Síntese e caracterização do poli-{trans- [ru cl2(vpy)4]- estireno–divinilbenzeno} impregnado com nanopartículas de prata e avaliação de suas propriedades anti-sépticas

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LABORATÓRIO DE SÍNTESE INORGÂNICA

SINTESE E CARACTERIZAÇÃO DO Poli-{trans- [Ru Cl

(Vpy)

]-ESTIRENO–DIVINILBENZENO} IMPREGNADO COM

NANOPARTÍCULAS DE PRATA E AVALIAÇÃO DE SUAS

PROPRIEDADES ANTI-SÉPTICAS

Eric Manoel Nunes de Oliveira

Orientador: Prof. Dr. César Vitório Franco

ESTIRENO–DIVINILBENZENO} IMPREGNADO COM

NANOPARTÍCULAS DE PRATA E AVALIAÇÃO DE SUAS

PROPRIEDADES ANTI-SÉPTICAS

Relatório da disciplina QMC 5510 apresentado

ao curso de Química da Universidade Federal de

Santa Catarina para a obtenção do Grau de

Bacharel em Química.

Orientador: Prof. Dr. César Vitório Franco

Florianópolis, dezembro de 2006.

Eric Manoel Nunes de Oliveira

NANOPARTÍCULAS DE PRATA E AVALIAÇÃO DE SUAS

PROPRIEDADES ANTI-SÉPTICAS

Relatório da disciplina QMC 5510 aprovado pela banca examinadora para a obtenção do Grau de Bacharel em Química, no curso de Química da Universidade Federal de Santa Catarina

Florianópolis, Dezembro de 2006

.

BANCA EXAMINADORA

Orientador: Prof. Dr. César Vitório Franco

Prof. Dr. Edson Minatti

Em especial

A minha amada mãe, meu querido avo e meus irmãos e sobrinhos que me deram muita força, sempre me incentivando com carinho e amor.

À minha namorada Camila e toda sua família por todo o apoio.

Ao Prof. Dr. César Vitório Franco, pela oportunidade que me deu de poder trabalhar em uma área tão fascinante, agradeço também por sua dedicação e perseverança com que me orientou.

À Doutoranda Karen Segala e a Doutora Rosilene Linhares Dutra por todo o carinho e dedicação, aos conselhos e puxões de orelha dados, e todas as palavras que me fizeram

crescer muito.

Aos colegas do laboratório de síntese inorgânica.

Ao Prof. Dr. Norberto Gonçalves e Dra. Lúcia Noda pela colaboração para obtenção das análises de espectroscopia Raman

Aos Doutorandos Daniel Borges e Eduardo P. de Souza pelo auxilio nas sínteses e monitoramento de nanopartículas.

A Prof. Dr. Liane Márcia Rossi pelas análises de MET e análises térmicas.

Ao hospital universitário da Universidade Federal de Santa Catarina pelo espaço físico e material cedido.

Aos amigos do curso de química, especialmente ao Eduard, Vitor, Tiago Pacheco, Tiago Artur, Fernando, Luana, Juliana e todos os que fizeram parte dessa jornada.

Ao amigo João Carlos e toda a sua família.

Aos colegas de apartamento Ernani e Ricardo

Aos amigos Ives e Andréia

Ao Conselho Nacional de Pesquisa e desenvolvimento (CNPq) pelo suporte financeiro desta pesquisa.

RESUMO

Neste trabalho está descrito a preparação e caracterização de um filme polimérico impregnado com nanopartículas de prata composto por poli-{trans-[RuCl2(vpy)4 ]-divinilbenzeno- estireno } (onde vpy = 4-vinilpiridina). Este filme foi sintetizado pela polimerização em suspensão não aquosa através da reação química entre o complexo trans-[RuCl2(vpy)4], divinilbenzeno (dvb) e estireno (sty), usando peróxido de benzoíla como iniciador. A morfologia do terpolímero resultante foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As propriedades térmicas foram analisadas por termogravimetria (TGA) e calorimetria diferencial de varredura (DSC). A espectroscopia RAMAN mostrou que a polimerização do grupo vinil do monômero do complexo metálico e os grupos vinílicos dos outros monômeros ocorreu com a incorporação do complexo de rutênio (II) na matriz polimérica. O efeito SERS foi observado nos experimentos de RAMAN e mostram a intensificação da banda do terpolímero contendo nanopartículas de prata. As nanopartículas de prata foram obtidas por redução química usando o borohidreto de sódio (NaBH4) como redutor e citrato de sódio como estabilizador. A dimensão nanométrica foi confirmada através da microscopia de transmissão eletrônica (MET) e monitorada por espectroscopia de UV – visível. Os resultados mostraram um filme com superfície lisa e foi observado um aumento na rugosidade do polímero impregnado com nanopartículas de prata. A atividade antimicrobiana do polímero foi avaliada pelo estudo microbiológico usando os microrganismos Escherichia

coli (ATCC-25922) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e os meios de cultura BHI,

salina e Muller & Hynton. A atividade microbiológica do terpolímero impregnado com nanopartículas de prata foi confirmada pela formação de um halo de inibição do microrganismo nos estudos microbiológicos.

LISTA

DE FIGURAS

Figura 1. Reação de polimerização de poliadição e policondensação Figura 2. Estrutura dos monômeros: (A) estireno e (B) divinilbenzeno

Figura 3. Imagem da síntese do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] via azul de rutênio Figura 4. Estrutura do complexo metálico trans-[RuCl2(vpy)4].

Figura 5. Mecanismo de formação de nanopartículas

Figura 6. Esquema de curvas termogravimétricas típicas: (A) única perda de massa e (B) várias perdas de massa.

Figura 7. Exemplo de uma curva obtida por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Figura 8. Espectro UV - visível de nanopartículas de prata

Figura 9. Micrografia de MET de nanopartículas de prata.

Figura 10. Histograma da distribuição do tamanho das nanopartículas de prata.

Figura 11. Estudo do efeito de temperatura sobre o sistema coloidal de nanopartículas de prata

Figura 12. Teste de estabilidade da solução coloidal de prata com o tempo

Figura 13. Voltamograma cíclico do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] em

acetonitrila-diclorometano 4:1 a uma concentração de 0,1x 10-3 mol L-1, a uma velocidade de varredura de 100 mV.s-1 no sentido anódico.

Figura 14. Espectro UV - visível do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]

Figura 15. Micrografia em MEV do polímero poli{trans[RuCl2(vpy)4]- dvb-sty}, (A) com prata e (B) sem prata.

Figura 16. Difração de Raio-X do polímero com e sem nanopartículas de prata.

Figura 17. Espectro Raman de (a) trans-[RuCl2(vpy)4]; (b) poly-{trans [RuCl2(vpy)4]} (c) poliestireno; (d) terpolímero 2 (sem Ag); (e) terpolímero 1 (com Ag), na região de 300-1800 cm-1.

Figura 18. Espectro Raman de (a) trans-[RuCl2(vpy)4]; (b) poli-{trans [RuCl2(vpy)4]} (c) poliestireno; (d) terpolímero 2 (sem Ag); (e) terpolímero 1 (com Ag)

Figura 19. TG/DTG e DSC em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1) e aquecimento do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-dvb-sty}(sem prata).

Figura 20. TG/DTG e DSC em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1) e aquecimento do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]- dvb-sty}(com prata).

Figura 21. Teste microbiológico realizado com o polímero poli{trans[RuCl2(vpy)4]- dvb-sty}, com prata impregnada (A), e sem prata impregnada (B)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Freqüências em Raman (cm-1) de trans [RuCl2(vpy)4], poliestireno, poli-{trans [RuCl2(vpy)4]} e terpolímero 1 (com Ag) e terpolímero 2 (sem Ag), na região acima de 900 cm-1.

LISTA DE ABREVIATURAS

sty – estireno.

dvb – divinilbenzeno.

MEV - microscopia eletrônica de varredura. TGA – termogravimetria.

DTG – derivada da curva de termogravimetria. DSC - calorimetria diferencial de varredura. MET - microscopia de transmissão eletrônica. UTI - unidades de terapia intensiva.

spr – superfície de plasma ressonante. Tf – temperatura de fusão.

Tc – temperatura de cristalização. Tg – temperatura de transição vítrea. UFC - unidades formadoras de colônias.

