Eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões (2D

A maioria das pesquisas em proteomas de plantas utiliza a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS em duas dimensões (2D - PAGE) para a separação de proteínas [6].

Na separação por 2D - PAGE, as proteínas são inicialmente separadas por focalizaçao isoelétrica (IEF), já descrita acima no item 2.2.1. A eletroforese por focalização isoelétrica (IEF) tem geralmente dois modos de separação. Um deles é o tradicional sistema baseado no transporte de anfólitos e o segundo é baseado na preparação de imobilização de gradientes de pH. A maior vantagem do sistema IPG é a disponibilidade de fitas pré-preparadas, proporcionando uma técnica de 2D mais fácil de se usar. Por outro lado, o sistema de anfólitos é utilizado principalmente quando grandes quantidades de proteínas são usadas ou proteínas básicas são separadas.

Após a corrida, as proteínas contidas nas fitas são desnaturadas e envolvidas por SDS, adquirindo cargas negativas. A fita é então aplicada em um gel de poliacrilamida, no qual ocorre a segunda dimensão da separação. Geralmente, a segunda dimensão separa proteínas baseada nas suas massas molares em géis com SDS [13].

Um interessante conjunto de fontes e informações sobre a eletroforese 2D estão disponíveis na Internet. Uma lista atual pode ser obtida no endereço http://www.lecb.ncifcrf.gov/EP/. Entretanto, uma revisão cuidadosa da Internet revela

algumas diferenças entre os bancos de dados para a identificação de spots de proteínas [13].

2.3 Espectrometria de massas

A espectrometria de massas tem se tornado uma ferramenta essencial nas ciências biológicas modernas, não apenas pela alta sensibilidade, mas, também, devido ao conteúdo total de informações derivadas dessa técnica [6].

A espectrometria de massas tem sido largamente usada na análise de proteínas após a introdução do MALDI e da ionização por Eletrospray. Existem muitas opções para analisadores de massas, sendo as mais comuns o tempo de vôo – TOF conectado ao MALDI e ao quadrupolo triplo, quadrupolo-TOF ou ao analisador de ion

trap acoplado ao ESI [16].

Na análise proteômica, as proteínas separadas eletroforeticamente podem ser identificadas por espectrometria de massas pela técnica chamada de “impressão digital” (fingerprint) de peptídeos ou, após a digestão dos peptídeos in gel, estes são fragmentados no espectrômetro de massas produzindo seqüências parciais de aminoácidos. Após isso, são realizadas buscas em bancos de dados usando tanto a massa molar quanto as informações dessas seqüências.

A seguir, será apresentado o princípio de funcionamento da técnica MALDI- TOF-MS e fingerprint de peptídeos [16].

2.3.1 Digestão tríptica

A amostra de proteínas, que geralmente foi separada por um processo eletroforético e está inserida em um gel, é digerida por uma enzima específica, muitas vezes tripsina, quando são gerados peptídeos com massas molares dentro da faixa de massas dos espectrômetros [6].

A tripsina cliva as ligações peptídicas de proteínas após os grupos carbonila dos resíduos de lisina (K) e arginina (R), exceto quando estas ligações são com prolina (P), ou seja, ligações K-P ou R-P. A tripsina é o reagente mais utilizado nos

experimentos de seqüenciamento por espectrometria de massas por ter um custo de produção relativamente baixo, por possuir uma alta atividade proteolítica, por produzir peptídeos pequenos (na faixa de 600 a 2500 Da) e por ser covalentemente modificada, de modo a minimizar os processos de autodigestão ou autólise [17].

Quando as proteínas são separadas eletroforeticamente em gel, por técnicas como SDS-PAGE ou 2D-PAGE, a digestão é feita na proteína ainda contida em uma banda do gel. Esta proteína encontra-se imobilizada no gel de poliacrilamida por precipitação, que ocorre durante a etapa de fixação do procedimento de coloração do gel. Por causa desta imobilização, a proteína não pode difundir do gel durante as etapas do protocolo de digestão até que ocorra a digestão tríptica, quando os peptídeos formados poderão se difundir do gel de poliacrilamida devido ao tamanho pequeno, em relação aos poros do gel de poliacrilamida. O protocolo de digestão consiste de seis etapas que são: Retirada da banda protéica do gel e lavagem, secagem das bandas, digestão com tripsina, extração dos peptídeos e lavagem,

captura dos peptídeos em uma coluna C18 e eluição da amostra [17].

