (Ruxton et al. 2004).

Dezesseis anos depois de Bates publicar seu artigo, Müller (1878) publicou uma explicação sobre a presença de diversas espécies impalatáveis que vivem juntas e apresentam o mesmo padrão de coloração: espécies impalatáveis não aparentadas também poderiam convergir para um mesmo padrão aposemático para dividir os custos do aprendizado do predador, ou seja, o predador teria que aprender menos padrões, consequentemente o aprendizado dele seria mais rápido, de forma que menos indivíduos seriam atacados das duas espécies co-miméticas.

Vários estudos com borboletas neotropicais provaram em campo que há benefício em manter o mesmo tipo de coloração em espécies impalatáveis. Um dos primeiros estudos nessa linha foi o trabalho de Benson (1972) na Costa Rica com a espécie Heliconius erato. Seguem-se a este o importante trabalho de Mallet e Barton (1989), com diferentes formas de H. erato, e o experimento de Kapan (2001) com as formas amarela e branca de H. cydno e os seus co-modelos amarelo (H. eleuchia) e branco (H. sapho). Embora o mimetismo batesiano e o mülleriano sejam geralmente considerados fenômenos diferentes, é importante ressaltar que essa divisão pode ser artificial, como sugerem alguns trabalhos que propõem o mimetismo quasi-Batesiano, que mostram que existe um espectro de palatabilidade entre os indivíduos (Turner 1984,

8 Huheey 1988, Speed & Turner 1999).

Para definir formalmente o mimetismo, Vane-Wright (1980) propôs uma definição ampla separando mimetismo da camuflagem (uma adaptação que é muitas vezes confundida com o mimetismo). No trabalho acima, mimetismo foi definido como envolvendo um organismo (doravante mímico), o qual simula algum sinal de um outro organismo (o modelo), sendo que esse sinal deve ser importante para um terceiro organismo (o operador). Assim o mímico tem sua adaptabilidade aumentada, pois o operador o confunde com o modelo. A camuflagem é definida como a simulação de algo desinteressante ao operador, o que permite ao organismo camuflado passar despercebido.

O exemplo mais estudado de mimetismo mülleriano é a similaridade entre as borboletas impalatáveis do gênero Heliconius e da subtribo Ithomiini (Nymphalidae: Danainae) na América do Sul. Nesse gênero ocorrem várias formas e espécies que se assemelham entre si localmente. Esses conjuntos de borboletas são chamados de “anéis miméticos”, sendo que nos neotrópicos existem diversos anéis diferentes, os mais comuns sendo o ‘tigrado’, o ‘vermelho’, o ‘azul’, o ‘laranja’, o ‘transparente’ e o ‘verde’ (Papageorgis 1975, Mallet & Gilbert, 1995, Beccaloni 1997) Esses anéis contêm além de borboletas Heliconius, outras espécies de lepidópteros e até outras ordens de insetos (Beccaloni 1997).

DeVries (1997) sugere que muitas borboletas da família Riodinidae participem de anéis miméticos, sendo elas tanto modelos impalatáveis quanto mímicos palatáveis, embora poucos estudos rigorosos sobre mimetismo em riodinídeos tenham sido feitos até agora. O gênero neotropical Stalachtis apresenta algumas características típicas de borboletas miméticas: os adultos são aposemáticos, possuem voo lento e são acompanhados localmente por outras espécies de lepidópteros com padrões alares similares. Como exemplo, as espécies S. calliope e S. magdalena apresentam padrão tigrado similar ao de diversos itomíneos e heliconíneos simpátricos a estas (D’Abrera 1994). Outras espécies como S. euterpe, S lineata e S. phaedusa têm asas raiadas com listras pretas em fundo branco ou azul claro, ou mesmo transparentes, similar ao padrão encontrado em diversos Ithomiini de subbosque. Kaye (1904) mostrou um anel mimético em Potaro Road, na Guiana, no qual participavam diversos itomíneos transparentes, algumas mariposas Dioptinae (Lepidoptera: Noctuoidea: Notodontidae), e também

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Stalachtis phaedusa e S. evelina (esta última sinonimizada com S. phaedusa). Finalmente,

o padrão laranja e preto com pontos brancos de S. phlegia é imitado por riodinídeos do gênero Lemonias (L. sontella e L. stalachtioides) em áreas de cerrado aberto, configurando um possível caso de mimetismo (D’Abrera 1994).

