Multiplicação in vitro de bromélias Aechmea aquilega e Bromelia balansae
In vitro multiplication of bromeliads Aechmea aquilega and Bromelia
balansae
DOI:10.34117/bjdv6n4-062
Recebimento dos originais:19/03/2020 Aceitação para publicação: 03/04/2020
Gabriel Junio da Silva Dias
Graduando em Agronomia, bolsista do PIBIC/CNPq, Instituto Federal Goiano - Campus Ceres,
E-mail: gabrielgoddri@hotmail.com
Letícia Ferreira da Silva
Graduanda em Agronomia no Instituto Federal Goiano – Campus Ceres – GO, E-mail:leticiafersi@hotmail.com
Leonardo Alves Carneiro
Bolsista DCR da FAPEG/CNPq no Instituto Federal Goiano – Campus Ceres – GO, E-mail:leonacw@uol.com.br
Cleiton Mateus Sousa
Professor, Instituto Federal Goiano-Campus Ceres, E-mail:cleiton.sousa@ifgoiano.edu.br
RESUMO
Objetivou-se avaliar a multiplicação in vitro de A. aquilega e B. balansae em função de combinações de ácido naftaleno acético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP). O experimento foi realizado em fatorial 2x3x4, sendo duas espécies de bromélias (B. balansae e B. aquilega), três níveis de ANA (0,0; 0,5 e 1,0 mg.L-1) e quatro níveis de BAP (0,0; 1,5; 3,0 e 6,0 mg.L
-1), em delineamento inteiramente casualizado, com três repetições e seis plântulas por unidade
experimental. Utilizou-se sementes para implantação das culturas in vitro. Após a germinação das sementes, em tubo de ensaio contendo meio MS, com a metade da concentração dos sais, as plântulas foram transferidas para recipientes plásticos, contendo 60 ml de meio MS, suplementado com as concentrações de ANA e BAP propostas. A interação entre ANA e BAP influenciou somente o número de brotos. A interação entre genótipos e BAP influenciou a brotação. O uso de citocinina foi determinante para a proliferação de brotos. Observou diferença entre as bromélias quanto a sensibilidade aos reguladoras de crescimento estudados. A A. aquilega apresentou maior eficiência de brotação em meio com 5,05 mg.L-1 de BAP, enquanto a B. balansae não atingiu o máximo de brotação com 6,0 mg L-1 BAP. Já para o enraizamento in vitro nas duas espécies de bromélias, não é necessário o uso de reguladores de crescimento. A presença de BAP reduziu o enraizamento. Houve diferença na massa fresca e massa seca dos genótipos. A B. balansae apresentou maior massa fresca. As duas espécies demonstraram facilidade na proliferação de brotos, assim como no enraizamento in vitro.
Recomenda-se o uso de citocinina para a multiplicação das duas espécies de bromélias estudadas e para obter plântulas com potencial para aclimatização, somente o meio MS.
Palavras chave: Bromeliaceae, Cerrado, cultura de tecidos, auxina e citocinina.
ABSTRACT
The objective was to evaluate the in vitro multiplication of A. aquilega and B. balansae as a function of combinations of naphthalene acetic acid (ANA) and 6-benzylaminopurine (BAP). The experiment was carried out in a 2x3x4 factorial, with two species of bromeliads (B. balansae and B. aquilega), three levels of ANA (0.0; 0.5 and 1.0 mg.L-1) and four levels of BAP (0.0; 1.5; 3.0 and 6.0 mg.L-1), in a completely randomized design, with three replications and six seedlings per experimental unit. Seeds were used to implant the cultures in vitro. After seed germination, in a test tube containing MS medium, with half the concentration of salts, the seedlings were transferred to plastic containers, containing 60 ml of MS medium, supplemented with the proposed ANA and BAP concentrations. The interaction between ANA and BAP influenced only the number of shoots. The interaction between genotypes and BAP influenced the sprouting. The use of cytokinin was decisive for the proliferation of shoots. There was a difference between the bromeliads in terms of sensitivity to the growth regulators studied. A. aquilega showed higher efficiency of sprouting in medium with 5.05 mg.L-1 of BAP, while B. balansae did not reach maximum sprouting with 6.0 mg L-1 BAP. For in vitro rooting in the two species of bromeliads, it is not necessary to use growth regulators. The presence of BAP reduced rooting. There was a difference in the fresh and dry mass of the genotypes. B. balansae had the highest fresh weight. Both species demonstrated ease in the proliferation of shoots, as well as in vitro rooting. It is recommended to use cytokinin for the multiplication of the two species of bromeliads studied and to obtain seedlings with potential for acclimatization, only the MS medium.
Keywords: Bromeliaceae, Cerrado, tissue culture, auxin and cytokinin.
