UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS
DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PLANTAS
MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS E QUANTIFICAÇÃO
DE METAIS ASSOCIADOS A ESSAS PROTEÍNAS
Orientada: Cristiana Schmidt de Magalhães
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
CAMPINAS – SP OUTUBRO DE 2008
Dedico esta Tese de Doutorado ao meu marido Maurício, ao meu filho João Pedro e meus pais Hélio e Ulda por todo amor e apoio durante mais esta etapa da minha vida.
“Àquele que foi manifestado na carne, foi justificado em espírito, contemplado por anjos, pregado entre os gentios, crido no mundo, recebido na glória.”
À Universidade Estadual de Campinas, em especial ao Departamento de Química Analítica, pela oportunidade oferecida para a realização deste trabalho.
À Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, e ao Departamento de Ciências Exatas pelo incentivo, suporte e apoio durante os anos de afastamento da docência.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Programa de Qualificação Institucional (PQI) pela concessão de bolsa de estudo e auxílio financeiro.
Ao professor Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda, pela orientação, apoio e amizade durante esses anos.
Ao professor Dr. Pedro Orival Luccas, pela amizade e valiosos conselhos. À professora Dra. Maria Elisa Pereira Bastos de Siqueira, por coordenar o Programa de Qualificação Institucional (PQI) e pela amizade.
À professora Dra. Helenice Aparecida de Carvalho do Departamento de Farmácia da UNIFAL-MG por disponibilizar o seu laboratório e equipamentos para a realização das medidas de Kjeldhal.
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pelo suporte dado para a execução dos experimentos na linha de fluorescência de raios-X, em especial ao Dr. Carlos A. Pérez.
À todos amigos do Grupo de Espectrometria, Preparo de Amostras e Mecanização (GEPAM): Adílson, Aline Lopes, Alessandra, Ana Christi, Eduardo, Eraldo, Herbert e Marcelo pelo agradável convívio, meu muito obrigado.
Aos colegas e ex-alunos do laboratório Aline Klassen, Américo, André, Araceli, César, Edenir, Fabíola, Geraldo, Jerusa, Joselito, Luciana, Marcel e Madson, pela amizade.
Aos funcionários do Instituto de Química, especialmente a Sílvia, Rodrigo e Bel, por sempre atenderem prontamente meus pedidos.
Campinas.
Aos meus irmãos da Igreja Batista Ágape, pelas orações, pela amizade e carinho em todos os momentos.
Ao meu marido, Maurício, por tanta compreensão nas minhas ausências, apoio, amor e cuidado comigo nestes anos.
Ao meu filhinho, João Pedro, pela alegria que sempre me proporciona.
Enfim, a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.
SÚMULA CURRICULAR
1. DADOS PESSOAIS
Nome: Cristiana Schmidt de Magalhães Data de Nascimento: 16 de Abril de 1967 Naturalidade: São Paulo - SP
Filiação: Hélio Schmidt e Ulda de Souza Moraes Schmidt Endereço eletrônico: magalhaes@unifal-mg.edu.br
2. FORMAÇÃO ACADÊMICA
2003 – 2008 Doutorado em Ciências
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
Título: Avaliação comparativa de procedimentos de extração de proteínas em plantas medicinais e fitoterápicos e quantificação de metais associados a essas proteínas.
1991 – 1994 Mestrado em Física
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
Título: Fotoluminescência estacionária em Carbeto de Silício amorfo hidrogenado.
1987 – 1991 Graduação em Física
Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
3. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Artigos publicados, aceitos e submetidos
• Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Sample preparation for metalloprotein
analysis: A case study using horse chestnuts, Talanta, 71(2007)1958.
• Garcia, J. S., Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and
metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1.
• Figueiredo, E. C., Souza, L. R., Magalhães, C. S. Wisniewski, C., Luccas, P. O., A home-made autosampler/injector commutator for flow injection analysis,
Journal of Automated Methods & Management in Chemistry, 2006(2006)1.
Magalhães, C. S., Perez, C. A., Arruda, M. A. Z., Qualitative Evaluation of Metal
Presence in Phytomedicine Proteins Through X-Ray Fluorescence, Activity
Report, 2005.
• D´andréa, E. D., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Semaan, F. S., Artérias e
veias simuladas no laboratório, Ciência Hoje, 36(2005) 72.
• Moreira, L. N., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Emprego de sistema e análise
em fluxo contínuo com biossensor potenciométrico para determinação de adrenalina em medicamentos, Infarma, 16(2005)59.
• Louzada, E. S., Luccas, P. O., Magalhães, C. S., Construção e caracterização
de um biossensor potenciométrico para determinação de pirogalol, Analytica, 2(2004)52.
• Semaan, F. S., Vieira, A. L. N., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Construção de
eletrodo tubular de cobre revestido íon seletivo a cloreto para uso em sistema de análise em fluxo contínuo, Revista da Escola de Farmácia e Odontologia de
Alfenas, 23(2002).
• Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence, Disorder
and Localization in Hydrogenated Amorphous Silicon Carbon Alloys, Brazilian
Journal of Physics, 24(1994)416.
• Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence Studies on
Silicon Carbon Alloys, Journal of Non-Crystalline Solids, 1027(1993)164.
• Magalhães, C. S., Alvarez, F., Properties of Amorphous Silicon-Carbon Alloys
with Very Low Densities of States, Journal of Physics Condensed Matter, 5(1993).
• Novellino, R. A., Vazquezlópes, C., Bernussi, A. A., Schmidt, C., Cerdeira, F., Motisuke, P., Pollak, F. H., Ploog, K., On the origin of Franz-Keldysh oscillations in
AlGaAs/GaAs modulation-doped heterojuctions, Journal of Applied Physics, 70(1991)5570.
Capítulo de Livro
• Magalhães, C. S., Garcia, J. S., Lopes, A. S., Figueiredo, E. C., Arruda, M. A.
Z., Strategies for sample preparation focusing biomolecules
determination/characterization, In: Marco Aurélio Zezzi Arruda (Ed.) Trends in
Sample Preparation, 1st ed., Nova Science, New York, 2006.
Principais trabalhos apresentados em eventos
• Magalhães, C. S., Arruda, M A. Z., Identificação e Quantificação de Metais em Proteínas de Folha de Sene (Cássia Angustifólia vahl). XLVI Congresso Brasileiro de Química – ABQ, 2006, Salvador.
• Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Evaluation of Protein Extraction Procedures
from Phytomedicines and their Separation by SDS-PAGE, apresentação oral. 7th
International Symposium on Advances in Extraction Technologies, 2005, Campinas.
• Magalhães, C. S., Pérez, C. A., Arruda, M. A. Z., Metalômica Quali e
Quantitativa de Proteínas de Castanha da Índia in natura, apresentação oral. 13o.
Encontro Nacional de Química Analítica, 2005, Niterói.
• Magalhães, C. S., Arruda, M A Z., Evaluation of protein extraction procedures in phytotherapic medicines. Trends in Sample Preparation 2004, 2004, Seggau –
Cu in Phytotherapics by ETAAS and TS-FF-AAS after Microwave-Assisted
Digestion. 8th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, 2004, Paraty, RJ.
• Magalhães, C. S., Perez, C. A., Arruda, M. A. Z., Avaliação Qualitativa da presença de Metais em Proteínas de Fitoterápicos por Fluorescência de Raios-X. XIV Reunião anual de Usuários do LNLS, 2004, Campinas.
• Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Estudo do comprimento de Localização em a-SiC:H e a-Si:H através da fotoluminescência dependente da temperatura, apresentação oral. Oficina de Propriedades de Materiais de Camada Fina para Aplicações Fotovoltáicas, Microeletrônicas e Recobrimentos, apresentação oral. 1994, Campinas.
• Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence Studies on Silicon Carbon Alloys, apresentação oral. XV International Conference on Amorphous Semiconductors: Science and Technology, 1993, Cambridge.
• Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence, Disorder and Localization in Hydrogenated Amorphous Silicon Carbon Alloys, apresentação
oral. 6th Brazilian School of Semiconductor Physics, 1993, São Carlos.
• Magalhães, C. S., Alvarez, F., Properties of Amorphous Silicon-Carbon Alloys with Very Low Densities of States, apresentação oral. SLAFS-7-70, Simposio Latinoamericano de Fisica de Superficies, 1992, Bariloche.
Total de trabalhos em eventos internacionais: 7 Total de trabalhos em eventos nacionais:41
Participações em eventos científicos: 23
• HISTÓRICO PROFISSIONAL
• Professor Assistente, Dedicação Exclusiva - Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL-MG Disciplina de Física
Período: 1999 – atualmente • Pesquisa e Desenvolvimento
- Fundação Centro Tecnológico para Informática – CTI
Projeto: Pesquisa e Desenvolvimento de TFT´s – Transistores de Filmes Finos – através de Pulverização Catódica “Sputtering”
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS E QUANTIFICAÇÃO
DE METAIS ASSOCIADOS A ESSAS PROTEÍNAS Autora: Cristiana Schmidt de Magalhães
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Este trabalho de Tese apresenta os resultados da avaliação de onze procedimentos de extração de proteínas nas plantas medicinais ginkgo biloba (Ginkgo
biloba L.) e castanha da Índia (Aesculus hippocastanum) e no fitoterápico Espirulina (Spirulina maxima). Os procedimentos variaram desde a simples agitação até àqueles onde se somavam várias etapas, tais como agitação, maceração, sonicação e centrifugação. A avaliação foi feita em termos da comparação da concentração de proteínas totais extraídas por meio de cada procedimento, utilizando-se o método de Bradford e de Kjeldhal. Os procedimentos contendo mais etapas se mostraram mais eficientes na extração de proteínas. Também foi feito o mapa protéico da castanha da Índia (Aesculus hippocastanum) e avaliada a influência dos procedimentos de extração de proteínas no perfil protéico da referida amostra. Para isso foi feita a separação das proteínas presentes nos extratos protéicos utilizando-se eletroforese SDS-PAGE. Esta separação (para as proteínas desnaturadas e sob condição não-redutora) permitiu identificar, em termos de massa molar, quais proteínas compunham os extratos protéicos, onde se verificou uma banda mais expressiva (MM = 33,2 ± 0,9 kDa), independentemente do procedimento de extração usado, fato que foi relacionado à mobilidade da proteína. Quando a separação ocorria sob condições redutoras, a banda mais expressiva apresentava MM = 23,5 ± 0,5 kDa. Com a finalidade de se fazer uma investigação mais detalhada, as proteínas da castanha da Índia que foram extraídas pelo procedimento de maceração e centrifugação, foram também separadas por eletroforese bidimensional, na qual houve o desdobramento
foram decompostas tripticamente e foram analisadas por espectrometria de massas, com a obtenção de várias seqüências peptídicas que se repetiam em várias bandas diferentes. Estes resultados sugerem que estas proteínas se tratam de isoformas. Finalmente, foi proposta a identificação de quais íons metálicos estariam ligados às proteínas, o que foi possível por meio do mapeamento das bandas protéicas utilizando-se a fluorescência de raios-X com radiação Síncrotron. Foram identificados 4 íons metálicos, os quais foram investigados quantitativamente. As bandas separadas por SDS-PAGE e por 2D-PAGE foram decompostas por radiação microonda e a determinação das concentrações dos íons metálicos foi obtida por ETAAS e FAAS. Para as bandas separadas por 2D-PAGE observou-se uma interessante distribuição não homogênea dos íons metálicos, sugerindo que algumas se trataram de metaloproteínas, enquanto outras não. Assim, estas proteínas podem ser de origem citosólica e de armazenamento, e que, embora sejam apenas coadjuvantes na ação medicinal da castanha, participariam ativamente nos processos germinativos e metabólicos da planta.
COMPARATIVE EVALUATION OF PROTEIN EXTRACTION PROCEDURES IN MEDICINAL PLANTS AND PHYTOMEDICINES AND QUANTIFICATION OF
ASSOCIATED METALS TO THESE PROTEINS Author: Cristiana Schmidt de Magalhães
Adviser: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
This work presents the evaluation of eleven protein extraction procedures using ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.), horse chestnut (Aesculus hippocastanum) medicinal plants, and also using the phytomedicine Spirulina (Spirulina maxima). The procedures varied since the agitation only until the addition of several steps, such as agitation, maceration, sonication, and centrifugation. This evaluation was made by comparing the total extracted proteins through Bradford and Kjeldhal methods. The more efficient protein extraction procedures were those whose steps were added. The influence of protein extraction procedures was also evaluated in the protein map of horse chestnut (Aesculus hippocastanum). The proteins present in extracts were separated by SDS-PAGE. This separation (for denatured and non-reduced proteins) allowed identifying the more expressive protein band (MM = 33.2 ± 0.9 kDa) independently of the used procedure. When the separation was carried out under reduced and denatured conditions, the more expressive protein band had MM = 23.5 ± 0.5 kDa. This difference in MM was attributed to protein mobility. The horse chestnut proteins extracted by maceration and centrifugation were also separated by two-dimensional electrophoresis in order to obtain a more detailed protein profile. Through this separation, the more expressive band was folded in, at least, nine protein bands. These bands were triptically decomposed and analysed by mass spectrometry. Several peptide sequences that repeated in different protein bands were obtained. These results suggested to deal of isoforms. Finally, the identification of metallic ions bonded to proteins, using Sincrotron radiation- X-ray fluorescence was also proposed.
bands separated by SDS-PAGE and by 2D-PAGE were decomposed using microwave radiation, and metallic ion concentrations were determined by ETAAS and FAAS techniques. For 2D-PAGE bands an interesting non-homogeneous metallic ion distribution was observed, suggesting that some proteins can be metalloproteins or metal-binding proteins. Therefore, these studied proteins probably present a citosolic origin and storing function. However, they may be coadjuvants at medicinal action, and much probably participate in germinating and metabolic processes.
LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS... xxv
LISTA DE QUADROS... xxix
LISTA DE TABELAS... xxx
LISTA DE FIGURAS... xxxii
INTRODUÇÃO ... 01
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 02
Capítulo 1 - Preparo de Amostras e Procedimentos de Extração de
Proteínas de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
...
05
1. OBJETIVOS... 07
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 07
2.1 Procedimentos de extração de proteínas... 07
2.1.1 Rompimento celular
... 08
2.1.2 Inativação ou remoção de interferentes
... 10
2.1.3 Solubilização de proteínas
... 12
2.2 Plantas medicinais e fitoterápicos ... 14
2.2.1
Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos–Definições ... 15
2.2.2 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos
-Perspectivas
...
