Alterações sexo-específicas na memória e homeostase glutamatérgica induzidas por bisfenol A em camundongos: efeito do disseleneto de difenila

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA. Natália da Silva Jardim. ALTERAÇÕES SEXO-ESPECÍFICAS NA MEMÓRIA E HOMEOSTASE GLUTAMATÉRGICA INDUZIDAS POR BISFENOL A EM CAMUNDONGOS: EFEITOS DO DISSELENETO DE DIFENILA. Santa Maria, RS, Brasil 2017.

(2) Natália da Silva Jardim. ALTERAÇÕES SEXO-ESPECÍFICAS NA MEMÓRIA E HOMEOSTASE GLUTAMATÉRGICA INDUZIDAS POR BISFENOL A EM CAMUNDONGOS: EFEITOS DO DISSELENETO DE DIFENILA. Dissertação apresentada ao curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Área de Concentração em Bioquímica Toxicológica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica Toxicológica. Orientadora: Profª Drª. Cristina Wayne Nogueira. Santa Maria, RS 2017.

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(5) Com carinho dedico esta dissertação aos meus pais Jorge e Vera os quais sempre me apoiaram em todas as minhas escolhas e aos meus irmãos Fernando, Fernanda e Eduardo por estarem sempre ao meu lado..

(6) AGRADECIMENTOS Agradeço à DEUS pela oportunidade da vida. À minha família, pessoas mais que essenciais. Muito obrigada por todo o apoio, por estar presente em momentos importantes, pela compreensão, confiança e cuidado em todos os momentos da minha vida. Muito obrigada!! À minha orientadora, professora Cristina, meu exemplo de profissionalismo. Obrigada pela oportunidade, por toda a orientação e tempo dedicado. Sem seu auxilio eu não teria alcançado esta etapa e muito menos as próximas etapas que se seguirão. Ao professor Gilson, pela orientação e muitos momentos de diversão, muito obrigada. À Glaúbia, minha “mãe-científica”, a qual teve grande importância para o meu amadurecimento profissional, participando desde o início do desenvolvimento desse trabalho. Agradeço por todas as orientações, ensinamentos, conselhos, pela paciência e principalmente pela amizade. Não poderia ter sido melhor. Muito obrigada por tudo!!! Ao Marcel, um grande amigo, a quem devo muito a concretização desse trabalho. Muito obrigada pela ajuda incondicional, disposição, dedicação, paciência e especialmente pela amizade. Obrigada por ter me “acolhido” sempre que precisei, és uma pessoa única. À Sabrina, aluna de iniciação científica, a qual me acompanhou durante o último ano. Obrigada pela ajuda, companhia, pela paciência e por sempre manter o bom humor durante os longos dias de experimentos. Ganhei mais que uma parceira de trabalho, ganhei uma amiga. Espero ter contribuído para sua formação e que tenhas um ótimo futuro pela frente. Aos meus amigos e colegas do LabCris, que sempre me estenderam a mão quando precisei, me acompanharam, ensinaram e aconselharam. Em especial, agradeço a Caroline pela amizade construída, pela companhia de todos as noites e dias, principalmente nos fins de semana de Lab, pelo mate de todas as manhãs, pela cumplicidade, paciência, cuidado e carinho. Agradeço por todos os “vamos”, na boa ou na ruim. Muito obrigada amiga!!! Aos colegas do LabGZ, muito obrigada pela amizade, parceria e pelos inúmeros momentos de descontração tanto fora como no Lab e principalmente ao Zé pela síntese do composto. Aos meus amigos que me acompanham desde a graduação, pois diz-se que um sonho que se sonha só é só um sonho que se sonha, mas um sonho que se sonha junto é realidade. À banca, Professores André Bairros e Natália Brucker pela disposição em avaliar meu trabalho. Aos professores e funcionários do Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica – UFSM. À CAPES, pelo auxílio financeiro e à Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica pela possibilidade de realização desse curso. Enfim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. Muito Obrigada!.

(7) Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. -Marthin Luther King.

(8) RESUMO. ALTERAÇÕES SEXO-ESPECÍFICAS NA MEMÓRIA E HOMEOSTASE GLUTAMATÉRGICA INDUZIDAS POR BISFENOL A EM CAMUNDONGOS: EFEITO DO DISSELENETO DE DIFENILA AUTORA: NATÁLIA DA SILVA JARDIM ORIENTADORA: CRISTINA WAYNE NOGUEIRA. O Bisfenol A (BFA) é um desregulador endócrino com alto potencial toxicológico, utilizado na manufatura de polímeros sintéticos, abrangendo embalagens de alimentos e bebidas. Embora os efeitos deletérios da exposição ao BPA sejam bem relatados, principalmente nos estágios iniciais da vida, nenhuma possível intervenção terapêutica foi desenvolvida ainda. Nesse sentido, o disseleneto de difenila, (PhSe)2, um dos compostos orgânicos de selênio mais estudados, é uma molécula pleiotrópica e de grande potencial terapêutico em doses farmacológicas. A literatura reporta diversos trabalhos que relatam seus mais variados efeitos em diferentes modelos animais, entre eles modelos de prejuízo cognitivo. Dessa forma, a presente dissertação avaliou o efeito do tratamento com o (PhSe)2 em reverter o prejuízo na aprendizagem e memória induzido pela exposição subcrônica ao BFA em camundongos machos e fêmeas durante o período pós natal, bem como o envolvimento do sistema glutamatérgico nesses efeitos. Para a realização deste modelo experimental, foram utilizados camundongos Swiss machos e fêmeas. A exposição ao BFA (5 mg/kg) foi realizada durante o período do 21º até 60º dia pós-natal, via intragástrica, uma vez ao dia. Posteriormente, durante a última semana do protocolo experimental, do 61º até 67º dia pós-natal, foi realizada a administração de (PhSe)2 (1 mg/kg), via intragástrica, uma vez ao dia. Após, os animais foram submetidos aos testes comportamentais para avaliação dos diferentes tipos de memória como, o labirinto aquático de Morris, o teste do reconhecimento do objeto e a esquiva passiva. Além disso, foram removidas estruturas cerebrais (córtex e hipocampo) para a realização de ensaios ex vivo, captação de glutamato e níveis das subunidades (2A e 2B) do receptor NMDA. Os resultados obtidos demonstraram que a exposição ao BFA induziu prejuízo na memória de reconhecimento em ambos os sexos. Enquanto, que prejudicou a memória espacial em fêmeas e a memória aversiva na esquiva passiva somente em machos. Além disso, os animais expostos ao BFA apresentaram um decréscimo na captação de glutamato e diminuição nos níveis das subunidades do receptor de NMDA nas regiões hipocampal e cortical. Os efeitos do tratamento com o (PhSe)2 em reverter as alterações nos diferentes tipos de memória causadas pela exposição ao BFA, além de restaurar a captação de glutamato e os níveis das subunidades do receptor de NMDA em hipocampo e córtex de camundongos foram independentes do sexo. Em conclusão, os dados deste estudo mostram que uma exposição subcrônica ao BFA durante o período de desenvolvimento cerebral induziu danos na formação da memória e aprendizagem de camundongos de maneira sexo-específica e tais efeitos podem ser relacionados com as alterações na homeostase glutamatérgica. No entanto, o (PhSe) 2 reverteu, independentemente do sexo, todas as alterações comportamentais e moleculares, demonstrando ser um potencial candidato ao tratamento de danos na memória causados pela exposição ao BFA em camundongos.. Palavras-chave: Bisfenol A. Desregulador endócrino. Selênio. Memória. Neurotoxicidade. Sexo. Sistema glutamatérgico.