SERS – efeito de intensificação de espalhamento por meio de superfície RR – Raman ressonante

HTBA - tetrabutil-amonio hexa-fluorfosfato. BHI – infusão cérebro-coração

LISTA

DE FIGURAS...ii

LISTA DE TABELAS...iv

LISTA DE ABREVIATURAS...v

2.3.3 Polímeros a base de forças de coordenação...6

2.3.4 Monômeros ...7 3. OBJETIVOS ...8 3.1 Objetivos Gerais ...8 3.2 Objetivos Específicos...8 4. MATERIAIS E MÉTODOS...9 4.1 Equipamentos...9

4.2 Reagentes, Microrganismos e meios de cultura utilizados...9

4.3 Métodos de síntese...10

4.3.1 Síntese do monômero trans-[Ru(vpy)4Cl2], via precursor azul de rutênio...10

4.3.2 Síntese de nanopartículas de prata...12

4.3.3 Síntese do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-dvb}...12

4.3.4 Procedimento para impregnação de nanopartículas de prata no polímero...13

4.4 Monitoramento e caracterização de nanopartículas de prata...13

4.4.1 Espectroscopia UV-visível e efeito de superfície de plasma ressonante (SPR)...13

4.4 2.Microscopia eletrônica de transmissão (MET)...14

4.5 Caracterização do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]...14

4.6.1 Microscopia Eletrônica de Varredura...16

4.6.2 Caracterização por espectroscopia RAMAN...16

4.6.3 Análises Térmicas...18

4.6.3.1 Análises termogravimétricas (TGA)...18

4.6.3.2 Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)...19

4.6.4 Estudo microbiológico dos polímeros impregnados com nanopartículas de prata...20

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...21

5.1. Monitoramento e caracterização de nanopartículas de prata...21

5.2 Estudo de estabilidade térmica e dinâmica das nanopartículas de prata...23

5.3 Caracterização do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] ...25

5.3.1 Voltametria cíclica do trans-[RuCl2(vpy)4]...25

5.3.2 Espectroscopia UV-visível do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]...27

5.4 Caracterização do terpolímero poli - {trans[RuCl2(vpy)4]-dvb-sty}...27

5.4.1 Caracterização por MEV...27

5.4.2 Caracterização por espectroscopia RAMAN...29

5.4.3 Caracterização por análises térmicas ...32

5.4.4 Estudo microbiológico...36

6. CONCLUSÕES ...38

7. ARTIGOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS E TRABALHOS APRESENTADOS EM EVENTOS...39

1. INTRODUÇÃO

Macromoléculas são compostos de alta massa molar, entre estes se encontram moléculas de grande importância biológica como hormônios, terpenos e os esteróides. Polímeros são compostos classificados entre as macromoléculas, com a peculiaridade de terem unidades repetitivas ao longo de sua cadeia. O termo “polímero” significa: poli – muitas, mero – parte. Polímeros podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais. Os de origem sintética têm sua formação a partir de uma reação de polimerização, e as unidades que se repetem ao longo de sua cadeia são chamadas de monômeros (1). Nas últimas décadas, uma especial atenção tem sido dedicada a novos materiais resultantes da mistura de um ou mais polímeros com metais de transição (2). Além dos metais de transição incorporados na matriz polimérica existe grande interesse na obtenção de compósitos polímeros metais. Partículas de metais e semicondutores na escala nanométrica têm propriedades ópticas, elétricas, catalíticas e magnéticas bem definidas, que dependem do tamanho e da forma destas partículas (3). A incorporação de prata em matriz polimérica ou como tratamento superficial tem sido proposta visando dar a esses materiais propriedades anti-sépticas e tornando-os atraentes na confecção de dispositivos hospitalares. Todavia o emprego da prata traz problemas devido ao grande tamanho das partículas. A solução para esse problema atualmente está na nanotecnologia que possibilita a produção de nanopartículas de prata com dimensões na escala de nanômetro.

A prata quando dispersa na forma de nanopartículas, suas propriedades são enormemente aumentadas em decorrência da ampliação dos pontos de contato disponíveis. A prata tem um efeito bactericida conhecido desde os primórdios da civilização, e isto ocorre através da assepsia de efeito oligo-dinâmico do íon prata. O íon prata com baixa dosagem atua na atividade celular:

R – S - H + Ag + => R – S - Ag + H+

O radical S - Ag afeta fortemente o crescimento bacteriano, mantendo sua ação constante e permanente (4). O uso da prata como agente antibacteriano teve o seu auge na primeira guerra mundial. Naquela época na ausência de antibióticos se aplicava injeção de prata nos soldados feridos para diminuir a infecção.

É sabido que pelo menos 5% dos pacientes hospitalizados em unidades de terapia intensiva (UTI) adquirem infecções que aumentam a taxa de mortalidade, este tipo de ocorrência é de cinco a dez vezes mais comuns que em outras enfermarias já que os pacientes possuem monitoramento cardiovascular, cateteres vesicais e intravasculares. Os cateteres são

indispensáveis na prática da medicina moderna, porem apresenta um risco de infecção local bastante grande. A magnitude do potencial dos cateteres venosos centrais para causar morbidade e mortalidade devido a complicações infecciosas foi estimada em vários estudos (5).

Estudos realizados estimaram que são utilizados 15 milhões de cateteres venosos centrais por ano somente em unidades de terapia intensiva nos Estados Unidos (5). Se, em média, a taxa de infecção da corrente sangüínea associada a cateter venoso central é 5,3/1000 cateteres-dia na UTI (6), aproximadamente 80.000 infecções da corrente sangüínea associadas a cateteres venosos centrais ocorrem a cada ano nos Estados Unidos. A mortalidade atribuída às infecções de corrente sangüínea foi determinada por um não aumento na mortalidade em estudos que controlaram a severidade das doenças (7-9), para 35% do aumento da mortalidade em estudos prospectivos que não fizeram esse controle (10-11). Assim, a mortalidade atribuída continua obscura. O custo atribuído por infecção está estimado entre U$34.508-56.000 (5-12), e o custo anual da assistência a pacientes com cateter venoso central associado à infecção de corrente sangüínea varia entre U$296 milhões e U$2,3 bilhões (13). Um total de 250.000 casos de infecção da corrente sangüínea associada a cateter venoso central foi estimado ocorrer anualmente se fosse realizada uma avaliação do hospital inteiro, ao invés de exclusivamente na UTI. Neste caso a mortalidade atribuída está estimada entre 12-25% para cada infecção, e o custo marginal para o sistema de saúde é de U$25.000 por episódio de infecção (14).

Com todo este cenário, vê-se um grande campo de aplicação de nanopartículas de prata como agente antimicrobiano, impregnada em polímeros que são utilizados na construção de peças utilizadas na medicina, como cateteres e seus introdutores ou cânulas de sucção cirúrgica.

Nesse estudo, usamos um monômero desenvolvido em nosso laboratório, o complexo trans-[RuCl2(vpy)4], para o desenvolvimento de um novo material polimérico.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Nanopartículas de prata

A prata possui uma ação antimicrobiana conhecida há muito tempo, porém na forma de nanopartículas tem uma superfície de contato infinitamente maior e suas propriedades são enormemente aumentadas. A medicina tem demonstrado que a prata destrói mais de 650 organismos patogênicos. Entretanto, partículas de dimensões micrométricas causam a obstrução das membranas celulares, causando envenenamento por prata, conhecido como Argyria (15). Isto não acontece com o uso de partículas de prata em dimensões nanométricas. Essas partículas são tão finamente dispersas e estão em tão baixa concentração que podem circular pelas membranas celulares sem ocasionar danos a organismos superiores, e visto que a concentração efetiva para atuação contra microorganismos é de 0,1 µgL-1 e a concentração tóxica a seres humanos é de 10 mgL-1 _(16).

2.2 Nanocompósitos

Nanocompósitos são mais comumente definidos como sistemas que contêm pelo menos uma característica estrutural com dimensões nanométricas até 150 nm. O interesse em nanocompósitos está associado à melhoria nas propriedades mecânicas e ao desgaste do material. Dispersões de pequenas quantidades de inclusões de zircônio nanométrica em corpo cerâmico de matriz de alumina, por exemplo, propiciam pelo menos um efeito benéfico: inibem o crescimento de grãos durante a sinterização (17). Outros benefícios que podem ser conseguidos com esses materiais são: alta rigidez, alto impacto, baixa densidade, resistência química, baixa permeação de gases, alta estabilidade térmica, propriedades superficiais, condutividade elétrica e térmica, impressão e pintura, dureza, anti-chama.