15
2.2.3 Espirulina, Ginkgo biloba e Castanha da Índia
... 16
2.3.2 Método de Kjeldahl
... 23
3. PARTE EXPERIMENTAL... 24
3.1 Equipamentos e acessórios... 24
3.2 Reagentes e soluções... 25
3.3 Preparo das amostras... 26
3.4 Extração das proteínas... 27
3.5 Determinação da concentração de proteínas totais... 30
3.5.1 Método de Bradford
... 30
3.5.2 Método de Kjeldahl
... 30
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES... 31
5. CONCLUSÕES PARCIAIS... 38
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 39
Capítulo 2 – Mapa Protéico da Castanha da Índia
... 47
1. OBJETIVOS... 49
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 49
2.1 Proteínas – Aspectos gerais... 49
2.1.1 Proteínas em plantas
... 50
PAGE)
...
54
2.2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões
(2D
PAGE)
...
55
2.3 Espectrometria de massas... 56
2.3.1 Digestão tríptica ...
... 56
2.3.2 MALDI-TOF-MS
... 57
2.3.3 Espectros de massas
... 58
3. PARTE EXPERIMENTAL... 60
3.1 Equipamentos e acessórios... 60
3.2 Reagentes e soluções... 60
3.3 Separação eletroforética em uma dimensão
(SDS-PAGE)...
62
3.3.1 Preparo das amostras para a separação eletroforética
baseada em SDS-PAGE
...
62
3.3.2 Separação de proteínas por eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE)
...
63
3.4 Separação eletroforética em duas dimensões
(2D-PAGE)...
64
3.4.1 Otimização da metodologia para a separação por
2D-PAGE
...
64
3.4.2 Separação bidimensional de proteínas por eletroforese com
focalização isoelétrica e em gel de poliacrilamida
(2D-PAGE)
...
65
3.5 MALDI-TOF-MS... 66
3.5.1 Digestão tríptica dos spots de proteínas
... 66
4.1 Géis SDS-PAGE... 68
4.1.1 Determinação de massa molar e de massa de proteína por
densidade óptica
...
69
4.2 Géis 2D-PAGE... 73
4.3 MALDI-TOF-MS... 77
5. CONCLUSÃO PARCIAL... 87
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 88
Capítulo 3 - Determinação e Quantificação de Metais Associados às
Proteínas
...
91
1. OBJETIVOS... 93
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 93
2.1 Metaloproteínas e proteínas de metal ligante... 93
2.2 Fluorescência de raios-X por radiação síncrotron
(SRXRF)...
95
3. PARTE EXPERIMENTAL... 97
3.1 Equipamentos e acessórios... 97
3.2 Reagentes e soluções... 98
3.3 Mapeamento dos metais ligados às proteínas nas bandas
por fluorescência de raios-X por radiação síncrotron
(SRXRF)...
99
3.4 Decomposição ácida sob radiação microonda... 100
3.5 Determinação de metais por ETAAS e FAAS nas bandas
SDS-PAGE e 2D-PAGE...
101
4.1 Avaliação qualitativa dos metais ligados às proteínas nas
bandas por SRXRF...
102
4.2 Avaliação quantitativa dos metais ligados às proteínas nas
bandas separadas por SDS-PAGE e 2D-PAGE utilizando as
técnicas ETAAS e FAAS...
104
5. CONCLUSÃO PARCIAL... 111
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 112
CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ... 115
Apêndice 1... 117
Apêndice 2... 119
Apêndice 3... 121
Apêndice 4... 123
1D Uma Dimensão
1D - PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em uma dimensão (do inglês, One Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
2D Duas Dimensões
2D-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em duas dimensões
(do inglês, Two Dimensional Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
AAS Espectrometria de Absorção Atômica (do inglês, Atomic
Absorption Spectrometry)
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATP Adenosina Tri-Fosfato (do inglês, Adenosine Tri-Phosphate)
BCA Ácido Bicinchonínico
BPFC Boas Práticas de Fabricação e Controle
CE Eletroforese Capilar (do inglês, Cappilary Electrophoresis)
Da Dalton (1 Da = 1,661x10-24 g)
Electrospray-MS do inglês, Electrospray Ionization Mass Spectrometry
ESI Ionização por Eletro Spray (do inglês, Electro Spray
Ionization)
ETAAS Espectrometria de Absorção Atômica com Atomização Eletrotérmica (do inglês, Electrothermal Atomic Absorption
Spectrometry)
FAAS Espectrometria de Absorção Atômica com Chama (do inglês,
Flame Atomic Absortion Spectrometry)
g Gravidades
HPGe Detector de Alta Pureza de Ge (do inglês, High Purity Ge
Detector)
ICP-MS Espectrometria de Massas com Fonte de Plasma Acoplado Indutivamente (do inglês, Inductively Coupled Plasma Mass
Spectrometry)
IEF Focalização Isoelétrica (do inglês, Isoelectric Focussing)
K Lisina
LC Cromatografia Líquida (do inglês, Liquid Chromatography)
LC-MS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry)
LD Limite de Detecção
LDI+ Modo íon positivo
LQ Limite de Quantificação
LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncroton
MALDI Dessorção/Ionização de Matriz Assistida por Laser (do inglês,
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)
MALDI-TOF-MS Espectrometria de Massas por tempo de Vôo acoplada à Ionização dessortiva de Matriz assistida por Laser (do inglês,
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)
MCP do inglês, Microchannel Plate
MM Massa Molar
MG Minas Gerais
MS Espectrometria de Massas (do inglês, Mass Spectrometry)
MSDB Banco de Dados (do inglês, Mass Spectrometry Data Bank)
MTs Metalotioneínas
P Prolina
pg Picogramas (1x10-12 g)
PAF Fator Ativador de Plaquetas
PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (do inglês,
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
P prolina
pI Ponto Isoelétrico
ppm partes por milhão
PTM Proteínas modificadas pós translacionalmente (do inglês, Post
Translationally Modified Proteins)
QTOF-MS Espectrometria de Massas assistida por Quadrupolo com Tempo de Vôo (do inglês, Quadrupole Time-Of-Flight Mass
Spectrometry)
REBLAS Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde
R Arginina
R2 Coeficientes de correlações lineares
SDS-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio (do inglês, Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide
Gel Electrophoresis)
SPE Extração por Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Extraction)
spot Banda 2D de proteínas
SR Radiação Síncrotron (do inglês, Sincrotron Radiation)
SRXRF Fluorescência de Raios-X por Radiação Síncrotron (do inglês,
Sincrotron Radiation X-Ray Fluorescence)
TOF Tempo de Vôo (do inglês, Time Of Flight)
Unifal-MG Universidade Federal de Alfenas
XRF Fluorescência de Raios-X (do inglês, X-Ray Fluorescence)
Quadro 1.1 Procedimentos de extração de proteínas para as diferentes
amostras... 29
Tabela 1.1 Concentrações de proteínas totais ± desvio padrão (em mg g-1) nas amostras determinadas pelo método de Bradford (N=3) para os diferentes processos de extração de proteínas...32
Tabela 2.1 Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4...70
Tabela 2.2 Massas estimadas de proteína (em µg) a partir das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4...71
Tabela 2.3 Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.6...72
Tabela 2.4 Dados estimados dos spots, segundo o programa ImageMaster 2D
Platinum, versão 6.0...75
Tabela 2.5 Valores estimados das massas de proteínas (em µg) em cada spot, com os respectivos valores de porcentagens, segundo o programa
ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0...76
Tabela 2.6 Dados estimados dos spots protéicos do gel 2D-PAGE da Figura 2.8, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0...79
Tabela 2.7 Razões m/z e as sequências peptídicas identificadas para as proteínas
dos spots B a Q, provenientes dos espectros
MS/MS...83
Tabela 3.1 Contagens relativas de metal das emissões Kα de íons metálicos. Os dados da intensidade média (contagens de íons de metal) foram calculados a partir dos três pontos mapeados, bem como foram descontadas as diferenças entre as intensidades das contagens das amostras e dos brancos analíticos...102
