RIDASCREEN
®FemtoLab H. pylori
N.º do art.: C2301
R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Alemanha
)
1. Finalidade
Para diagnóstico in vitro. O RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori é um enzima-imuno-ensaio para a detecção qualitativa de antígenos de Helicobacter pylori em amostras de fezes.
2. Resumo e explicação do teste
Através da detecção de antígenos é possível tanto auxiliar um primeiro diagnóstico, como também verificar o sucesso da terapia dentro de 4 a 6 semanas após o final da terapia de erradicação ou detectar a nova ocorrência de uma infecção .
3. Princípio do teste
4. Conteúdo da embalagem
Os reagentes de uma embalagem são suficientes para 96 doses
Plate 96 doses
1 un. 100 un.
Microplaca revestida com anticorpos
12 tiras divisíveis, cada uma com 8 cavidades; revestidas com anticorpos monoclonais contra antígenos de H. pylori; em sacos fechados de alumínio, com secante;
Folha de proteção para as tiras;
Retirador de amostras (bastonetes de madeira)
Diluent | 2 100 ml Tampão de diluição de amostra; 75 mM tampão de fosfato; pH 7,4; com aditivos antimicrobiais; prontos para o uso; de cor verde Wash 100 ml Concentrado de tampão de lavagem (10x); tampão de fosfato 10 x
concentrado 250 mM; pH 7,4; com detergente e aditivos antimicrobiais
Control⎮+ 2 ml Controle positivo; H. pylori Lysat inativo, fraccionado em tampão de fosfato 75 mM; pH 7,4; com aditivos antimicrobiais; pronto para o uso; de cor vermelha
Control⎮- 2 ml Controle negativo; tampão de fosfato 75 mM, pH 7,4; com aditivos antimicrobiais; pronto para o uso; de cor azul
Conjugate 7 ml Conjugado de enzima; anticorpos monoclonais contra antígenos de
H. pylori; conjugado de peroxidase em tampão de fosfato 75 mM;
pH 7,4; com aditivos antimicrobiais; pronto para o uso; de cor verde Substrate 12 ml Peróxido de ureia/TMB ,pronto para o uso
Stop 12 ml Solução bloqueadora, 1 N ácido sulfúrico;
pronto para o uso
5. Reagentes e a sua armazenagem
6. Reagentes e equipamentos adicionais necessários
6.1. Reagentes
- Água destilada ou deionizada
6.2. Equipamento
- Tubos de amostra
- Aparelho de lavagem para as microplacas ou pipetas de vários canais (300 µl)
- Fotômetro para as microplacas (450 nm, eventualmente filtro de referência ≥ 600 nm) - Centrífuga (pelo menos 5000 rpm)
- Agitador, adequado para as microplacas - Mixer Vortex
- Cronômetro
- Cilindro de medição (1000 ml)
- Micropipeta para volumes de 50 – 100 µl e 1 ml - Filtro de papel (lenços de laboratório)
- Contentor para lixo com uma solução de hipocloreto de 0,5 %
7. Medidas de precaução
Somente para diagnóstico in vitro.
Este teste só deve ser efetuado pelo pessoal de laboratório instruído. As regras de trabalho nos laboratórios médicos devem ser observadas. As instruções de uso para a execução do teste devem ser estritamente observadas.
O controle disponível no kit contém antígenos Helicobacter inativo. Porém, eles devem ser tratados como potencialmente infecciosos, bem como as amostras dos pacientes, de acordo com as regras de segurança nacionais.
Não pipetar as amostras ou reagentes com a boca, evitar o contato com a pele ferida ou mucosas. Durante o manejo de amostras, deve usar luvas descartáveis e, após o término do teste, deve-se lavar as mãos. Nas áreas, nas quais se trabalha com as amostras ou com os reagentes do teste, não fumar, comer ou beber.
Tampão de diluição da amostra, tampão de lavagem, controle positivo e negativo, bem como o conjugado contêm aditivos antimicrobiais. Evitar o contato com a pele ou com as mucosas.
O reagente bloqueador contém 1 N de ácido sulfúrico. Evitar contato com a pele e com as roupas. No caso de contato com a pele, enxaguar com água.
Todos os materiais e reagentes, que vêm junto com as amostras potencialmente infecciosas, devem ser manejados com desinfetantes adequados ou autoclavadas pelo menos 1 hora a 121 °C. ATENÇÃO: para evitar a formação de gases venenosos, o dejeto líquido, que contém reagente bloqueador, deve ser neutralizado, antes que seja colocado em uma solução de hipocloreto.