Bates já sugeria que muitas borboletas amazônicas deveriam ser miméticas do gênero Stalachtis, incluindo Ithomeis aurantiaca mimica H. Bates, 1862 (Riodinidae) que possui cores muito parecidas com S. euterpe, e Dismorphia theucharila lysinoe (Hewitson, [1853]) (Pieridae) que deveria quando em voo, imitar Stalachtis phaedusa duvalii (Perty, 1833). Também foi reportada a semelhança entre a rara Eueides lampeto lampeto H. Bates, 1862 (Nymphalidae: Heliconiinae) e a comum S. calliope. A maioria dos exemplos de mimetismo apresentados por Bates tinham como modelo espécies de itomíneos, entretanto esses exemplos com modelos do gênero Stalachtis chamaram a atenção de Bates, pois mostravam que o padrão de coloração do mímico depende principalmente da localidade, sendo que a borboleta modelo poderia variar até de família de acordo com a região.

Ainda que a natureza do mimetismo de Stalachtis não seja conhecida, algumas evidências apontam para estas como modelos impalatáveis. Uma evidência é o gregarismo das lagartas de S. phlegia e S. susanna, as quais se alimentam de plantas hospedeiras da família Simaroubaceae que sabidamente possuem compostos secundários tóxicos (Callaghan 1985, Hall 2006). Outra evidência (já citada acima) é o voo lento de todas as espécies conhecidas (Callaghan 1986), um comportamento típico de borboletas impalatáveis. Por fim, o fato de que muitas espécies são localmente abundantes (incluindo a rara e localizada S. halloweeni) se encaixa com a possibilidade de que estas sejam modelos.

Como apresentado até aqui, existe muito pouca informação sobre o gênero

Stalachtis em todos os níveis (ecologia, taxonomia e história natural). Por isso, o primeiro

objetivo do presente trabalho é esclarecer as relações filogenéticas dentro de Stalachtis. Com isso poderemos rever a taxonomia e as sinonimizações específicas feitas, mantendo a taxonomia adequada à evolução do gênero. Com a hipótese filogenética produzida, será possível se propor uma hipótese para a evolução dos padrões de coloração aposemáticos dentro de Stalachtis, avaliando se as espécies mais próximas possuem o mesmo padrão filogenético – ou seja, o padrão evoluiu apenas uma vez – ou se não há relação entre os

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padrões aposemáticos e a filogenia – os padrões similares são convergentes.

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Figuras

Figura I-1. Desenho adaptado de Harvey (1987) da asa de Stalachtis susanna com a nomenclatura proposta por Miller (1970).

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Figura I-3. Filogenias para o gênero Stalachtis, primeiro a classificação de Stichel (1910-1911) e o segundo apresentando a hipótese filogenética de Hall (2006).

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CAPÍTULO ÚNICO

FILOGENIA MOLECULAR E DELIMITAÇÃO DAS ESPÉCIES DO GÊNERO

S

H

,

1818

(L

:

R

)

I

Atualmente, Stalachtis Hübner, 1818 é o único gênero da tribo Stalachtini, dentro da subfamília Riodininae (Riodinidae) (Callaghan & Lamas 2004). Todas as espécies do gênero Stalachtis apresentam padrões aposemáticos, e participam de anéis miméticos envolvendo outras espécies de lepidópteros (Seitz 1916–20, D'Abrera 1994). O gênero possui sete espécies descritas atualmente (Callaghan & Lamas 2004), entretanto já foram reconhecidas até 10 espécies dentro de Stalachtis (Hall 2006).

O gênero Stalachtis ocorre desde o Panamá até o sudeste do Brasil, sendo restrito à região Neotropical. Ele foi caracterizado pela presença de um tufo de longas cerdas em volta da margem posterior do oitavo segmento abdominal nos machos (Harvey 1987). As lagartas conhecidas de Stalachtis são gregárias e se alimentam de plantas da família Simaroubaceae (Callaghan 1986) que apresentam fitoquímicos tóxicos e de sabor amargo (Alves 2014), sugerindo que as lagartas de Stalachtis poderiam ser impalatáveis. Desde Bates (1861), já existem trabalhos que sugerem que as borboletas do gênero Stalachtis seriam modelos miméticos impalatáveis (Seitz 1916–20, D'Abrera 1994), mas esse fato carece de comprovação.