Tabela 3.2 Concentrações de metais nas proteínas separadas por SDS-PAGE (média ± desvio padrão, n=3). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS...105
Tabela 3.3 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) obtidos experimentalmente nas amostras de bandas protéicas usando as técnicas de ETAAS e FAAS...105
Tabela 3.4 Concentrações de metais nos spots de proteínas do gel 2D-PAGE da castanha da Índia (vide Fig.2.7, Capítulo 2). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS (média ± desvio padrão, n=3)...108
Tabela 3.6 Estimativa dos números de moléculas de proteínas e números de átomos de cada metal em cada spot...110
Figura 1.1 Espirulina (Spirulina máxima)...17 Figura 1.2 Folhas de Ginkgo biloba. Foto extraída do site:
http://www.xs4all.nl/~kwanten/thetree.htm...18
Figura 1.3 Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum). Ilustração extraída de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Illustration_Aesculus_hippocastanum 0.jpg...20
Figura 2.1 Uma proteína típica: Diagrama de ligações peptídicas e N e C
terminais...49
Figura 2.2 Anatomia de uma célula de planta. Ilustração adaptada de [5]...51 Figura 2.3 Ilustração dos processos que ocorrem durante a MALDI. Adaptada de
Nyman [16]...58
Figura 2.4 Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos, nos quais foram
utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares. Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm...69
Figura 2.5 Variação das densidades ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do
padrão protéico (linha azul) e do extrato bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha)...70
Figura 2.6 Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos diluídos com
tampão dissociante, nos quais foram utilizados os procedimentos 1 (sem diluição), 4, 5, 8 e 9 (diluídos com tampão dissociante) e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares (em kDa). Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm...72
Figura 2.7 Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5
(amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH
6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de MM de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão denominados de A a I, da esquerda para direita. No destaque, à direita superior, estão as bandas protéicas em três dimensões...74
massa molar de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão destacados em vermelho e denominados de A a Q, da esquerda para direita...78
Figura 2.9 Espectros de massas em duplicata para as proteínas dos spots A e
H...80
Figura 2.10 Espectros de massas gerados para os spots protéicos B, C, G, I e
N...81
Figura 3.1 Configuração do sistema utilizado para a aquisição dos dados referentes
ao mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas...99
Figura 3.2 Espectros de raios-X adquiridos na análise por SRXRF: (a) branco
analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 33,0 kDa
extraída por procedimento 1 (—); (b) branco analítico (proteína
ovalbumina + gel) (—) e proteína de 33,0 kDa extraída por procedimento
2 (—); (c) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de
23,5 kDa extraída por procedimento 8 (—) (d) branco analítico (proteína
ovalbumina + gel) (—) e proteína de 23,5 kDa extraída por procedimento
9 (—). As contagens relativas das emissões Kα de íons variaram de 0 a 3000...102
INTRODUÇÃO
Esta Tese foi preparada em três Capítulos distintos, mas interligados, visando uma melhor compreensão e clareza do assunto proposto.
É bem conhecido que o preparo de amostras é freqüentemente o passo mais problemático na seqüência analítica por ser bastante trabalhoso, com etapas complexas e tediosas, consumir muito tempo, bem como ser o responsável, muitas vezes, por erros aleatórios e sistemáticos nos resultados finais produzindo informações (bio)químicas inadequadas [1]. Outro problema a ser considerado relaciona-se à instabilidade do analito, principalmente quando se trata de análise de biomoléculas [2]. Assim, é importante que exista um compromisso entre o preparo das amostras e os procedimentos adequados para a manutenção da integridade dos analitos [3]. No primeiro Capítulo, foram sugeridos vários procedimentos de preparo de amostras e de extração de proteínas em algumas plantas medicinais e fitoterápicos. Estas amostras foram escolhidas pelo grande interesse tanto no aspecto científico, quanto no aspecto comercial. Para a avaliação comparativa entre os procedimentos propostos foram utilizados métodos analíticos já bem estabelecidos na literatura [4 - 6], definindo-se a castanha da Índia como amostra de estudo.
É impossível estudar o comportamento dos sistemas biológicos enfocando exclusivamente o genoma, pois são as proteínas, e não os genes, que determinam o fenótipo de um organismo. Por exemplo, em resposta a um estímulo interno ou externo, a síntese de algumas proteínas pode ser estimulada ou inibida; estas proteínas podem sofrer modificações pós-transducionais ou podem ser degradadas ou, ainda, ser realizadas em diferentes locais da célula [7]. A proteômica estuda os processos biológicos através da análise sistemática das proteínas expressas nas células ou tecidos, em conseqüência direta das condições externas e do estado do organismo em um determinado momento. Obter o proteoma de uma célula ou organismo é como fazer uma “fotografia instantânea” das proteínas expressas naquele determinado momento. Pode-se afirmar, portanto, que cada genoma, potencialmente, pode originar um número infinito de proteomas [7, 8].
Têm sido realizados esforços e avanços para se entender as metaloproteínas, principalmente no que concerne à estrutura e funções dos sítios metálicos, bem como das implicações biológicas das suas interações. O processo analítico para a identificação e quantificação de uma metaloproteína inclui pelo menos três etapas: (i) uma etapa seletiva, na qual é necessário que se use uma técnica de separação (tais como LC, CE, 2DE ou 2D-PAGE) para o isolamento da metaloproteína da matriz; (ii) uma etapa estrutural, na qual se tem por objetivo uma caracterização mais exata das biomoléculas em estudo (onde podem ser usadas técnicas como, por exemplo, MALDI-TOF-MS ou QTOF-MS) e (iii) uma etapa quantitativa, para a quantificação das espécies metálicas (utilizando-se técnicas como, por exemplo, ICP-MS ou AAS).
As primeiras duas etapas foram exploradas no Capítulo 2 desta Tese, em que se caracterizaram as proteínas da amostra castanha da Índia por meio de técnicas analíticas de eletroforese, em uma e duas dimensões, e de MALDI-TOF-MS.
No terceiro Capítulo, objetivou-se a investigação da presença de metais nas estruturas das proteínas caracterizadas e a influência da preservação dos mesmos, ao se utilizar os diversos processos de extração de proteínas sugeridos no Capítulo 1. Foram utilizadas as técnicas SRXRF, para a identificação e AAS, para a quantificação das espécies metálicas ligadas às proteínas.
Desta maneira, buscou-se interligar as informações obtidas em todos os Capítulos, fornecendo um panorama do proteoma e do metaloproteoma da amostra em estudo, enfatizando os cuidados com a manipulação da amostra neste tipo de estudo.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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[2] Magalhães, C. S., Garcia, J. S., Lopes, A. S., Figueiredo, E. C., Arruda, M. A. Z.,
Strategies for Sample Preparation Focusing on Biomolecules Determination/Characterization, In: Marco Aurélio Zezzi Arruda (Ed.) Trends in
[3] Garcia, J. S., Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and
metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1.
