Influência do cilostazol na degeneração muscular de camundongos MDX

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TÚLIO DE ALMEIDA HERMES

" INFLUÊNCIA DO CILOSTAZOL NA

DEGENERAÇÃO MUSCULAR EM CAMUNDONGOS

MDX"

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

TÚLIO DE ALMEIDA HERMES

" INFLUÊNCIA DO CILOSTAZOL NA

DEGENERAÇÃO MUSCULAR EM

CAMUNDONGOS MDX"

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do Título de Mestre em Biologia Celular e Estrutural, na área de Anatomia.

Orientadora: Dra. Elaine Minatel

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pelo candidato

Túlio de Almeida Hermes

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Assinatura da Orientadora

v Campinas, 20 de Fevereiro de 2015.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Gustavo Ferreira Simões.

Assinatura

Profa. Dra. Adriana Pertille.

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Dedico...

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Agradeço...

Primeiramente à Deus, por me conceder a vida e estar presente em todos os momentos de minha vida, tantos os momentos de alegrias e felicidade, quanto os momentos tristes e difíceis.

Agradeço ao meu pai Geraldo e minha mãe Margarete, por acreditarem nos meus sonhos e estarem comigo sempre, sendo meu porto seguro e minha maior referência e exemplo de vida.

Ao meu irmão Bruno pelo companheirismo e carinho.

À minha afilhada Camila, pelo amor incondicional, e pelos momentos de alegria.

Agradeço aos meus familiares e amigos pela paciência e colaboração.

À minha namorada Ariana, pelo amor, paciência e companheirismo, e que apesar da distância, me ajuda a ter força para conquistar meus sonhos.

Agradeço à minha orientadora Professora Drª Elaine Minatel pela oportunidade a qual me foi dada, sou grato por toda confiança e dedicação, e por contribuir e muito para o meu crescimento e enriquecimento acadêmico e profissional.

Ao Dr. Luís Henrique Rapucci Moraes, amigo e companheiro de laboratório, que esteve comigo desde o começo me ajudando e ensinando, sempre com paciência e dedicação.

À equipe do Laboratório de Plasticidade Muscular, parceiros de trabalho e amigos, aos doutorandos Aline Macedo e Rafael Mâncio, ao mestre Rafael Burgos e Fernanda dos Santos, mestrandas Daniela Mizobuti e Amanda Harduim, aos iniciações cientificas, Aline Reis, Ian Feller, Priscyla Cavalcante, obrigado por toda ajuda neste trabalho e as horas de distração que me proporcionaram, muito obrigado a todos.

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À Professora Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, por ter oferecido e disponibilizado o seu laboratório para o aprendizado e realização da técnica de imunohistoquímica, meus sinceros agradecimentos.

Agradeço também a toda equipe do Laboratório de Biologia da Reprodução, em especial o Dr. Fábio Montico e a doutoranda Larissa Akemi, pela paciência e dedicação no ensinamento da técnica de imunohistoquíminca.

Agradeço aos professores do Departamento de Anatomia pelos sucessivos ensinamentos, Dr. Humberto Santo Neto, Dra. Maria Julia Marques, Dra. Valeria Quitete, Dr. Alexandre Leite, Dr. Marco César Somazz, Dr. Angelo Camilli, Dr. José Meciano, muito obrigado.

Aos amigos e colegas da Pós Graduação, Doutorandos Adriana Maurício, Juliano, Drielen, Samara e Matheus, aos Doutores Gustavo, Taize, Cintia e Felipe, sou grato a vocês pela amizade e toda ajuda que me foi dada neste tempo, sempre que precisei pude contar com vocês.

Aos técnicos e todos os funcionários do Departamento de Anatomia: Sr. Marcos, Lorivaldo, Toni, Paulo, Walter e Sra. Fátima pelos auxílios quando necessitado.

Agradeço ao Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Estrutural, em especial a secretária Liliam, pelo auxilio em todos os momentos em que necessitei, sempre muito atenciosa e dedica, obrigado.

À banca examinadora, Doutores Elaine Minatel, Marcelo Rodrigues da Cunha, Renato Ferretti, Gustavo Ferreira Simões e Adriana Pertille, por terem aceitado o convite e assim colaborar para o crescimento e enriquecimento deste trabalho.

À FUNCAMP pelo auxílio financeiro concedido durante o Programa Estágio Docente(PED).

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À CAPES e ao CNPq pelo auxílio financeiro e agilidade na prestação de seus serviços.

À todos aqueles que direta ou indiretamente se envolveram na realização deste trabalho.

À você, por prestigiar este trabalho com o seu interesse e leitura.

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“Há homens que lutam um dia e são bons. Há outros que lutam um ano e são melhores.

Há os que lutam muitos anos e são muito bons.

Porém, há os que lutam toda a vida. Esses são imprescindíveis.”

xv SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ... XVII

RESUMO ... XXI

ABSTRACT ... XXIII

1.0 INTRODUÇÃO ... 1

1.1APRESENTAÇÃO ... 1

1.2DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE (DMD) ... 2

1.3DMD E CAMUNDONGO MDX ... 5

1.4DMD E RESPOSTA INFLAMATÓRIA ... 6

1.5DMD,ESTRESSE OXIDATIVO E SISTEMA DE DEFESA ANTIOXIDANTE ... 8

1.6CILOSTAZOL ... 9 2.0 OBJETIVO ... 11 3.0 MATERIAIS E MÉTODOS ... 12 3.1ANIMAIS ... 12 3.2PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 12 3.3TRATAMENTO ... 12

3.4.MEDIÇÃO DA FORÇA MUSCULAR ... 13

3.5ANÁLISE HISTOLÓGICA ... 14

3.6REAÇÃO DIHYDROETIDIO (DHE) PARA DETECÇÃO DE EROS (O2-) ... 15

3.7DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DE MICROVASOS POR IMUNOHISTOQUIMICA (ANTI-CD31) ... 15

3.8DOSAGEM DE CREATINA-QUINASE (CK) E IL-1Β E TNF-Α EM AMOSTRAS DE SANGUE ... 16

3.9QUANTIFICAÇÃO DE TNF-Α,NF-ΚB(P65), E 4-HNE POR WESTERN BLOTTING ... 17

3.10DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA GLUTATIONA PEROXIDADE (GPX), GLUTATIONA REDUTASE (GR) E SUPERÓXIDO DISMUTASE CITOPLASMÁTICA (SOD-1), E DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA REDUZIDA (GSH). ... 19

xvi

4.0 RESULTADOS ... 21

4.1MASSA CORPORAL ... 21

4.2DETERMINAÇÃO DA FORÇA MUSCULAR ... 22

4.3ANÁLISE QUALITATIVA ... 23

4.4ANÁLISE QUANTITATIVA ... 26

4.5REAÇÃO DIHYDROETIDIO (DHE) ... 29

4.6DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DE MICROVASOS ... 31

4.7DOSAGEM DE CREATINA-QUINASE (CK) E IL-1Β E TNF-Α EM AMOSTRAS DE SANGUE ... 33

4.8QUANTIFICAÇÃO DE TNF-Α,NF-ΚB(P65), E 4-HNE(WESTERN BLOTTING) ... 34

4.9DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ... 40

5.0 DISCUSSÃO ... 42

5.1EFEITO SOBRE A DEGENERAÇÃO MUSCULAR ... 42

5.2EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO ... 44

5.3EFEITO ANTIOXIDANTE ... 46

5.4EFEITO SOBRE A VASCULARIZAÇÃO ... 47

7.0 REFERÊNCIAS ... 51

xvii LISTA DE ABREVIATURAS

4-HNE - 4-Hidroxinoneal AE - Azul de Evans ADP - Adenosina difosfato

AMPc - Adenosina cíclica - 3´,5´- monofosfato ATP - Adenosina trifosfato

BB - Músculo Bíceps Braquial BSA – Bovine serum albumin C57BL/10 - Camundongo controle CDG - Complexo distrofina-glicoproteínas CD31 – Anti-CD31 antibody CK - Creatina quinase Cox-2 - Ciclo-oxigenase-2 Ctrl - Grupo controle C57BL/10 DAB - Diaminobenzidina DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane

DIA - Músculo Diafragma DHE - Reação Dihydroetídeo

DMD - Distrofia muscular de Duchenne DOVP - Doença obstrutiva vascular periférica DTNB - Ditiobis (2-nitrobenzóico)

xviii EROs - Espécies reativas de oxigênio

e-NOS - Óxido nítrico sintase endotelial

GAPDH - Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

GPx - Gluatationa Peroxidase GR - Glutationa Redutase GSH - Glutationa Reduzida HE - Hematoxilina-Eosina H2O2 - Peróxido de hidrogênio

HClO - Ácido hipoclorito Inf. - Área de inflamação IL-1β - Interleucina 1 beta IL-6 - Interleucina 6 IgG - Imunoglobulina G

I-NOS - Óxido nítrico sintase Induzível

MAPKs - Proteínas quinase ativadas por mitógenos MC - Massa corporal

mdx- Camundongo murine dystrophin X-linked; grupo mdx controle tratado com solução

salina

mdxC - grupo mdx tratado com Cilostazol

MMPs - Matriz Metaloproteinase

NADPH - Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase

xix NC - Núcleo central

NF-kB - Fator de transcrição nuclear NP - Núcleo periférico

NO - Óxido nítrico

n-NOS - Óxido nítrico sintase neural O2- - Ânion radical superóxido OH- - Hidroxila

O2 - Oxigênio

PBS - Phosphate buffer saline (tampão fosfato salina) PDE-3 – Fosfodiesteraze 3

QUA - Músculo Quadríceps SDS - Sodium dodecyl sulfate

SOD-1 – Superóxido dismutase citoplasmática TA - Músculo tibial anterior

TBS-T - Tris-Buffered Saline - Tween 20 TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa XO – Xantina oxidase

xxi RESUMO

Estresse oxidativo e resposta inflamatória exacerbada são fatores que contribuem com a fisiopatogênese da distrofia muscular de Duchenne (DMD). No presente trabalho, avaliamos se a administração de Cilostazol, antes que se iniciem os ciclos degeneração/regeneração, diminui a degeneração muscular em camundongos mdx, modelo experimental da DMD. Nossa hipótese é que o Cilostazol possa apresentar efeito benéfico sobre as fibras musculares distróficas, uma vez que, este apresenta efeitos anti-inflamatório (reduzindo a expressão de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, IL-1β e IL-6) e antioxidante (diminuindo a atividade de superóxido e eliminando radicais hidroxilas). Para verificar o efeito do cilostazol sobre as fibras musculares distróficas, camundongos mdx, com 14 dias de vida, receberam por gavagem 100 mg/kg de Cilostazol, por 14 dias consecutivos (grupo mdxC). Camundongos mdx não tratados (grupo mdx) e da linhagem C57BL/10 (grupo Ctrl) foram utilizados como controle. A análise de medida de força realizada em todos os animais (antes e após o período de tratamento) demonstrou que os animais do grupo mdxC apresentaram maior força muscular (cerca de 32%) em relação ao grupo mdx. Na análise bioquímica da degeneração muscular (análise de creatina quinase- CK em amostras de sangue), observou-se aumento significativo nos níveis séricos de CK nos camundongos mdx em relação aos animais controle e redução significativa de 63,2% deste aumento nos mdx tratados com Cilostazol. Na análise histológica dos músculos bíceps braquial (BB), diafragma (DIA) e tibial anterior (TA), verificou-se redução de 93,6% de fibras em degeneração (indicadas pela marcação com azul de Evans) no músculo BB, redução de 66,6% e 36,7% de fibras regeneradas (indicadas pela presença de núcleo centralizado) nos músculos TA e DIA, respectivamente e redução de 39,1% na área de inflamação no músculo BB dos animais do grupo mdxC em relação ao grupo mdx. Através da técnica de western blotting, moléculas envolvidas no processo inflamatório como o TNF-α e NF-κB e um dos produtos da peroxidação lipídica, o 4-HNE, foram analisados nos músculos BB, DIA e TA. Nos animais do grupo mdxC, observou-se diminuição significativa no conteúdo de TNF-α nos músculos DIA (48,5%), TA (35,4%) e BB (45,9%) em relação ao controle. O conteúdo de NF-κB apresentou-se reduzido 25,9% no músculo DIA. O conteúdo de 4-HNE reduziu nos músculos analisados do grupos mdxC, porém esta redução não foi significativa. Na reação Dihydroetidio (DHE) para detecção de espécies

xxii reativas de oxigênio, o tratamento com Cilostazol demonstrou ser potencialmente eficaz contra o estresse oxidativo, reduzindo a marcação de DHE em 36,8%, 40,4%, e 75,4% nos músculos BB, TA e DIA, respectivamente. Na análise de vascularização, observamos que os animais tratados com Cilostazol apresentaram aumento da densidade de microvasos no tecido muscular (cerca de 42,7% para o músculo BB e 15,3% para o músculo DIA). Em relação à análise da atividade antioxidante no músculo quadríceps (QUA), identificamos aumento na quantidade de GSH (33,1%) e na atividade da GR (89,1%), no grupo mdx em relação ao Ctrl. Em relação ao tratamento, este não apresentou efeito sobre a atividade antioxidante. O conjunto dos resultados nos permite sugerir que o Cilostazol apresenta potencial efeito benéfico sobre as fibras musculares distróficas.

xxiii ABSTRACT

Oxidative stress and exacerbated inflammatory response are factors that contribute to Duchenne muscular dystrophy (DMD) pathogenesis. In this work, we evaluated whether administration of Cilostazol, before beginning the degeneration/regeneration cycles, reduces muscle degeneration in mdx mice, an experimental model of DMD. Our hypothesis is that the Cilostazol may provide beneficial effects on dystrophic muscle fibers, since this has anti-inflammatory effects (reducing the expression of proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β and IL-6) and antioxidant (decreasing the activity of superoxide and eliminating hydroxyl radicals). To evaluate the Cilostazol effects on dystrophic muscle fibers, mdx mice, 14 days old, received by gavage 100 mg/kg of Cilostazol for 14 consecutive days (mdxC group). Mdx mice untreated (mdx group) and C57BL/10 mice (group Ctrl) were used as controls. Analysis strength measurement performed in all animals (before and after the treatment period) demonstrated that the animals of the mdxC group higher muscle strength (by 32%) compared to mdx group. In biochemical analysis of muscle degeneration (creatina kinase – CK analysis in blood samples), there was significant increase in CK levels in mdx mice compared to control animals and a significant reduction by 63.2% of this increase in Cilostazol treated mdx. Histological analysis of the biceps brachial (BB), diaphragm (DIA) and tibial anterior (TA), showed a reduction of 93.6% of degenerating fibers (indicated by labeling with Evans blue) in the BB muscle, reduction of 66.6% and 36.7% of regenerated fibers (defined by central nuclei presence) in TA and DIA muscles respectively, and a reduction by 39.1% in inflammation area in BB muscle of

mdxC group compared to mdx group. By the western blotting technique, molecules

involved in inflammation such as TNF-α and NF-κB and one of the lipid peroxidation product, 4-HNE, were analyzed in the BB, DIA and TA muscles. In animals of mdxC group, we observed a significant decrease in TNF-α content in DIA (48.5%), TA (35.4%) and BB (45.9%) compared to control muscles. The NF-κB content had been reduced by 25.9% in the DIA muscle. The 4-HNE content reduced in the muscles analyzed in mdxC groups, but this reduction was not significant. In Dihydroethidium (DHE) reaction for detecting reactive oxygen species, treatment with Cilostazol shown to be potentially effective against oxidative stress, reducing DHE marking by 36.8%, 40.4% and 75.4% in

xxiv BB, TA and DIA muscles, respectively. In the vasculature analysis, we observed that cilostazol treated animals showed increased microvessel density in muscle tissue (approximately by 42.7% for the BB muscle and 15.3% for DIA muscle). On the analysis of antioxidant activity in the quadriceps (QUA), we identified an increase in the GSH content (33.1%) and GR activity (89.15) in the mdx group compared to Ctrl group. Regarding treatment, this had no effect on antioxidant activity. The results together suggest that cilostazol has a potential beneficial effect on the dystrophic muscle fibers.

1 1.0 INTRODUÇÃO

1.1 Apresentação

As distrofias musculares constitui um grupo heterogêneo de doenças geneticamente determinadas, caracterizadas por uma alteração degenerativa progressiva e irreversível da musculatura esquelética (Schmalbruch 1982). Dentre as diferentes formas, a distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a mais comum, com uma incidência de um em cada 3500 nascimentos do sexo masculino (Engel et al. 1994).