(9) ABSTRACT. BISPHENOL A IMPAIRS THE MEMORY FUNCTION AND GLUTAMATERGIC HOMEOSTASIS IN A SEX-DEPENDENT MANNER IN MICE: EFFECTS OF DIPHENYL DISELENIDE AUTHOS: NATÁLIA DA SILVA JARDIM ADVISOR: CRISTINA WAYNE NOGUEIRA. Bisphenol A (BFA) is an endocrine disruptor with high toxicological potential, used in the manufacture of synthetic polymers, including food and beverage packaging. Even though the deleterious effects of BPA exposure have been well reported, mainly in the early stages of life, none possible therapeutic intervention was developed. In this sense, diphenyl diselenide, (PhSe)2, one of the most studied organic selenium compounds, is a pleiotropic molecule with great therapeutic potential at pharmacological doses. The scientific literature shows different pharmacological properties; among them, the protective effects on the cognitive impairment induced in different experimental models were already described. Taking it into account, the objective of the present dissertation was to investigate the effects of (PhSe) 2 on the memory impairments induced by BPA exposure to male and female mice and the possible involvement of glutamatergic system in these effects. Three-week-old male and female Swiss mice received BPA (5 mg/kg), intragastrically, from 21 st to 60th postnatal day. After, the animals were intragastrically treated with (PhSe)2 (1 mg/kg) during seven days. The mice performed the behavioral memory tests, Morris water maze, object recognition and step-down passive avoidance. The [3H] glutamate uptake and NMDA receptor subunits (2A and 2B) analyses were carried out in the hippocampus and cerebral cortex of mice. The results demonstrated that the BPA exposure induced impairment of object recognition memory in both sexes. However, it caused impairments in spatial memory in female and in the passive avoidance memory in male mice. Besides, BPA caused a decrease in the [ 3H] glutamate uptake and NMDA receptor subunits in the cortical and hippocampal regions depending on the sex. The effects of treatment with (PhSe)2 on reversing the alterations in the different types of memory caused by exposure to BFA were independent of sex. As well as the restorative effects of this compound in the [ 3H] glutamate uptake and NMDA receptor subunits levels in the hippocampus and cortex of mice. In conclusion, the results of this study showed that subchronic exposure to BFA during the brain development period induced damage in the memory formation in a sex-dependent manner and these effects may be related to alterations in the glutamatergic homeostasis. However, (PhSe)2 reversed all behavioral and molecular changes in a sex-independent manner, demonstrating to be a potential candidate for the treatment of memory damage caused by exposure to BPA in mice.. Keywords: Biphenol A. Endocrine Disruptor. Seleniun. Memory. Neurotoxicity. Sex. Glutamatergic System.

(10) LISTA DE FIGURAS. INTRODUÇÃO Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 -. Reações envolvendo a molécula de BFA........................................................... Fases do processamento da memória e classificação dos tipos de memória..... Neurotransmissão glutamatérgica e receptores ionotrópicos de glutamato....... Estrutura química do composto Disseleneto de Difenila [(PhSe)2].................... 15 18 21 24. CONCLUSÃO Figura 5 -. Representação esquemática de conclusão dessa dissertação.............................. 60. MANUSCRITO Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 -. Schematic experimental design representation of this study............................. Effects of (PhSe)2 treatment in the Morris water maze test after the BPA exposure to mice................................................................................................ Effect of (PhSe)2 treatment in the object recognition test after the BPA exposure in mice................................................................................................ Effect of (PhSe)2 treatment in the step-down avoidance test after the BPA exposure in mice................................................................................................ Effect of (PhSe)2 treatment on the [3H] glutamate uptake of hippocampus and cerebral cortex slices in BPA treated mice................................................. Effect of (PhSe)2 treatment on N-methyl-D-aspartate receptor subunits in BPA treated mice................................................................................................ 54 55 56 57 57 58.

(11) LISTA DE TABELAS. MANUSCRITO Table 1 Table 2 -. Summary of the results obtained on behavioral tests and ex vivo analyses in male and female mice after BPA exposure and (PhSe)2 treatment.................. Locomotor parameters of male and female mice evaluated during the Morris water maze test after BPA exposure and (PhSe)2 treatment................. 53 53.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS. (PhSe)2 AMPA BFA Ca2+ EAAT1 EAAT2 EAAT3 EAAT4 EAAT5 Gln Glu Gt(g) Gt(n) iGluRs K+ KA Mg2+ mGluRs Na+ NMDA NMDA R2A NMDA R2B NR1 NR2 NR3 SNC VGLUT. Disseleneto de difenila Ácido-amino- 3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiônico Bisfenol A Cálcio Transportador de aminoácidos excitatórios 1 Transportador de aminoácidos excitatórios 2 Transportador de aminoácidos excitatórios 3 Transportador de aminoácidos excitatórios 4 Transportador de aminoácidos excitatórios 5 Glutamina Glutamato Transportadores de Glutamato glial Transportadores de Glutamato neuronal Receptores ionotrópicos de glutamato Potássio Cainato Magnésio Receptores metabotrópicos de glutamato Sódio N-metil-D-aspartato Subunidade 2A dos receptores NMDA Subunidade 2B dos receptores NMDA Subunidade 1 dos receptores NMDA Subunidade 2 dos receptores NMDA Subunidade 3 dos receptores NMDA Sistema nervoso central Transportador vesicular de glutamato.