[4] Zaia, D. A. M., Zaia, C. T. B. V., Lichtig, J., Determinação de Proteínas Totais via
espectrofotometria: Vantagens e Desvantagens dos Métodos Existentes, Química
Nova, 21(1998)787.
[5] Bradford, M. M., Rapid And Sensitive Method For Quantitation Of Microgram
Quantities Of Protein Utilizing Principle Of Protein-Dye Binding, Anal. Biochem. 72(1976)248.
[6] Cecchi, H. M., Fundamentos Teóricos e Práticos em análise de alimentos, Cap. 6, ed. Unicamp, Campinas, 1999, 60.
[7] Pereira, A. S., Bicalho, B., Lília, S., De Nucci, G., Desafios da Química analítica
frente às necessidades da indústria farmacêutica, Química Nova, 28(2005)S107. [8] Graves, P. R., Haystead, T. A. J., Molecular biologist's guide to proteomics,
CAPÍTULO 1
Procedimentos de Preparo de Amostras e
de Extração de Proteínas em Plantas
1. OBJETIVOS
• Propor procedimentos de extração de proteínas para algumas plantas medicinais e fitoterápicos, levando em conta a dificuldade no preparo deste tipo de amostra vegetal;
• Avaliar alguns procedimentos de extração de proteínas em termos de eficiência de extração, através da determinação de proteínas totais utilizando-se os métodos de Kjeldhal e Bradford;
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Procedimentos de extração de proteínas
Existem vários procedimentos descritos na literatura para a extração de proteínas. Esses procedimentos estão relacionados com o objetivo da extração, ou seja, para qual fim a proteína estará sendo extraída, como, por exemplo, para se medir a sua concentração, ou a atividade enzimática, para separação por técnicas como eletroforese ou cromatografia, para se estabelecer a seqüência de aminoácidos ou se determinar a estrutura tridimensional de uma proteína. Entretanto, algumas recomendações gerais devem ser seguidas. As etapas de extração devem ser as mais simples possíveis para garantir a reprodutibilidade dos resultados e as modificações nas estruturas das proteínas devem ser minimizadas para evitar modificações químicas nas determinações. Os três passos fundamentais no preparo de amostras de proteínas são rompimento celular, inativação ou remoção de interferentes e solubilização das proteínas [1 - 5]. Assim, serão descritos, nos próximos itens, alguns procedimentos comumente utilizados para extração de proteínas.
2.1.1 Rompimento celular
O rompimento celular pode ser obtido tanto por procedimentos químicos como físicos, dependendo da natureza da amostra e do tipo de análise que se deseja utilizar. As células de microorganismos ou de tecidos de plantas geralmente requerem condições mais drásticas para a lise celular, devido à robustez da parede celular deste tipo de amostras. Já amostras mais delicadas, como células de mamíferos ou organelas celulares (como mitocôndrias) exigem procedimentos mais amenos [6].
Vários procedimentos de lise (destruição celular por rompimento das células devido à destruição da membrana celular [7]) podem ser utilizados, como, lise osmótica (quando a célula é suspensa em um meio hipotônico e seu volume sendo aumentado até ocorrer a lise da membrana [8]), lise por detergentes e lise enzimática da parede celular. Além desses, também se utilizam a agitação, a maceração a várias temperaturas (ambiente, a zero grau Celsius ou com nitrogênio líquido). Em amostras sólidas, geralmente, emprega-se a maceração manual sob nitrogênio líquido para transformar a amostra em um pó fino. Pode ser usada também a trituração com sonda de aço, capaz de promover a homogeneização do material, além de cortá-lo em pequenos pedaços. Para amostras líquidas, utiliza-se ultra-som (ou sonicação) para homogeneizar o material e romper as células [9], além da centrifugação [10]. As
ondas ultra-sonoras de alta potência (< 1 W a milhares de W cm-2) causam
permanente mudança física e química porque produzem cavitação e microfluidos nos líquidos, aquecimento e ruptura de sólidos e instabilidade na superfície da interface de sistemas líquido-líquido e líquido-gás [11]. A propagação das ondas ultra-sonoras no meio reacional cria uma variação de pressão, a qual é responsável pela cavitação, que pode ser definida como a formação e implosão de microbolhas de gás no centro de um líquido. A variação de pressão cria, num ponto do líquido, momentos de compressão e descompressão alternados. A cavitação acústica envolve três estágios: formação de núcleos de cavitação, crescimento das bolhas e violentas implosões. No momento da implosão, há formação de ondas de choque e na fase final esperam-se, no centro da bolha, temperatura e pressão muito elevadas, da ordem de 10000 K e 1000 atm. Nos sistemas heterogêneos, nas interfaces sólido-líquido, a natureza da
destruição das bolhas se apresenta diferente. A destruição se faz de forma não simétrica, dando origem a um jato de líquido dirigido para a superfície sólida. Além disso, micro-fluxos de líquido são formados devido à absorção de grande quantidade de energia vibracional dentro de pequeno volume, com pouco ou nenhum aquecimento associado. Isto favorece o transporte de massa entre a fase líquida e as superfícies sólidas, contribuindo para a aceleração da velocidade da reação. Assim, a eficiência da extração de um analito depende das variáveis que influenciam no processo no processo de cavitação (temperatura, viscosidade, presença de partículas sólidas, altura da coluna de água, freqüência e posição dos frascos dentro do banho). Tão logo as condições experimentais estejam otimizadas, o processo de ultra-som é bastante eficiente para a extração sólido-líquido [11, 12].
Como exemplo de estudo de procedimentos de rompimento celular, Chan et al. [13] otimizaram as condições de preparo de amostras para análise por eletroforese em duas dimensões de Prorocentrum triestinum, um dinoflagelado. Eles reconheceram que o primeiro passo do preparo da amostra era o rompimento celular para a liberação de todo o conjunto de proteínas do organismo. Na amostra em estudo, seriam necessários métodos mais vigorosos de rompimento celular, uma vez que os dinoflagelados são encapsulados por paredes celulares robustas. Para isso, eles propuseram o uso da sonicação e da agitação vigorosa com o uso de lâminas de vidro num agitador de vidro. Foi tomada aproximadamente uma massa de 150 mg de células de P. triestinum, previamente centrifugada e homogeneizada num tampão
Tris-HCl resfriado (4oC), que foi submetida à agitação com as lâminas de vidro ou à
sonicação. Ao se compararem os resultados pelos dois métodos, os autores obtiveram aumento de 5% quando utilizaram a sonicação na extração de proteínas por peso úmido de amostra em relação à extração quando utilizaram as lâminas de vidro. Considerando que os resultados mostraram padrões similares ao se compararem os géis de eletroforese em duas dimensões, os autores elegeram a sonicação como o método mais efetivo de rompimento celular para os dinoflagelados.
2.1.2 Inativação ou remoção de interferentes
Durante ou após o rompimento celular, vários compostos interferentes como enzimas proteolíticas (proteases), sais, ácidos nucléicos, polissacarídeos, fenóis e/ou proteínas muito abundantes precisam ser removidos ou inativados. Em material vegetal podem ser incluídos, também, as ligninas, os pigmentos e os alcalóides. Desses, os mais importantes interferentes, ou seja, os que mais causam interferências ou erros nas determinações são os sais e as proteases.