As borboletas desse gênero apresentam um certo grau de variação nos padrões alares dentro das espécies, por isso, mesmo sendo um gênero pequeno de riodinídeos, 19 subespécies são reconhecidas para Stalachtis (Callaghan & Lamas 2004, Warren et al. 2013), sendo que algumas dessas foram descritas originalmente como espécies. Este é o caso de Stalachtis phlegia susanna (Fabricius, 1787) e Stalachtis phaedusa zephyritis (Dalman, 1823). Além disso, algumas espécies foram sinonimizadas como o caso de

Stalachtis terpsichore Seitz, 1917 que atualmente é um sinônimo de Stalachtis calliope calliope (Linnaeus, 1758) (Callaghan & Lamas 2004). Esses exemplos mostram que apesar

de ser um gênero pequeno e relativamente bem conhecido, ainda existem questões básicas taxonômicas a serem investigadas em Stalachtis.

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O primeiro trabalho taxonômico sobre Stalachtis foi publicado em 1861 (Bates 1861), no qual o autor propôs uma subfamília dentro de Erycinidae (= Riodinidae), chamada Stalachtinae. Esta subfamília foi proposta com base em características da pupa que o próprio autor posteriormente indicou como não informativos para classificação de Riodinidae (Bates 1867-1868, Hall 2006). Após esse primeiro estudo, Stichel (1910-11) definiu a tribo Stalachtini, contendo apenas o gênero Stalachtis, assim como Bates (1861).

No trabalho mais recente sobre Stalachtis, Hall (2006) descreveu uma nova espécie - Stalachtis halloweeni - além de propor uma hipótese filogenética baseada em caracteres das asas e da genitália masculina para o gênero. Nessa hipótese, ele dividiu o gênero em três grupos: 1) grupo “phlegia” composto apenas pela espécie S. phlegia, 2) grupo “calliope” para S. calliope e S. magdalena, e 3) grupo “euterpe” composto por S.

euterpe, S. phaedusa, S. lineata e S. halloweeni.

Ainda não existe uma filogenia formal proposta para Stalachtis, e filogenias moleculares são ótimas ferramentas para resolver problemas taxonômicos em grupos pouco conhecidos (Damm et al. 2010). Mais ainda, marcadores moleculares têm sido amplamente utilizados para identificação de novas espécies de borboletas (alguns exemplos são: Burns et al. 2013, Aguila et al. 2013, Seraphim et al. 2014). Por isso, o objetivo desse trabalho é inferir uma hipótese filogenética molecular adequada para o gênero, que também poderá ser usada para delimitar as espécies descritas.

Entre os animais, um dos marcadores mais utilizados para identificação e delimitação de espécies é a porção 5’ do gene mitocondrial citocromo oxidase sub-unidade I (COI) – a “região barcode”. Hebert et al. (2003) propuseram o uso desse marcador devido a região ser codificante de uma proteína com a sequência de aminoácidos razoavelmente conservada, e por possuir diferenças suficientes para separar espécies próximas, com a premissa que a variação intraespecífica nesta região seria menor que aquela entre espécies (Hebert et al. 2003 e 2004).

Desde então, a região barcode têm sido utilizada como marcador molecular em muitos trabalhos taxonômicos e filogenéticos, entretanto existe um grande debate e críticas com relação a utilização e eficiência deste marcador como delimitador e identificador de novas espécies (Williams & Knowlton 2001, Meyer & Paulay 2005, Brower 2006, Hickerson et al. 2006, Wiemer & Fiedler 2007, Townzen et al. 2008, Brower

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2010). É importante ressaltar que para borboletas em particular e Lepidópteros em geral, as revisões mais recentes mostram o uso da região barcode – aliada com outros marcadores ou caracteres morfológicos – como uma ferramenta adequada para a identificação de espécies e para estudos de sistemática molecular (Silva-Brandão et al. 2009). Atualmente a forma mais aceita de se delimitar e descrever espécies é o uso de várias fontes de evidências – morfológicas, ecológicas, biogeográficas, reprodutivas e genéticas – na delimitação de espécies, denominada taxonomia integrativa (DeSalle et al. 2005, Dayrat 2005, Will et al. 2005, Padial et al. 2010). Visto isso, esse trabalho propõe o uso de caracteres tanto morfológicos quanto moleculares para delimitar as espécies de

Stalachtis.