Na DMD, os sinais clínicos aparecem em torno de 2 a 3 anos de idade, com quedas frequentes, dificuldade de subir escadas, correr e levantar-se do chão. A maioria das crianças perde a capacidade de deambular no início da segunda década de vida, culminando com a insuficiência cárdio-respiratória entre 20 e 30 anos (Biggar et al. 2002).

A alteração genética ocorrida na DMD causa modificação do gene responsável pela codificação da proteína distrofina, a qual é responsável pela ancoragem do complexo distrofina-glicoproteínas (CDG) associado às proteínas do sarcolema da fibra muscular (Petrof 2002; Spencer; Mellgren 2002). A ausência da distrofina e de componentes do CDG promove instabilidade do sarcolema durante os ciclos de contração e relaxamento, ocasionando influxo exacerbado de íons cálcio, hipercontração miofibrilar, ativação de proteases endógenas e necrose da fibra muscular (Biggar et al. 2002; Bogdanovich et al. 2004).

Outros fatores associados à patogênese da DMD são o processo inflamatório e o estresse oxidativo. Sugere-se que os músculos distróficos apresentam resposta inflamatória excessiva em conseqüência à lesão das fibras musculares, independente do mecanismo que provoca a lesão. A resposta inflamatória exacerbada é um mecanismo que aumenta a mionecrose e contribui para a progressão da doença (Wehling et al. 2001; Porter et al. 2002; Hodgetts et al. 2006). No que diz respeito ao estresse oxidativo, o acúmulo intracelular de íons cálcio na fibra muscular distrófica conduz a uma produção elevada de espécies reativas de oxigênio (EROs) (Brookes et al. 2004). Marcadores de EROs foram identificados em músculos de pacientes distróficos e de camundongos mdx, modelo

2 experimental da DMD (Ragusa et al. 1997; Rodriguez; Tarnopolsky 2003). Outros trabalhos também indicam o envolvimento do estresse oxidativo na fisiopatologia da DMD. Dentre estes podemos destacar os que enfocam que as células musculares distróficas são mais susceptíveis as EROs (Disatnik et al. 1998; Rando et al. 2001); que os radicais livres contribuem para a perda da integridade da membrana nas distrofias musculares (Murphy; Kehrer 1989); redução da concentração de antioxidantes endógenos (glutationa e vitamina E) e alterações na atividade de enzimas antioxidantes nas fibras musculares distróficas (Ragusa et al. 1997; Murphy; Kehrer 1989).

Atualmente, o tratamento mais utilizado para distrofia muscular de Duchenne é a administração de glicocorticóides (Ricotti et al. 2013). Entretanto, o uso prolongado desses medicamentos produz diversos efeitos colaterais, como ganho de peso, desenvolvimento de catarata e glaucoma, retardo no desenvolvimento ósseo e surgimento de osteoporose, decorrente da perda de osso trabecular, e alterações no metabolismo da glicose, com indução ou agravamento de quadro de diabetes (Ricotti et al. 2013). Portanto, é fundamental a busca por outros fármacos que minimizem a evolução da doença, melhorem a qualidade de vida dos pacientes distróficos e ao mesmo tempo apresentem menos efeitos colaterais. Neste sentido, considerando que o processo inflamatório e o estresse oxidativo são fatores que contribuem efetivamente com a fisiopatogênese da DMD, levantamos a hipótese que o tratamento com o medicamento Cilostazol, que apresenta efeitos antiinflamatório e antioxidante, possa apresentar potencial efeito terapêutico sobre a DMD.

1.2 Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

A DMD é considerada a mais comum e devastadora das distrofias musculares, afetando aproximadamente 1 em cada 3500 crianças do sexo masculino nascidas vivas (Engel et al. 1994). Especificamente no Brasil, ocorre cerca de 700 novos casos por ano (Zatz; Pessoa 1986). É caracterizada por perda progressiva da musculatura, substituição das fibras musculares por tecido fibroadiposo e aumento do tecido conjuntivo intersticial (Engel et al. 1994).

As manifestações clínicas da DMD se tornam evidentes no início da infância, geralmente nos três primeiros anos de vida. As alterações funcionais iniciam-se com o enfraquecimento muscular, que ocorre gradualmente e de forma ascendente, simétrica e

3 bilateral, com início na cintura pélvica e membros inferiores, progredindo para musculatura de tronco e para a musculatura responsável pela sustentação da postura bípede, cintura escapular, membros superiores, pescoço e músculos que participam da mecânica respiratória (Emery 2002). A fraqueza muscular torna-se evidente por volta dos cinco anos de idade, quando as crianças apresentam sintomas iniciais, tais como dificuldade de subir escadas, pular e correr, além de quedas frequentes (Emery 2002). No início da segunda década de vida a maioria dos indivíduos perde a capacidade de deambular e fica dependente de cadeira de rodas. Embora a utilização de recursos terapêuticos seja capaz de melhorar qualidade de vida dos portadores da DMD, na maioria dos casos o óbito ocorre ao fim da segunda década de vida por falência cárdio-respiratória (Engel et al. 1994).

A DMD é uma doença recessiva ligada ao cromossomo X, sendo que as translocações e deleções detectadas neste foram observadas na banda 1 da região 2 do braço curto do cromossomo, denominada de banda Xp21. Essa banda apresenta uma seqüência de nucleotídeos responsáveis pela expressão de uma proteína composta por 3685 aminoácidos que integra o sarcolema da fibra muscular denominada distrofina (Verellen et al. 1984; Francke et al. 1985), proteína estrutural do sarcolema que desempenha papel importante na manutenção de sua estabilidade (Hoffman et al. 1987; Bonilla et al. 1988) e em processos de sinalização celular (Rando 2001). A distrofina é uma proteína que integra um complexo protéico denominado complexo distrofina-glicoproteínas (CDG) (Figura 1). Este complexo é responsável pela conexão entre o citoesqueleto da fibra muscular e a matriz extracelular, sendo importante para a manutenção da estabilidade mecânica das fibras musculares (Petrof 2002).

4 Figura 1. Esquema do complexo ditrofina-glicoproteínas (CDG), composto por distroglicano (as subunidades α- e β- são mostradas), sarcospan, complexo sarcoglicano, distrofina e utrofina, α-distrobrevina, sintrofina, actina (se ligando à distrofina) e a enzima oxido nítrico sintase neuronal (nNOS), se ligando à α-distrobrevina e sintrofina. Adaptado de Whitmore; Morgan, 2014.

Várias hipóteses procuram explicar os mecanismos que levam à degeneração muscular nos músculos distróficos. Dentre estas podemos destacar:

(1) A hipótese mecânica, a qual sugere que a inexistência da ligação entre os meios intra e extracelular, decorrente da ausência da distrofina e das demais proteínas do CDG, torna o sarcolema mecanicamente instável (Engel et al. 1994). A instabilidade mecânica faz com que os músculos se tornem susceptíveis à lesão durante os ciclos de contração e relaxamento. Em virtude desta fragilidade, ocorrem áreas de descontinuidade do sarcolema permitindo a passagem de substâncias do meio extracelular para o meio intracelular, como o íon cálcio, e de substâncias do meio intracelular para o meio extracelular, como a enzima creatinoquinase (CK) (Engel et al. 1994).

(2) O envolvimento das espécies reativas de oxigênio (EROs) na patogênese das distrofinopatias. A hipótese de que as EROs estejam envolvidas na fisiopatologia das

5 distrofias musculares foi inicialmente baseada nas similaridades entre as mudanças patológicas que ocorrem na DMD e mudanças que ocorrem no músculo sob diferentes condições de estresse oxidativo, como isquemia, exercício físico intenso e deficiência de vitamina E (Murphy; Kehrer 1989). Além disso, verificou-se peroxidação lipídica na membrana celular causada pelo aumento da produção de EROs no período que antecede a qualquer necrose nas fibras distróficas (Disatnik et al. 1998).

(3) Participação de fatores inflamatórios liberados por neutrófilos, macrófagos e citocinas, como o fator de necrose tumoral α (TNF-α) (Whitehead et al. 2006). Os músculos distróficos apresentam resposta inflamatória excessiva em conseqüência à lesão das fibras musculares, independente do mecanismo que provoca a lesão. A resposta inflamatória exacerbada é um mecanismo que aumenta a mionecrose e contribui para a progressão da doença (Hodgetts et al. 2006).