As proteases devem ser inativadas para impedir a degradação das proteínas. Inibidores de proteases são usualmente adicionados, mas podem modificar as proteínas, causando erros nas análises [6]. Outras alternativas são levar a amostra ao ponto de ebulição num tampão com dodecil sulfato de sódio (SDS / sem uréia) ou inativar as proteases com valores de pH baixo (por exemplo, precipitando com ácido tricloroacético – TCA). Porém, deve-se levar em conta a dificuldade de se inativar completamente todas as proteases [14].
A precipitação das proteínas com ácido tricloroacético/acetona (TCA/AC) é muito útil para minimizar a degradação destas e remover compostos interferentes, tais como sais ou polifenóis. Entretanto, é importante ressaltar que podem ocorrer perdas de proteínas devido à precipitação ou re-solubilização incompleta. Além disso, pode-se obter um conjunto completamente diferente de proteínas extraídas com um tampão de lise, dependendo se foi utilizada uma etapa prévia de precipitação ou não [15]. A remoção de sais pode ser obtida pela diálise ou, como já dito acima, pela precipitação de proteínas com TCA ou solventes orgânicos (por exemplo, acetona a zero grau Celsius). Outra alternativa seria utilizar kits de limpeza ou a diluição da amostra para
que a concentração de sais fique abaixo do nível crítico (<100 mmol L-1) [16].
Grandes quantidades de lipídeos podem interagir com proteínas da membrana e consumir detergentes. A remoção de lipídeos pode ser realizada pela extração com solventes orgânicos (por exemplo, etanol ou acetona a zero grau Celsius). Neste caso, podem ocorrer perdas significativas de proteínas se estas forem solúveis em solventes orgânicos ou porque elas nem sempre se re-solubilizam [6].
Alternativamente, pode ser empregada a centrifugação a alta velocidade [17], seguida da remoção da camada lipídica.
Polissacarídeos e ácidos nucléicos podem interagir com anfólitos e proteínas. Além disso, estas macromoléculas podem aumentar a viscosidade das soluções. Um procedimento comum para remoção é a precipitação das proteínas com acetona ou TCA/acetona. Outras recomendações para remoção dos ácidos nucléicos é a digestão com uma mistura de RNAses e DNAses (livres de proteases) ou por ultracentrifugação e adição de uma poliamina básica [6].
Fenóis estão presentes em materiais vegetais, principalmente em folhas de plantas e podem interagir com proteínas. Compostos polifenólicos podem ser removidos pela adição de polivinilpolipirrolidona ou, também, pela precipitação com
TCA e subsequente extração de fenóis com acetona a 0ºC [18 - 20].
Wang et al. [21] propuseram um protocolo para extrair proteínas de tecidos de plantas recalcitrantes (folhas e frutos). Foram utilizadas amostras de folhas de bambú (Bambusa vulgaris), de uva (Vitis vinifera), de iris (Iris pseudacorus), de oliva (Olea
europea), de limão (Citrus limonum), de pinheiro (Pinus nigra), de sequóia (Sequoia
sempervirens), de cana de açúcar (Saccharum officinarum) e de tabaco (Nicotiana
tabacum) e frutas maçã, banana, grape, kiwi, azeitona, laranja, pêra e tomate. O protocolo foi ajustado para processar pequenas quantidades de tecidos, em microtubos, no intervalo de 1 h, podendo ser expandido para escalas maiores (cerca de 1 a 5 g de tecido, em tubos de 30 a 50 mL). No protocolo proposto, a amostra era macerada manualmente em nitrogênio líquido até se obter um pó fino e lavada com TCA/acetona, metanol e, por fim, com acetona. A amostra era seca à temperatura ambiente até a remoção de todo resíduo de acetona, para se então proceder a extração e a precipitação das proteínas e do fenol. Os autores adicionaram entre 0,4 a 0,8 mL da amostra a um tampão contendo SDS e fenol na proporção de 1:1. Misturaram e deixaram incubar por 5 min, centrifugando logo a seguir a 16000 g por 3 min. Transferiram a parte superior da fase fenólica a um novo microtubo, que continha
solução metanólica de acetato de amônio a 0,1 mol L-1, o qual era armazenado em
submetida à centrifugação, a 16000 g por 5 min (4oC) e então o sobrenadante era descartado. A pastilha (contendo as proteínas) era lavada com metanol (PA) e novamente lavada com acetona 80% (v/v). A seguir, a pastilha era seca e utilizada na análise de proteínas (quantificação, PAGE ou IEF, etc). Os autores afirmaram que utilizando o protocolo proposto foi possível extrair um número maior de proteínas e com menos interferentes. Isto foi demonstrado por meio das imagens dos géis eletroforéticos, tanto em uma como em duas dimensões, onde foi obtido um número maior de spots de proteínas.
2.1.3. Solubilização de proteínas
Após o rompimento celular e a remoção dos compostos interferentes, os polipeptídeos devem ser solubilizados e, dependendo da finalidade da análise, desnaturados e reduzidos para romper as interações intra e inter-moleculares. A solubilização da amostra é geralmente realizada com um tampão contendo compostos caotrópicos (uréia ou tiouréia), detergentes não-iônicos ou zwitteriônicos (por exemplo, Triton X-100), agentes redutores, anfólitos e, dependendo do tipo de amostra, inibidores de protease. O tampão de solubilização mais popularmente usado é o de O´Farrell [22], tal qual descrito ou com algumas modificações [22].
Dentre os compostos caotrópicos, a uréia é bastante eficiente na ruptura das ligações de hidrogênio. Ela desnatura as proteínas pelo rompimento das ligações não-covalentes e iônicas entre os resíduos de aminoácidos [3], levando ao desdobramento e desnaturação da proteína. Em contraste, a tiouréia é muito adequada para a quebra das interações hidrofóbicas, aumentando a solubilização de proteínas de membranas hidrofóbicas [23, 24]. Atualmente, a solução mais indicada para solubilização de
proteínas hidrofóbicas é um tampão com uma combinação de 5 a 7 mol L-1 de uréia e
2 mol L-1 de tiouréia, com os detergentes apropriados.
Os detergentes são utilizados para impedir as interações hidrofóbicas entre os domínios de proteínas hidrofóbicas, evitando a perda destas devido à agregação e precipitação. A solubilização de proteínas em solução contendo o detergente aniônico SDS, à temperatura de ebulição, tem sido recomendada [25, 26]. Entretanto, a
concentração crítica para o uso do SDS é abaixo de 0,2% (m/v), tornando, assim, recomendável a troca desse detergente por outro não-iônico, como NP-40 ou Triton X-100 (apesar de não serem tão efetivos para a solubilização de proteínas hidrofóbicas de membrana como o SDS) ou por detergentes zwitteriônicos, como
sulfonato de 3-[(3-cloroamidopropil)dimetilamonio]-1-propano (CHAPS) ou
sulfobetainas (SB 3-10 ou ASB 14) [6]
Os agentes redutores promovem a redução e a prevenção da re-oxidação das pontes dissulfeto. Eles são necessários na clivagem das pontes intra e intermoleculares dissulfeto para se obter um desdobramento completo da proteína.