2.3 Polímeros

Macromoléculas são compostos orgânicos ou inorgânicos de alta massa molar, que têm como constituição básica átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio. Polímeros são compostos macromoleculares que possuem em sua cadeia unidades repetitivas (1). A grande revolução na área de materiais feita durante o século XX foi o desenvolvimento de polímeros. Com este avanço foram criadas fibras sintéticas, resinas artificiais e plásticas. Antes mesmo de se utilizar o

termo polímero, o látex de borracha, a goma arábica, a celulose e outros já eram utilizados. Uma breve revisão histórica pode ser dada assim:

1833 - Introdução do termo polímero; vulcanização da borracha. 1839 – Poli (estireno)

1870 - Celulóide

1927 - Acetato de celulose e PVC.

1930 - Carothers dá início à preparação de poli (ésteres) e poli (amidas); tem também início à produção industrial de poli (acetato de vinila), de polímeros acrílicos, poli (estireno) poli (uretanos), melamina, resinas alquídicas e da borracha sintética poli (butadieno). Apesar do sucesso comercial destes materiais, ainda não se tinha uma idéia definida sobre a sua estrutura. 1953 - O modelo proposto por Staudinger que descrevia os polímeros como cadeias lineares de moléculas ligadas covalentemente (1924) valeram-lhe finalmente o Prêmio Nobel.

1963 - Ziegler e Natta receberam o Prêmio Nobel pelo desenvolvimento de catalisadores de coordenação e respectiva aplicação que permitiram a produção de polímeros estereoregulares. 1974 - Flory recebeu o Prêmio Nobel pelo desenvolvimento da teoria sobre o comportamento de polímeros em solução, bem como o desenvolvimento de métodos matemáticos capazes de descrever e compreender o mecanismo de poli condensação.

1980 - Aparecimento dos cristais líquidos poliméricos.

1990 - O interesse no uso destes materiais por parte das indústrias farmacêutica e das indústrias ligadas a opto e microeletrônica reforça o interesse nesta área científica.

2000 - Novos mecanismos de polimerização abriram mais um grande leque de aplicações.

2.3.1 Classificação de Polímeros

Polímeros podem ser classificados de acordo com o aspecto do material que se deseja analisar, as mais usuais envolvem estrutura química, o método de preparação, as características tecnológicas e o comportamento mecânico.

- Método de preparação: são divididos, em geral por polímeros de adição e polímeros de condensação, conforme ocorra uma simples adição, sem subproduto, ou uma reação em que são abstraídas dos monômeros pequenas moléculas, como HCl, H2O, KCl.

- Características tecnológicas: são à base da classificação dos polímeros termoplásticos e termorrígidos. Os polímeros lineares ou ramificados, que permitem fusão por aquecimento e

solidificação por resfriamento, são chamados termoplásticos. Os polímeros que, por aquecimento ou outra forma de tratamento, assumem estrutura tridimensional, reticulada, com ligações cruzadas, tornando-se insolúveis e infusíveis, são chamados termorrígidos (thermoset).

- Comportamento mecânico: existem três grandes grupos: elastômeros ou borrachas, plásticos e fibras. Borracha ou elastômero é um material macromolecular exibindo elasticidade em longa faixa, à temperatura ambiente. O termo plástico vem do grego, e significa “adequado à moldagem”. Plásticos são materiais que contém, como componente principal, um polímero orgânico sintético e se caracterizam porque, embora sólidos à temperatura ambiente em seu estado final, em alguns estágios a de seu processamento, tornam-se fluídos e possíveis de serem moldados, por ação isolada ou conjunta de calor e pressão. Esse ingrediente polimérico é chamado de resina sintética. Fibra é um corpo que tem uma elevada razão entre o comprimento e as dimensões laterais, e é composto principalmente de macromoléculas lineares, orientadas longitudinalmente (18).

2.3.2 Tipos de polimerização

A estrutura e conseqüentemente as características do polímero são reflexo direto da maneira como a reação de polimerização acontece. As mais comuns são poliadição ou polimerização por etapas (Figura 1) onde o monômero é consumido logo nos momentos iniciais, formando-se dímeros, trímeros entre outros, até que se obtêm cadeias poliméricas. Outro tipo de polimerização é a poli condensação ou polimerização em cadeia onde ocorre formação de longas cadeias logo nos instantes iniciais. Ao longo do tempo o número de cadeias vai aumentando, porém o monômero nunca chega a ser completamente consumido (1).

Figura 1. Reação de poliadição e policondensação.

2.3.3 Polímeros a base de forças de coordenação

A síntese de polímeros com base em forças de ligações coordenadas é raramente estudada. A primeira síntese direta de um polímero contendo um complexo metálico de transição gerou um polímero de coordenação baseado na mistura complexo rutênio (II)-terpiridina e está descrito na literatura (19). A associação de polímeros convencionais a centros metálicos gera propriedades intrínsecas ao metal, e matem as propriedades convencionais do polímero. Uma nova propriedade acrescentada à classe, devido ao centro metálico, é a eletroatividade, dentre os metais de transição o rutênio tem sido amplamente utilizado pela química de coordenação, graças a sua facilidade de formar complexos extremamente estáveis, principalmente com ligantes piridínicos e seus derivados (20).

2.3.4 Monômeros

As propriedades de um polímero dependem principalmente de dois fatores, as propriedades químicas dos monômeros e o método de síntese. A escolha de monômeros que propiciem as qualidades desejadas ao material se torna fundamental. O estireno (Figura 2A), um dos monômeros mais conhecidos dentro da área de polímeros é um hidrocarboneto aromático de fórmula C8H8 facilmente polimerizável, possui ponto de ebulição de 145,2 oC e apresenta baixa

solubilidade em água (0,032g/100mL) (21), a polimerização deste resulta no poliestireno, um termoplástico duro e quebradiço com transparência cristalina, muito semelhante ao vidro, e foi descoberto acidentalmente em 1839 por Eduard Simon, em Berlin. O divinilbenzeno, de fórmula C10H10 (Figura 2B) é um monômero que possui dois grupos vinílicos, que polimeriza facilmente

por métodos convencionais, não apresenta cor, possui ponto de ebulição de 195 oC. A sua solubilidade em água é de 0,1 g/100 mL a 18 oC e seu peso molecular é 130,189 g.mol-1 (21), polímeros contendo este monômero tem como características principais um grande numero de ligações cruzadas e serem bastante quebradiços, causada pela baixa mobilidade do grupamento benzílico.

Figura 2. Estrutura dos monômeros: (A) estireno e (B) divinilbenzeno.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivos Gerais

Sintetizar material polimérico contendo na matriz o monômero trans-[RuCl2(vpy)4]

impregnado com nanopartículas de prata apresentando atividade antimicrobiana para a utilização em instrumentos médico-odontológicos.

3.2 Objetivos Específicos

3.2.1 Sintetizar nanopartículas de prata, monitorar por UV-visível e caracterizar por microscopia eletrônica de transmissão (MET);

3.2.2 Sintetizar material polimérico que contenha os monômeros trans-[Ru(vpy)4Cl2],

estireno (sty), e divinilbenzeno (dvb).

3.2.3 Caracterizar os polímeros sintetizados por MEV, análise termogravimétrica (TGA), calorimetria diferencial de varredura (DSC) e RAMAN.

3.2.4 Fazer um estudo microbiológico para a verificação de ação antimicrobiana do polímero sintetizado utilizando os microrganismos Escherichia coli – ATCC – 25922 e Staphylococcus aureus – ATCC – 25923.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Equipamentos

• Espectrofotômetro UV-visível HP modelo 8452A

• Microscópio eletrônico de varredura (MEV) Philips modelo XL 30 • Potenciostato/ galvanostato eg&g modelo 273A

• Ultra-som Servilab. • Shimadzu TGA-50 • Shimadzu DSC-50

• Microscópio eletrônico de transmissão (MET) - Philips CM200

• Espectrômetro Renishaw Raman System 3000 equipado com CCD usando a linha de 632.8 nm de um laser Ele-He-Ne (modelo 127 da Spectra-Física)

• Manta de aquecimento com agitação - Marca Dist

4.2 Reagentes, Microrganismos e meios de cultura utilizados Reagentes: • Cloreto de rutênio-Sigma • Metanol-Merck • Clorofórmio-Nuclear • Etanol-Nuclear • Diclorometano-Merck • Tolueno-Merck • Hidroquinona-Fluka • 4-Vinilpiridina-Aldrich • Estireno-Aldrich • Borohidreto de sódio-Nuclear • Nitrato de prata-Riedel-de-Haen • Acido clorídrico-Nuclear • Divinilbenzeno-Fluka • Peróxido de benzoíla- Fluka

• Citrato de sódio-Nuclear

Microrganismos:

• Escherichia coli – ATCC – 25922 • Staphylococcus aureus – ATCC – 25923

Meios de culturas:

• BHI(Brain Heart Infusion) - DFICO; Salina; Muller & Hynton - DFICO

4.3 Métodos de síntese

A matriz polimérica proposta para ser impregnada com prata para utilização em utensílios medico – odontológicos foi a de poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-dvb-sty}. Toda água utilizada para

lavagem de vidrarias e preparo das soluções foi ultrapura (MiliQ - Milipore). O monômero trans-[RuCl2(vpy)4] e as nanopartículas de prata foram sintetizados de acordo com a literatura (22). As

sínteses foram feitas com o uso de gás argônio comercial, proveniente da White-Martins.