1.3 DMD e Camundongo mdx

O uso de modelos animais, como camundongos por exemplo, é fundamental para o melhor entendimento da fibra muscular distrófica e para a investigação de terapias moleculares, celulares e farmacológicas.

Um dos modelos experimentais mais utilizado nos estudos da compreensão dos aspectos da biologia dos músculos esqueléticos distróficos e dos mecanismos envolvidos na DMD é o camundongo mdx (Bulfield et al. 1984). Esta linhagem, denominada C57BL/10

mdx (X chromosome-linked muscular dystrophy) surgiu espontaneamente da linhagem

C57BL/10 e foi descoberta ao acaso durante a realização de estudos sobre alterações nos glóbulos vermelhos (Bulfield et al. 1984). Nos camundongos mdx o gene afetado é homólogo ao dos pacientes com DMD, o que faz com que apresentem deficiência na produção de distrofina nas suas fibras musculares, reproduzindo assim, as características das fibras musculares dos pacientes portadores de DMD (Bulfield et al. 1984).

Apesar da ausência da distrofina ser um achado comum tanto nos pacientes portadores de DMD quanto nos camundongos mdx, estes diferem da distrofia humana por não apresentarem fibrose intensa e depósito de tecido adiposo na maioria dos tecidos musculares esqueléticos (Cullen; Jaros 1988), e machos e fêmeas são afetados (Torres; Duchen 1987). Uma outra diferença é que os múculos de camundongos mdx regeneram

6 sucessivamente após um período de necrose (Torres; Duchen 1987). Nos músculos de camundongos mdx os ciclos de degeneração/regeneração se iniciam efetivamente por volta dos 20 dias de idade. Estudos mostraram que no sétimo dia pós-nascimento os camundongos apresentam cerca de 0,62% das fibras musculares regeneradas. No décimo quarto e vigésimo primeiro dias, 2,2% e 5%, respectivamente, período caracterizado como estado pré-necrótico (Minatel et al. 2003). No período entre 21 e 28 dias de vida pós-natal, observa-se extensa área de inflamação e necrose no músculo tibial anterior destes animais (Shavlakadze et al. 2004). A intensa necrose miofibrilar, observada neste período, providencia um excelente modelo para o estudo de intervenções terapêuticas designadas para prevenir ou reduzir a necrose, uma vez que a redução da miopatia é facilmente identificada (Radley; Grounds 2006). Entre 35 e 90 dias a necrose atinge seu ápice, comprometendo um grande número de fibras. Neste período encontram-se mais de 50% das fibras do músculo em regeneração, com diâmetro variável e centronucleação. Com cerca de 120 dias de idade, praticamente todas as fibras do músculo encontram-se regeneradas (Tanabe et al. 1986). Independentemente das diferenças observadas em relação aos pacientes distróficos, o camundongo mdx apresenta intenso processo inflamatório, o qual é uma característica patológica proeminente na DMD (Hodgetts et al. 2006; Radley; Grounds 2006).

1.4 DMD e Resposta Inflamatória

A resposta inflamatória do tecido muscular se inicia logo após a morte das fibras musculares. Ela compreende uma série de eventos que envolvem a integração do sistema imunológico com o tecido lesado e sua finalidade é o reparo tecidual, para que a regeneração possa acontecer (Prisk; Huard 2003).

As fibras musculares em degeneração liberam várias substâncias, dentre as quais se destacam as citocinas pró-inflamatórias, proteases, prostaglandinas, colagenases, fatores quimiotáticos e fatores de crescimento. As citocinas pró-inflamatórias e os fatores quimiotáticos estimulam o deslocamento de células inflamatórias, principalmente neutrófilos e macrófagos, para local da lesão (Tidball 2005). Os neutrófilos e macrófagos liberam proteases que degradam os fragmentos celulares e fagocitam estes fragmentos,

7 auxiliando na remoção dos mesmos do local da lesão. As proteases liberadas por estas células podem provocar danos ao tecido muscular íntegro que circunda a lesão e assim aumentar a área da lesão, gerando aumento da resposta inflamatória local (para revisão ver Tidball 2005).

Em condições patológicas tais como nas miopatias e nas distrofias, a resposta inflamatória excessiva também pode promover mionecrose. Verificou-se, tanto no paciente distrófico quanto no camundongo mdx, um elevado nível de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, e do fator de transcrição nuclear kappa-B (NF-κB) (Kumar; Boriek 2003; Grounds et al. 2008).

O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória expressa por células inflamatórias, mioblastos, miotubos e músculo esquelético lesado (Kuru et al. 2003). É também produzido por tecido adiposo (Weisberg et al. 2003; Fruhbeck 2004), o qual é frequentemente pronunciado na DMD. Em resposta a menor lesão muscular, o TNF-α é rapidamente liberado por mastócitos e também por neutrófilos, acumulando-se próximo ao local lesado (Tidball 2005; Radley; Grounds 2006). Também é um potente fator quimiotáxico atraindo células inflamatórias para a área lesada (Peterson et al. 2006). Tem sido proposto que o aumento exacerbado de TNF-α e de neutrófilos, no início do dano sarcolemal conduz a necrose das fibras musculares distróficas. Reforçando esta hipótese, o bloqueio in vivo do TNF-α por cromoglicato de sódio, prevenindo a degranulação de mastócitos que liberam altos níveis de TNF-α (Radley; Grounds 2006), depleção de neutrófilos hospedeiros, bloqueio da função do TNF- α com Enbrel (Hodgetts et al. 2006) ou com Remicade (Grounds; Torrisi 2004) protege os camundongos mdx da necrose muscular.

Com relação ao NF-κB, este fator regula a expressão de genes envolvidos nas respostas inflamatória e imunológica, aumentando a taxa de transcrição desses genes, com consequente síntese de mRNA e proteínas. Apresenta papel importante na produção de mediadores pró-inflamatórios (citocinas, enzimas, receptores imunes e moléculas de adesão), além de iniciar a transcrição de citocinas como TNF-α, IL-1β, IL-2 e IL-6 (Celec 2004). Em fibras musculares distróficas, o aumento de sua expressão e/ou ativação está associado ao aumento do conteúdo de diversas moléculas inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF-α, moléculas de adesão e matrix metaloproteinase-9, as quais podem causar direta ou indiretamente perda muscular (Reid; Li 2001; Senftleben; Karin 2002). Enquanto que, a

8 inibição do fator NF-κB em fibras musculares distróficas de camundongos mdx foi acompanhada da diminuição da mionecrose (Yang et al. 2012; Tang et al. 2010).

1.5 DMD, Estresse Oxidativo e Sistema de Defesa Antioxidante

A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), entre outras espécies reativas, é parte integrante do metabolismo humano e é observada em diversas condições fisiológicas. Normalmente quando sua produção é exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilíbrio. No entanto, em condições de exaustão, é criado um estado de estresse oxidativo, levando a danos no sistema biológico (Vasconcelos et al. 2007).

O sistema antioxidante, segundo Zwart e Meerman (1999) é composto por enzimas (Superóxido Dismutase, SOD; Catalase, CAT e Glutationa Peroxidase, GPx) e substâncias protetoras não enzimáticas (inclui especialmente compostos de origem dietética, dentre os quais se destacam as vitaminas, minerais e compostos fenólicos), algumas atuam reduzindo a velocidade de iniciação dos processos radicalares, suprimindo a geração de radicais livres, ou eliminando-os; Outras enzimas, tais como a GPx e CAT, decompõem hidroperóxidos lipídicos e o peróxido de hidrogênio sem gerar radicais livres. Proteínas transportadoras de íons ferro e cobre como a transferrina e a ceruloplasmina, atuam impedindo que estes metais catalisem reações oxidativas, já os carotenóides e a enzima superóxido dismutase atuam suprimindo o oxigênio singleto (O2) e catalisando a desmutação do ânion radical

superóxido, respectivamente (Fridovich 1997; Fang et al. 2002).

No músculo distrófico, o estresse oxidativo tem sido considerado um dos mecanismos primários da degeneração muscular, ao invés de ser um efeito secundário deste processo (Whitehead et al. 2006). Marcadores de EROs foram identificados em músculos de pacientes distróficos e de camundongos mdx, modelo experimental da DMD (Ragusa et al. 1997; Rodriguez; Tarnopolsky 2003). Evidenciando o dano oxidativo nos músculos distróficos, tratamentos com antioxidantes que inibem a formação de EROs, como por exemplo, N-Acetilcisteina, chá verde, ácido ascórbico, mostraram resultados positivos no tratamento da distrofia muscular (Evans et al. 2010; Tonon et al. 2012; de Senzi et al. 2013), evidenciados por diminuição da fraqueza muscular e redução da degeneração muscular.