1 INTRODUÇÃO
A família bromeliaceae é muito diversificada. Atualmente são 58 gêneros e cerca de 3.140 espécies, normalmente são encontradas em regiões neotropicais e subdivididas nas subfamílias; Brocchinioideae, Bromelioideae, Hechtioideae, Lindmanioideae, Navioideae, Pitcairnioideae, Puyoideae e Tillandsioideae (GIVNISH et al., 2011). Na flora brasileira as bromélias estão presentes em todos os ecossistemas, sendo representadas por 44 gêneros dessa família por 1.348 espécies, aproximadamente 90% endêmicas do país (BFG, 2015).
As bromélias apresentam diferentes hábitos, podendo ser epífitas, terrestres ou saxícolas. São plantas herbáceas e perenes, apresentam adaptações formadas pelas folhas que possuem escamas peltadas, associadas à roseta que recobrem as folhas para absorção de água e nutrientes (Horres et al. 2007). Entre as espécies destaca-se a Bromelia balansae, amplamente distribuída, não apresentando endemismo no Brasil. Está presente nas regiões;
Centro-Oeste, Nordeste, Norte, Sudeste e Sul. Do mesmo modo na Argentina, Bolívia, Colômbia e Paraguai (Wanderley et al, 2007). Essa planta está presente na lista vermelha da flora brasileira (CNCFlora, 2012). Já a Aechmea aquilega, tem origem no brasil com forte ocorrência no Nordeste, presente em vários habitats e ecossistemas (Bispo, 2011). Essas espécies apresentam importante papel ecofisiológico. Realizam a ciclagem dos nutrientes e armazenam água em um tanque formado pelas folhas entrelaçadas em sua base, promovendo um micro-habit favorável para o desenvolvimento e reprodução de vários organismos como insetos, vertebrados e invertebrados (Frank et al., 2004; Del-Claro, 2012).
Além de apresentar importantes papéis ecológicos, as bromélias possuem importância agrícola, medicinal e ornamental. Espécies dessa família é largamente cultivada, o Ananas
comosus, conhecido como abacaxi é utilizado na alimentação humana. As folhas apresentam
substâncias extraídas que podem ser utilizadas como antioxidantes e antimicrobianas na indústria farmacêutica (Divensi & Araújo, 2012). Devido a beleza das folhas com colorações variadas e rusticidade, são utilizadas na ornamentação urbana. Dessa forma, as bromélias apresentam expressivo potencial econômico, o que as torna alvo do extrativismo, justificando a preocupação com alternativas de conservação e produção de mudas.
A cultura de tecidos é uma estratégia representada por técnicas assépticas, para a propagação de mudas visando a comercialização em larga escala, produção de plantas sadias e a conservação do material genético. Avanços na cultura de tecidos vegetais tem permitido a obtenção de mudas de bromélias com qualidade (GUERRA & DAL VESCO, 2010). Entre as técnicas, destaca-se a propagação in vitro (Sarasan et al. 2006).
Nesse sentido, o objetivou-se avaliar a multiplicação in vitro de A. aquilega e B.
balansae em função de combinações de ácido naftaleno acético e 6-benzilaminopurina.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto Federal Goiano – Campus Ceres. A implantação das culturas in vitro foi a partir de sementes disponibilizadas pelo Jardim Botânico de Brasília. A desinfestação consistiu na imersão das sementes em etanol 70%, durante 1 minuto, em seguida em solução de 0,125% de hipoclorito de sódio com três gostas de tweem-80 durante 20 minutos, finalizando com três lavagens com água deionizada e autoclavada.
Após a desinfestação, as sementes foram inoculadas em tubos de ensaio (2,5 cm x 15cm), contendo 20 ml de meio de cultura com 50% das concentrações dos sais MS
(Murashige e Skoog, 1962), vitaminas (Tiamina 0,05 mg.L-1, ácido nicotínico 0,25 mg.L-1 e
ácido piridoxina 0,25 mg.L-1), mio-inositol 50 mg.L-1, glicina 1 mg.L-1, acrescido de 30 g.L-1
de sacarose e 7 g.L-1agar. Antes da adição do ágar, o pH foi ajustado a 5,7. Os tubos de ensaios
com as sementes foram mantidos em sala de crescimento a 25±2º C e fotoperíodo de 16h luz e 8 horas escuro.
Quando as plântulas apresentaram um par de folhas com aproximadamente 4 cm de altura, 97 dias após a germinação para B. balansae e 98 para A. aquilega, foram transferidas para recipientes plásticos, contendo 60 ml de meio MS vitaminas (tiamina 0,1 mg.L-1, ácido nicotinico 0,5 mg.L-1 e ácido piridoxina 0,5 mg.L-1) mio-inositol 100 mg.L-1, glicina 2 mg.L
-1, acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, o pH foi ajustado a 5,7. Os frascos continham esferas de
argila expandida cobertas com papel filtro como suporte, e o meio de cultura foi suplementado com as combinações de auxina e citocinina propostas.
