VERIFICAÇÃO DA QUALIDADE DE DNA GENÔMICO EXTRAÍDO DE PLASMA BOVINO PARA PCR*

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estudos , Goiânia, . 339, n. 2, p . 245-251, abr ./jun. 2012.

ALEX SILVA DA CRUZ, DANILO CONRADO SILVA, EMILIA OLIVEIRA A. COSTA, CLÁUDIO CARLOS DA SILVA,

APARECIDO DIVINO DA CRUZ

Resumo: com o surgimento e melhoramento constante de técnicas

labo-ratoriais voltadas a identificação de sexo fetal, uma das técnicas amplamente utilizada é a da reação em cadeia pela polimerase. Para que esta metodolo-gia funcione corretamente é nessesarios metodolometodolo-gias de fornecimento de DNA de boa qualidade. O objetivo do presente estudo foi avaliar a qualidade de DNA bovino isolado de plasma Até o momento, não foi publicado teste semelhante para bovinos.

Palavras-chave: Qualidade. DNA Genômico. Plasma bovino.

P

ara que as metodologias de determinação sexual por análise de DNA funcionem corretamente é necessário uma padronização de técnicas, que resultem na extração e quantificação de DNA fetal de boa quali-dade do sangue materno (SAITO et al., 2000).

A biologia molecular tem criado ferramentas para pesquisa, tanto na me-dicina humana como na meme-dicina veterinária. A reação em cadeia da polime-rase (PCR) possibilita testes altamente sensíveis, cujas aplicações vão desde o diagnóstico clínico até a programas de melhoramento animal. Contudo, tais procedimentos dependem da habilidade de se extrair DNA em quantidade suficiente e de boa qualidade. Há vários métodos de purificação do DNA ge-nômico, no entanto, ainda persistem problemas como contaminação por DNA estranho, inibidores de PCR e sensibilidade da molécula de DNA, que facilitam sua quebra (COELHO _{et al., 2004).}

VERIFICAÇÃO

DA QUALIDADE DE DNA

GENÔMICO EXTRAÍDO

DE PLASMA BOVINO

PARA PCR*

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As técnicas de extração e quantificação de DNA para utilização na reação em cadeia pela polimerase (PCR) permitem a investigação em diferentes amostras biológicas, mesmo quando o DNA esta presente em pequenas quantidades. Resquícios de saliva, esfregaço bucal, sangue, bulbos capilares, tecidos incluídos em parafina, ossos, plasma sanguíneo, gotas de esperma, entre outros, podem fornecer informações importantes, desde que analisados de forma adequada (BAREA _{et al., 2004).}

Implementação de uma metodologia simples e precisa para extração e quantificação de DNA fetal em bovinos é importante para a otimização do manejo reprodutivo em programas de seleção e melhoramento (CARVALHAIS _{et al., 2005).}

Neste aspecto, o conhecimento prévio do sexo fetal, possibilita ao pecuarista pla-nejar antecipadamente o manejo dos rebanhos e os cuidados no pós-parto, direcionando a venda dos lotes animais e selecionando as fêmeas matrizes que farão parte dos lotes de reposição, antecipadamente. Nessa situação, a padronização de uma técnica eficaz de extração e quantificação de DNA permitiria à sexagem fetal, que se tornaria uma ferramenta útil na seleção dos animais e, conseqüentemente, promover o melhoramento e direcionar os caminhos da atividade (MARTINHAGO, 2006).

O objetivo do presente estudo foi avaliar a qualidade de DNA bovino isolado de plasma mediante amplificação de DNA genômico por PCR. Adicionalmente, este es-tudo foi desenvolvido com o intuito de se aprimorar e difundir o método de extração e isolamento de DNA circulante em plasma de bovinos.

MATERIAIS E MÉTODOS Grupo Amostral

Este estudo foi realizado com um grupo de bovinos, composto de animais machos, fêmeas não prenha e fêmeas, com idade gestacional de 8 meses.