Os redutores mais comumente usados são o 1,4 ditiotreitol (DTT), o ditioeritritol
(DTE) e o 2-mercaptoetanol [27]. Existem outras indicações de redutores como: a tributilfosfina (TBP) [28] e o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) [29], mas a escolha do DTT e DTE é predominante [30].
Chan et al. [13] também testaram várias combinações do uso de uréia e tiouréia como agentes caotrópicos para a solubilização das proteínas do P. triestinum.
Eles usaram tampões com concentrações de 9,5 mol L-1 de uréia, 8 mol L-1 de uréia e
as combinações de 2 mol L-1 de tiouréia com 5 mol L-1 de uréia e, por último, 2 mol L-1
de tiouréia com 7 mol L-1 de uréia. Também estudaram os efeitos da adição de três
redutores (DTT, TBP e TCEP) nos tampões de re-hidratação (64 mmol L-1 de DTT, 2
mmol L-1 de TBP e 4 mmol L-1 de TCEP) e de equilíbrio, com ou sem o agente
alquilante iodoacetamida (0,26 mol L-1). Eles observaram um aumento no número de
spots nos géis de eletroforese ao se utilizar uréia e um aumento ainda maior ao se utilizar a combinação de uréia e tiouréia, atribuindo esses aumentos ao efeito de solubilização da uréia e da tiouréia. Quanto aos agentes redutores, eles observaram que o gel onde utilizaram o tampão com TCEP apresentou melhor resolução em comparação com os outros agentes e desaconselharam o uso do tampão com iodoacetamida na última etapa de equilíbrio, por provocar a perda de proteínas de baixa massa molar.
2.2 Plantas medicinais e fitoterápicos
A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. No início da década de 90, a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou que 65 a 80% da população dos países em desenvolvimento dependiam das plantas medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde [31].
É cada vez mais freqüente o uso de plantas das medicinas tradicionais hindú e chinesa, completamente desconhecidas dos povos ocidentais. Estas plantas comercializadas são apoiadas em propagandas que prometem “benefícios seguros, já que se trata de fonte natural”. Muitas vezes, entretanto, as supostas propriedades farmacológicas anunciadas não possuem validade científica, por não terem sido sequer indicadas no uso tradicional, ou por não terem tido suas ações farmacológicas comprovadas em testes pré-clínicos ou clínicos [31].
Os fitoterápicos importados de países asiáticos são um grande risco para a população, uma vez que as formulações são bastante diferentes das preparadas no ocidente, contendo metais potencialmente tóxicos em concentrações que, muitas vezes, ultrapassam os valores seguros para o consumo. Na medicina tradicional indiana a importância de metais como ouro, cobre, estanho, chumbo, mercúrio, ferro, prata e zinco é enfatizada. Assim, esses metais são utilizados geralmente junto com extratos de plantas medicinais.
Estudos multidisciplinares envolvendo etnobotânicos, químicos, farmacólogos e agrônomos (neste caso, no cultivo de ervas medicinais) são necessários para que sejam ampliados os conhecimentos sobre as plantas medicinais: como agem, quais são seus efeitos tóxicos e colaterais, como seriam suas interações com os medicamentos alopatas e quais estratégias mais adequadas para o controle de qualidade e produção de fitoterápicos, atendendo às novas normas das agências reguladoras, como as resoluções da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
No Brasil, resoluções recentes da ANVISA, de 16 de março de 2004 [32], visam a normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. A resolução-RDC número 48 determina que todos os testes referentes ao controle de qualidade de fitoterápicos devem ser realizados em rede credenciada no sistema REBLAS (Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde) ou por empresas que possuam certificado de BPFC (Boas Práticas de Fabricação e Controle) [32].
2.2.1 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos - Definições
A OMS define planta medicinal como sendo “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos” [33]. A diferença entre planta medicinal e fitoterápico reside na elaboração da planta para uma formulação específica, o que caracteriza um fitoterápico. Segundo a Secretaria de Vigilância Sanitária, em sua portaria número 6 de 31 de janeiro de 1995, fitoterápico é todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico, com benefício para o usuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. É o produto final acabado, embalado e rotulado. Na sua preparação podem ser utilizados adjuvantes farmacêuticos permitidos na legislação vigente. Não podem estar incluídas substâncias ativas de outras origens, não sendo considerado produto fitoterápico quaisquer outras substâncias ativas, ainda que de origem vegetal, isoladas ou mesmo suas misturas. Neste último caso, encontra-se o fitofármaco, que por definição “é a substância ativa, isolada de matérias-primas vegetais, ou mesmo, mistura de substâncias ativas de origem vegetal” [32].2.2.2. Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos - Perspectivas
Com o aumento da expectativa de vida, o número de doenças crônicas está crescendo, e as respostas da medicina convencional não têm sido satisfatórias. Além disso, muitos pacientes recusam-se a ingerir um número cada vez maior demedicamentos sintéticos que geralmente apresentam efeitos colaterais consideráveis e estão almejando por alternativas menos agressivas. Na Europa, essa tendência em relação à medicina natural tende a continuar crescendo. Isso se aplica principalmente ao campo da fitoterapia bem documentada, que tem se tornado cada vez mais aceita
e apreciada, não somente pelos pacientes como também pelos médicos. Na Ásia,
ambos os métodos de terapia, convencional e tradicional, são praticados igualmente, sendo que nenhuma das duas é classificada como universal. Os fitoterápicos apresentam diversos efeitos fisiológicos exatamente por conterem maior número de substâncias, tornando sua pesquisa mais complexa. Relativamente poucas pesquisas clínicas estão sendo conduzidas com plantas. Os motivos são principalmente econômicos: as plantas não podem ser patenteadas; portanto, não existem incentivos para se gastar grandes somas de dinheiro para provar que uma planta é segura e efetiva, de acordo com os padrões exigidos para aprovação de um novo medicamento. Apesar dessas dificuldades, são necessárias maiores contribuições científicas, tanto da Farmacognosia como da Medicina para que a fitoterapia ocupe
definitivamente seu espaço na cura, prevenção e manutenção da saúde [34].
2.2.3. Espirulina, Ginkgo biloba e Castanha da Índia
Para o estudo sistemático dos procedimentos de extração de proteínas foram escolhidas as amostras de fitoterápicos tradicionais, ou seja, plantas medicinais de uso alicerçado na tradição popular, sem evidências, conhecidas ou informadas, de risco à saúde do usuário, cujas eficácias são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas ou publicações indexadas [32]. Nestas amostras, as proteínas não são, na maioria das vezes, os princípios ativos, mas coadjuvantes.
No presente trabalho os fitoterápicos escolhidos como amostras foram: espirulina (Spirulina maxima), folhas de ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.) e castanha da Índia (Aesculus hippocastanum).
A espirulina, ou alga azul, pertence a um grupo de mais de mil e quinhentas espécies de plantas aquáticas microscópicas. É uma cianobactéria. As duas espécies
mais comumente usadas para consumo humano são Spirulina maxima (Figura 1.1) e
Spirulina platensis . Elas são cultivadas em alguns lagos nas Américas Central e do
Sul e na África. Ela é um suplemento alimentar popular no Japão, Israel, França e
também é comercializada nos Estados Unidos[35, 36].
Figura 1.1. Espirulina (Spirulina máxima).