4.3.1 Síntese do monômero trans-[Ru(vpy)4Cl2], via precursor azul de rutênio

Foi preparado utilizando-se de 1,1 mmol de RuCl3 • xH2O, diluído em metanol e água. O

sistema foi montado utilizando um balão de três bocas, uma manta de aquecimento com agitação e foi deixada em refluxo por quatro horas, à temperatura de 75°C, sob atmosfera inerte de argônio e protegido da luz. Após o tempo de reação obteve-se uma solução de coloração azul intensa denominada azul de rutênio (Figura 3).

Figura 3. Imagem da síntese do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] via azul de rutênio.

Completada a formação do complexo intermediário, foi adicionado um mmol de hidroquinona e 0,019 mol de vpy, o refluxo foi mantido mais 40 minutos, em seguida a solução foi retirada e colocada na geladeira para precipitação do complexo durante aproximadamente 24 horas. Após este período a solução foi filtrada a vácuo em um funil de placa porosa e lavado com água.

O material retido no filtro foi solubilizado com clorofórmio, e purificado Lavou num balão de separação com clorofórmio/água, foi feito este procedimento 4 vezes, em seguida a solução de clorofórmio contendo o complexo foi deixada na capela para a evaporação do solvente. O produto obtido, trans-[RuCl2(vpy)4] (Figura 4), é um sólido amorfo de coloração

vermelha, que foi devidamente pesado e caracterizado(23).

R u C l C l N N N N

4.3.2 Síntese de nanopartículas de prata

As nanopartículas de prata foram sintetizadas por redução química utilizando borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor e citrato de sódio como estabilizante.

Todas as soluções foram preparadas com água ultra-pura (Mili-Q) a temperatura de aproximadamente 4 °C. Todas as vidrarias utilizadas foram resfriadas.

Foi preparada uma solução de nitrato de prata (AgNO3) 0,25 mmol.L-1, citrato de sódio

0,25 mmol.L-1 e NaBH4 0,01 mol.L-1. Em um béquer previamente resfriado, adicionou-se 10 mL

da solução de AgNO3 a 10 mL de citrato de sódio, sob agitação vigorosa. A solução tem aspecto

límpido, incolor. Foi adicionado 0,6 mL da solução de NaBH4, e a solução passa a ficar

esverdeada e levemente turva. Após a adição do agente redutor a solução é mantida sob agitação durante 30 minutos (22). A redução da prata por NaBH4 ocorre seguindo o mecanismo da Figura

5 (3).

4Ag+ _{+ n BH}

4- Æ 4Ag + n H2BO3- + 4nH+ +2nH2

Figura 5. Mecanismo de formação de nanopartículas

.

4.3.3 Síntese do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-dvb}

A reação é processada num balão de três bocas de 250 mL com fundo redondo mantido sob refluxo com agitação, em atmosfera de gás inerte argônio, em manta aquecedora a temperatura de 70°C durante 2 horas.

Primeiramente, é adicionado no balão o complexo trans-[RuCl2(vpy)4] em uma proporção

de 0,5% em mol em relação à soma dos mols dos monômeros, sty (0,82mol) e dvb (0,18 mol). Em seguida, o peróxido de benzoíla, a 1% em mol em relação aos monômeros, foi diluído em 6,5 mL de tolueno e adicionado ao balão. Depois é adicionado 6,5 mL de sty e 6,5 mL de dvb à

Agente redutor

solução. O sistema foi mantido em agitação vigorosa, sob refluxo, atmosfera de argônio, aquecimento e mantido protegido da luz. Completada a reação o polímero é vertido em uma placa de petri e deixado na capela para secagem (23).

4.3.4 Procedimento para impregnação de nanopartículas de prata no polímero

Após o período de síntese do polímero, item 4.3.3, este é separado em duas partes iguais: uma parte é vertida em placa de petri para secagem na capela, e foi usada posteriormente para comparação com a matriz contendo nanopartículas de prata. A outra parte foi adicionada 5 mL de solução de nanopartículas de prata mantendo o sistema sob aquecimento a 70° C e agitação por 5 minutos

Em seguida foi vertida em placa de petri e deixada na capela para a completa secagem.

4.4 Monitoramento e caracterização de nanopartículas de prata

4.4.1 Espectroscopia UV-visível e efeito de superfície de plasma ressonante (SPR)

A oscilação do plasma em um metal é a excitação coletiva de um gás formado pelos elétrons de condução. Esta onda de excitação ao se propagar em estruturas nanométricas possui uma freqüência que depende da geometria e do tamanho destas partículas, sendo denominada plasmon de superfície. Medidas de absorção de luz pelo plasmon de nanopartículas metálicas podem ser obtidas nas regiões do ultravioleta, visível e infravermelho próximo. O aumento no tamanho das partículas resulta em um deslocamento da banda do plasmon de superfície do metal para a região espectral de maior comprimento de onda (3; 24).

Baseado nesses fatos a dimensão nanométrica foi monitorada através do padrão dos espectros de UV-visível tais como largura da banda e deslocamento hipsocrômico e batsocrômico do máximo da banda, que fornece informações sobre distribuição de tamanhos de partículas e forma. Para isso foi feito num espectrofotômetro UV-visível medidas de banda SPR da solução de nanopartículas de prata.

4.4 2. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Um microscópio eletrônico de transmissão consiste de um feixe de elétrons e um conjunto de lentes eletromagnéticas, que controlam o feixe, encerrados em uma coluna evacuada com uma pressão cerca de 10-5 mmHg. Um microscópio moderno de transmissão possui cinco ou seis lentes magnéticas, além de várias bobinas eletromagnéticas de deflexão e aberturas localizadas ao longo do caminho do feixe eletrônico. Entre estes componentes, destacam-se três pela sua importância com respeito aos fenômenos de difração eletrônica: lente objetiva, abertura objetiva e abertura seletiva de difração. A função das lentes projetores é apenas a produção de um feixe paralelo e de suficiente intensidade incidente na superfície da amostra. Os elétrons saem da amostra pela superfície inferior com uma distribuição de intensidade e direção controladas principalmente pelas leis de difração impostas pelo arranjo cristalino dos átomos na amostra. Em seguida, a lente objetiva entra em ação, formando a primeira imagem desta distribuição angular dos feixes eletrônicos difratados. Após este processo importantíssimo da lente objetiva, as lentes restantes servem apenas para aumentar a imagem ou diagrama de difração para futura observação na tela ou na chapa fotográfica. Deve-se finalmente destacar que embora existam em operação alguns aparelhos cuja tensão de aceleração é de 1000 kV, a maioria dos equipamentos utilizados no estudo de materiais (metálicos, cerâmicos e poliméricos) dispõe de tensão de aceleração de até 200 kV. Os MET utilizados em biologia (materiais orgânicos naturais) em geral operam na faixa de 60 a 80 kV (25).

As amostras analisadas por MET foram preparadas colocando-se uma gota da solução aquosa contendo as nanopartículas de prata em contato com uma grade revestida de carbono.

4.5 Caracterização do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]

Todas as amostras de complexo sintetizadas foram caracterizadas por voltametria cíclica e por espectroscopia UV - visível.

4.5.1 Espectroscopia UV-visível

A espectroscopia no ultravioleta visível utiliza a luz na faixa do ultravioleta (UV) e do visível. Nessas faixas de energia as moléculas sofrem transições eletrônicas. O método utilizado para determinação de um modo quantitativo da concentração de substâncias em solução que absorvem radiação, é usando a lei de Lambert-Beer:

− ,

onde: A é a absorbância medida, I0 é a intensidade da luz incidente a um dado comprimento de

onda, I é a intensidade transmitida pela amostra, L é o caminho óptico pela amostra (distância que a luz percorreu por ela), ε é uma constante conhecida como absortividade molar (que varia de substância para substância), e c é a concentração da substância. (26).