9 1.6 Cilostazol

O Cilostazol (6-[4-(1-ciclohexil-1H-tetrazol-5-yl)butoxi]-3,4-dihidro-2(1H)-quinolinona) (Figura 2) é descrito como sendo um inibidor seletivo da enzima fosfodiesterase tipo 3A (PDE-3), gerando desta forma, aumento de adenosina cíclica - 3´,5´- monofosfato (AMPc), presente em células trombolíticas e musculares lisas, caracterizando um dos efeitos farmacológico do medicamento que é um potente antiagregante plaquetário, antitrombolítico e vasodilatador (Schror 2002). Por esta razão é na pratica clínica comumente usado para tratamento de doenças obstrutivas vasculares periféricas (DOVP) (Yasuda et al. 1985, Kamiya; Sakaguchi 1985) como a claudicação intermitente (Regensteiner et al. 2002).

Figura 2. Estrutura química do Cilostazol (Schror 2002)

Estudos recentes demonstraram que o Cilostazol também desempenha efeito anti-inflamatório. Experimentos in vitro e in vivo demonstraram que o Cilostazol reduziu significantemente a expressão dos níveis de TNF-α, IL-1β e IL-6 (Mendes et al. 2009; Park et al. 2010). Segundo Park e colaboradores (2010), esta redução está associada ao efeito do Cilostazol em inibir a ativação o fator NF-κB. Geralmente, o NF-κB está presente no citosol associado com a sua proteína inibitória (IKB-α), mas quando esta é degradada o NF-κB transloca para o núcleo e ativa o processo de transcrição de diversos genes relacionados à inflamação e sua ativação pode induzir a transcrição das citocinas pró-inflamatórias e também de quimiocinas, moléculas de adesão, matriz metaloproteinase (MMPs), ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzível (i-NOS) (Tak; Firestein 2001).

10 Portanto admite-se que com a inibição da translocação do NF-κB para o núcleo, não ocorra à transcrição das citocinas pró-inflamatórias.

Outros dois efeitos são também atribuídos ao Cilostazol: efeito antioxidante e o de promover neo-vascularização. O Cilostazol atuou como antioxidante diminuindo o superóxido (Lee et al. 2005) e eliminandoos radicais hidroxila (Choi et al. 2002).

Quanto ao efeito de promover neo-vascularização, recentemente verificou-se que o cilostazol promoveu neo-vascularização em resposta a isquemia tecidual via mecanismo dependente de óxido nítrico (NO), estimulando a ativação da enzima e-NOS (Hori et al. 2012). Para a manutenção do fluxo sanguíneo adequado para o tecido muscular durante a contração, o NO atua na vasoconstricção simpática no músculo durante o período de contração muscular, diminuindo-a a fim de adequar o fluxo sanguíneo à necessidade fisiológica do tecido.

Um dado interessante, é que nos músculos distróficos, a ação protetora do NO (descrita acima) é deficiente e os músculos ficam sujeitos à ocorrência de isquemia durante o desempenho de suas atividades. Uma das hipóteses sugeridas para a mionecrose ocorrida na DMD é que esta isquemia pode desencadear eventos que culminam com a morte de fibras musculares (Kaminski; Andrade 2001). Reforçando essa hipótese, pacientes distróficos apresentaram isquemia em músculos esqueléticos e cardíaco e verificou-se redução da expressão da n-NOS e e-NOS em camundongos mdx (Kaminski; Andrade 2001; Loufrani et al. 2004).

Diante do exposto, sugerimos que o Cilostazol, além de sua ação antiinflamatória e antioxidante, também possa apresentar potencial efeito sobre a vascularização do tecido muscular distrófico e consequentemente reduzir a mionecrose.

11 2.0 OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito do tratamento com Cilostazol sobre as fibras musculares distróficas do camundongo mdx.

2.2 Objetivos específicos

- Avaliar se a administração do Cilostazol interfere no ganho de massa corporal e reduz a perda de força muscular nos camundongos mdx;

- Avaliar se a administração do Cilostazol, antes que se iniciem os ciclos degeneração/regeneração, diminui a degeneração muscular em camundongos mdx;

- Avaliar se a administração do Cilostazol reduz o estresse oxidativo nos camundongos

mdx;

- Avaliar se a administração do Cilostazol diminui a resposta inflamatória nos camundongos mdx;

- Avaliar o efeito da administração do Cilostazol sobre a vascularização do tecido muscular distrófico.

12 3.0 Materiais e Métodos

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos das linhagens mdx e C57BL/10 (camundongos heterozigotos para o gene que desencadeia a DMD e que deram origem à linhagem mdx), de ambos os sexos, com 14 dias de vida pós-natal, obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica da UNICAMP. Durante todo o experimento, os animais foram mantidos em caixas plásticas com 12 horas de ciclo claro/escuro, ração e água ad libitum. Os protocolos experimentais foram desenvolvidos de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e aprovados pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (protocolo número 3115-1; Anexo 1).

3.2 Protocolo Experimental

Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais:

Grupo controle: constituído de 20 camundongos da linhagem C57BL/10.

Grupo mdx: constituído de 40 camundongos da linhagem mdx divididos em 2 subgrupos (n=20 cada): mdx (tratado com solução salina) e mdxC (tratado com Cilostazol).

3.3 Tratamento

A partir do 14o dia de vida pós-natal, os animais do grupo mdxC foram pesados diariamente e tratados por 14 dias com 100 mg/kg de Cilostazol® (Eurofarma, M.S. 1.0043.0992.006-8) diluído em 0,05mL de solução salina (Matsumoto et al. 2008) por gavagem. Camundongos do grupo mdx receberam 0,05mL de solução salina pela mesma via e período.

13 3.4. Medição da força muscular

Para análise da força dos camundongos (n=20) foi utilizado um aparelho composto por: uma base onde o animal é colocado, uma barra de tração ligada a um transdutor de força (o qual mede a força de tração aplicada a barra), e um aparelho chamado amplificador de pico de tração, que apresenta um display digital responsável por registrar a tração máxima (expresso em gramas) aplicada à barra feita pelo animal imediatamente antes dele se soltar. O aparelho é conectado ao transdutor de força através de um cabo (Figura 3). Procedimento: O camundongo é colocado sobre a base do aparelho, em frente à barra de tração de forma triangular. Instintivamente, o camundongo segura o triângulo com suas patas dianteiras enquanto é tracionado para trás pela cauda, soltando somente quando é incapaz de manter-se agarrado. Assim que o animal solta o triângulo de tração, o resultado é obtido através da média das três maiores medidas, obtendo-se assim a pontuação de força.

14 3.5 Análise Histológica

Doze horas antes do sacrifício, os animais (n=5 de cada grupo experimental) foram pesados e 0,1 ml de uma solução a 1% de azul de Evans (AE) para cada 10g de camundongo, foi injetada intraperitonealmente. O corante AE (tetrasodiumdiazosalt Evans blue dye; Sigma) é uma molécula impermeável à membrana plasmática, não penetrando em fibras musculares esqueléticas de camundongos normais. O corante liga-se a albumina sérica e penetra na fibra muscular quando a membrana não está íntegra. A marcação in vivo com este corante possibilita detectar alterações de permeabilidade do sarcolema e fibras em degeneração precocemente, fornecendo informações sobre algumas características dinâmicas e estruturais de músculos esqueléticos normais e portadores de patologias (Matsuda et al., 1995). Após o tempo acima referido, os animais foram anestesiados via intraperitoneal com solução de cloridrato de xilazina 2% (Vyrbaxyl, Virbac) e cloridrato de quetamina (Francotar, Virbac) na proporção de 1:1 e dose de 0,1mL/30g de peso corporal. Os músculos bíceps braquial (BB), diafragma (DIA) e tibial anterior (TA) foram retirados, congelados primeiramente em isopentano a –90ºC resfriado em nitrogênio líquido, em seguida foram inseridos em nitrogênio líquido a –159ºC e armazenados em biofreezer a – 70ºC. Para obtenção dos cortes em criostato (Microm-HS%/%E) os músculos foram mantidos a –23ºC, seccionados transversalmente na espessura de 8 m e coletados em lâmina. Foram obtidas 06 lâminas com cerca de 12 cortes de cada músculo dos referidos grupos experimentais, dessas 03 foram banhadas com acetona por 15 minutos e posteriormente montadas em meio de montagem DABCO (Sigma) para fluorescência para visualização das fibras coradas com AE e 03 foram coradas com HE e montadas em resina. Para a verificação da penetração do AE nas fibras musculares, foram analisados dois cortes de cada músculo em microscópio óptico de fluorescência (Nikon). O número de fibras coradas foi quantificado e expresso em porcentagem em relação ao número total de fibras da mesma secção. As lâminas coradas com HE foram observadas em microscópio de luz. Foi avaliado o número de fibras que apresentam núcleo central (indicativo de fibras musculares regeneradas – Torres; Duchen 1987), de fibras com núcleo periférico

