RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os resultados das concentrações de proteínas totais dos extratos protéicos são apresentados na Tabela 1.1, sendo que as curvas analíticas obtidas usando o método

de Bradford apresentaram coeficientes de correlações lineares (R2) entre 0,986 e

Tabela 1.1: Concentrações de proteínas totais ± desvio padrão (em mg g-1_{) nas} amostras determinadas pelo método de Bradford (n=3) para os diferentes processos de extração de proteínas. Procedimento / Amostra Número Castanha da Índia (mg g-1) Espirulina (mg g-1) Ginkgo biloba (mg g-1) 1 Agitação em água 18,1±0,6 99±4 4,3±0,3 2 Agitação em tampão 15,1±0,6 58±4 2,6±0,5

3 Agitação e diálise em água 12,2±0,4 55±2 3,8±0,2

4 Maceração em água 30,4±0,8 133±5 3,6±0,4

5 Maceração em tampão 35,9±0,2 132±4 2,7±0,3

6 Maceração e diálise em água 17,4±0,8 74±5 1,4±0,1

7 Agitação em água e sonicação 23,1±0,4 66±1 0,79±0,02 8 Maceração em água e sonicação 33,8±0,9 92±4 4,4±0,6 9 Maceração em tampão e sonicação 55±1 222±4 2,7±0,2 10 Idem procedimento 8, à 40oC 48±2 125±4 ND 11 Idem procedimento 9, à 40oC 38±2 95±4 ND ND – não detectado

Estes resultados não forneceram informações sobre o tipo de proteínas extraídas, isto é, por meio desses resultados não foi possível saber se houve alguma proteína que foi extraída em maior quantidade do que outra, ou se algumas foram extraídas ou não dependendo do procedimento utilizado. Nem mesmo foi possível determinar quais proteínas estavam sendo extraídas, ou se elas estavam intactas (ou

não) após a extração. Para isso seria necessário se utilizar outros métodos de caracterização, sendo um assunto a ser abordado no Capítulo 2 dessa Tese, onde será tratada a caracterização das proteínas. Assim, o que se pode inferir apenas a respeito das proteínas, é que se tratavam de proteínas hidrossolúveis, devido aos meios extratores utilizados. Apesar dessas limitações, os resultados apresentados na Tabela 1.1 foram utilizados para a comparação da eficiência relativa de extração.

Com relação aos meios extratores, estes foram escolhidos por não apresentarem interferência na determinação de proteínas totais, de acordo com a literatura [47, 50]. Foi tomado o cuidado de se extrair as proteínas apenas com água ou com tampão Tris-HCl, sem a adição de qualquer concomitante. Entretanto, não se pode ignorar que na composição da própria amostra, principalmente após a maceração e quando existir a liberação de substâncias fenólicas, existam concomitantes que possam alterar os resultados. Para uma provável minimização destes concomitantes, deveria se proceder a uma etapa de limpeza, talvez precipitação e re-solubilização das proteínas num meio sem concomitantes, para finalmente se realizar a determinação por Bradford.

Por outro lado, sabe-se que a cada etapa adicionada, principalmente de limpeza, corre-se o risco de perdas de proteínas, ou seja, no resultado final se teria também uma alteração na concentração de proteínas totais. Finalmente, optou-se por não adicionar mais nenhum passo ou procedimento de limpeza, mas apenas tomar-se os cuidados já citados.

Inicialmente pode-se observar, a partir dos resultados da Tabela 1.1, que os procedimentos mais eficientes para a extração (aqui se utiliza esse termo no sentido de maior concentração de proteínas extraídas) foram os procedimentos 8 e 9 para todas as amostras, ou seja, os procedimentos onde se utilizou a maceração manual seguida de sonicação, para os dois meios extratores. Para a amostra de ginkgo biloba

se alcançou uma concentração de proteínas totais de 4,4 ± 0,6 mg g-1 ao se utilizar o

procedimento 8. Já para as amostras de castanha da Índia e espirulina obtiveram-se

concentrações de proteínas totais de 55 ± 1 e 222 ± 4 mg g-1_{, respectivamente,}

respectivamente, 0,4%, 5,5% e 22% m/m da composição das amostras de ginkgo, castanha e espirulina.