O grupo foi constituído de 1 touro e 6 fêmeas bovinas. Os animais não apresenta-vam à época da colheita das amostras sanguíneas sintomas de doenças e não estaapresenta-vam em uso de medicamentos.

Colheita das Amostras e Separação do Plasma

As amostras de sangue periférico foram coletadas por punção venosa com seringas descartáveis heparinizadas. Durante o transporte, as amostras foram colocadas em uma caixa de isopor, contendo gelo, evitando se drásticas variações de temperatura.

O sangue do macho e da fêmea não prenha foram mantidos inteiros e encaminhados à extração. Estas amostras extraídas foram destinadas para controle masculino e feminino na reação de PCR. O restante dos materiais coletados (5 amostra de sangue periférico de fêmeas com 8 meses de prenhez), foram centrifugados para separação do plasma.

A parte sólida do sangue foi precipitada mediante centrifugação por 10 minutos a 2000rpm. O plasma foi recolhido e processado imediatamente para a extração e puri-ficação do DNA circulante.

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Extração e Quantificação de DNA

O DNA do plasma materno sangue total de fêmea e do macho foi isolado e purificado usando se dois kits comerciais, incluindo Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin® (GE HEALTHCARE,UK), Easy-DNA® (Invitrogen Life Technologies, USA), conforme instruções do fabricante. Foi realizado uma purificação com o extrator Easy-DNA® do-brando as quantidades de amostra e do produto mantendo apenas a adição final de água. O DNA do sangue total de fêmea e do macho utilizados no controle da PCR foi extraído utilizando o kit comercial Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin® (GE HEALTHCARE,UK).

A quantificação das amostras extraídas foi realizada usando se o quantificador fluorômetro de ácidos nucléicos, GeneQuant pro® (Amersham Biosciences, EUA), conforme instrução do fabricante.

Amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase

Para a PCR, foram utilizados, conjuntos de primers (oligonucleotídeos iniciadores) descritos por Resende e colaboradores (2008), contidos na tabela 1.

Primers Seqüência (5’  3’) Localização Amplicons (pb) Gbr bov AGG TCG CGA GAT TGG TCG _{CTA GGT CAT GCA} Autossômica 280 Gbr bov AAG ACC TCG AGA GAC CCT _{CTT CAA CAC GT} Autossômica 280

Para a determinação do melhor DNA amplificável pela PCR, as amostras do material extraído de plasma e do grupo de controle foram colocados em tubos de PCR , cujas concentrações foram calculadas para um volume final de 25µL. As condições gerais de termociclagem podem ser obtidas da Tabela 2.

PCR Volume H2O Miliq 7.5µl Tampão Gold 5.0µl MgCl2 _0.5µl Primer A. 29 pb 0.5µl Primer A. 30 pb 0.5µl Taq Polimerase 1.0µl DNA 10µl Total 25µl

Tabela 1: Descrição de primers autossômico bovino

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As amplificações das amostras foram feitas por um termociclador de forma descrita na tabela 3.

Tabela 3: Condições de termociclagem para amplificação de DNA genômico isolado de plasma bovino

Ação Temperatura (o_C) _{Tempo (minutos)} _{Quantidade de ciclos}

Desnaturação inicial 94 5 1 Desnaturação 94 1 40 Anelamento 58 0.30 40 Extensão 72 1 40 Extensão final 72 7 1 Armazenamento 4 ∞

-Foi feita eletroforese da amostra em gel de agarose em uma concentração de 1,0%, durante um período de 1:30 horas, sendo que a voltagem utilizada foi a de 10 volts por centímetro de gel.

Análise Estatística

O pacote estatístico Excel® 2007 (Microsoft Corporation, EUA) foi usado para o cálculo das médias, desvio padrão e freqüências percentuais de amplificação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados das Extrações e Quantificações de Dna

Os resultados observados durante a extração e quantificação das amostras de plas-ma das fêmeas pelos meios de purificação: Ilustra Blood GenomicPrep, Easy-DNA e extração Easy-DNA 2X estão demonstrados na Tabela 4.