Nos complexos de metais de transição são observados na região do visível e do ultravioleta. Estes espectros trazem informações importantes sobre o comprimento de onda da energia absorvida, ou seja, quantidade de energia necessária para promover um elétron de um determinado nível para outro mais elevado (27).

Para este trabalho as amostras de complexo sintetizadas foram caracterizadas por espectroscopia UV–visível. Foram preparadas soluções em diclorometano a uma concentração de 1.10-3 molL-1, essa concentração baixa foi utilizada devido ao fato de o complexo ter uma cor muito intensa, que significa um ε muito elevado.

4.5.2 Voltametria cíclica

A técnica de voltametria cíclica consiste em realizar a varredura do potencial direto e inverso em vários ciclos sucessivos, observando-se regiões catódicas e anódicas da espécie eletroativa. Se houver adsorção do metal no eletrodo, os picos catódicos e anódicos irão crescer a cada varredura. Este crescimento irá ocorrer no mesmo potencial se o sistema for reversível, isto é, se a quantidade de cargas envolvidas nas varreduras catódicas e anódicas forem idênticas (26).

As amostras foram pesadas em uma cela eletroquímica, e diluídas em diclorometano e o eletrólito tetrabutil-amônio hexa-fluorfosfato (HTBA) foi dissolvido em acetonitrila. O voltamograma cíclico foi feito partindo-se do potencial -320 mV até 480 mV vs Ag/AgNO3. A

4.6 Caracterização do terpolímero poli - {trans-[RuCl2(vpy)4]- sty- dvb}

4.6.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A microscopia eletrônica de varredura é utilizada em várias áreas do conhecimento. Esta técnica se torna a cada dia mais freqüente pelo fato de fornecer informações da microestrutura do material com aumento de 300.000 vezes. A imagem deste tipo de aparelho é formada pela incidência de um feixe de elétrons na amostra, sob condições de vácuo. A incidência destes promove a emissão de elétrons retro espalhados, Auger e absorvidos, também promove a emissão de raios-X característicos e de catodoluminescência. A imagem eletrônica de varredura representa em tons de cinza o mapa e a contagem de elétrons secundários e retro espalhados emitidos pelo material analisado (28).

Neste trabalho as análises microscópicas do terpolímero foram feitas em microscopia eletrônica de varredura com um recobrimento das amostras em ouro para se obter a condutividade elétrica.

4.6.2 Caracterização por espectroscopia RAMAN

Uma técnica bastante útil no estudo de sistemas moleculares é a espectroscopia RAMAN. Em nível molecular as radiações eletromagnéticas podem sofrer interações com a matéria por processos de absorção ou por espalhamento que neste caso pode ser descrito como elástico ou inelástico. O dito elástico foi relatado pela primeira vez em 1928 pelo físico indiano Chandrasekhara Vankata Raman, e passou a ser chamado de espalhamento RAMAN, onde luz a componente de campo elétrico do fóton espalhado perturba a nuvem eletrônica da molécula e pode ser entendido como um processo de excitação do sistema para um estado de mais alta energia.

Quando uma molécula em um estado vibracional de baixa energia absorve um fóton de energia һνi que excita a molécula para um estado de mais alta energia e emitindo (espalhando)

um fóton de energia һνs, de modo que һνi> һνs, conservando assim energia, que será utilizada para

levar a molécula há um estado de energia vibracional mais alto. Se a amostra já se encontrar em um estado excitado de energia vibracional, depois absorver e emitir um fóton, ela pode cair para um estado de energia vibracional menor, o que demonstra que a molécula transformou energia vibracional em energia do fóton emitido, һνi< һνs. Nos dois casos a diferença de energia entre һνi

e һνs é chamado de deslocamento RAMAN e corresponde à diferença entre os níveis de energia

de vibração que a molécula transitou. O fato de o sistema ganhar ou perder energia de vibração (ou rotação) a freqüência de deslocamento Raman se da acima e/ou abaixo da energia do fóton emitido em relação ao fóton incidente. Um gráfico de numero de fótons espalhados detectados pelo equipamento versus o deslocamento Raman em torno de um comprimento de onda laser incidente gera o espectro RAMAN (29).

Existem, apesar disso, efeitos de intensificação que melhoram o desempenho da técnica como o efeito RAMAN ressonante (RR) e o efeito de intensificação de espalhamento por meio de superfície (SERS). O efeito SERS, é observado quando uma espécie química está próxima ou adsorvida sobre uma superfície metálica rugosa, permitindo um aumento significativo da intensidade RAMAN. Dentre os metais o cobre, ouro prata mostram-se os substratos mais eficientes em experimentos SERS, devido ao fato da absorção do plasmon de superfície desses metais situar-se na região do visível, onde geralmente se encontram os comprimentos de onda das linhas lasers disponíveis em espectrômetros RAMAN. Além disso, para a observação do efeito faz-se necessária uma rugosidade na superfície metálica da dimensão de dezenas de nanômetros (desde que válida a aproximação λ>>d, onde λ = comprimento de onda da radiação excitante e d = tamanho da partícula) (24).

A atividade de uma vibração no infravermelho está condicionada à variação do momento dipolar (µ), o qual deve necessariamente existir, seja no estado fundamental da molécula ou no estado vibracional excitado; para que um modo vibracional seja Raman-ativo é necessária à existência de um momento dipolar induzido pelo campo elétrico da radiação eletromagnética. Este momento dipolar induzido, dividido pelo campo elétrico causador do mesmo, é o tensor polarizabilidade, que pode ser interpretado como uma deformação (mais ou menos intensa) da nuvem de elétrons, pelo componente elétrico da radiação. Para que uma vibração seja Raman-ativa, deve produzir uma modificação da polarizabilidade da molécula (30).

O espectro RAMAN foi obtido através de um aparelho Renishaw Raman System 3000 equipado com CCD usando a linha de 632.8 nm de um laser Ele-He-Ne (modelo 127 da Spectra-Física) ou a linha de 514.5 nm de um laser do íon do argônio (Omnichrome), para os terpolímeros 1 a 4. O laser foi focalizado na superfície da amostra por meio de um microscópio (Olympus BH2T) e a potência do laser foi mantido em 3 mW. As amostras pulverizadas foram pressionadas em uma corrediça do microscópio. A definição espectral empregada era 4 cm-1.

4.6.3 Análises Térmicas

Análises térmicas são técnicas na qual a amostra é submetida a um tratamento térmico para verificação das propriedades físicas do material, entre elas se destacam a termogravimétrica (TGA) e a calorimetria diferencial de varredura (DSC) (31).

4.6.3.1 Análises termogravimétricas (TGA)

Técnica baseada na medida da massa da amostra durante uma variação de temperatura controlada, ou do tempo a uma temperatura constante, que é essencialmente usada quando é necessário conhecer perdas de massa ocasionada por evaporação, decomposição, absorção de gases ou desidratação (32). A Figura 6 mostra os dois tipos de curvas de TGA mais comuns, onde se observa uma única perda de massa em (A) e em (B) a perda de massa ocorre em várias etapas.

Figura 6. Esquema de curvas termogravimétricas típicas: (A) única perda de massa e (b) várias

perdas de massa.

A estabilidade térmica e a transição térmica do terpolímero com e sem prata foram avaliados por termogravimetria e calorimetria diferencial de varredura. As curvas TG/DTG foram obtidas com uma termobalança modelo TGA50 (Shimadzu) numa faixa de temperatura de 25 a 700 ºC usando 5 mg de amostra em cadinho de platina sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1) e rampa de aquecimento de 10 ºC.min-1.

4.6.3.2 Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)

Esta técnica mede a diferença de energia fornecida a substância e a um material de referência em função da temperatura enquanto ambos são submetidos a aquecimento programado. Essa técnica permite identificar regiões de transição térmica de primeira ordem (variações de entalpia, por exemplo, fusão (Tf), cristalização (Tc)) e de segunda ordem (variação da capacidade calorífica e propriedades visco elásticas, por exemplo, transição vítrea (Tg)) (33).