(13) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 13 1.1 BISFENOL A .................................................................................................................. 13 1.1.1 Bisfenol A e a exposição em humanos .................................................................. 14 1.1.2 Aspectos toxicológicos do Bisfenol A no sistema nervoso central ...................... 16 1.2 APRENDIZAGEM E MEMÓRIA: DEFINIÇÕES GERAIS ......................................... 17 1.3 SISTEMA GLUTAMATÉRGICO ................................................................................. 19 1.3.1 Receptores glutamatérgicos ................................................................................... 20 1.4 SELÊNIO ........................................................................................................................ 23 1.4.1 Compostos orgânicos de selênio: Disseleneto de difenila.................................... 24 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 26 2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 26 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 26 3 DESENVOLVIMENTO...................................................................................................... 27 3.1 MANUSCRITO .............................................................................................................. 28 4 CONCLUSÃO...................................................................................................................... 60 5 PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 62 6. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 63 ANEXO A - CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA ........................................................................................... 72.

(14) 13. 1 INTRODUÇÃO 1.1 BISFENOL A Uma das classes de contaminantes emergentes que tem chamado a atenção de pesquisadores e órgãos de fiscalização durante os últimos anos tem sido aqueles denominados Desreguladores Endócrinos, do inglês, Endocrine Disrupting Chemicals. Com base nas informações encontradas na literatura existem várias definições para classificar os desreguladores endócrinos, embora ainda sejam necessários mais dados científicos para uma investigação mais ampla a fim de identificar os critérios específicos para a classificação dessas substâncias. No entanto, em todas as definições há um ponto em comum: trata-se de uma substância química que interfere no funcionamento natural do sistema endócrino de espécies animais, incluindo os seres humanos (GHISELLI, 2007). Tais. substâncias. podem. ser. de. origem. antrópica,. também. denominadas. xenoestrogênios, de origem natural, como por exemplo, os fitoestrogênios (GHISELLI, 2007) e os hormônios presentes no corpo humano (estrogênio, progesterona e testosterona). Alguns autores relatam que os desreguladores endócrinos alteram o sistema endócrino, de forma a afetar diretamente o metabolismo de hormônios no organismo atuando via receptores nucleares, receptores não esteroides, através de vias enzimáticas envolvidas na biossíntese de esteroides (DE COSTER e VAN LAREBEKE, 2012). Além disso podem interferir na produção, liberação, transporte, metabolismo, ligação ou eliminação dos hormônios naturais (BRUCKER-DAVIS, 1998; CRISP et al., 1998; HARRISON et al., 1997; SONNENSCHEIN e SOTO, 1998) e em diversos outros mecanismos relacionados ao sistema endócrino e reprodutivo. Ainda são conhecidos uma infinidade de xenoestrógenos com ação de desregulador endócrino, sendo o Bisfenol A (BFA) uma das substâncias mais amplamente estudada (MARKEY et al., 2005). BFA é um monômero formado por dois anéis fenólicos, sintetizado pela primeira vez em 1891 pelo químico russo Alexander P. Dianin em uma reação de condensação de duas moléculas de fenol com uma molécula de acetona (HUANG et al., 2012) (Figura 1, a). Décadas mais tarde, DODDS e LAWSON (1936) reportaram, pela primeira vez, efeitos estrogênicos atribuídos à molécula do BFA. A atividade estrogênica do BFA foi descoberta ocasionalmente, sendo inicialmente identificada uma proteína capaz de ligar-se ao estrogênio em leveduras e, posteriormente, estudada a existência de um ligante endógeno acoplado a esta proteína. Depois do primeiro relato de que a levedura produzia estradiol (FELDMAN et al.,.

(15) 14. 1984), esses pesquisadores verificaram que a atividade estrogênica não era proveniente da levedura, mas sim do meio de cultura preparado com água esterilizada em frasco de policarbonato (KRISHNAN et al., 1993), a substância foi purificada e identificada como sendo o BFA. Desde então, estudos realizados in vitro e in vivo foram conduzidos e não somente confirmaram os dados obtidos anteriormente, como também ampliaram o conhecimento a respeito dos efeitos prejudiciais do BFA em apresentar efeito estrogênico, antiestrogênico ou antiandrogênico (KRISHNAN et al., 1993; NEGISHI et al., 2003) em organismos vivos. Dessa forma acredita-se que a gênese de seus efeitos seja devido à alteração na síntese e liberação hormonal, assim como alterações na expressão e atividade dos seus respectivos receptores em tecidos alvo (MACLUSKY et al., 2005; XU, X. H. et al., 2010a; XU, X. H. et al., 2010b).. 1.1.1 Bisfenol A e a exposição em humanos A ideia de que a exposição de homens e animais às substâncias do meio ambiente com ação estrogênica podem resultar em alterações adversas ao desenvolvimento reprodutivo, funcional e/ou comportamental não é recente. A molécula de BFA é mundialmente conhecida por estar presente na manufatura de polímeros sintéticos, principalmente de plásticos de policarbonatos e resinas epóxi (RICHTER et al., 2007), abrangendo a produção de mamadeiras; brinquedos; utensílios domésticos; embalagens retornáveis de água; cervejas e refrigerantes; frascos para alimentos infantis ou ainda na área farmacêutica em resinas de implantes médicos e dentários (FONTENELE et al., 2010). Dessa forma, o BFA é altamente integrado em produtos de consumo diário que, consequentemente, aumentam a exposição humana a este desregulador endócrino, uma vez que existe a possibilidade de migração deste para o produto acondicionado. Em condições de alta temperatura, decréscimo de pH ou uso prolongado das embalagens plásticas, é possível a ocorrência de um aumento da migração do BFA dos polímeros sintéticos para os alimentos e bebidas (LAKIND e NAIMAN, 2011) tornando-o um importante contaminante (Figura 1, b). De fato, já foi comprovada a migração do BFA durante o processo de aquecimento, tendo sido encontrados resíduos do composto em vegetais enlatados, alimentos infantis, bebidas enlatadas e produtos cárneos e de pescado (GRUMETTO et al., 2008). Assim, a população está sujeita a repetidas exposições ao BFA, através da inalação de pó doméstico, exposição dérmica e, principalmente, por meio da dieta (VANDENBERG, L. N. et al., 2012)..