Tabela 4: Resultados da quantificação espectrofotométrica de DNA genômico total isolado de plasma das vacas, utilizando-se kits comerciais

Animais Illustra Blood Easy-DNA Easy-DNA 2X

F1 9.6ng/ µL 17.9ng/ µL 18.5ng/ µL F2 6.1ng/ µL 21.9ng/ µL 18.9ng/ µL F3 6.4ng/ µL 3.4ng/ µL 17.0ng/ µL F4 6.8ng/ µL 18.8ng/ µL 31.4ng/ µL F5 6.9ng/ µL 38.2ng/ µL 57,3ng/ µL Média (DP) 1.40 ng/ µL 12.95ng/ µL 17.04ng/ µL F1, F2, F3, F4, F5 Amostra de plasma de fêmeas. DP, desvio padrão.

A extração e isolamento de DNA genômico pelo Illustra Blood apresentaram a menor concentração e o menor desvio padrão dentre os métodos avaliados. Entretanto, o DNA isolado com Illustra Blood® produziu o melhor rendimento na PCR, com 100% da amostras amplificadas (Figura 1). Porque o método utiliza Proteinase K (PK), os re-sultados da PCR podem ser atribuídos a esta etapa, visto que os contaminantes protéicos contidos nos produtos isolados são a principal causa de inibição da DNA polimerase

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in vitro. Assim, o uso de uma protease de largo espectro como a PK contribuiu para a obtenção de DNA de qualidade de plasma. Considerando-se que no plasma sanguíneo a concentração de proteína é elevada, sugerimos que ao se isolar DNA de plasma deve se incorporar um passo de digestão proteolítica com uma enzima de largo espectro.

A extração e isolamento de DNA usando o kit Easy-Dna®, embora considerado robusto para obter DNA de sangue periférico e outros tecidos biológicos, no presente estudo não foi capaz de produzir DNA de plasma bovino com qualidade satisfatório para ser amplificado por PCR. Tanto a técnica sugerida pelo fabricante, quanto a modificação inserida por estes autores não produziu os resultados esperados. Apenas 40% das amostras foram amplificadas por PCR, sendo as amostra F1 e F2 para o Easy-DNA® e F1 e F3 para o produto isolado com a técnica modificada. Porque o método de isolamento de DNA Easy-DNA® não utiliza um protease inespecífica, parte do contaminante protéico isolado concomitantemente com o DNA funcionam como um potente inibidor da reação de PCR. Para funcionar como controles de amplificação por PCR, foi obtido DNA bovino isolado de sangue total de um macho e de uma fêmea, cujos resultados foram repre-sentados na Tabela 5. Foi usado sangue periférico para a obtenção de DNA controle devido à facilidade de se obter maior quantidade de DNA a partir das células sanguí-neas nucleadas em circulação periférica. Para simular as condições do DNA isolado de plasma, para a PCR os DNAs genômicos controles forma diluídos de 1:10, refletindo a média de concentração de todos as amostra avaliadas.

Resultados da amplificação do material extraído

Tabela 5. Resultados da quantificações espectofotométrica do DNA controle obtido de sangue total de bovinos.

Animais controles Ilustra Blood

M 242.5 ng/ µL

F 229.0 ng/ µL

A Figura 1 ilustra os resultados da PCR feita a partir de DNA isolado de plasma bovino. Os amplicons foram produzidos conforme o esperado (280pb) para todas as amostras do Illustra Blood® e em apenas 40% para as amostras extraídas com EasyDNA®.

Figura 1: Amplicons de genoma bovino gerados por PCR a partir de DNA isolado de plasma

Legenda: MM = marcador de tamanho molecular em pares de base; F1 a F5 = fêmeas doadoras de plasma; C- = controle negativo; C+f = controle positivo de fêmea; C+m= controle positivo de macho. Tamanho do amplicon esperado foi de 280pb.