Um gráfico característico de DSC é apresentado na Figura 7, mostrando três regiões características. Primeiramente nota-se um desvio da linha de base, característico da transição vítrea, tal transição não envolve nenhuma absorção ou liberação de calor, assim não há variação de entalpia. Entretanto a capacidade calorífica antes e depois desse tipo de transição é diferente, observada no abaixamento da linha de base (33). Um pico exotérmico, no qual ocorre à liberação de calor pela amostra, é característico de cristalização, que é o processo segundo o qual, mediante resfriamento uma fase ordenada é produzida a partir de um líquido fundido que possui uma estrutura molecular aleatória. Na fusão, processo inverso que ocorre quando o polímero é aquecido, observa-se um pico endotérmico, resultante da absorção de calor pela amostra (33).

As curvas de DSC foram obtidas em uma célula DCS 50 (Shimadzu) sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1), faixa de aquecimento de 10 ºC.min-1 numa faixa de temperatura de 25 a 600 ºC com 2 mg de amostra em cadinho de alumínio e 25 a 200 ºC (três ciclos sucessivos de aquecimento) utilizando 6 mg de amostra, esta etapa foi realizada para determinação da temperatura de transição vítrea.

4.6.4 Estudo microbiológico dos polímeros impregnados com nanopartículas de prata

Foram feitos estudos microbiológicos com os microrganismos Escherichia coli (ATCC – 25922) e Staphylococcus aureus (ATCC – 25923). Primeiramente as bactérias foram reativadas em meios ágar sangue para Staphylococcus aureus e MacConkey para Escherichia coli. Após o período de reativação, a bactéria E. coli (Gram negativa) foi deixada 1 hora no meio BHI para ocorrer à turvação até atingir o equivalente a 106 unidades formadoras de colônias (UFC), a bactéria S. aureus (Gram positiva) foi deixada 1 hora em salina para ocorrer à turvação equivalente a 106 UFC. Em seguida foram semeadas no meio Muller & Hynton para posterior estudo microbiológico.

A amostra de polímero impregnada com prata em escala nanométrica foi depositada nas placas com o meio Muller & Hynton e em seguida foram deixadas por 24 horas em estufa a 37°C. Após o período de 24 horas as placas foram analisadas para observar se o material polimérico havia inibido o crescimento de microorganismos.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Monitoramento e caracterização de nanopartículas de prata

Após a obtenção das nanopartículas de prata por redução química, descrito no item 4.3.2, iniciou-se a caracterização destas partículas primeiramente por UV-visível. Nesta caracterização foi observada uma banda em torno de 400 nm chamada banda de absorção de SPR, banda esta característica de partículas metálicas em dimensão nanométrica (3), indicando a formação de nanopartículas, como pode ser observado na Figura 8.

300 400 500 600 700 800 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 Absor bância Comprimento de onda (nm)

Figura 8. Espectro UV - visível de nanopartículas de prata

Entretanto se fez necessário uma caracterização que fornecesse melhores resoluções do tamanho e forma das partículas obtidas por este método, optou-se então pela micrografia eletrônica de transmissão (MET). A Figura 9 mostra nanopartículas pouco uniformes em sua forma, porem mantendo um padrão circular. Através da medida do diâmetro de 600 partículas, contadas e selecionadas aleatoriamente pelo equipamento, foi construído o histograma da Figura 10, e observou-se nanopartículas de prata com dimensões entre 5 a 45 nm de diâmetro, e um considerável predomínio das partículas com dimensão em torno de 15 nm.

Figura 9. Micrografia de MET de nanopartículas de prata

Figura 10. Histograma da distribuição do tamanho das nanopartículas de prata.

Estando o foco do trabalho mais voltado para a característica anti-séptica do material, não é de grande importância que as partículas mantenham determinada forma, apenas é necessário

que tenham um diâmetro de partícula abaixo de 100nm, para que se possa manter os padrões de toxicidade anteriormente citados. Sendo a inibição bacteriana diretamente proporcional a superfície de contato das partículas com o meio propicio ao crescimento bacteriano. O aperfeiçoamento desta técnica de síntese de modo que se obtenha diâmetros de partículas menores certamente viria a somar e será alvo de posteriores estudos.

5.2 Estudo de estabilidade térmica e dinâmica das nanopartículas de prata

Para uma maior homogeneidade na distribuição das partículas pela matriz polimérica seria necessário que estas fossem adicionadas ao polímero com este ainda num estado líquido. E isso ocorreria a uma temperatura elevada, ou então seria necessário se dissolver o polímero, que acabaria por ser mais uma etapa dificultando o trabalho. Também era necessário avaliar a resposta das partículas a uma possível secagem do polímero em temperaturas elevadas.

Foram realizados estudos de temperatura das nanopartículas de prata com o objetivo de verificar a sua estabilidade térmica para a impregnação destas partículas durante a síntese do polímero. Para isso foi preparada uma solução de nanopartículas de prata e feita a leitura no espectrofotômetro, após esta solução foi aquecida a 500C e feita nova leitura, repetindo-se este procedimento para 70 e 1000C, com o objetivo de verificar a estabilidade térmica da solução de nanopartículas, pois grandes alterações no tamanho das partículas poderiam comprometer o andamento do trabalho.

Os resultados apresentados na Figura 11 mostram que mesmo após aquecimento as partículas mantiveram-se em escala nanométrica. Mesmo havendo mudanças no tamanho e forma da banda, que indicam alteração no tamanho e forma das partículas, o que não impossibilita sua utilização na impregnação da matriz polimérica.

Figura 11. Estudo do efeito de temperatura sobre o sistema coloidal de nanopartículas de prata

Outra questão relevante quando se pensa em uma futura aplicação industrial, é a estabilidade destas partículas com o tempo, e a necessidade ou não destas serem sintetizadas no período imediatamente anterior a impregnação do polímero. É importante salientar que na mesma solução em que as nanopartículas são geradas, elas são mantidas e utilizadas para impregnação e monitoramento por UV-visível.

Para revelar esse comportamento o estudo da estabilidade das partículas com o tempo foi feito preparando-se uma solução de nanopartículas e feitas leituras no espectrofotômetro no momento da síntese e em 10, 45 e 60 dias após a síntese, o resultado é apresentado na Figura 12.

Figura 12. Teste de estabilidade da solução coloidal de prata com o tempo

A Figura 12 mostra que ocorre um aumento do pico com o decorrer do tempo, indicando que ocorre um aumento do numero de partículas na solução. Este aumento pode ser causado por processos de redução de espécies ainda na forma de Ag+ pelo citrato de sódio presente na solução. Observou-se também que a largura da banda sofreu um aumento, indicando que os tamanhos das partículas passaram a ter um maior intervalo de diâmetro, isto ocorre por processos de coalescência.

5.3 Caracterização do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]

5.3.1 Voltametria cíclica do trans-[RuCl2(vpy)4]

Foram feitas análises de todas as amostras sintetizadas, e observam-se os picos característicos de redução Ru3+/2+ e oxidação Ru2+/3+, sendo o rutênio o centro metálico do

complexo. Um potencial de oxidação de -40,98 mV (vs Ag/AgNO3), e um potencial de redução

de -163,57 mV (vs Ag/AgNO3) foi observado para o complexo trans-[RuCl2(vpy)4] conforme

apresentado na Figura 13. O voltamograma é condizente com o relatado na literatura (34-36), confirmando por estas características que se trata realmente do complexo trans-[RuCl2(vpy)4],

não observa-se sinais de sub-produtos da reação de formação do complexo.

Figura 13. Voltamograma cíclico do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] em

acetonitrila-diclorometano 4:1 a uma concentração de 0,1x 10-3 mol L-1, a uma velocidade de varredura de 100 mV.s-1 no sentido anódico.

Ru2+/3+

5.3.2 Espectroscopia UV-visível do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]

No espectro eletrônico do complexo observou-se uma banda intensa em torno de 446 nm e outra, de menor intensidade, na forma de um ombro em torno de 500 nm (Figura 14). De acordo com a literatura essas bandas correspondem a transições eletrônicas do tipo 1A1g Æ 1T2g e 1A1g Æ 1_T

1g (20).

Figura 14. Espectro UV-visível do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]

O resultado das caracterizações do complexo mostrou um composto adequado à síntese do polímero. O espectro corrobora com os dados publicados em literatura para o mesmo complexo e outros da mesma classe de complexos de rutênio (34-36).