(16) 15. Após a ingestão oral, o BFA é rapidamente absorvido no trato gastrointestinal (>95% da dose). Uma grande parte do BFA ingerido pode sofrer um processo conhecido como biotransformação, na qual ocorre reações de glicuronidação e sulfatação, formando metabólitos isentos de atividade estrogênica (DEKANT e VOLKEL, 2008), os quais são mais facilmente eliminados na urina (Figura 1, c). Entretanto, o BFA livre tem sido encontrado em níveis superiores a 0,1µg/L em amostras de urina, além de estar presente no plasma, fluido folicular, sêmen, líquido amniótico, saliva, leite materno e tecido adiposo (BLOOM et al., 2011; DONG et al., 2011). Tais relatos demostram que há pouca eficiência nos processos de biotransformação e excreção do BFA. Ainda, de acordo com a literatura (DUPONT, 2011), baixas doses de BFA têm efeitos adversos sobre a fertilidade, o sistema nervoso, diabetes, câncer, obesidade, puberdade precoce, comportamento, doenças cardíacas etc. Decorrente do conhecimento das ações danosas do BFA ao organismo humano, vários países em uma tentativa de substituição da molécula de BFA têm apresentando novas medidas de segurança e controle da presença desse contaminante. No entanto, as alternativas existentes ainda são limitadas, pois, não apresentam bom desempenho, são significativamente mais caras, além de apresentarem sua própria toxicidade. Enquanto que o BFA possui excelentes propriedades físicas, químicas e mecânicas, baixa absorção de humidade e alta estabilidade térmica (HUANG et al., 2012), além de obter transparência, leveza e resistência.. Figura 1. Reações envolvendo a molécula de BFA.. (a) Reação de condensação de duas moléculas de fenol com uma molécula de acetona para formação do BFA. (b) Representação de moléculas de policarbonato. O policarbonato é composto de moléculas de BFA unidas pela.

(17) 16. ligação de ésteres. As ligações ésteres são suscetíveis à hidrólise quando expostas a altas temperaturas ou alterações de pH. Quando hidrolisado, o BFA é liberado no meio circundante. (c) Principais vias de biotransformação do BFA em humanos e roedores: conjugação com ácido glicurônico e conjugação com sulfato. Fonte: adaptado de TAYLOR et al. (2011).. 1.1.2 Aspectos toxicológicos do Bisfenol A no sistema nervoso central Uma vez que as funções dos hormônios são de grande relevância para a organização de muitos aspectos importantes do desenvolvimento animal, desde a diferenciação sexual até a organização cerebral, as substâncias químicas desreguladoras endócrinas representam um perigo especialmente para os embriões e durante as primeiras etapas da vida (SANTAMARTA, 2001). Além disso, podem afetar o desenvolvimento adulto visto que apresentam efeito acumulativo (WEILAND, 1992). Nesse contexto, torna-se importante ressaltar que durante o período de desenvolvimento, o sistema nervoso central (SNC) é altamente susceptível a alterações causadas por hormônios endógenos, uma vez que, é observada uma abundância na expressão de receptores de estrógeno nessa região, responsáveis por desempenhar papéis importantes na regulação e funcionalização dos sistemas neuronais (WEILAND, 1992; WONG e MOSS, 1992; WOOLLEY e MCEWEN, 1994). Inúmeras pesquisas têm sido realizadas para estimar os efeitos potencialmente prejudiciais da exposição ao BFA, especialmente, durante períodos em que ocorre o desenvolvimento do SNC, visto que tal substância pode alterar a homeostase hormonal e dessa forma prejudicar o desenvolvimento normal do cérebro (GIOIOSA et al., 2013; XU, X. B. et al., 2014; YU et al., 2011). Em um estudo conduzido por Farabollini e colaboladores (1999) foi demonstrado que a exposição ao BFA durante o período de desenvolvimento e diferenciação do cérebro desencadeia alterações comportamentais na idade adulta, confirmando os efeitos deletérios do BFA no SNC. Ainda, tal exposição ao BFA, apresenta inúmeros efeitos neuroquímicos que estão relacionados com modificações comportamentais em animais, tais como a hiperatividade, aumento da agressividade, depressão e ansiedade (GONCALVES et al., 2010; XU, X. et al., 2012), . Além disso, a exposição ao BFA durante os períodos pré- e pós-natal está associada a prejuízos na aprendizagem e memória de roedores devido a alterações causadas na densidade e no número de neurônios em áreas subcorticais, indispensáveis para aquisição da memória (GOLUB et al., 2010; MASUO e ISHIDO, 2011; WOLSTENHOLME et al., 2011). Xu e colaboladores (2011) demonstraram pela primeira vez que a exposição.