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estudos , Goiânia, . 39, n. 2, p . 245-251, abr ./jun. 2012. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos com a extração de DNA genômico de plasma bovino permitem concluir que o kit comercial de purificação de DNA Illustra Blood® apresenta eficiência de 100% resultando em DNA de boa qualidade comprovada pela amplificação pela PCR. De fato as extrações que não utilizam uma protease inespecífica, resultaram em baixa eficiência de amplificação (40%), devido a presença do contaminante protéico isolado juntamente com o DNA funcionam como um inibidor da reação de PCR.

Finalmente é permitido concluir que a utilização de uma protease inespecífica é fundamental para a purificação de DNA genômico de boa qualidade. Nesse sentido a padronização de uma técnica de extração de DNA bovino e amplificação por PCR é um fator muito importante para a execução da sexagem fetal em plasma de vacas prenhas. Abstract: with the rise and continuous improvement of laboratory techniques aimed at identifying fetal sex, a technique widely used is the polymerase chain reaction. For this methodology is to work properly necessaries methods of providing good quality DNA. The aim of this study was to evaluate the quality of DNA isolated from bovine plasma So far, not been published similar test for cattle.

Referências

Barea, J. A.; Pardini, M.I. M. C., Gushiken, T. Extração de DNA de materiais de arquivo e fon-tes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR). Rev Bras Hematol Hemoter, v. 26, n. 4, p. 274-81, 2004.

Carrapa, A., Coelho, J., Pedrosa, S., Santos, J., Zão, A. Técnicas de análise de DNA aplicadas a diagnóstico. Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Departamento de Biologia Celular e Molecular. Porto, 18 de Abril de 2005.

Carvalhais, I., Pimenta, J., Marques, C. C., Baptista, M. C., Vasques, I., Horta, A. E. M., Santos, I. C., Marques, M. R., Santos, M. F, Pereira, R. M,. Implementação de um método simples e preciso para sexagem de embriões bovinos. Ciências Veterinárias. 3º Congresso da SPCV, Livro de Resumos, p. 121, 2005.

Coelho, E. G. A., Oliveira, D. A. A., Teixeira, C. S, Sampaio, I. B. M., Rodrigues, S.G., Alves ,C.. Comparação entre métodos de estocagem de DNA extraído de amostras de sangue, sêmen e pêlos e entre técnicas de extração. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.56, n.1, p.111-115, 2004. Martinhago, C. D., De Oliveira, M. R., Tomitão, M. C., Vagnini, L. D., Oliveira, J. B. A., Peter-sen, C. G., Junior, J. G. F. Determinação precoce do sexo fetal pela análise do DNA no plasma materno. Rev. Bras. Ginecologia e Obstetrícia. n° 28. p. 190 - 194. 2006.

Resende, M. V., Moreira-Filho, C. A. Leal, C. L. V., M.F.P.D., Ramalho, A.O. Almeida, R. Vantini, V. F. M. Hossepian de Lima. Falha na sexagem por inibição do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro com anticorpos anti H-Y. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.60, n.3, p.594-599, 2008.

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estudos , Goiânia, . 339, n. 2, p . 245-251, abr ./jun. 2012. * Recebido em: 05.03.2012. Aprovado em: 17.03.3012.

ALEX SILVA DA CRUZ

Mestrando em Biologia Celular e Molecular na Universidade Federal de Goiás (UFG).Zootecnista pela Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás).

DANILO CONRADO SILVA

Biólogo pela PUC Goiás.

EMILIA OLIVEIRA A. COSTA

Bióloga e Mestre em Genética pela PUC Goiás. Bolsista da Comissão Nacional de Energia Nuclear.

CLÁUDIO CARLOS DA SILVA

Doutor em Biologia Celular e Molecular pela UFG. Professor na PUC Goiás.

APARECIDO DIVINO DA CRUZ

Doutor em Biologia Molecular pela University of Victoria- BC, Canadá. Professor nos Departamentos de Biologia e de Medicina da PUC Goiás. Biomédico Geneticista da Secretaria de Estado da Saúde de Goiás. E-mail: acruz@pucgoias.edu.br