5.4 Caracterização do terpolímero poli - {trans[RuCl2(vpy)4]- -sty - dvb }

5.4.1 Caracterização por MEV

Os polímeros sintetizados foram analisados por MEV. A morfologia do polímero sem a adição de nanopartículas mostrou uma superfície bastante irregular (Figura 15), enquanto o polímero com a presença das partículas apresentou uma superfície bem uniforme e sem irregularidades aparentes (Figura 16). Essas diferenças morfológicas podem ser explicadas pela forma de secagem do polímero, no caso da adição da prata, que se encontra em solução aquosa, a água acaba formando uma fase acima do filme do polímero, deixando-o então entre duas

superfícies planas. Isso não ocorre com o material em que não é adicionada a prata, que acaba tendo sua superfície em contato com o ar, e como a capela se encontrava ligada durante a sua secagem, o vento causado por esta podendo criar imperfeições na superfície do material. Essas diferenças não podem ser relacionadas diretamente com a presença do metal em dimensão nanométrica.

A grande observação oriunda desta caracterização é de que não foi visualizada prata depositada sobre o polímero, havia uma suspeita de que pontos claros na superfície do polímero impregnado, fossem depósitos do metal. Porem a análise elementar destes pontos, vistos na Figura 16, não detectam a presença de prata, dando base para a afirmação de que o metal realmente estaria em nanopartículas, ou seja, fora da detecção do método.

Figura 15. Micrografias em MEV do polímero poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-dvb}sem prata,

com aumento de 25vezes (1), 50 vezes (2), 100 vezes (3) e 200 vezes (4).

1

2

Figura 16. Micrografias em MEV do polímero poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-dvb}com prata,

com aumento de 25vezes (1), 50 vezes (2), 100 vezes (3) e 200 vezes (4).

5.4.2 Caracterização por espectroscopia RAMAN

O polímero foi caracterizado por RAMAN. A Figura 17 mostra os espectros das amostras 1 (com Ag) e 2 (sem Ag) do terpolímero junto com os espectros do monômero trans-[RuCl2(vpy)4], do poliestireno e do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]} obtido por polimerização

eletroquímica (37).

1 2

1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 (c) (e ) (d ) (b ) (a ) In te n s ity / a .u . R a m a n s h ift / c m-1

Figura 17. Espectro RAMAN de (a) trans-[RuCl2(vpy)4]; (b) poli-{trans [RuCl2(vpy)4]} (c)

poliestireno; (d) terpolímero 2 (sem Ag); (e) terpolímero 1 (com Ag), na região de 300-1800 cm -1_.

As freqüências típicas de vibração do trans-[RuCl2(vpy)4], poliestireno, poli-{trans-

[RuCl2(vpy)4]}, terpolímeros 1 e 2 são apresentadas na Tabela 1. As bandas que aparecem nos

terpolímeros 1 e 2 em 997, 1023, 1062, 1200, 1602 e 1627 cm-1_{, e em 1023 e 1627 cm}-1 _são

atribuídas ao trans-[RuCl2(vpy)4] (monômero), que são características deste composto. A faixa

em 1627 cm-1 é atribuída à ligação (C=C), nos terpolímeros 1 e 2 e indica que a polimerização estava incompleta. A faixa em 1062 cm-1 é atribuída ao monômero trans-[RuCl2(vpy)4], embora o

polímero tenha também uma faixa com freqüência perto do valor observado no terpolímero, mas com intensidade baixa. As faixas em 1200 e 1602 cm-1 _{podem ser atribuídas ao monômero}

trans-[RuCl2(vpy)4] e ao polímero, porque estão presentes em ambos os compostos com intensidade

elevada. Por outro lado, a faixa do terpolímero em 997 cm-1 pode com segurança ser atribuída ao poliestireno, porque não está presente nem no monômero nem no polímero do complexo.

Tabela 1. Freqüências em (cm-1) de trans-[RuCl2(vpy)4], poliestireno, poli-{trans-

[RuCl2(vpy)4]} e terpolímero 1 (com Ag) e terpolímero 2 (sem Ag), na região acima de 900 cm -1_.

trans-[RuCl2(vpy)4] poliestireno

poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]} Terpolímeros 1 e 2 1013 (m) 998 (fo) 997 (m) 1032 (fa) 1030 (fa) 1022 (m) 1023 (m) 1056 (fa) 1056 (fa) 1062 (m) 1153 (fa) 1180 (fa)

1200 (fo) 1198 (fa) 1194 (fo) 1200 (m)

1204 (o) 1207 (o) 1209 (o)

1220 (fa)

1604 (fo) 1600 (fa) 1597 (fo) 1602 (fo)

1625 (m) 1627 (m)

fo = forte; m = media ; fa = fraca; o = ombro

A Figura 18 é uma ampliação da Figura 17, na região 850-1180 cm-1. Comparando as faixas dos terpolímeros 1 e 2, em 997, 1023 e 1062 cm-1, pode-se observar que no terpolímero 1 a faixa em 997 cm-1 (do poliestireno) está ligeiramente enfraquecida com relação à faixa em 1023 cm-1 do poli-{trans [RuCl2(vpy)4]} comparado ao espectro do terpolímero 2. Este fato indica que

conhecido como efeito SERS provocado pela presença de nanopartículas de prata (24). Outro fato que deve ser mencionado é a intensificação das faixas na região de baixa freqüência (ao redor 300-500 cm-1_{) no terpolímero 1. Estas faixas são atribuídas às faixas do óxido de rutênio (38).}

Assim, os átomos de Ag no terpolímero 1 são responsáveis pelo realce das faixas do complexo e das faixas do óxido de rutênio.

1000 0 10000 20000 30000 1030 1032 (e) 1056 998 997 1062 1023 1022 1013 1056 (c) (e) (d) (b) (a) Inten s id ad e / a.u. Raman shift / cm-1

Figura 18. Espectro RAMAN , na região de 850-1180 cm-1do (a) trans-[RuCl2(vpy)4]; (b)

poli-{trans [RuCl2(vpy)4]}; (c) poliestireno; (d) terpolímero 2 (sem Ag); (e) terpolímero 1 (com Ag)

5.4.3 Caracterização por análises térmicas

As curvas de TG/DTG e de DSC do terpolímero poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-dvb-sty}

preparado sem e com nanopartículas de prata são mostradas nas Figuras 19 e 20, respectivamente. As curvas de TG/DTG de ambos os materiais mostram um comportamento térmico similar com perda de massa total de 82.1% (sem prata) e de 81.6% (com prata) no intervalo de 25 a 700 °C. Uma perda de massa mais baixa do polímero impregnado com a prata é consistente com a presença do componente metálico não volátil na matriz polimérica. Em ambos

os materiais, uma perda de massa inicial de aproximadamente 3% foi encontrada no intervalo de 25 a 200°C seguido por uma perda de massa de aproximadamente 17% na faixa de 200 a 400ºC. Uma perda de massa mais importante ocorre de 400 a 700ºC que corresponde à perda 61.9% e 60.5% de massa para o terpolímero sem e com nanopartículas de prata, respectivamente. As curvas de DSC para o terpolímero com e sem prata revelaram um processo exotérmico de 80 a 200ºC (Tpico DSC = 140ºC) que pode ser atribuído às reações da polimerização de grupos

vinílicos que ainda não haviam reagido. Após três ciclos sucessivos de aquecimento no intervalo de 25 a 200°C (curvas de DSC introduzidas nas figuras principais) foi possível estimar a transição vítrea para o terpolímero sem prata (145oC) e para o terpolímero impregnado com a prata (155oC), calculada após o segundo aquecimento, este valor é o grande diferencial, indicando uma possível estabilidade provocada pela adição das nanopratas. O processo exotérmico principal que corresponde à decomposição do terpolímero ocorreu entre 400 e 500ºC para ambos os materiais. Entretanto, as curvas de DSC indicam um evento exotérmico na temperatura de 463ºC para o terpolímero sem prata e a 469ºC para o terpolímero impregnado com prata, o que não indica uma diferença significativa que possa ser associada à presença do metal.

Figura 19. TG/DTG e DSC em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1) e aquecimento

Figura 20. TG/DTG e DSC em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1) e aquecimento

5.4.4 Estudo microbiológico

As amostras de polímeros foram testadas nos microorganismos Gram positivo S. aureus (ATCC-25923) e Gram negativo E. coli (ATCC-25922), para verificação se estas realmente apresentavam atividade antimicrobiana. As Figuras 21 e 22 mostram os resultados dos testes realizados com o polímero poli-{trans-[RuCl2(vpy)4] -sty-dvb}.