(18) 17. crônica ao BFA, em baixos níveis, interfere diferencial e negativamente na aprendizagem e memória espacial, assim como, na memória aversiva entre a adolescência e o início da idade adulta em camundongos machos e fêmeas.. 1.2 APRENDIZAGEM E MEMÓRIA: DEFINIÇÕES GERAIS A aprendizagem é um processo pelo qual adquirimos novas informações e conhecimentos, contudo, nem sempre memorizamos todas as informações aprendidas ao longo da vida (BEAR, 2007). A habilidade de memorização tem grande importância adaptativa às diferentes espécies, sendo a principal ferramenta que permite aos animais modificarem seus comportamentos para interagirem de maneira eficiente e segura com o ambiente. Dessa forma, define-se memória como o registro de informações e aprendizados adquiridos através de experiências vividas (IZQUIERDO, L. A. et al., 2002; KANDEL et al., 2000). É importante destacar que o aprendizado e a memória estão intimamente conectados (SQUIRE, 2008). Conseguimos aprender e lembrar de muitas coisas diferentes, que podem ser, ou não processadas e armazenadas por um único circuito neural. No entanto, de forma isolada, nenhuma estrutura cerebral ou mecanismo celular é capaz de explicar totalmente como ocorrem esses fenômenos (BEAR, 2007). A formação da memória é um processo complexo que envolve inúmeros eventos bioquímicos, neuroquímicos e moleculares em regiões específicas do cérebro (IZQUIERDO, I. e MEDINA, 1997). Neste contexto, mecanismos distintos estão relacionados e podem modular esse processo, assim como, várias substâncias podem interferir em qualquer uma de suas etapas (GIOIOSA et al., 2007). Particularmente, tem-se estudado, extensivamente, os processos de aprendizagem e memória e acredita-se que existam dois diferentes tipos quanto à natureza de seu conteúdo: a memória declarativa e a não declarativa. Ainda, a memória compreende uma sequência de três processos divididos e bem estabelecidos (Figura 2A). Durante a aquisição, que dura de segundos a poucos minutos, ocorre o processo de aprendizado inicial, em que as informações permanecem na memória de trabalho. A consolidação é o processo pelo qual uma informação adquirida é estabilizada para ser armazenada como memória de longa duração. A evocação ocorre após a memória ser consolidada, sendo um processo que permite a lembrança e o uso de informações retidas (IZQUIERDO, L. A. et al., 2002; KANDEL et al., 2000). Ainda, é importante ressaltar que as diferentes fases da memória não são lineares, ou seja, uma fase não é pré-requisito para a outra..

(19) 18. Quanto ao critério temporal, a memória pode ser classificada em diferentes tipos: memória de trabalho é aquela em que as informações estão disponíveis por segundos a minutos, sendo processada principalmente pela atividade neural no córtex pré-frontal (ZANTO et al., 2011), enquanto que na memória de curta duração (minutos a algumas horas) e na memória de longa duração (horas ou anos) a formação envolve a ocorrência de diversos eventos bioquímicos (IZQUIERDO, I. et al., 1999), originando novas conexões sinápticas (MCGAUGH, J. L. e IZQUIERDO, 2000b; QUEVEDO et al., 2003). Ainda, alguns autores classificam aquelas informações armazenadas por um período maior de tempo como memória remota (anos a décadas) (NADEL et al., 2000) (Figura 2B).. Figura 2. Fases do processamento da memória e classificação dos tipos de memória.. (A) Ilustração esquemática das fases do processamento da memória. (B) Classificação dos tipos de memória de acordo com o tempo que perduram. Fonte: (o próprio autor). A memória pode ser afetada quando as sinapses encarregadas de fazer ou evocar memórias encontram-se inibidas ou alteradas, além da idade avançada, muitas doenças são acompanhadas de perda de memória e da capacidade de aprendizado (IZQUIERDO, I. et al., 1998). A neurofisiologia da modulação da memória, referente principalmente a influência de drogas, neurotransmissores ou hormônios sobre as fases de formação e conservação da.

(20) 19. memória tem sido amplamente investigada e acredita-se que a modulação do tônus glutamatérgico seja um dos importantes passos para a formação da memória (CAHILL e MCGAUGH, 1996; MCGAUGH, J. L., 2004; MCGAUGH, JAMES L e IZQUIERDO, 2000a; QUEVEDO et al., 2003; ROESLER e SCHRODER, 2011; TULLY e BOLSHAKOV, 2010). A memória também poder ser modulada pelas emoções e pelos estados de ânimos os quais podem influenciar os processos mnemônicos (IZQUIERDO, 2002). Algumas evidências indicam que as alterações hormonais causam modificações na aprendizagem dependente do hipocampo e na formação de memória (HOJO et al., 2008). O BPA é considerado um agonista de estrogênio, porque pode ligar-se a receptores de estrogênio nucleares e não nucleares (ALONSO-MAGDALENA et al., 2012; BOUSKINE et al., 2009; SORIANO et al., 2012), sugerindo que a exposição ao BPA pode influenciar as ações estrogênicas endógenas normais. Assim, dado que a aprendizagem e a formação de memória podem ser moduladas pelo hormônio estradiol, uma exposição oral a um produto químico que desregula o funcionamento natural do sistema endócrino, tal como o BPA pode também afetar processos de aprendizagem e memória (LIU et al., 2016).. 1.3 SISTEMA GLUTAMATÉRGICO O glutamato é o principal e mais abundante neurotransmissor excitatório do SNC em mamíferos, exercendo um papel essencial em inúmeras funções cerebrais, como a neuroplasticidade (MATTSON, 2008), a memória e os processos de aprendizagem (DANBOLT, 2001). A manutenção da homeostase do sistema glutamatérgico é realizada através do equilíbrio adequado entre os processos de liberação, captação e reciclagem deste neurotransmissor (DANBOLT, 2001), sendo de grande importância para o SNC. Além disso, o metabolismo cerebral é controlado, principalmente, através de receptores presentes em neurônios pré e pós-sinápticos e nas células gliais. Os níveis de glutamato remanescentes na fenda sináptica após a liberação são controlados por transportadores de aminoácidos excitatórios pré-sinápticos e gliais (EAAT1, EAAT2, /EAAT3, EAAT4 e EAAT5) (GREWER e RAUEN, 2005; TZINGOUNIS e WADICHE, 2007; VANDENBERG, R. J. e RYAN, 2013). O ciclo do glutamato-glutamina que ocorre entre as células gliais e os neurônios tem sido proposto como a maior via de reciclagem do glutamato. Em resumo, após a recaptação do glutamato pelas células gliais e neuronais, este será primeiramente convertido à glutamina, pela ação da glutamina sintetase, que posteriormente é transportada ao neurônio e convertida a glutamato pela ação da.