15 (característica de fibras normais) e foram delimitadas as áreas de inflamação (Infl.). A contagem da população de fibras foi obtida através de um retículo de cem pontos acoplado à ocular do microscópio em objetiva de 40X, com auxílio de um contador manual. Todas as fibras dos cortes (fibras normais e regeneradas) foram contadas para estimar a população total de fibras de cada músculo, possibilitando a obtenção da porcentagem de fibras normais e regeneradas dos animais empregados no experimento. Para delimitar a área de inflamação, as imagens foram capturadas por uma câmera fotográfica acoplada ao microscópio. As imagens foram analisadas pelo programa Image- Pro Express. A área total da secção transversal de cada músculo foi obtida por meio da soma das partes fotografadas.

3.6 Reação Dihydroetidio (DHE) para detecção de EROs (O2-₎

Os animais foram anestesiados conforme descrito no item 3.5. A produção de EROs, ânion superóxido (O2-) especificamente, foi determinada por incubação dos cortes

histológicos dos músculos BB, DIA e TA com 5 μl de DHE em PBS a 37◦C durante 30 min. A intensidade de DHE reativo por área do músculo foi quantificada através da mensuração de pixels excedente a um limite (70-255 comprimento de onda), que foi ajustado de forma a eliminar a interferência de qualquer fluorescência de fundo.

3.7 Determinação da densidade de microvasos por imunohistoquimica (anti-CD31)

Secções dos músculos BB, DIA e TA foram submetidas à fixação em paraformoldeído 4% por 20 minutos. O bloqueio das peroxidases endógenas foi obtido com H2O2 (0,3% em metanol) por 15 minutos. Solução bloqueadora com albumina soro bovino

(3%) em tampão TBS-T por 1 hora foi utilizada. Posteriormente, o antígeno, CD31 foi localizado através do anticorpo policlonal goat (sc-1506) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) para CD31, diluído (1:50) em BSA 1% e armazenado overnight a 4 ºC. O kit Envision HRP (Dako Cytomation Inc., CA, USA) foi usado para detecção dos antígeno, de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagem com tampão TBS-T, os cortes foram incubados com anticorpo secundário HRP conjugado proveniente do kit Envision (Dako) por 40 minutos e, posteriormente revelados com diaminobenzidina (DAB). Para a contra-coloração destes, foi utilizado Hematoxilina de Harris. Os cortes de cada músculo citado

16 foram avaliadas a partir do precipitado de cor castanho de DAB, o qual indicou a imunorreatividade do anticorpo.

A determinação da densidade de microvasos foi realizada por meio da contagem do número de vasos sanguíneos com marcação positiva para CD31 em 3 animais de cada grupo experimental. Para tal foram definidos 10 campos aleatórios e sem sobreposição por animal, fixando-se as observações com a objetiva de 40X. Tais campos foram fotografados no fotomicroscópio Nikon Eclipse E-400 (Nikon, Tóquio, Japão) e a seguir submetidos à contagem dos vasos CD31 positivos através do programa Nis-Elements: Advanced Research (EUA). A densidade de microvasos foi expressa como o valor médio obtido nos 10 campos de cada animal (Hochberg et al. 2002). De acordo com os critérios estabelecidos por Weidner et al. (1993), qualquer célula ou grupo de células endoteliais com coloração acastanhada, nitidamente distintos de microvasos adjacentes e de outros elementos de tecido conjuntivo foram considerados como microvasos contabilizáveis. Além disso, a presença de lúmen não foi necessária para que uma estrutura seja definida como um microvaso (Weidner et al. 1993).

3.8 Dosagem de Creatina-Quinase (CK) e IL-1β e TNF-α em amostras de sangue

Após os tratamentos, os animais (n=10 de cada grupo experimental) foram anestesiados conforme descrito no item 3.5. A seguir, amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca. Parte das amostras foi utilizada para determinar a atividade de CK e a outra parte para dosagem das citocinas IL-1β e TNF-α.

Determinação da atividade de CK

As amostras foram centrifugadas (centrifuga refrigerada Sigma® 3-18K) a 3000 rpm, por 10 minutos a 4 °C. O soro obtido foi utilizado para determinar a atividade de CK através do kit CK Nac Cinético Crystal da Bioclin. As absorbâncias das amostras foram lidas a 25 °C utilizando-se o equipamento Multi-Mode Microplate Reader Model Synergy H1M (Bio-Tek Instruments) com comprimento de onda de 340 nm, conforme descrito por Matsumura et al. (2009).

17 Dosagem das citocinas IL-1β e TNF-α por método imunoenzimático

As amostras foram centrifugadas (centrifuga refrigerada Sigma® 3-18K) a 5000 rpm, por 10 minutos. O soro obtido foi utilizado para determinar a dosagem de IL-1β e TNF-α (Plomgaard et al. 2007), utilizando-se reagentes comerciais pelo método imunoenzimático (Invitrogen, Life technologies). As absorbâncias das amostras foram lidas utilizando-se o equipamento Multi-Mode Microplate Reader Model Synergy H1M (Bio-Tek Instruments) com comprimento de onda de 450 nm.

3.9 Quantificação de TNF-α, NF-κB (p65), e 4-HNE por western blotting

Depois da retirada do sangue, os animais foram perfundidos com PBS e os músculos BB, DIA e TA foram retirados e congelados. A seguir, os músculos foram homogeneizados em 2 ml de tampão para homogeneização (Triton X-100 1%, tris-HCl 100 mM (ph 7,4), pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio 100mM, ETDA 10mM, ortovanadato de sódio 10 mM, PMSF 2 mM e 0,1 mg/ml de aprotinina) a 4 ºC usando homogeneizador tipo Polytron PTA 20S (modelo PT 10/35; Kinematica Ag) operando em velocidade máxima por 30 segundos. Os extratos centrifugados a 11000 rpm a 4 ºC por 20 min e o sobrenadante foi utilizado para análise do extrato total. A determinação de proteína foi realizada pelo método de Bradford et al. (1976). As amostras do extrato proteico foram tratadas com tampão Laemmli (azul de bromofenol 0,1% e fosfato de sódio 1 M pH 7,0, glicerol 50% e SDS 10%), acrescido de ditiotreitol 100 mM, aquecidas em água fervente por 5 min e centrifugadas por 1 min. Em seguida, 30 µg de proteína foram aplicados em gel SDS-poliacrilamida (12-16%) em aparelho para eletroforese da Bio-Rad (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA). A eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose foi realizada em 90 minutos a 120 V (constante) em aparelho de transferência da Bio-Rad. As membranas foram incubadas com solução basal (Trisma base 10 mM, cloreto de sódio 150 mM e Tween-20 0,02%) contendo 5% de leite desnatado, por 2 horas em temperatura ambiente para reduzir a ligação não específica de proteínas. Posteriormente, foram incubadas com 10µg de anticorpo primário diluído em 10 ml de solução basal contendo 3% de leite desnatado a 4 ºC overnight. No dia seguinte, as

18 membranas foram lavadas por 30 minutos com solução basal e incubadas em 10 ml de solução basal contendo 1% de leite desnatado e 2,5µg de anticorpo secundário por duas horas em temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram novamente lavadas por 30 minutos com solução basal. Para detectar as bandas imunorreativas, as membranas foram expostas à solução de quimioluminescência (Super Signal West Pico Chemiluminescente, Pierce) por 5 minutos, e o sinal fluorescente capturado no equipamento G-Box (GeneSys). A quantificação da densitometria óptica foi verificada por meio do programa Image J (Image Processing and Analysis in Java).