Observou-se um halo de inibição do microorganismo no meio de cultura nas amostras de polímero com prata, o que não foi observado com o polímero sem prata impregnada. No meio onde foram semeadas as bactérias, ocorreu à liberação de nanopartículas de prata, inibindo assim o crescimento de microorganismo, desta maneira se caracteriza as propriedades anti-sépticas do novo material polimérico. Havendo a dúvida de que este efeito de inibição do crescimento bacteriano fosse provocado por outra espécie que poderia estar sendo liberado pelo polímero, o teste foi realizado utilizando como padrão o mesmo polímero sem a adição de partículas de prata (Figura 21B).

Como reportado na literatura (16), a prata só se torna realmente efetiva quando no estado oxidado ou excitado, que ocorre no meio em que o polímero se encontra, e segue o mecanismo:

O2(Aq) + 4H3O+ + 4Ag(S) Æ 4Ag+(Aq) + 6H2O(Aq) (37)

Estes íons prata se ligam fortemente a grupamentos contendo enxofre, oxigênio e nitrogênio, atuando assim sobre o DNA, inibindo também processos de transporte, interagindo em processos de oxidação celular e por fim causando a morte do microorganismo (39).

Figura 21. Teste microbiológico do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-dvb}, com prata impregnada

(A), e sem prata impregnada (B), com microorganismo S. aureus (Gram positiva).

Figura 22. Teste microbiológico do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-dvb}, com prata impregnada

(A), e sem prata impregnada (B), com microorganismo E. coli (Gram negativa).

6. CONCLUSÕES

A dimensão das nanopartículas de prata foi caracterizada por MET e monitorada por UV - visível, confirmando partículas na faixa de 5 a 45 nm. Sua estabilidade térmica e dinâmica foi comprovada.

O complexo metálico trans-[RuCl2(vpy)4] foi sintetizado, purificado e caracterizado por

voltametria cíclica e por UV-visível, dando resultados concordantes com os esperados.

O terpolímero poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-dvb- sty} foi sintetizado e caracterizado por

MEV, TGA, DSC, RAMAN.

A micrografia por MEV mostrou um filme com uma superfície lisa e um aumento da rugosidade do polímero sem a adição da prata, não foi detectado também a presença de partículas de prata, que por estarem em escala nanométrica não podem ser visualizadas pelo equipamento.

A curva de TG/DTG apresentou perda de massa na região entre 400 e 700 ºC correspondente a 60,5% e 61,9% do terpolímero com e sem prata, respectivamente.

Na curva de DSC a transição vítrea do terpolímero foi de 155 ºC e 145 ºC com e sem prata, respectivamente.

O espectro RAMAN mostrou as bandas esperadas do monômero complexo e do estireno. Ocorreu também a intensificação das bandas do complexo no polímero com a presença de nanoprata, comprovando assim o efeito SERS provocado pela presença de nanopartículas de prata.

Os estudos microbiológicos mostraram um halo inibitório do terpolímero impregnado com prata na placa de microcultivo, confirmando a propriedade anti-séptica do novo material e assim cumprindo com o objetivo principal deste trabalho.

7. ARTIGOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS E TRABALHOS APRESENTADOS EM EVENTOS

1- K. Segala, R. L. Dutra, E. N. de Oliveira, L. M. Rossi, J. R. Matos, M.M.S. Paula, C. V. Franco. Characterization of poly-{trans-[RuCl2(vpy)4]-styrene-4-vinylpyridine} Impregnated

with Silver Nanoparticles in Non Aqueous Medium. Journal of the Brazilian Chemical Society (Online), v. 17, p. 1679-1682, 2006.

2- R. L. Dutra, K. Segala, E. N. de Oliveira, E. P. de Souza, L. M. Rossi, J. R. Matos, C. V. Franco. preparation and characterization of the novel terpolymer of poly-{trans-[RuCl2(vpy)4

]-styrene-divinylbenzene} impregnated with silver nanoparticles. Materials Science and

Engineering: C – 2006. Submetido.

3 - K. Segala, R. L. Dutra, E. N. de Oliveira, L. M. Rossi, J. R. Matos, M.M.S. Paula, C. V. Franco. Characterization of poly-{trans-[RuCl2(vpy)4]-styrene-4-vinylpyridine} Impregnated

with Silver Nanoparticles in Non Aqueous Medium. XIII Brazilian Meeting on Inorganic

Chemistry. Fortaleza, 2006.

4 - R. L. Dutra, K. Segala, E. N. de Oliveira, C. V. Franco. Preparation and characterization of the novel terpolymer of poly-{trans-[RuCl2(vpy)4]-styrene-divinylbenzene} impregnated with

silver nanoparticles. V Encontro da SBPMat, Brazilian MRS Meeting. Florianópolis, 2006. 5 - E. N. de Oliveira, R. L. Dutra, K. Segala, C. V. Franco. Caracterização do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4] -estireno-4-vinilpiridina} impregnado com nanopartículas de prata em meio

orgânico. SEPEX – 6ª Semana de Ensino, Pesquisa e extensão da UFSC, 2006.

6 - E. N. de Oliveira, R. L. Dutra, K. Segala, C. V. Franco. Caracterização de complexo metálico macromolecular de RuII impregnado com nanoprata e característica anti-séptica. E. N. de Oliveira, K. Segala, R. L. Dutra, L. M. Rossi, J. R. Matos, M.M.S. Paula, C. V. Franco. Caracterização do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4] -estireno-4-vinilpiridina} impregnado com

nanopartículas de prata em meio orgânico. SBQ SUL-Sociedade Brasileira de Química da

Região Sul. Erechim, 2006.

7 - E. N. de Oliveira, R. L. Dutra, K. Segala, C. V. Franco. Caracterização do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4] -estireno-4-vinilpiridina} impregnado com nanopartículas de prata em meio

orgânico. SBQ SUL-Sociedade Brasileira de Química da Região Sul. Erechim, 2006.

8 - R. L. Dutra, K. Segala, E. N. de Oliveira, E. P. de Souza, L. M. Rossi, J. R. Matos, C. V. Franco. Preparation and characterization of the novel terpolymer of poly-{trans-[RuCl2(vpy)4

]-styrene-divinylbenzene} impregnated with silver nanoparticles. 17º Cbecimat – Congresso

8 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 - J.R.D. Marinho. Macromoléculas e Polímeros. Ed. Manole Ltda. Barueri, São Paulo. 2005. 2 - A.L. Santana. Complexos formados entre Poli (4-vinilpiridina) e sais de cobre (II): Propriedades térmicas, espectroscópicas e eletroquímicas. Dissertação de Mestrado, Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2004.

3 - J.P. Abid. Laser Induced Synthesis and Nonlinear Optical Properties of Metal Nanoparticles. Tese Doutorado. École Polytechnique Fédérale De Lausanne, Lausanne, France, 2003.

4 – E. Angioletto. Desenvolvimento de Processo de Fabricação de Cerâmicas com Propriedades Antimicrobianas. Tese de Doutorado - Departamento de Engenharia de Materiais, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2003.

5 – L. A. Mermel. Prevention of intravascular catheter-related infections. Ann Intern Med., v.132, p.391-402, 2000.

6 - Centers for Disease Control and Prevention. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System report, data summary from October 1986-April 1998, issued June 1998. Am J Infect Control., v.26, p.522-533, 1998.

7- B. Digiovine, C. Chenoweth, C. Watts, M. Higgins. The attributable mortality and costs of primary nosocomial bloodstream infections in the intensive care unit. Am J Respir Crit Care Med., v.160, p.976-981, 1999.

8 - J. Rello, A. Ochavagia, E. Sabanes, et al. Evaluation of outcome of intravenous catheter-related infections in critically ill patients. Am J Respir Crit Care Med., v.162, p.1027-1030, 2000. 9 – L. Soufir, J. F. Timsit, C. Mahe, J. Carlet, B. Regnier, S.Chevret. Attributable morbidity and mortality of catheter-related septicemia in critically ill patients: a matched, riskadjusted, cohort study. Infect Control Hosp Epidemiol., v.20, p.396-401, 1999.

10 – P. J. Collignon. Intravascular catheter associated sepsis: a common problem. The Australian Study on Intravascular Catheter Associated Sepsis. Med J Aust., v.161, p.374-378, 1994.

11 – D. Pitter, D. Tarara, R.P. Wenzel. Nosocomial bloodstream infection in critically ill patients. Excess length of stay, extra costs, and attributable mortality. JAMA, v.271, p.1598-1601,1994. 12 – J.B. Dimick, R.K. Pelz, R. Consunji, S.M. Swoboda, C.W. Hendrix, P.A. Lipsett. Increased resource use associated with catheter-related bloodstream infection in the surgical intensive care unit. Arch Surg., v.136, p.229-234, 2001.