Após a eluição dos peptídeos, estes são misturados a uma solução de matriz e a mistura será depositada numa placa para a análise por massas.

2.3.2 MALDI-TOF-MS

Para a análise por MALDI, a amostra de proteínas, geralmente um spot de interesse que está inserida em um gel, é digerida por uma enzima específica, muitas vezes tripsina conforme citado no item 2.3.1, e este conjunto de peptídeos é misturado a uma solução de matriz. Esta solução de matriz é uma solução ácida concentrada ou saturada de baixa massa molar e absorvedora de radiação ultra- violeta (especificamente para o MALDI). Aproximadamente 1 µL desta mistura de amostra e matriz é colocada sobre a placa de MALDI, e conforme o solvente da mistura seca, a matriz se cristaliza sendo que as moléculas de peptídeos ficam incluídas nestes cristais.

Quando o LASER incide sobre os cristais de matriz/amostra, a matriz absorvedora de UV e que deve estar em excesso em relação à amostra, absorve

energia e a transfere para a amostra de uma maneira suave, de forma que o processo de ionização não fragmente os peptídeos. Dessa forma, a energia do LASER produz uma pluma de matriz que carrega os íons de analito numa forma gasosa [6]. Na Figura 2.3 é apresentada uma ilustração do princípio mencionado acima.

Figura 2.3. Ilustração dos processos que ocorrem durante a MALDI. Adaptada de Nyman [16].

Os íons de peptídeos são, então, separados pelo analisador de tempo de vôo (TOF), no qual os íons são acelerados de uma posição inicial e voam através do tubo TOF. Os íons mais leves (aqueles com menor relação massa/carga) voam mais rápido através do analisador que os íons mais pesados (com maior relação massa/carga), de forma que o tempo de vôo para alcançar o detector pode ser usado para a determinação da relação massa/carga dos íons [6].

2.3.3 Espectros de massas

Para cada pulso de LASER é produzido um espectro de massas que conterá íons provenientes dos peptídeos da proteína digerida, juntamente com os íons da

matriz (estes com relação massa/carga abaixo de 500 Da), além de alguns peptídeos

originados da autóliseda protease usada para a digestão da proteína-amostra.

O primeiro passo em um experimento de fingerprint de peptídeos é a de- isotopagem do espectro de massas produzido, que é realizada por um programa de processamento de dados. A de-isotopagem identificará os picos isótopos, que causam identificações falsas de proteínas e os removerá. A seguir, é obtida uma lista de massas dos picos mais intensos dos valores massa/carga que são comparados a um filtro (outro programa computacional) que reconhecerá e removerá qualquer pico originado da autólise da protease utilizada para a digestão. A lista de picos é, então, submetida a um banco de dados, que comparará as massas dos peptídeos do espectro com aqueles de proteínas teoricamente digeridos e produzirá uma lista de possíveis combinações (matches) e um mecanismo de pontuações (scores) para a correta identificação.

Antes da lista de picos ser submetida ao banco de dados, várias informações relevantes devem ser consideradas e especificadas, tais como a espécie da qual a proteína é originada, o pI e a massa molar aproximada da proteína, a protease usada na digestão, quaisquer modificações ocasionadas na proteína e a tolerância de massa. Destas variáveis, a protease utilizada e a tolerância de massa são as mais importantes. A protease usada especificará com qual lista de proteínas teóricas digeridas se fará as comparações dos espectros produzidos. Já a tolerância de massa, especificará o quão próximo (medida em partes por milhão, ppm) a massa do peptídeo submetido e a massa do peptídeo teórico poderão estar para o matching. Uma descrição mais detalhada sobre a interpretação do espectro de massas, bem como dos vários métodos para se obter maior exatidão de massas para os peptídeos e identificação de proteínas pode ser obtida na revisão de Newton et al. [6].