Ao se compararem os valores obtidos com a literatura, é possível verificar que as concentrações obtidas para a castanha da Índia estão em concordância com os valores publicados (concentrações entre 0,4 e 11,0% m/m) [75 - 77]. Gumilevskaya et

al.[78]observaram que as castanhas da Índia não acumulam grandes quantidades de

proteínas de armazenamento e que a quantidade total de proteínas não excederia 7,5% em peso seco. Portanto, o resultado obtido do procedimento 9 representando 5,5% da concentração de proteínas totais está em concordância com os valores esperados.

Já para a ginkgo biloba, os máximos valores obtidos (4,4 ± 0,6 mg g-1_{, que}

corresponderiam a 2,2 mg de proteínas em 500 mg de amostra, ou seja, 0,44% m/m) foram abaixo dos apresentados pela literatura (em torno de 9% m/m) [79], o mesmo ocorrendo para a espirulina. Para esta última amostra, o máximo valor obtido (222 ± 4

mg g-1_{, corresponderiam a 111 mg de proteínas em 500 mg de amostra, ou seja,}

22,2% m/m) foi menor que o apresentado pelo laudo de análise (61,6% m/m) [Apêndice 2] e também menor do que os valores apresentados pela literatura (de 55 a 70% m/m) [80].

Devido à discrepância entre os valores obtidos e os apresentados pela literatura para a concentração de proteínas totais das amostras ginkgo biloba e espirulina, houve a preocupação em se determinar a concentração de proteínas totais por meio de outro método, que não fosse espectrofotométrico. Para isso, foi escolhida a espirulina uma vez que essa amostra possui um laudo de análise, cujas especificações foram determinadas de acordo com a British Herbal Pharmacopeia

(1996) e a World Health Organization – Geneva (1978). Assim, foi determinada a concentração de proteínas totais da espirulina por meio do método de Kjeldahl [53],

obtendo-se o valor de 554 ± 5 mg g-1 de proteínas totais. Esse valor corresponde a

55,4% (m/m) da composição da amostra, que comparado ao valor do laudo de análise (61,6% m/m) se mostrou menos discrepante do que aquele obtido pela análise espectrofotométrica. Isto nos sugere que, possivelmente, os valores apresentados

pela literatura sejam obtidos por métodos não espectrofotométricos, como, por exemplo, o de Kjeldahl.

Diante de resultados tão diferentes obtidos por esses dois métodos, vale a pena algumas considerações. O método de Kjeldahl é muitas vezes considerado como um método para validação [81], onde se considera que a contribuição do nitrogênio não orgânico ou o orgânico proveniente de outras estruturas é desprezível frente à parcela do nitrogênio orgânico proveniente da composição das proteínas. Entretanto, na composição da amostra espirulina as proteínas contribuem com 50 a 70% (m/m) da composição e os aminoácidos essenciais livres com 30% (m/m) [43]. Essa contribuição dos aminoácidos essenciais livres é significativa, ou seja, influenciaria significativamente no resultado da determinação de nitrogênio orgânico na amostra e, conseqüentemente, no resultado da concentração de proteínas totais pelo método de Kjeldahl, trazendo dúvida quanto à exatidão dos resultados deste método.

Por outro lado, o método de Bradford, apesar de suas vantagens, tem se mostrado altamente dependente do grupo de proteínas que compõem a amostra, representando o maior problema para o uso indiscriminado deste método [81]. Como exemplos, Keller e Neville [59] compararam os métodos do biureto, do BCA (ácido bicinchonínico, 4,4´-dicarboxi-2,2´-biquinolina) [51], de Lowry e de Bradford para a determinação de proteínas em leite humano. Nestes estudos, o valor para a concentração de proteínas obtidas pelo método de micro-Kjeldahl foi utilizado como padrão. Enquanto os resultados fornecidos pelos métodos do biureto, de Lowry e do BCA superestimaram a concentração de proteínas, o de Bradford subestimou o valor da concentração de proteínas. Fountoulakis e colaboradores [66] compararam o método de Bradford, do BCA e de Lowry para um conjunto de proteínas glicosiladas e não-glicosiladas. Para as proteínas não-glicosiladas os três métodos forneceram valores consistentes com aqueles obtidos por análise quantitativa de aminoácidos. Porém, para as proteínas glicosiladas o método de Bradford forneceu valores mais baixos, enquanto que os de Lowry e do BCA forneceram valores acima do obtido pela análise de aminoácidos. Quanto à composição da amostra espirulina, conforme já foi

descrito no item 3.2.3 deste capítulo, existem algumas proteínas que possuem corantes ligados às suas estruturas. Estas são conhecidas como ficocianinas ou ficobiliproteínas. Na estrutura de uma ficobiliproteína, o cromóforo linear tetrapirrólico (bile) se liga covalentemente via uma ou duas ligações tiól-éter aos resíduos de cisteína de uma apoproteína [82].