8. Coleta e armazenagem das amostras
O material do exame deve ser mantido a 2 – 8 °C até ser utilizado. Se o material não for utilizado para o teste dentro de 3 dias, recomenda-se uma armazenagem a –20 °C ou mais frio. Deve-se evitar um congelamento e descongelamento repetido das amostras. As amostras de fezes ou coletas anais não devem ser coletadas em contentores que contenham meio de transporte com conservantes, soros animais, íons metálicos, agentes oxidantes ou detergentes, pois pode acontecer uma interferência com o teste RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori. Se coletas anais forem utilizadas, deve-se observar que material de fezes suficiente (aprox. 200 mg) esteja disponível para o teste.
9. Execução do teste
9.1. Generalidades
Antes da utilização, todos os reagentes e a microplaca Plate devem ser colocados em temperatura ambiente (20 – 25 °C). As tiras só devem ser retiradas do saco de alumínio após a temperatura ambiente tiver sido alcançada. Os reagentes devem ser misturados imediatamente antes da utilização. Após a utilização, as tiras (no saco fechado) e os reagentes devem ser armazenados novamente a 2 – 8 °C. As tiras não podem ser usadas mais de uma vez. Os reagentes e as tiras não devem ser utilizadas se a embalagem estiver danificada ou se o vaso não é impermeável. O contato direto das amostras com os componentes do kit deve ser evitado para que não ocorra a contaminação cruzada. A luz do sol direta durante a execução do teste deve ser evitada. Recomenda-se cobrir ou colar uma cobertura sobre a microplaca para evitar perdas de evaporação
.
9.2. Fabricação do tampão de lavagem
9.3. Preparação das amostras
Em um tubo de amostra marcado, é colocado 1 ml de tampão de diluição de amostra RIDASCREEN® Diluent⎮2. A amostra de fezes é misturada e uma porção do tamanho de uma ervilha das fezes do paciente (ca. 200 mg) é inserida no tampão de amostra. No caso de amostras líquidas, deve-se utilizar 200 µl de fezes. Após uma suspensão com o mixer vortex (15 seg.) a amostra é centrifugada por 5 minutos a 5000 rpm. O supernatante é utilizado no teste. Para cada amostra deve ser utilizado um novo bastonete de madeira. A suspensão de fezes pode ser mantida por 24 horas a 2 - 8 °C, não podendo, no entanto, ser congelada.
9.4. Primeira incubação
Após inserir um número suficiente de cavidades no quadro de suporte é feita a adição de 50 µl do supernatante da amostra de fezes, 50 µl do controle positivo Control⎮+ ou 50 µl do controle negativo Control⎮- em cada cavidade. Depois, são pipetados 50 µl do conjugado de enzima Conjugate diretamente na amostra ou nos controles. A placa é incubada por 60±5 minutos a temperatura ambiente (20 –25 °C) em um agitador. Para isso, as cavidades devem ser cobertas com a folha anexa cortada para o tamanho respectivo.
9.5. Lavagem
Uma lavagem cuidadosa é importante para um alcance correto dos resultados e, portanto, deve ser feita exatamente de acordo com as instruções. O incubado nas cavidades deve, depois, ser esvaziado em um contentor de lixo com hipocloreto para a desinfecção. Depois a placa é batida em papel absorvente para retirar restos de humidade. Então, lava-se 5 vezes, cada vez com 300 µl de tampão de lavagem. Com isso, deve fazer um esvaziamento completo após cada lavagem, batendo em uma parte anda seca e inutilizada do papel.
9.6. Segunda incubação
Adição de 100 µl de solução do substrato Substrate em cada cavidade. Depois a placa é incubada por 10 minutos a temperatura ambiente (20 –25 °C) no escuro. Depois, a reação enzimática é bloqueada com a adição de 100 µl de solução bloqueadora Stop em todas as cavidades. Após a cuidadosa mistura (batida suave na beira da placa) a absorbância é medida a 450 nm (comprimento da onda de referência ≥ 600 nm).A compensação do valor zero deve ocorrer contra o ar – ou seja, sem microplaca.
Nota : Amostras de pacientes altamente positivas podem causar precipitados pretos do substrato.