(21) 20. glutaminase (AMARA e FONTANA, 2002; DANBOLT, 2001) Uma vez no neurônio, o glutamato é estocado em vesículas pela ação dos transportadores VGLUT1 e VGLUT2, para posterior liberação por exocitose (BENARROCH, 2010) (Figura 3). Entretanto, o aumento da liberação ou a diminuição da recaptação do glutamato em estados patológicos, além de alterações na ativação de receptores ionotrópicos de glutamato, podem resultar em um ciclo de retroalimentação positiva envolvendo níveis intracelulares aumentados de Ca2+, lesão celular e maior liberação do neurotransmissor glutamato. Em conjunto, tais processos podem levar à ocorrência de excitotoxicidade, definida como a ocorrência de morte neuronal causada por excitação celular excessiva podendo resultar em diversas doenças agudas e crônicas como isquemia, hipoglicemia, hipóxia e trauma (CHOI, 1988; LIPTON, 1999), além das doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington (DANBOLT, 2001; MARAGAKIS e ROTHSTEIN, 2001; SEGOVIA et al., 2001). Apesar do grande interesse na excitotoxicidade, os mecanismos intracelulares responsáveis ainda não foram completamente elucidados.. 1.3.1 Receptores glutamatérgicos Os receptores glutamatérgicos são divididos em dois grandes grupos: os ionotrópicos (iGluRs) e os metabotrópicos (mGluRs). Os iGluRs medeiam as respostas sinápticas excitatórias rápidas. Esses receptores são canais seletivos de cátions constituídos por múltiplas subunidades que, ao serem ativadas, permitem o fluxo de íons Na+, K+ e Ca2+ através das membranas plasmáticas. Os iGluRs podem ser subdivididos de acordo com a sua sensibilidade a agonistas, propriedades farmacológicas e fisiológicas em: N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido-amino- 3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiônico (AMPA) e cainato (KA) (Figura 3). Por sua vez, os mGluRs são acoplados a proteínas G e participam dos mecanismos de resposta intracelular através da ativação de segundos mensageiros. Por esse motivo, são responsáveis pela geração de respostas pós-sinápticas mais lentas (PINHEIRO e MULLE, 2008).. Figura 3. Neurotransmissão glutamatérgica e receptores ionotrópicos de glutamato.

(22) 21. (A) Síntese, liberação e recaptação do neurotransmissor excitatório glutamato (Glu): Após a liberação do Glu na fenda sináptica; este se liga a receptores ionotrópicos e metabotrópicos na membrana pós-sináptica. O Glu é removido da fenda sináptica, através da recaptação, pelos transportadores de Glu presentes nos neurônios [Gt(n)] e nas células gliais [Gt(g)]. Na célula glial, a enzima glutamina sintetase converte o Glu em glutamina (Gln). Posteriormente, a Gln é transportada da célula glial para o neurônio pré-sináptico no qual é convertida em Glu pela ação da enzima glutaminase, encerrando o ciclo glutamato-glutamina (ciclo de reciclagem do neurotransmissor) disponibilizando o Glu novamente para ser estocado nas vesículas sinápticas. (B) Ilustração esquemática dos receptores ionotrópicos de glutamato: AMPA; NMDA e Cainato. Fonte: Adaptada de FORMAN (2009). Dentre todos os grupos de receptores de glutamato o mais estudado é o NMDA, devido ao seu envolvimento com a neurotoxicidade. Os receptores NMDA são expressos primariamente no hipocampo, no córtex cerebral e na medula espinal, estando localizados na membrana pós-sináptica das sinapses excitatórias e exibindo alta permeabilidade ao Ca2+, e baixa permeabilidade ao Na+ e ao K+, característica que lhes confere um papel mais ativo em mecanismos neurotóxicos. No entanto, os receptores de NMDA desempenham um papel importante durante as fases do desenvolvimento cerebral (COLLINGRIDGE et al., 2009; SNYDER et al., 2013), atuando nos processos de regulação e controle da estrutura e função das sinapses, apresentando a função de induzir e manter a plasticidade e o desenvolvimento das sinapses, além de serem decisivos para o aprendizado e para a formação e consolidação da memória. Ainda, estão envolvidos na cognição, atenção, humor, ansiedade e em processos básicos, como a atividade locomotora e a respiração (GONDA, 2012)..

(23) 22. Existem diversos sítios de ligação no receptor NMDA, além do sítio de ligação do glutamato, que permitem diversas interações alostéricas, tais como, o sítio de ligação da glicina, o sítio de ligação de poliaminas, o sítio de ligação do zinco, o sítio de ligação da fenciclidina, o sítio de fosforilação, assim como os sítios que podem ser modulados por diferentes pH e estados redox (MARTIN et al., 1995), sendo assim, inúmeras moléculas no SNC podem atuar como moduladores desses receptores. A ativação do receptor NMDA, que permite o efluxo de K+, bem como o influxo de Na+ e Ca2+, exige 3 fatores ocorrendo simultaneamente: 1) a ligação do neurotransmissor glutamato; 2) a ligação da glicina (coagonista obrigatório); e 3) a despolarização da membrana pós-sináptica. Em potenciais de repouso os receptores de NMDA normalmente estão bloqueados por íons Mg2+ e a liberação do canal depende da despolarização da membrana (EDMONDS et al., 1995). Nesse contexto, sabe-se que estes 3 fatores provocam uma mudança na conformação alostérica do receptor diminuindo a afinidade pelo Mg2+ que é deslocado, permitindo assim o fluxo dos íons através do canal iônico (BRESSAN e PILOWSKY, 2003). Adicionalmente, os receptores NMDA são complexos transmembrana oligoméricos, formados pela combinação de uma subunidade NR1 com um dos 4 subtipos da subunidade NR2 (NR2A-D) e em alguns casos, com uma subunidade NR3 (MCBAIN e MAYER, 1994). Diferentes combinações de subunidades determinam especificidades na capacidade funcional de cada receptor. Nas regiões do pró-encéfalo tais como o hipocampo e o córtex cerebral, as subunidades NMDA R2A e R2B estão predominantemente disponíveis para formar o receptor com a subunidade NR1 (BROTHWELL et al., 2008). A expressão e a regulação adequadas dos receptores de NMDA no cérebro são críticas para os processos de aprendizagem e memória, plasticidade e maturação de sinapses (COLLINGRIDGE et al., 2009; SNYDER et al., 2013), bem como sinapses excitatórias e a formação de transmissão sináptica (ADAMS et al., 2004; SANDERSON et al., 2010). Já foi relatado que a concentração de glutamato e expressão de receptores de NMDA são considerados altamente susceptíveis a fatores de contaminação ambiental como, por exemplo, o BPA (DIAS et al., 2003; MARSDEN, 2011). A literatura relata que a exposição ao BPA durante o período perinatal causa um comprometimento na memória com uma concomitante regulação negativa dos receptores NMDA do hipocampo em camundongos machos (XU et al., 2010b). Além disso, a supressão seletiva de receptores de NMDA contendo a subunidade NMDA N2B do hipocampo resulta em danos na aprendizagem do labirinto aquático de Morris em camundongos (VON ENGELHARDT et al., 2008). Ademais, a exposição perinatal ao BPA nas doses de 0,5, 5 e 50 mg/kg/dia prejudica a memória e inibe as expressões das.

