METABOLISMO DO NITROGÊNIO
O Nitrogênio, utilizado pelas plantas, provém do N2 atmosférico.
Antes de alcançá-las, o nitrogênio deve passar por várias transformações. O N2 é fixado em amônia (NH4+) por microorganismos do solo. A degradação da matéria orgânica (aa, á. orgânicos, nitrosaminas) também produz NH4+. O íon amônio é nitrificado em nível da rizosfera a NO3-. A presença de NO3-
inibe a nodulação O N2 atmosférico é fixado pelos nódulos de associações simbióticas. A forma preferencial é o NH4+,, absorvido preferencialmente em relação ao NO3-, especialmente em solos ácidos a nitrificação é inibida por substâncias exsudadas pelas raízes.
Uma vez absorvido, dentro da planta o NO3- é reduzido a NO2- pela nitrato redutase, em seguida a NH4+ pela nitrito redutase, pois ele não pode ser assimilado, na forma inorgânica.
As duas etapas da redução requerem elétrons e prótons para o trabalho. A primeira reação é catalisada pela NR. Esta enzima transfere 2 elétrons do NADH (em algumas espécies NADPH). Ocorre no citoplasma, fora de qualquer organela.
NR
NO3- + 2 e- + 2 H+ NO2- + H2O (NR = nitrato redutase)
A segunda reação do processo global ocorre nos cloroplastos das folhas ou plastídeos de raízes. A redução de NO2- requer 6 elétrons derivados da água pelo sistema de transporte eletr|ônico acíclico. Cerca de 20% da capacidade da CTE da fase fotoquímica são utilizados para redução de NO3- a NO2-. NiR
2. NO2- + 6 e- + 6 H+ NH4+ + H2O (NiR = nitrito redutase)
hν
3H2O + 6Fd (Fe+3) 1,5O2 + 6H+ + 6Fd (Fe+2)
NO2- + 6Fd (Fe+2) + 8 e- NH4+ + 6Fd (Fe+3) + 2H2O
TRANSPORTE:
O transporte de NO3- é exclusivamente feito pelo xilema. O fluxo só pode ocorrer como função da transpiração e só durante o dia. Como foi visto acima a fotossíntese é importantíssima para a redução.
Na planta o local predominante de redução de NO3- depende da espécie. Em Xanthium (carrapicho rasteiro) exclusivamente nas folhas. Em Pisum (ervilha) na raiz, onde há uma alta atividade da NR e nas folhas.
A importância relativa da raiz e da folha depende da capacidade da raiz de reduzir NO3- e do nível de NO3- no meio. Quanto mais nitrato no meio, maior possibilidade de saturar a raiz, ultrapassando assim sua capacidade de reduzir NO3-, então o excedente vai para a folha. Quanto maior a concentração de NO3-, mais importante é a folha para redução. A redução de NO3- é mais eficiente nas folhas.
Algumas espécies apresentam uma alta atividade da NR à noite e baixa atividade durante o dia (o café, por exemplo). Provavelmente ocorra oxidação de açúcares para formação do NADH e do complexo Fd-NADPH.
O nitrito deve ser rapidamente reduzido a NH4+, pois é tóxico. O NH4+
também é tóxico, e sua concentração máxima nos tecidos não pode passar de 1,0 mM, também deve ser rapidamente assimilado.
ENZIMAS
A nitrato redutase (NR) é uma enzima grande, com pelo menos 4 subunidades. O seu peso molecular varia de 500.000 a 600.000 Da, enquanto que a maioria das enzimas têm PM·em torno de 100.000 Da.
O controle do processo global da redução ocorre por dois mecanismos principais, em nível de NR. O primeiro é por retroinibição, no qual o produto NH4+ desacopla as subunidades da enzima. Por outro lado o substrato NO3-
induz o reacoplamento.
O segundo mecanismo de controle envolve a ação de cianeto. O CN- ocorre naturalmente nas células, em quantidades mínimas e por isso não alcança níveis tóxicos. Se houver acúmulo de aminoácidos não utilizados na célula, ocorre a formação de nitrosaminas. As nitrosaminas combinam-se
com glioxima para formar OXIMA, sendo que nessa reação ocorre liberação de CN-, e o cianeto liberado desacopla as subunidades da enzima.
A nitrato redutase (NiR) possui uma subunidade Fe-S que recebe 2 elétrons doados pela ferredoxina (Fd), passando-os a seguir para a subunidade Fe-Heme, que acumula 6 cargas. O nitrito que entrou no sítio ativo da enzima, recebe estes elétrons e se reduz a amônia. O nitrito só sai de dentro da enzima após receber 6 elétrons da Fd.