10. Controle de qualidade – sinais da expiração do reagente
Para o controle de qualidade, o controle padrão positivo e o controle negativo devem ser feitos a cada execução de teste, para garantir uma correta execução do teste e a estabilidade do reagente. O teste é validado se o valor de absorbância do controle negativo a 450 nm for menor de 0,14 (OD450 / 620 até 650 nm < 0,10) e o valor medido do controle positivo a 450 nm for maior de 1,04 (OD450 / 620 até 650 nm >1,00) . Se o valor do controle negativo for maior de 0,14 com medição monocromática ou 0,10 com medição bicromática, isto pode ser um indício para uma lavagem insuficiente. Um desvio dos valores necessários, bem como um escurecimento de reagente ou coloração em azul do substrato incolor antes da adição nas cavidades, pode ser uma indicação de expiração do reagente. Se os valores prescritos não são alcançados, antes da repetição do teste deve-se controlar o seguinte:
- Validade dos reagentes utilizados
- Funcionalidade dos equipamentos utilizados (por ex. calibragem) - Execução correta do teste
- Controle visual dos componentes do kit para verificar se há contaminação ou
11. Avaliação e interpretação
11.1. Cálculo do valor marginal
Medição a 450 nm contra os comprimentos da onda de referência entre 620 e 650 nm. O Cut-off é determinado da seguinte maneira:
Cut-off = 0,150 OD
Se, com o fotômetro utilizado, não houver a possibilidade de medir o comprimento da onda de referência, os seguintes valores devem ser considerados para o Cut-off a 450 nm:
Cut-off = 0,190 OD 11.2. Resultado do teste
As amostras cujo valor de absorbância é mais de 0,02 unidades acima do valor marginal calculado são consideradas positivas.
As amostras cujo valor de absorbância ficam na área de 0,02 unidades acima e abaixo do valor marginal são consideradas marginais e devem ser repetidas. Se um exame repetido com uma amostra fresca ficar novamente na área cinza, a amostra deve ser considerada negativa.
As amostras cujo valor de absorbância é de mais de 0,02 unidades abaixo do valor marginal calculado devem ser consideradas negativas.
12. Limites do método
O RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori detecta uma antígeno altamente específico de Helicobacter pylori nas amostras de fezes. Uma relação entre a altura de um valor de absorbância alcançado e dos sintomas presentes ou altamente clínicos não pode ser ignorada aqui. Os resultados
alcançados devem sempre ser interpretados em conjunto com o quadro clínico.
Um resultado positivo não exclui a presença de outros agentes patogênicos.
Um resultado negativo não exclui uma possível infecção com Helicobacter pylori. Ele pode ter sido causado pela segregação do agente patogênico ou por uma quantidade muito pequena de antígeno na amostra. Se houver de forma anmnéstica a suspeita fundada de uma infecção com H. pylori, uma outra amostra de fezes deve ser examinada.
Um resultado marginal pode ser causado por uma distribuição não homogênea do antígeno na amostra. Por isso, em um caso destes, uma segunda suspensão da mesma amostra deve ser examinada ou uma outra amostra deve ser requerida.
África e na América Latina demonstraram uma prevalência ainda mais alta, de 70 – 90 %. As taxas de infecção com H. pylori são relacionadas com a idade, origem étnica e padrão de vida. Nos Estados Unidos, a prevalência da infecção aumenta, p. ex., com cada ano de vida em 1 %. Os valores estimados dependem da região geográfica e do tipo da população paciente.
O número de resultados positivos pode variar de acordo com o método de detecção utilizado ou a coleta e manuseio das amostras. O RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori é um teste qualitativo e não permite afirmações quantitativas. Os resultados do teste devem ser interpretados em relação aos dados clínicos e/ou outros processos de teste. Antibióticos, inibidores da bomba de prótons e preparados de bismuto impedem o crescimento de H. pylori. Um exame da amostra de fezes, bem como um controle posterior da erradicação, só pode ser feito pelo menos 2 semanas após a última ingestão de inibidores da bomba de prótons ou preparados de bismuto ou 4 semanas após a última ingestão de antibióticos. Um resultado do teste positivo ainda não justifica a indicação de uma terapia de erradicação; outros métodos para a confirmação de uma infecção com H. pylori podem ser necessários. Porém, para determinar úlceras, gastrites autoimunes ou tumores, é necessário um diagnóstico diferencial através de um método endoscópico invasivo.