O experimento foi em arranjo fatorial 2x3x4, sendo: duas espécies de bromélias (B.
balansae e B. aquilega); três níveis de ácido naftaleno acético (0,0; 0,5 e 1,0 mg.L-1) e quatro de 6-benzilaminopurina (0,0; 1,5; 3,0 e 6,0 mg.L-1), em delineamento de blocos ao acaso, três repetições e seis plântulas em cada unidade experimental. Após 249 dias, avaliou-se sobrevivência (%), brotação (%), enraizamento (%), número médio de brotos produzidas por plântula, massa fresca e massa seca da B. balansae e A. aquilega.
As análises estatísticas dos dados foram submetidas a análise variância (ANAVA) realizadas por meio de teste F, as médias comparadas pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade, ou regressão linear, utilizando o programa Sisvar (Ferreira, 2003).
3RESULTADOSEDISCUSSÕES
As sementes de Bromelia balansae e de Aechmea aquilega apresentaram germinação acima de 90% e 84,7%, respectivamente. A interação entre auxina e citocinina influenciou apenas no número de brotos. A interação entre os genótipos e citocinina influenciou a brotação (%). Os níveis de BAP influenciaram o enraizamento e número de brotos. Houve diferença na massa fresca e massa seca entre os genótipos (Tabela 1).
Tabela 1. Resumo do quadro da análise de variância com os valores do quadrado médio e a significância pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
FV GL Brotação (%) Enraizamento (%) Nº Brotos Massa fresca Massa seca GENÓTIPO 1 156.250000NS 1111.111111NS 2.777778NS 68.874784* 0.496684* ANA 2 225.694444NS 850.694444NS 348.270833NS 1.913308NS 0.018701 NS BAP 3 35989.583333* 7638.888889* 9266.622685* 14.470186NS 0.026089 NS GEN x ANA 2 677.083333NS 538.194444NS 200.173611NS 6.825589NS 0.019473 NS GEN x BAP 3 5804.398148* 1712.962963NS 719.199074NS 4.577592NS 0.018458 NS ANA x BAP 6 364.583333NS 1128.472222NS 2548.706019* 16.358930NS 0.076785 NS
GEN xANA x BAP 6 1464.120370NS 1417.824074NS 681.997685NS 11.601484NS 0.053268 NS
Erro 120 1107.638889 1062.500000 990.854861 9.301859 0.036778 *valor de F significativo a 5%; ns não significativo.
A Aechmea aquilega apresentou melhores resultados para percentagem de brotação que a B. balansae em relação as concentrações de citocinina. A concentração de 5,05 mg.L-1 de BAP, proporcionou maior brotação nesta espécie, enquanto a B. balansae não apresentou o máximo de brotação em meio com 6,0 mg.L-1 de BAP (Figura 1).
Figura 1. Brotação (%) em duas espécies de bromélias in vitro em função de concentrações de BAP.
Os reguladores de crescimento são moléculas com ações semelhantes aos hormônios. O uso em baixas concentrações, proporcionam, inibem ou alteram vários processos fisiológicos e morfológicos nos vegetais (Sousa, 2005). As citocininas estão relacionadas à vários processos no ciclo de vida, como aumento da percentagem e crescimento de brotações (Müller & Sheen, 2007). - - - - Aechmea aquilega = -3,702x2 + 37,40x + 1,112 R² = 0,993 _____ B. balansae = -0,842x2 + 13,85x + 31,21 R² = 0,761 0 20 40 60 80 100 0 1,5 3 4,5 6 B ro taçã o (%) Concentrações de BAP (mg. L-1)
As citocininas possuem receptores celulares que apresentam sensibilidade entre cada genótipo, ocasionando interação especifica entre citocinina-receptor. Conforme Müller & Sheen (2007), o reconhecimento molecular das citocininas, envolve modificações das cadeias laterais ligadas à adenina. Dessa forma, o uso exógeno de BAP em A. aquilega, promove a interação citocinina-receptor, com o aumento da concentração até 5,05 mg L-1, ocorre incremento na percentagem de brotos.
Geralmente, é comum o uso de explantes com baixas ou nenhuma capacidade em sintetizar moléculas com ação hormonal. Desta forma, os tecidos dependem da adição de reguladores de crescimento exógeno no meio de cultura para induzir determinada resposta fisiológica (Grattapaglia & Machado, 1998). Estes fatos relacionados com o balanço hormonal endógeno e a sensibilidades celular à molécula utilizada, explica a divergência de brotação nas bromélias estudadas.
Para o enraizamento in vitro, os genótipos apresentaram boa capacidade de enraizamento, chegando a 98% sem o uso de reguladores de crescimento. Observou-se que a presença de BAP no meio de cultivo, bem como o aumento das concentrações, influenciaram significativamente diminuindo a percentagem de enraizamento (Figura 2).