(24) 23. subunidades NMDAR1, NMDAR2A e NMDAR2B no hipocampo de roedores, tanto durante o desenvolvimento quanto na idade adulta (XU, X. H. et al., 2010b). Assim, o comprometimento da função de subunidades dos receptores de NMDA por fatores ambientais ou fatores genéticos durante as fases pré ou pós-natal podem causar o desenvolvimento anormal e prejuízos subsequentes nos processos de aprendizagem e memória.. 1.4 SELÊNIO O selênio (Se) é um elemento sólido à temperatura ambiente e pode ser encontrado tanto na forma inorgânica, como na forma orgânica sendo um micronutriente essencial, conhecido, principalmente, por sua importância na manutenção de funções biológicas em organismos vivos (EWAN, 1976). Sua importância foi reconhecida após a descoberta da doença de Keshan, uma cardiopatia infantil com alta incidência em algumas regiões da China onde o solo é extremamente pobre em Se (GE e YANG, 1993). O elemento Se pode entrar na cadeia alimentar pelas plantas que o absorvem do solo, podendo ser encontrado em diversos alimentos como: castanha-do-pará, alho, cebola, brócolis, cogumelos, cereais, pescados, ovos e carnes (DUMONT et al., 2006). Em mamíferos, o Se encontra-se altamente distribuído nos tecidos na forma de 25 diferentes tipos de selenoproteínas exercendo suas principais funções fisiológicas (BRTKOVA e BRTKO, 1996; OGAWA-WONG et al., 2016), sendo essencial para o crescimento, metabolismo, desenvolvimento, sistema imune e defesa antioxidante de organismos vivos (DODIG e CEPELAK, 2004; MOCCHEGIANI et al., 2014; STAZI e TRINTI, 2008). Sabe-se que o Se é de extrema importância para o SNC e, que concentrações baixas de Se no cérebro são responsáveis por prejudicar a função normal, podendo causar perda neuronal e alterações metabólicas (SCHWEIZER et al., 2004). Desta forma, em quadros de depleção deste nutriente, o SNC recebe oferta prioritária de Se em relação aos demais órgãos (BEHNE et al., 1988; BUCKMAN et al., 1993). O envolvimento do Se na manutenção da saúde tem despertado o interesse de muitos pesquisadores visto que, esse nutriente possui eficácia terapêutica confirmada em inúmeros modelos experimentais de doenças cerebrais (ISHRAT et al., 2009; YOUSUF et al., 2007), influenciando nas funções cognitivas (AKBARALY et al., 2007; SMORGON et al., 2004) e reduzindo a neurodegeneração em modelos de doença de Alzheimer em roedores (ISHRAT et al., 2009). No entanto, apesar do papel essencial do Se para a saúde, cabe ressaltar que os limites entre níveis essenciais e tóxicos desse nutriente são bastante próximos (LI et al., 1985)..

(25) 24. Embora os mecanismos envolvidos na toxicidade causada por Se ainda não estejam bem definidos, a Organização Mundial de Saúde (OMS) preconiza uma ingestão diária recomendada (IDR) de 34-35 μg para adultos (FAO/OMS, 2002). Sendo assim, uma IDR que exceda a capacidade corporal de eliminação pode ocasionar intoxicação, caracterizada pelos seguintes sintomas crônicos: irritação das vias respiratórias, gosto metálico na boca e edema pulmonar (DIAZ et al., 1997). Nas últimas décadas, o desenvolvimento de derivados orgânicos do elemento Se, pertencentes a classe dos organocalcogênios, vêm sendo amplamente estudados, tanto em síntese orgânica quanto em sistemas biológicos. Estes estudos são atribuídos às suas propriedades farmacológicas e toxicológicas bem como a sua maior disponibilidade e menor toxicidade em relação a forma inorgânica (NOGUEIRA, C. W. e ROCHA, 2011; NOGUEIRA, C. W. et al., 2004; PARNHAM e GRAF, 1991; YOUNG et al., 1982). Com o mesmo propósito, os compostos orgânicos de Se são alvos de pesquisa em nosso grupo.. 1.4.1 Compostos orgânicos de selênio: Disseleneto de difenila Pertencente a classe dos organocalcogênios, o disseleneto de difenila, [(PhSe)2], é uma molécula pleiotrópica e de grande potencial terapêutico (Figura 4). A literatura contém diversos trabalhos que relatam seus mais variados efeitos em diferentes modelos animais. É importante ressaltar a diversidade das ações farmacológicas relacionadas ao uso do (PhSe)2, dentre elas, atividade anti-inflamatória (NOGUEIRA e ROCHA, 2010), antidepressivo (QUINES et al., 2016), antioxidante (MANCINI et al., 2014), hepatoprotetora (BORGES et al., 2008) antiviral (SARTORI et al., 2016) e antinociceptivo (ROSA, S. G. et al., 2015).. Figura 4. Estrutura química do composto disseleneto de difenila [(PhSe)2].. O (PhSe)2 é um composto com características lipofílicas, dessa forma é capaz de atravessar facilmente a barreira hemato-encefálica, aumentando os níveis de Se no SNC, que estão relacionados principalmente a efeitos neuroprotetores (BRITO et al., 2009; GHISLENI.