Para a normalização dos dados obtidos foi realizado o controle interno através da incubação das amostras com o anticorpo GAPDH (FL-335, rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology). O protocolo consiste na reutilização das membranas utilizadas para marcação de TNF-α, NF-κB e 4-HNE. Para tanto, as referidas membranas foram lavadas com TBS-T (solução basal) 3 vezes, por 10 min. Em seguida, foram incubadas com 10 mL de Stripping Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5; β-Mercaptoethanol 0.1 M; Uréia 8 M) durante 1 hora, à 60 °C. Após esse período, as membranas foram reequilibradas e lavadas com TBS-T. A seguir foram incubadas com 10 mg do anticorpo primário GAPDH e 2,5 mg do anticorpo secundário, seguindo o protocolo acima descrito.

Anticorpos primários utilizados: - TNF-α, policlonal, Chemicon;

- anti-NF-κB, policlonal, p65, Santa Cruz Biotechnology; - 4-HNE, policlonal, Santa Cruz Biotechnology.

Anticorpos secundários utilizados:

- Goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004 (Santa Cruz); - Goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005 (Santa Cruz).

19 3.10 Determinação da atividade enzimática da glutationa peroxidade (GPx), glutationa redutase (GR) e superóxido dismutase citoplasmática (SOD-1), e dos níveis de glutationa reduzida (GSH).

Após os tratamentos, os animais (n=5 de cada grupo experimental) foram anestesiados como descrito anteriormente e o músculo quadriceps (QUA) foi retirado. As amostras foram homogeneizadas em homogeneizador de tecidos com 1 ml de solução tampão fosfato tamponado (PBS), imediatamente imersas em nitrogênio líquido e armazenadas em biofreezer (-70ºC). Posteriormente foram utilizadas para quantificação da atividade enzimática e dos níveis dos grupamentos sulfidrila (tiol) – GSH

GPx

O homogenato de tecido muscular foi diluído em tampão fosfato (1: 10). Em 100 μL desta solução foi adicionado 50 μL H2O2 (0.25 mM), 20 μL de glutationa reduzida (GSH)

(10 mM), 20 μL NADPH (4 mM), 10 μL (1 U) de enzima glutationa redutase em PBS, pH 7,8. A absorbância foi lida em espectrofotômetro a 365 nm. Os resultados foram expressos em nmol/mim por mg de proteína.

GR

A atividade dessa enzima foi determinada seguindo-se espectrofotometricamente a oxidação de NADPH a 340 nm. A reação enzimática foi constituída de 100 μL do homogenato previamente diluído em tampão fosfato (1:10), 50 μL de tampão fosfato (1 M), pH=7, 10 μL de EDTA (0,2 mM, 20 μL de GSSG (1 mM) e 20 μL de NADPH (0,1 mM). O consumo de NADPH foi determinado pela diminuição da absorbância à 340 nm. A atividade da enzima foi definida como nmol NADPH consumido/min/mg de proteína.

SOD-1

A atividade da SOD-1 foi determinada pela inibição da redução do NBT (nitro blue tetrazolium) pelo radical superóxido gerado através do sistema hipoxantina/ xantina oxidase (XO) à 37º C. O homogenato de tecido foi diluído em tampão fosfato (1:10). Em 100 μL desta solução, foram adicionados 40 μL de tampão fosfato 0.1 M (pH: 7.4), xantina 0.07 U/ml, 20 μL de hipoxantina (100 μM) e 20 μL de NBT. A absorbância foi lida em espectrofotômetro a 560 nm. Os resultados foram expressos em U/mg de proteína.

20 Dosagem de grupamentos sulfidrila – GSH

As amostras foram centrifugadas (12000 rpm, a 4°C, por 15 minutos) e o sobrenadante diluído (1:10) em tampão fosfato de sódio (0, 1 M, pH = 7,4). Em seguida, foi realizada a leitura da absorbância de 100 mL da amostra, acrescidos de 100 mL de solução de Tris (1,0 mM) e EDTA (0,02 mM), a 412 nm (A1). Após esta leitura foi adicionado 20 mL de ácido 5,5 ditiobis (2-nitrobenzóico) diluído em metanol (DTNB – 0,01mM) e então foi realizada uma nova leitura (A2), a 412 nm, após 15 min de reação, para determinação de grupamentos sulfidrila não protéicos (GSH). A concentração de grupamentos sulfidrila (tiol) é dada por (A1-A2) x1,57 (Faure; Lafond, 1995).

3.11 Análise Estatística

Para análise estatística foi utilizado o software GraphPad Prism 5®, em que foi aplicado o teste ANOVA One Way seguido do teste Tukey para as devidas comparações entre os grupos, e os dados apresentados por meio de média e desvio padrão.

21 4.0 Resultados

4.1 Massa corporal

Determinamos o ganho de massa corporal dos animais de todos os grupos, dado pela porcentagem da média da massa corporal de todos os animais ao 28º dia de vida, em relação à média da massa corporal ao 14º dia de vida (14º ao 28º dia de vida corresponde ao período de tratamento com o Cilostazol). Verificamos que os grupos apresentaram ganho de massa corporal entre 50 e 81% (Tabela 1). Estes dados indicam que o tratamento com Cilostazol não interfere no ganho de peso dos camundongos mdx.

Tabela 1. Representação do ganho de massa corporal dos grupos Ctrl, mdx, mdxC no período de tratamento.

Valores são expressos como média ± desvio padrão (n=5 camundongos por grupo). Ctrl: camundongos C57BL/10 utilizados como controle; mdx: camundongo tratados com solução salina; mdxC: camundongos tratados com Cilostazol.14º dia: início do tratamento com Cilostazol; 28º dia: final do tratamento com Cilostazol; Ganho de MC: Porcentagem de ganho de massa corporal no período de tratamento.

14º dia 28º dia Ganho de MC

Massa corporal (g) Massa corporal (g) (%)

Ctrl 6,47±0,75 11,76±1,28 81,76

mdx 7,39±0,80 11,09±0,98 50,06

22 4.2 Determinação da força muscular

No início do tratamento com Cilostazol, nota-se que os animais distróficos, tratados e não tratados, não apresentaram diferença significativa entre si, em relação à força de tração. Já os animais do grupo controle, no mesmo período, apresentaram uma força de tração relativamente maior que os grupos mdx e mdxC (ver Tabela 2). No 28º dia de tratamento, os animais tratados com Cilostazol apresentaram maior força muscular (cerca de 32%) em relação ao grupo mdx, porém ainda diferem do grupo Ctrl., (Tabela 2).

Tabela 2. Comparação do teste de força no 14º dia de nascimento e no 28º dia de nascimento, entre os grupos Ctrl, mdx e mdxC.

Valores são expressos como média ± desvio padrão (n=5 camundongos por grupo). Ctrl: camundongos C57BL/10 utilizados como controle; mdx: camundongo tratados com solução salina; mdxC: camundongos tratados com Cilostazol. 14º dia: início do tratamento com Cilostazol; 28º dia: final do tratamento com Cilostazo; Ganho Força/período: Porcentagem de ganho de força muscular no período de tratamento a: difere do grupo Ctrl

p <0,05; b: difere do grupo mdx p ≤0.05, (one way Anova), pós teste de Tukey HSD).

14º dia 28º dia Ganho de

Força/período Força/massa corporal (g/g) Força/massa corporal (g/g) (%) Ctrl 2,98±0,09 3,99±0,34 33,8 mdx 1,73±0,23a 1,88±0,23a 8,6 mdxC 2,07±0,35a 2,49±0,46a,b 20,2

23 Analisando o desenvolvimento da força muscular durante o período de tratamento (14º ao 28º dia de vida), observamos que todos os grupos experimentais apresentaram aumento na sua força muscular, porém o grupo mdx apresentou um aumento de apenas 8,6 %, demonstrando um desenvolvimento na capacidade de apreensão e contração muscular dos músculos da pata dianteira bem menor que o grupo Ctrl, uma vez que este apresentou um aumento de 33,8 % na força de tração. O grupo mdxC apresentou um aumento de 20,2 % na força de tração no mesmo período, indicando que o Cilostazol, apresentou um potencial efeito na manutenção e preservação no desenvolvimento da capacidade contrátil dos músculos de camundongos mdx (Tabela 2).