Figura 2. Enraizamento (%) em bromélias in vitro em função de concentrações de BAP.
Os resultados para enraizamento neste trabalho, contraria Gupta (1986), o qual refere-se à adição de citocinina como favorável ao enraizamento. Segundo Leão et al. (2014), no enraizamento in vitro de microbrotos de A. setigera, a formação de raízes adventícias ocorreu
y = 1,4164x2- 13,881x + 96,096 R² = 0,9986 0 20 40 60 80 100 0 1,5 3 4,5 6 En ra iza m en to (% ) Concentrações de BAP (mg. L-1)
em todos os tratamentos, inclusive na ausência de reguladores de crescimento exógeno. Londe
et al. (2015), e Barboza (2004), trabalhando com A. comosus cv. Erectifolius utilizando 1,0
mg.L-1 de BAP no meio de cultura não observaram formação de raiz.
Para Vriesea scalaris, a ausência de regulador no meio de cultura induz a formação de raizes, portanto, o uso de AIB não proporcionou o aumento na quantidade na regeneração de raízes (Silva et al. 2009). No enraizamento in vitro de abacaxizeiros multiplicados in vitro sob sistema dupla-fase de cultivo, o uso de reguladores de crescimento é desnecessário para aumentar o número de raízes (Scherwinski-Pereira et al. 2012).
Segundo Pasqual et al. (2008) a atividade fisiológica das auxinas depende não apenas daquelas adicionadas ao meio, mas também do AIA no interior dos tecidos cultivados e da interação entre os dois. Fatores que afetam os níveis naturais de AIA e atividade deste composto podem, desse modo, ser importantes para controlar o crescimento e a morfogênese na cultura.
Dessa forma, um dos fatores que pode ter contribuído para o bom enraizamento in vitro da A. aquilega e B. balansae, foi o tamanho das partes aéreas, favorecendo a produção endógena de auxina pela planta. Tendo em vista que altas concentrações de citocinina pode inibir a emissão e o desenvolvimento radicular, observamos que a ausência de BAP promoveu o enraizamento.
Observa-se que o número de brotos dos genótipos foi influenciado pela interação entre ANA e BAP (Figura 3). A multiplicação in vitro de A. aquilega e B. balansae sob diferentes combinações de ANA e BAP, mostraram-se mais eficientes na combinação de 3,45 mg.L-1 de BAP e 0,5 mg.L-1 de ANA, atingindo a media de 44,14 brotos em cada plântula (Figura 3).
Figura 3. Número de brotos em bromélias in vitro em função da interação ANA e BAP. - - - - 0,0 mg de ANA = 6,944x - 0,004 R² = 0,978 ____ 0,5 mg L-1 de ANA = -4,315x2 + 29,73x - 7,074 R² = 0,661 -- -- -- 1,0 mg de ANA = 5,400x + 0,532 R² = 0,995 0 10 20 30 40 50 60 0 1,5 3 4,5 6 n . d e b ro to s Concentrações de BAP (mg. L-1)
Figura 5. Respostas in vitro de B. balansae em função de combinações de ANA e BAP.
A massa fresca apresentou variações em relação aos genótipos. A B. balansae mostrou-se mais eficiente em acumulo de biomassa fresca, quando comparada com A. aquilega (Figura 6).
Vieira et al. (2014), trabalhando com B. pinguin sob o efeito de fitorreguladores, não identificou diferença significativa entre os tratamentos para massa fresca, mostrando que o meio nutritivo foi favorável ao desenvolvimento dos explantes.
Segundo Macedo et al. (2003), pequenas concentrações de BAP (1,0 mg.L-1), conjugadas com ANA (0,5 mg.L-1), proporcionaram maior peso da massa fresca de plântulas de abacaxizeiro (Ananas comosus).
Os resultados obtidos para essa variável podem estar associados a capacidade de cada genótipo em seus tecidos, conseguir absorver maior quantidade de água, nutrientes e responder a determinados estímulos, aumentando altura da planta e multiplicação de brotos.
4 CONCLUSÕES
As duas espécies apresentaram facilidade na brotação e enraizamento in vitro. No entanto, observou diferença entre as espécies quanto as respostas às moléculas reguladoras de crescimento. A bromélia A. aquilega apresentou maior percentual de brotação em meio com 5,05 mg.L-1 de BAP, enquanto a B. balansae exige concentrações acima de 6,0 mg.L-1 de BAP para atingir o máximo. A combinação de 3,45 mg.L-1 de BAP e 0,5 mg.L-1 de ANA
proporcionou maior número de brotos por planta (44,14). Para obter plântulas in vitro, das duas espécies de bromélias, enraizadas e com potencial para aclimatização, não é necessário o uso de reguladores de crescimento.
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