Nessa conjuntura, esse trabalho tem como objetivo propor uma filogenia para as espécies do gênero Stalachtis com base em marcadores moleculares – o gene COI e três genes nucleares. Como esse é o primeiro estudo desse tipo para Stalachtis, nossos objetivos específicos são: 1) inferir uma hipótese filogenética molecular para o gênero; 2) avaliar se o gênero é monofilético; e 3) investigar a distribuição geográfica das espécies do gênero. Com esses dados, podemos testar os grupos propostos baseados em caracteres morfológicos por Hall (2006) para o gênero Stalachtis. Além do estudo filogenético proposto, será avaliada a variabilidade genética das espécies do gênero

Stalachtis e será proposta uma classificação das espécies do gênero com base nas

evidências moleculares, biogeográficas e morfológicas.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem taxonômica

Foram obtidos 100 indivíduos adultos de todas as sete espécies descritas para o gênero, representando pelo menos 10 subespécies (Tabela II-1). Os padrões alares dos indivíduos foram comparados com as fotos dos tipos das espécies no site “Illustrated lists of American butterflies” (Warren et al. 2013) além dos tipos encontrados no museu de História Natural de Londres, Inglaterra (BMNH). Assim foi possível uma identificação morfológica das subespécies presentes.

Todos os indivíduos coletados foram armazenados em freezer a -20 °C até o

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DNA total. Após a obtenção do DNA, todos os indivíduos foram montados e receberam um código único de identificação, sendo depois depositados no Museu de Zoologia da Universidade Estadual de Campinas, Unicamp, Campinas, São Paulo (ZUEC) como material testemunho. Material adicional também foi obtido das seguintes coleções: ZUEC-AVLF - Coleção André V. L. Freitas, UFMG - Coleção Entomológica da Universidade Federal de Minas Gerais, e DZUP - Departamento de Zoologia da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná. Algumas das amostras procedentes da Colômbia estão depositadas no “Museo Entomológico Francisco Luis Gallego” (UNCM— Universidad Nacional de Colombia) em Medellín, na Colômbia.

Tabela II-1. Dados de coleta dos indivíduos de Stalachtis utilizados.

Extração Espécie Coletor Localidade

BLU-164 Stalachtis calliope AVL Freitas Foz do Acúria, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-165 Stalachtis calliope AVL Freitas Foz do Breu, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-166 Stalachtis euterpe AVL Freitas Foz do Breu, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-167 Stalachtis euterpe AVL Freitas Foz do Breu, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-168 Stalachtis phlegia LA Kaminski Porto de Moz – PA

BLU-169 Stalachtis phlegia LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-170 Stalachtis phlegia LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-171 Stalachtis phaedusa LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-172 Stalachtis phaedusa LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-173 Stalachtis lineata LA Kaminski Porto de Moz – PA

BLU-175 Stalachtis phlegia AVL Freitas Mata do Jiqui Parnamirim, Natal - RN BLU-176 Stalachtis phlegia AVL Freitas Mata do Jiqui Parnamirim, Natal - RN BLU-182 Stalachtis euterpe D Dolibaina Mâncio Lima – AC

BLU-183 Stalachtis euterpe D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-184 Stalachtis euterpe D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-185 Stalachtis calliope D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-186 Stalachtis calliope D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-228 Stalachtis phlegia M Uehara-Prado Aragão, Paranaíta – MT BLU-229 Stalachtis lineata M Uehara-Prado Nilo, Paranaíta – MT BLU-253 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Caraça, Catas Altas - MG BLU-254 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Caraça, Catas Altas - MG BLU-255 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Caraça, Catas Altas - MG BLU-306 Stalachtis phlegia LA Kaminski Serra do Amolar, Cáceres – MS BLU-307 Stalachtis phlegia M Uehara-Prado Três Lagoas – MS BLU-347 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-348 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-349 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-350 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA

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BLU-351 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-352 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-353 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-354 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-355 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-356 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-357 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-358 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-359 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-360 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-361 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-362 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-363 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-364 Stalachtis terpsichore DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-365 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-386 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-387 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-388 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-389 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-437 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-438 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-439 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-440 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-441 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA

BLU-443 Stalachtis euterpe AVL Freitas Pq. Nac. Serra do Divisor, Mâncio Lima - AC BLU-458 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-459 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-460 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-461 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-473 Stalachtis calliope KS Brown Alto do Cristalino, Alta Floresta - Mt BLU-491 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-492 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-503 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-504 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-505 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-506 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-507 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-508 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-509 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-513 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-514 Stalachtis terpsichore DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-515 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-516 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Rola-Moça, Ibirité - MG BLU-517 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Rola-Moça, Ibirité - MG

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BLU-518 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Rola-Moça, Ibirité - MG BLU-519 Stalachtis phlegia LA Kaminski Pq. Nac. da Chapada dos Guimarães,

Chapada dos Guimarães – MT BLU-520 Stalachtis phlegia LA Kaminski Est. Eco. Serra das Arararas, Cáceres - MT BLU-521 Stalachtis phlegia LA Kaminski Panamirim, Natal – RN

BLU-537 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-538 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-539 Stalachtis terpsichore DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-540 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-611 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-647 Stalachtis sp. K Willmott Morona-Santiago, Macas - Equador

BLU-648 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA

BLU-649 Stalachtis lineata R Rogner Oriximiná – PA

BLU-650 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA

BLU-651 Stalachtis phlegia R Rogner Pto Parada, Lagoa Seca, Manaus - AM BLU-652 Stalachtis euterpe R Rogner Rio Tapajós, Itaituba - PA

BLU-653 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA

BLU-654 Stalachtis lineata R Rogner Oriximiná – PA

BLU-655 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA

BLU-656 Stalachtis calliope R Rogner Reserva da Campina, Manaus - AM

BLU-657 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA

BLU-673 Stalachtis susanna KS Brown Pindamonhangaba - SP

BLU-691 Stalachtis phlegia LA Kaminski Mata do Jiqui Parnamirim, Natal - RN BLU-692 Stalachtis susanna G Acácio Reserva Biológica de Uma - BA BLU-693 Stalachtis phlegia E Araújo Fazenda Buritirana, Peri Mirim - MA BLU-694 Stalachtis phlegia E Araújo Fazenda Buritirana, Peri Mirim - MA BLU-695 Stalachtis phlegia E Araújo Fazenda Buritirana, Peri Mirim - MA BLU-698 Stalachtis halloweeni M Costa Serra de Lema, Bolivar - Venezuela BLU-699 Stalachtis halloweeni M Costa Serra de Lema, Bolivar - Venezuela BLU-704 Stalachtis susanna KS Brown Serra Grande, Uruçuca - BA

Técnicas moleculares

O DNA genômico total foi extraído utilizando três kits de extração diferentes. Nas primeiras amostras extraídas, até março de 2014, foi utilizado o kit e o protocolo do

Invisorb Spin Tissue Mini Kit, e para as amostras extraídas mais recentemente o kit illustra tissue and cells genomic Prep Mini Spin Kit da GE foi utilizado, enquanto que o kit DNeasy Blood & Tissue Kit da Qiagen foi utilizado para amostras de exemplares mais antigos ou

de museus. O uso de kits para a extração de DNA é comum entre os estudos moleculares com borboletas (Wahlberg et al. 2003). O DNA purificado foi armazenado em tampão TE a – 20 °C.

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Quatro marcadores moleculares foram utilizados neste estudo: um gene mitocondrial, citocromo oxidase sub-unidade I (COI) (1.500 pares de bases (pb)), e três genes nucleares codificantes de proteínas; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (691 pb), o domínio proteico da carbamoil-fosfato sintase (CAD) (803 pb) e a proteína ribossomal S5 (RPS5) (613 pb). Esses quatro marcadores foram escolhidos por serem amplamente utilizados em estudos filogenéticos com borboletas (Leneveu et al. 2009, Kondaramaiah & Wahlberg 2009). A tabela II-2 exibe os primers utilizados para cada gene nas reações de amplificação. Os primers para os genes nucleares e a segunda metade do COI têm adicionado as caudas universais T7 (Direto) e T3 (Reverso), apresentadas na tabela. Isso permite que o sequenciamento seja feito utilizando as caudas independente do marcador, facilitando a reação de sequenciamento. Os primers aqui utilizados e os seus protocolos foram descritos em Wahlberg & Wheat (2008).