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Equipamentos e acessórios

Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o desenvolvimento deste Capítulo:

• Agitador por efeito vortex, marca Thermolyne, modelo M-37600; • Balança analítica, marca Mettler, modelo AE200;

• Centrífuga, marca Nova Técnica, modelo NT 811;

• Cubas para eletroforese do tipo SDS-PAGE, marca Permatron; • Estufa, marca Quimis;

• Espectrômetro de massas do tipo MALDI-QTOF, marca Waters -Micromass,

modelo PremierTM ;

• Fonte de corrente contínua, marca Pharmacia Biotech, modelo EPS 1001; • Mesa agitadora, marca Quimis, modelo Q225M;

• Placa aquecedora, marca Quimis;

• Potenciômetro, marca Digimed, modelo DM20;

• Scanner, marca GE Healthcare, modelo ImageScannerTM II;

• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo Quantum TM cartridge;

• Sistema para eletroforese 2D-PAGE, marca GE Healthcare, modelo EttanTM

Daltsix;

• Ultracentrífuga refrigerada, marca BioAgency, modelo Bio-Spin-R; • Vidrarias apropriadas.

3.2 Reagentes e soluções

Todos os reagentes usados foram de grau analítico, sendo as soluções preparadas com água desionizada. A seguir são listados todos os reagentes/soluções empregados nesta parte do trabalho

2-Mercaptoetanol, HSCH2CH2OH, MM = 73,18 g mol-1 (J. T. Baker);

Acetato de amônio, C2H7NO2, MM = 77,08 g mol-1 (Mallinckrodt);

Acetona P.A., (CH3)2CO, MM = 58,08 g mol-1 (Synth);

Acetonitrila, C2H3N, MM = 41,05 g mol-1 (Merck);

Ácido acético glacial, CH3COOH, MM = 60,05 g mol-1 (J. T. Baker);

Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, C10H7NO3, MM = 189,16 g mol-1 (Sigma-

Aldrich);

Ácido clorídrico 37% m/v, HCl, MM = 36,46 g mol-1 (J. T. Baker);

Ácido fosfórico 85%, H3PO4, MM = 98,00 g mol-1 (Merck);

Ácido tricloroacético, C2HCl3O2, MM = 163,39 g mol-1 (Synth);

Ácido trifluoroacético, C2HF3O2, MM = 114,03 g mol-1 (Mallinckrodt);

Acrilamida, MM = 71,08 g mol-1 (BioAgency);

Agarose grau biologia molecular (BioAgency);
Albumina de soro bovino (Merck);

Anfólitos, pH de 3 a 10 (Amersham Biosciences);

Azul de bromofenol, C19H9Br4NaO5S, MM = 691,94 g mol-1 (BioAgency);

Azul de Coomassie G-250, C47H50N3NaO7S2, MM = 854,03 g mol-1 (J.T. Baker);

Cloreto de potássio, KCl, MM = 74,55 g mol-1 (Merck);

Ditiotreitol, DTT, (CHOHCH2SH)2, MM = 154,24 g mol-1 (Amersham

Biosciences);

Dodecil sulfato de sódio, SDS, C12H25NaO4S, MM = 288,28 g mol-1 (Synth);

Etanol 95%, C2H6O, MM = 46,07 g mol-1 (J. T. Baker);

Glicerol 87%, HOCH2CH(OH)CH2OH, MM = 92,09 g mol-1 (Amersham

Biosciences);

Glicina, NH2CH2COOH, MM = 75,07 g mol-1 (Amersham Biosciences);

Iodoacetamida, C2H4INO, MM = 184,96 g mol-1 (Amersham Biosciences);

Kit para digestão tríptica dos géis In-Gel DigestZP Kit (Millipore);

Metanol P.A., CH3OH, MM = 32,04 g mol-1 (Ecibra);

N,N’-metilenobisacrilamida, C7H10N2O2, MM = 154,17 g mol-1 (Amersham,

N,N’,N,N’-tetrametiletilenodiamina, TEMED, C6H16N2, MM = 116,20 g mol-1 (J. T. Baker);

Óleo mineral, (Amersham Biosciences);

Padrão protéico de massa molar, 116,0–14,4 kDa (MBI, Fermentas);

Peróxido de hidrogênio, H2O2 30% (m/m) (Merck);

Polioxietileno(10) isooctilfenil éter, Triton X-100, (J. T. Baker);

Uréia, NH2CONH2, MM = 60,06 g mol-1 (BioAgency).