A espirulina é uma fonte rica em proteínas (de 50 a 65% m/m), com todos os oito aminoácidos que são nutricionalmente requeridos. Entretanto, possui uma baixa concentração de metionina, em relação aos outros aminoácidos presentes [37, 38]. Ela também possui em sua composição clorofila, carotenóides, minerais, ácido gama-linoléico e alguns pigmentos específicos. Esses pigmentos, chamados de ficobilinas, incluem a ficocianina e a aloficocianina. Os pigmentos dão à espirulina a cor de azul ou verde intenso. As ficobilinas têm estruturas similares aos pigmentos da bile, tais como a bilirrubina. Na célula da espirulina, as ficobilinas são ligadas às proteínas e o complexo ficobilina-proteína é chamado ficobiliproteína [39].
Além do uso como suplemento alimentar, estudos preliminares in vitro e in vivo têm apresentado algumas indicações de efeitos antivirais. Existem também algumas evidências de que ela pode afetar favoravelmente algumas funções imunoprotetoras e de que tenha capacidade hepatoprotetora. Além disso, em estudos recentes, existem possibilidades de inibição de algumas reações alérgicas e efeitos hipocolesterômicos [40, 41]. Ainda, é utilizada na alimentação de microcrustáceos, moluscos e peixes nos
primeiros estágios de desenvolvimento e no processo de purificação de águas, removendo nitratos, fosfatos e outros elementos em grandes quantidades [37].
Com relação ao ginkgo biloba (vide Figura 1.2), tem havido um crescente interesse pelo seu uso nos últimos anos, tanto no uso popular, quanto em termos científicos. Uma prova desse crescente interesse é o grande número de citações (quase 2 milhões) que se pode observar em sites de busca como o Google.
Chamada pelos japoneses pelo carinhoso nome de Yin- Kuo, fruto de prata, o ginkgo (com nome científico de Ginkgo biloba L.), da família das Ginkgoáceas, é considerado sagrado pelos budistas, sendo as suas árvores plantadas nas entradas de todos os templos. Descrita pela primeira vez por volta de 1690 pelo médico alemão Engelbert Kaelmpter, foi levada para a Europa somente no ano de 1727, sendo considerada como um fóssil vivo [42].
O ginkgo, que faz parte do milenar arsenal terapêutico chinês, adapta-se muito bem às características urbanas e ao clima temperado, não sendo exigente com os solos. Resiste muito bem à poluição pesada, insetos, fungos, bactérias e vírus. As partes utilizadas são as folhas, frutos e sementes, sendo as folhas a parte mais comumente empregada [43].
Figura 1.2. Folhas de ginkgo biloba. Foto extraída do site:
A composição química das folhas de ginkgo é constituída por ácido butanóico, ácido ginkgólico, ácidos graxos, alcanos, antocianina, asoginkgetina, benzenóides,
bioflavonóides, caferol, carboidratos, carotenóides, catequina, diterpenos
ginkgolídeos, ésteres de ácido cumárico, esteróis, fenilpropanóides, ginol, glicosídeos flavonóides (principalmente ginkgobilina, quercetina e isoamnetina), kaempferol, lactona bilobalida, lipídeos, minerais, quercetina, sitosterol e triterpenos. Nos frutos também são encontrados ácidos ginkgólicos e ginol.
As suas folhas são consideradas adstringentes, antifúngicas, anti-helmínticas, antiblenorrágicas, antiinflamatórias, antioxidantes, antiplaquetárias, bactericidas, cardiotônicas, digestivas, estimulantes da circulação periférica, fungicidas, rejuvenescedoras, revigorantes, tônicas, vasodilatadoras periféricas. Assim, as indicações são inúmeras, tais como prevenir angiopatias, ansiedade e asma, para o tratamento de deficiências de audição, inibir o crescimento de bactérias, promover a sensação de bem-estar geral, bronquite, ajudar a combater câncer, recuperar a
capacidade intelectual, inibir a hiperpermeabilidade mediada pela bradicinina e
histamina (nos vasos capilares), cefaléia, combater a peroxidação lipídica das membranas, ativar o metabolismo energético e no tratamento profilático do envelhecimento das células, para o tratamento de irrigação deficiente no cérebro, isquemia, distúrbios arteriais, má-circulação sangüínea, para melhorar a concentração, para inibir o crescimento de fungos, furúnculos, prevenir infecções, inibir o PAF (fator ativador de plaquetas), labirintite, melhorar ou recuperar a perda de memória de pessoas idosas, em nível cerebral- aumentar o consumo de glicose e oxigênio, facilitando a síntese de ATP, para combater radicais livres, reduzir vertigens e zumbidos, entre outras [42].
No que se refere à castanha da Índia (Aesculus hippocastanum, Figura 1.3), a sua árvore é nativa da Ásia e norte da Grécia. As primeiras indicações de uso datam de 1565 e muitos anos depois seu uso cresceu por toda Europa. No leste da Europa, ela foi usada durante muito tempo como alimento para cavalos e gado. A árvore produz frutos dentro de cápsulas com espinhos, contendo de uma a três grandes sementes, conhecidas como as castanhas da Índia. Tradicionalmente, várias partes
aéreas da árvore, incluindo as sementes, as folhas e a casca são usadas em preparações medicinais [43].
Figura 1.3. Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum). Ilustração extraída de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Illustration_Aesculus_hippocastanum0.jpg
As sementes têm em sua composição química saponinas, responsáveis pelo sabor acre e amargo, taninas, d-catecol, pectina, leucoantocianina, potássio, óleos voláteis, cálcio, fósforo, entre outros. Os princípios ativos mais importantes são os flavonóides derivados, saponinas triterpênicas (escina, proescina e escigenina) e aminoácidos (adenina, adenosina, guanina, lisina e triptofano) [44]. Devido à presença da escina, a castanha é usada para promover a circulação nas veias [45]. A escina força o tônus normal nas paredes das veias, promovendo o retorno do sangue para o coração. Portanto, ela é usada para o tratamento de insuficiência venosa crônica e, numa menor extensão, no tratamento de veias varicosas. Ela também possui
propriedades anti-inflamatórias e tem sido usada para a redução de edemas após traumas, particularmente usada após traumas de esportes e cirurgias [45, 46].
2.3 Determinação de proteínas totais
Muitos métodos ao longo dos anos têm sido propostos para a determinação de proteínas totais, mas não existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios [47]. Dentre os métodos espectrofotométricos, os mais utilizados geralmente, são:
Biureto [48], que se baseia na reação do reativo do biureto, uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante (tartarato de sódio) que estabiliza o cobre em solução. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica; o de Lowry [49], que se baseia numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II) e produz um composto com absorção máxima em 750 nm; o de Bradford [50] e de Smith ou BCA (ácido bicinchonínico, 4,4´-dicarboxi-2,2´-biquinolina) [51], se baseia na reação do cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um complexo com BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm; e de espectrofotometria de absorção no ultravioleta [52]. Além desses, também são muito utilizados métodos que fazem a determinação de proteínas totais por meio do carbono total ou do nitrogênio total (método de Kjeldahl) [53]. Cada um deles possui suas vantagens e limitações e são mais aplicados a tipos de amostras específicas. Outra consideração que se deve fazer quanto à escolha do método a ser utilizado diz respeito ao meio em que as proteínas estão e se esse meio pode ser considerado como um interferente, alterando os resultados finais. A seguir, serão apresentados dois métodos que foram escolhidos para serem aplicados na determinação de proteínas totais neste trabalho de Tese.