4.3 Análise qualitativa

Os parâmetros histológicos avaliados nos músculos BB, DIA e TA dos animais dos grupos Ctrl, mdx e mdxC foram:

1. Fibras com núcleo periférico (característica de fibras normais; Figura 4).

2. Fibras regeneradas, caracterizadas pelo núcleo centralizado (Torres; Duchen 1987), condensado, citoplasma eosinófilo e diâmetro da fibra muscular próximo ao de uma fibra muscular esquelética com núcleo periférico (ver Figura 4). 3. Áreas de Inflamação caracterizadas por infiltrado inflamatório exuberante, em

áreas de grande celularidade (ver Figura 4).

4. Fibras com alteração da permeabilidade do sarcolema ou em degeneração evidenciadas pela presença de AE no seu interior (Figura 5).

24 Figura 4. Cortes transversais dos músculos BB, DIA, e TA dos diferentes grupos experimentais. Ctrl: camundongos C57BL/10 utilizados como controle; mdx: camundongos mdx tratado com solução salina; mdxC: camundongos mdx tratados com Cilostazol. Coloração em HE, mostrando áreas de inflamação (área demarcada), fibras com núcleo central (cabeça de seta) e fibras com núcleo periférico (seta preta). Barra 100µm.

25 Figura 5. Cortes transversais dos músculos BB, DIA, e TA dos diferentes grupos experimentais. Ctrl: camundongos C57BL/10 utilizados como controle; mdx: camundongos mdx tratado com solução salina; mdxC: camundongos mdx tratados com Cilostazol. Mostrando fibras positivas ao azul de Evans (seta branca). Barra 100µm.

26 4.4 Análise quantitativa

Para a análise quantitativa histológica dos grupos experimentais, utilizou-se a média das porcentagens da área de Inflamação (Média % Infl.) sobre a área total de secção transversal dos músculos BB, DIA e TA; a média das porcentagens de fibras com núcleo central (Média % NC.), núcleo periférico (Média % NP) e fibras marcadas por AE (Média % AE) em relação ao número total de fibras.

Tabela 3. Porcentagem da área de Inflamação, de fibras com núcleo central, fibras com núcleo periférico e fibras marcadas pelo azul de Evans no músculo BB dos grupos C57BL/10 (Ctrl), mdx salina (mdx), mdx Cilostazol (mdxC). % Infl. % NC % NP % AE BB Ctrl 0,63 ± 0,85 2,37 ± 0,69 97,63 ± 0,69 0,00 ± 0,00 mdx 6,04 ± 2,20a 6,93 ± 1,40a 88,55 ± 2,53a 5,45 ± 0,19a mdxC 3,68 ± 1,02 7,44 ± 2,53a 91,54 ± 2,24a 0,35 ± 0,16a,b

%Infl., porcentagem da área total que se encontra em processo inicial deregeneração com presença de abundante infiltrado inflamatório; %NC, porcentagem de fibras regeneradas com núcleo central; %NP, porcentagem de fibras com núcleo periférico; %AE, porcentagem de fibras positivas ao azul de Evans. a: difere do grupo Ctrl p ≤0.0001; b: difere do grupo mdx p ≤0.0001, (one way Anova, pós teste de Tukey HSD).

27 Tabela 4. Porcentagem da área de Inflamação, de fibras com núcleo central, fibras com núcleo periférico e fibras marcadas pelo azul de Evans no músculo DIA dos grupos C57BL/10 (Ctrl), mdx salina (mdx), mdx Cilostazol (mdxC).

%Infl., porcentagem da área com presença de abundante infiltrado inflamatório; %NC, porcentagem de fibras regeneradas com núcleo central; %NP, porcentagem de fibras com núcleo periférico; %AE, porcentagem de fibras positivas ao azul de Evans. a_{: difere do}

grupo Ctrl p ≤0.001, (one way Anova), pós teste de Tukey HSD).

Tabela 5. Porcentagem da área de Inflamação, de fibras com núcleo central, fibras com núcleo periférico e fibras marcadas pelo azul de Evans no músculo TA dos grupos C57BL/10 (Ctrl), mdx salina (mdx), mdx Cilostazol (mdxC). % Infl. % NC % NP % AE TA Ctrl 0,00 ± 0,00 0,24 ± 0,08 99,79 ± 0,07 0,00 ± 0,00 mdx 7,29 ± 3,64a _{24,57 ± 14,96}a _{71,39 ± 15,26} a _{4,10 ± 1,60}a mdxC 3,68 ± 2,07 3,66 ± 0,66 88,57 ± 10,42 2,01 ± 1,99

%Infl., porcentagem da área com presença de abundante infiltrado inflamatório; %NC, porcentagem de fibras regeneradas com núcleo central; %NP, porcentagem de fibras com núcleo periférico; %AE, porcentagem de fibras positivas ao azul de Evans. a_{: grupo mdx}

difere dos grupos Ctrl p ≤0.05, (one way Anova), pós teste de Tukey HSD).

% Infl. % NC % NP % AE

DIA

Ctrl 0,00 ± 0,00 0,23 ± 0,14 99,41 ± 0,73 0,00 ± 0,00

mdx 10,92 ± 2,92a 4,36 ± 2,04a 93,72 ± 3,19a 1,72 ± 1,20a

28 No músculo BB do grupo mdx, identificamos aumento significativo na porcentagem de área de inflamação (858%), na porcentagem de fibras com núcleo central (192%) e na porcentagem de fibras positivas ao AE (545%), e redução significativa na porcentagem de fibras com núcleo periférico (9,3%) em relação grupo Ctrl. (Tabela 3).

Observamos no músculo DIA do grupo mdx, aumento significativo na porcentagem da área de inflamação (1092%), na porcentagem de fibras com núcleo central (1795%) e na porcentagem de fibras positivas ao AE (172%), com concomitante redução na porcentagem de fibras com núcleo periférico (5,7%) em relação ao grupo Ctrl (Tabela 4).

No músculo TA do grupo mdx, verificamos aumento significativo na porcentagem da área de inflamação (729%), na porcentagem de fibras com núcleo central (10137%) e na porcentagem de fibras positivas ao AE (410%), com concomitante redução significativa na porcentagem de fibras com núcleo periférico (28,4%) em relação ao grupo Ctrl (Tabela 5).

Nos camundongos mdx tratados com Cilostazol verificou-se redução significativa (p< 0,0001) de fibras positivas ao AE no músculo BB (93,57%) quando comparados aos camundongos mdx que receberam salina (Tabela 3). Observou-se também redução (embora não significativa) de fibras com núcleo centralizado nos músculos TA e DIA (66,62% e 36,69%, respectivamente), da área de inflamação nos músculos BB (39,07%), DIA (22,16%) e TA (49,51%) e do número de fibras positiva ao AE nos músculos TA (50,97%), DIA (77,90%) nos camundongos mdx tratados quando comparados aos animais não tratados.

29 4.5 Reação Dihydroetidio (DHE)

No músculo BB, observou-se marcação mais intensa (642,7%) no grupo mdx em relação ao grupo Ctrl. O tratamento demonstrou ser significantemente eficaz na redução da marcação de DHE, no grupo mdxC (85,9%) em relação ao grupo mdx (Figura 6).

No músculo TA verificou-se aumento de 1049,4% na marcação de DHE no grupo

mdx em relação ao grupo Ctrl. O tratamento com Cilostazol apresentou redução de 69,5%

da marcação de DHE em relação ao grupo mdx (Figura 6).

No músculo DIA houve aumento de 748,6% na marcação do grupo mdx em relação ao grupo Ctrl. O grupo mdxC apresentou redução da marcação de DHE, reduzindo cerca de 73% (Figura 6).

30 Figura 6. A, Cortes transversais dos músculos BB, DIA, e TA mostrando a intensidade de DHE nos grupos estudados: Ctrl: camundongos C57BL/10 utilizados como controle; mdx: camundongos mdx tratado com solução salina; mdxC: camundongos mdx tratados com Cilostazol. B, média e desvio padrão da fluorescência de DHE como medida para os músculos BB, DIA, e TA dos diferentes grupos tratados: Ctrl, mdx, mdxC. Valores representam a área de fluorescência sob um limite especifico (70-255 comprimento de onda), expressado como porcentagem de área total do corte muscular. a Difere do Ctrl p ≤ 0,0001; b Difere do mdx p ≤ 0,0001, (one way Anova), pós teste de Tukey HSD). Barra 100 µm.