13. Características de desempenho
13.1. Qualidade do teste
Estudo 1: Diagnóstico primário em pacientes adultos
Tabela 1: Diagnóstico primário nos pacientes adultos com RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori e com o teste de referência de histologia
Histologia RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori + - + 141 6 - 7 202 Sensibilidade: 95,3 % Especificidade: 97,1 % ± 95 % CI 90,5 - 98,1 % ± 95% CI 93,8 - 98,9 %
Estudo 2: Diagnóstico primário em pacientes pediátricos
RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori foi testado em um estudo com amostras de fezes de crianças, nas quais foi feita uma endoscopia devido a dores abdominais e/ou outros problemas intestinais. Neste estudo foram examinados 239 crianças (124 masculinos, 115 femininos; idade 6 meses - 18 anos) de 3 centros gastroenterológicos pediátricos na Europa. Como teste de referência foi utilizada a histologia e a cultura.
Os pacientes foram definidos como H. pylori positivos, quando a histologia e/ou a cultura foram positivas, e H. pylori negativos, quando ambos os testes foram negativos. O RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori demonstra uma sensibilidade de 98,6 % e uma especificidade de 99,4 %. Os intervalos de confidência (CI) foram calculados através do método exato binominal.
Tabela 2: Diagnóstico primário nos pacientes pediátricos com RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori e com o teste de referência de histologia/cultura
Estudo 3: Controle de erradicação
Neste estudo foram considerados 40 crianças infectadas comH. pylori com dores abdominais (idade de 3 a 15 anos) de dois centros gastroenterológicos. A infecção H. pylori foi detectada através do teste de respiração e da sorologia. Todas as 40 amostras de fezes foram identificadas como H. pylori positivas com o RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori (sensibilidade 100 %; 95 % CI = 91,2 – 100 %). A erradicação foi feita através de uma terapia tripla durante 7 dias. O controle de erradicação foi feito 4 semanas após o final da terapia através do teste de respiração. O RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori demonstrou em comparação com o resultado do resultado do teste uma sensibilidade de 100 % e uma especificidade de 98,9 %. Os intervalos de confidência foram determinados através do método exato binominal.
Tabela 3: Controle de erradicação com RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori e teste de respiração 4 semanas após o final da terapia de erradicação.
Teste de respiração RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori + - + 8 1 - 0 31 Sensibilidade: 100 % Especificidade: 96,9 % ± 95 % CI 63,1 – 100 % ± 95 % CI 83,8 - 99,9 % 13.2. Atividade cruzada
O RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori é altamente específico para o antígeno H. pylori. Uma atividade cruzada não foi detectada para algum dos microorganismos descritos abaixo (tabela 4). Ao contrário, o H. pylori demonstrou um resultado de teste positivo.
Tabela 4 : Atividade cruzada com microorganismos patogênicos
Acinetobacter lwoffii1 Proteus mirabilis1, 2 Aeromonas hydrophila anaerogenes1 Proteus vulgaris 1,2 Aeromonas hydrophila hydrophila 1 Providencia stuartii1
Citrobacter freundii 1, 2 Salmonella infantis1 Enterobacter cloacae 1 Salmonella ohio 1 Enterococcus faecalis1, 2 Salmonella typhimurium 1 Enterococcus faecium 1 Serratia proteamaculans 1 Escherichia coli 1, 2 Shigella flexneri1
Escherichia hermannii 1 Shigella sonnei 1 Eubacterium aerofaciens 2 Staphylococcus aureus 1 Klebsiella pneumoniae 2 Streptococcus agalactiae 1 Lactoccocus lactis 1 Streptococcus dysgalactiae1
Listeria innocua1 Yersinia enterocolitica 2 Peptostreptococcus productus 2
1 Cada grupo foi testado em uma concentração de > 1×108 organismos/ml
no tampão de diluição das amostras.
2 Cada grupo foi testado em uma concentração de 100 µg proteína Lysate/ml no tampão de
diluição de amostras no RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori. 13.3. Limites da comprovação
Com o RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori podem ser detectados 5 antígenos femtomol por grama de fezes.
13.4. Precisão
As variações intra e inter ensaio foram determinadas através da testagem de amostras negativas (n=2), fracamente positivas (n=2), mediamente positivas (n=2) e fortemente positivas (n=2). As medições foram feitas em 3 laboratórios independentes na Europa. Cada amostra foi testada em dez doses em cada um destes laboratórios. Os coeficientes de variação intra e inter ensaio (CV) foram calculados e são apresentados na tabela 5. Para os valores OD e as variações intra e inter ensaio das diversas amostras são indicados respectivamente o valor menor e o maior.
Tabela 5: Variações intra e inter ensaio com RIDASCREEN® FemtoLab H. pylori
RIDASCREEN®
FemtoLab H. pylori negativo
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