As reações de PCR para a amplificação da região terminal 5’ do COI (região de aproximadamente 640pb chamada de DNA Barcode) foram padronizadas para um volume final de 25μL. A soluções continham 14,3μL de H2O milli-q, 2,5μL de solução tampão (500 mM KCl), 0,5μL de DNTPs com a concentração final de 40μM, 2,5μL de BSA (0,5mg/mL), 2μL de MgCl2 (2mM), 0,5μL de cada primer (5pMol), 0,2μL de Taq DNA-Polimerase (Invitrogen) (1U) e 2 μL do DNA extraído. A amplificação no termociclador era iniciada por 95°C por 5 minutos, depois 35 ciclos com três temperaturas, sendo elas 94°C por 30 segundos, 45°C por um minuto e 72°C por um minuto e meio, após os ciclos uma extensão final de 72°C por 10 minutos era feita.

Para os genes nucleares GAPDH e RPS5 e para a segunda região do gene COI, as reações de PCR foram padronizadas para um volume final de 20μL. As soluções continham 9,6μL de H2O, 2,0μL de solução tampão (500 mM KCl), 1,0μL de DNTPs (40μM), 2,0μL de BSA (0.5mg/mL), 1,2μL de MgCl2 (2mM), 0,4μL de cada primer (0.2pMol), 0,4μL de Taq DNA-Polimerase (Invitrogen) (2U) e 3 μL do DNA extraído. O programa no termociclador era iniciado por 95°C por 5 minutos, depois 35 ciclos com três temperaturas, sendo elas 94°C por 30 segundos, 52°C por um minuto (50° C para a segunda metade do COI) e 72°C por um minuto e meio, após os ciclos uma extensão final de 72°C por 10 minutos era feita.

Para o gene CAD, a reação de PCR tinha um volume final de 20μL. As soluções continham 9,1μL de H2O, 2,0μL de solução tampão NH4, 1,6μL de DNTPs, 2,4μL de MgCl2

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(4mM), 0,8μL de cada primer (0,4pMol), 0,3μL de Taq DNA-Polimerase (Invitrogen) (1,5U) e 3μL do DNA extraído. O programa da reação foi 95° C por 5 minutos, 40 ciclos de três temperaturas sendo elas, 95°C por 45 segundos, 55°C por um minuto, 72°por um minuto e meio e uma extensão final de 10 minutos a 72°.

Para verificar o resultado das reações foi feita uma eletroforese em gel de agarose 1%, utilizando 3 μL de cada reação de PCR corado com uma solução de azul de metileno e GelRed™ (Biotium). O produto final dos PCRs foi purificado com dois protocolos diferenciados, para o COI e para as amplificações com alto rendimento aplicou-se o protocolo Exonuclease-1 e Fast-AP (Werle et al. 1994). Enquanto que para reações com menor rendimento foi empregado o kit illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification da GE de purificação, que permite concentrar a amostra em menor volume.

O sequenciamento foi feito tanto no sentido direto quanto reverso para todos os genes analisados. A reação de sequenciamento possuía um volume final de 3μL do PCR purificado, e 1μL do primer (5mMol). As sequências obtidas foram visualizadas no programa FinchTV (Geozpisa), além disso foram analisadas no programa Geneious versão 6 (http://www.geneious.com, Kearse et al. 2012), as sequências foram alinhadas diretamente no programa BioEdit(Hall 1999), já que todos os marcadores utilizados são genes codificantes de proteínas e apresentam a estrutura de códons conservada (Wahlberg 2014).

Tabela II-2. Lista dos primers desenhador por Wahlberg & Wheat (2008) utilizados para amplificação dos genes neste trabalho.

Gene Nome Sequência 5’-3’

Barcode (COI)

LCO F GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

Nancy-mod R CCTGGTAAAATTAAAATATAAACTTC

HCO R TAAACTTCAGGGTGACCAAAAA ATCA Segunda HybJerry F CAACAYTTATTTTGATTTTTTGG região do COI HybPat R ATCCATTACATATAATCTGCCATA

GAPDH HibFrigga F AARGCTGGRGCTGAATATGT

HibBurre R GWTTGAATGTACTTGATRAGRTC