É interessante também verificar o mecanismo de interação entre o corante

coomassie e a proteína. Sedmark e Grossberg [83] sugeriram que a ligação do corante à proteína seria mediada pela interação com grupos amina protonados na proteína. Além deles, de Moreno et al. [84] demonstraram a importância dos grupos amina nas proteínas, sugerindo que os grupos sulfônicos no corante formariam um par iônico com os resíduos de lisina e arginina. Assim, somente as espécies desprotonadas (ionizadas) do corante coomassie se ligariam à proteína (resíduos lisina e arginina) [85, 86]. Portanto, pode-se supor que, apesar do coomassie e da bile se ligar a resíduos diferentes na proteína, a bile provocaria dificuldades ou impedimento estérico para o coomassie se ligar à proteína, levando a resultados subestimados fornecidos pelo método de Bradford para a concentração de proteínas totais para esta amostra. Com isso, entende-se que a amostra espirulina possui um conjunto de proteínas na sua composição que não é adequado para a determinação pelo método de Bradford.

Pelos argumentos apresentados acima, escolheu-se para a continuidade do trabalho da Tese a amostra de castanha da Índia, uma vez que essa apresentou resultados diretamente concordantes com a literatura, os quais passarão a ser discutidos.

A partir dos resultados da amostra castanha da Índia na Tabela 1.1 e considerando o valor máximo obtido para a concentração de proteínas totais

(castanha da Índia: 55 mg g-1, quando o meio extrator era o tampão Tris HCl à 1,0 mol

L-1, pH 6,8) como valor de referência (100%), foram comparados os procedimentos de

extração:

Observaram-se diminuições de 34,7% na quantidade de proteínas extraídas entre os procedimentos 5 (quando a amostra era macerada no meio extrator) e 9, e

de 72,5% entre os procedimentos 2 (quando a amostra era agitada no meio extrator) e 9, ou seja, entende-se que os procedimentos de agitação e maceração não foram tão eficazes na extração das proteínas.

Quando a água foi utilizada como meio extrator, houve uma diminuição de 10% na quantidade extraída de proteínas totais entre os procedimentos 4 (quando a amostra era macerada no meio extrator) e 8, e de 46,4% entre os procedimentos 1 (quando a amostra era agitada no meio extrator) e 8. Assim, verificou-se que quanto maior o número de passos adicionados aos procedimentos de extração das proteínas, isto é, a agitação seguida da maceração e sonicação, se aumentava o rompimento celular liberando mais proteínas das membranas e organelas celulares vegetais e se aumentava a concentração das proteínas extraídas.

Os menores valores das concentrações de proteínas totais foram obtidos naqueles procedimentos onde foi utilizada a diálise (o que já se esperava, uma vez que a diálise pode ser considerada um procedimento bastante ameno comparado aos outros procedimentos utilizados e levando-se em conta o tipo de amostra bastante complexa): diminuições de 48,5% entre os procedimentos 6 (quando a amostra era macerada em água e submetida à diálise) e 8, e de 64% entre os procedimentos 3 (quando a amostra era submetida à diálise em água) e 8. Apesar deste procedimento “limpar” as amostras, ou seja, partículas e fragmentos de proteínas ou proteínas menores do que 8 kDa passarem pela membrana, entende-se que as proteínas, dentro de membranas ou organelas, provavelmente não foram extraídas, ou ainda, que apenas ao se usar a agitação seguida de diálise as proteínas não tenham sofrido total desnaturação. Isso poderia dificultar o acesso ou a ligação do corante coomassie à proteína, justamente pelo enovelamento (estrutura terciária) da proteína.

Portanto, em termos de concentrações de proteínas totais, os procedimentos mais eficientes foram aqueles onde era utilizada a agitação seguida de maceração,

sonicação e centrifugação, à temperatura ambiente ou à 40oC (procedimentos 8, 9, 10

e 11) e os menos eficientes (sob as condições analisadas) foram aqueles onde a diálise foi utilizada (procedimentos 3 e 6).