(26) 25. et al., 2003; GHISLENI et al., 2008; GLASER et al., 2014) podendo interferir positivamente em muitos processos neuronais. Modelos experimentais nos quais o (PhSe)2 possui eficiência em melhorar a função cognitiva e o processo de aprendizagem em camundongos no teste de reconhecimento do objeto (ROSA, R. M. et al., 2003), melhorar a cognição de camundongos em modelos de disfunção cognitiva induzida por escopolamina (SOUZA et al., 2010), aumentar a aquisição e retenção da memória espacial em ratos no labirinto aquático de Morris (STANGHERLIN et al., 2008), além de melhorar as memórias de curta e longa duração em ratos velhos tratados com uma dieta suplementada com o (PhSe)2 (CECHELLA et al., 2014), confirmam a multiplicidade de efeitos benéficos desse composto no SNC. Adicionalmente o (PhSe)2 apresenta efeito protetor sobre a excitotoxicidade causada pelo glutamato, um neurotransmissor importante para a formação da memória (RAMPON et al., 2000) e é capaz de modular receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (PRIGOL et al., 2008). Levando-se em conta as propriedades do Se e o potencial farmacológico do (PhSe)2, torna-se importante esclarecer detalhadamente os mecanismos de ação envolvidos em seus efeitos biológicos..

(27) 26. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar o potencial efeito do tratamento com o (PhSe)2 em reverter o prejuízo cognitivo induzido pela exposição subcrônica ao BFA em camundongos machos e fêmeas durante o período pós natal. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Considerando os aspectos mencionados, os objetivos específicos desta dissertação compreendem:  Investigar se o tratamento com (PhSe)2 e/ou BFA causa alterações em diferentes tipos de memória através da avaliação de testes comportamentais em camundongos machos e fêmeas;  Determinar se o tratamento com (PhSe)2 e/ou BFA causa alterações na captação de glutamato em fatias de córtex cerebral e hipocampo de camundongos machos e fêmeas;  Avaliar se o tratamento com o (PhSe)2 e/ou com o BFA causa alterações nos níveis de proteínas envolvidas no sistema glutamatérgico em córtex cerebral e hipocampo de camundongos machos e fêmeas;  Investigar a influência do sexo no comportamento de camundongos machos e fêmeas após administração subcrônica de BFA e posterior tratamento com (PhSe)2..

(28) 27. 3 DESENVOLVIMENTO O desenvolvimento dessa dissertação está apresentado na forma de um manuscrito. Os itens Introdução, Materiais e Métodos, Resultados, Discussão e Referências Bibliográficas encontram-se descritos no próprio manuscrito, que está estruturado de acordo com as normas da revista ao qual foi submetido..

(29) 28. 3.1 MANUSCRITO Bisphenol A impairs the memory function and glutamatergic homeostasis in a sexdependent manner in mice: Beneficial effects of diphenyl diselenide. Natália S. Jardim, Glaúbia Sartori, Marcel H. M. Sari, Sabrina G. Müller; Cristina W. Nogueira. Laboratório de Síntese, Reatividade e Avaliação Farmacológica e Toxicológica de Organocalcogênios, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, CEP 97105-900, RS, Brasil. *Correspondence should be sent to: Cristina Wayne Nogueira Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, CEP 97105-900, RS, Brazil. Phone: 55-55-3220-9611 FAX: 55-55-3220-8978 E-mail: criswn@ufsm.br.

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(61) 60. 4 CONCLUSÃO Os resultados apresentados nessa dissertação permitem concluir que (Figura 5):. - O (PhSe)2 reverteu alterações em diferentes tipos de memória induzidas pela exposição subcrônica ao BFA durante o período de desenvolvimento cerebral em camundongos: reconhecimento do objeto em ambos os sexos, Morris water maze em fêmeas e esquiva passiva em machos. - O (PhSe)2 foi efetivo em reverter o decréscimo da captação de glutamato induzido pela exposição subcrônica ao BFA em camundongos na região hipocampal em ambos os sexos e cortical apenas em fêmeas. - O (PhSe)2 restaurou os níveis da subunidade 2A do receptor NMDA alterados após exposição subcrônica ao BFA durante o período de desenvolvimento cerebral em hipocampo e córtex cerebral de camundongos machos e fêmeas. - O (PhSe)2 reestabeleceu os níveis da subunidade 2B do receptor NMDA diminuidos após exposição subcrônica ao BFA durante o período de desenvolvimento cerebral somente em córtex cerebral de camundongos fêmeas. - Os efeitos do BFA em prejudicar a memória de camundongos machos e fêmeas, assim como, na homeostase glutamatérgica em regiões cerebrais (hipocampo e córtex cerebrais) foram dependentes do sexo; - Os efeitos do (PhSe)2 em reverter as alterações causadas pela exposição subcrônica ao BFA durante o período de desenvolvimento cerebral em hipocampo e córtex cerebral de camundongos machos e fêmeas foram independentes do sexo.. Os dados deste estudo demonstraram que uma exposição subcrônica ao BFA durante o período de desenvolvimento cerebral causou danos no processamento da memória e aprendizagem de camundongos e tais efeitos podem estar associados com alterações na homeostase glutamatérgica. O tratamento com o (PhSe)2 reverteu as alterações comportamentais e moleculares causadas pela exposição subcrônica ao BFA. Por fim, é importante ressaltar que o (PhSe)2 pode ser um potencial candidato ao tratamento de danos de memória causados pela exposição ao BPA. Os efeitos do (PhSe)2 podem ser atribuídos a restauração de parâmetros da homeostase glutamatérgica, no entanto, mais estudos são necessários para melhor elucidar o mecanismo exato pelo qual o composto age, bem como sugerir novos possíveis alvos de ação do composto (PhSe)2 (Figura 5)..

(62) 61. Figure 5. Representação esquemática simplificada de conclusão da presente dissertação. Linhas pontilhadas indicam possíveis alvos da ação do composto; linhas cheias indicam os resultados demonstrados nesta dissertação. Fonte: Adaptada de FORMAN (2009).

(63) 62. 5 PERSPECTIVAS A seguir, as perspectivas para trabalhos futuros:. Avaliar o efeito do (PhSe)2 em outros parâmetros do sistema glutamatérgico, visando melhor esclarecer os mecanismos pelos quais o composto age. Investigar o efeito do (PhSe)2 nos níveis de algumas proteínas que fazem parte do processo de aprendizagem e memória, visando descobrir se o composto pode modular algumas destas vias de sinalização. Realizar diferentes protocolos com exposição ao BFA e a memória, para melhor compreender o mecanismo de ação envolvido no efeito sexo-específico do BFA..

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