ASSIMILAÇÃO DE NH4+
A assimilação do amônio (NH4+) em glutamina (GLN) é catalisada pela enzima glutamina sintetase (GS). Essa enzima funciona em baixas concentrações de amônio, aparentemente só para formar glutamina, mas precisa haver disponibilidade de glutamato, onde o NH4+ é incorporado.
Assim para a GS funcionar é preciso que outra enzima esteja ativa para formar glutamato. A GOGAT (glutamina oxiglutarato aminotransferase) é a enzima que produz malato. Mas para essa reação ocorrer precisa haver disponibildade de GLN, que é o substrato para transaminação de grupamentos amina. Assim a GS e a GOGAT funcionam de maneira sincronizada, pois um dos substratos da GS – o glutamato – é o produto da GOGAT. Por outro lado, o substrato da GOGAT – a glutamina – é o produto da GS.
GS GS 2 . N H
2 . N H44++ + GLU + ATP GLN+ GLU + ATP GLN GOGAT
GOGAT GLN +
GLN + αKG + 2 eαKG + 2 e-- 2 GLU 2 GLU
t ransam ina t ra nsa m inaçãçãoo aa
a a GS
GS 2 . N H
2 . N H44++ + GLU + ATP GLN+ GLU + ATP GLN GOGAT
GOGAT GLN +
GLN + αKG + 2 eαKG + 2 e-- 2 GLU 2 GLU
t ransam ina t ra nsa m inaçãçãoo aa
a a
Ou seja, para que a GS possa funcionar precisa de outra enzima, a GOGAT (glutamina oxiglutarato aminotransferase).
Se a GDH não é importante na assimilação, onde está a sua importância·?
Nos processos de senescência de órgãos como as folhas ou de germinação e desenvolvimento da plântula, onde ocorre hidrólise de reservas e compostos orgânicos. Como a GDH funciona nas duas direções, sintetizando ou hidrolisando glutamato, sua função nesses processos é quebrar o glutamato em α-cetoglutarato, liberando o NH4+ , incorporado em glutamina pela GS. A glutamina formada pela degradação de proteínas vai para a reserva da semente. Durante o processo germinativo, esta reserva protéica é hidrolisada por várias enzimas até glutamato, quebrado em α- cetoglutarato e NH4+. O NH4+ servirá também como fonte de N para o desenvolvimento da plântula.
GDH GS
Proteína GLU αKG + NH4+ GLN
INTERAÇÃO ENTRE FOTOSSÍNTESE E METABOLISMO DO NITROGÊNIO
O processo fotossintético envolve não apenas a assimilação e metabolismo de carbono, mas também de nitrogênio. Neste processo estão envolvidos o citoplasma, o cloroplasto e as mitocôndrias. O poder redutor gerado pelo transporte de elétrons na fase fotoquímica da fotossíntese (nos cloroplastos) é utilizado para reduzir NO3- a NO2- (no citoplasma), para transformar NO2- a NH4+ e produzir glutamina e glutamato (nos cloroplastos).
Para formar glutamato são necessários esqueletos de carbono, especificamente o oxoglutarato (2-OG), também denominado de α- cetoglutarato (α-KG) proveniente do Ciclo de Krebs, nas mitocôndrias.
É importante notar que cerca de 20% da capacidade da cadeia de transporte eletrônico da fase fotoquímica são utilizados para transformar NO3-
em NH4+.
Além disso, nos cloroplastos são produzidos muitos aminoácidos, a maioria dependente das reações fotoquímicas. Para todos esses processos são necessários ATP ou poder redutor (ferredoxina reduzida, NADPH ou thióis de membrana reduzidos).
Outro aspecto importante é o papel regulatório da fixação de CO2. Nas plantas superiores o NO3- não pode ser assimilado se o Ciclo de Calvin não estiver operante ou se não houver uma fonte de carboidrato disponível.
Nos tecidos fotossintetizantes das C3, ocorreuma competição direta entre a fixação de CO2 e redução de NO3-, exceto em condições de luz saturantes, pois nestas condições a capacidade do transporte eletrônico excede e muito as necessidades para fixação de CO2. Mas nas C4, o NO3- é sempre reduzido no mesofilo. Não compete diretamente com o Ciclo de Calvin, pois este ocorre somente na bainha vascular.
Raghavendra, 1998.
FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO
A fixação do N2 atmosférico envolve a participação de uma só enzima, a nitrogenase, que só funciona em anaerobiose.
16 ATP-Mg 6 e-
N2 2 NH4+
As plantas não possuem capacidade de fixar N2, somente os microorganismos. Por isso, nas plantas o processo de fixação do N2
atmosférico só ocorre em associações simbióticas.
CATEGORIAS DE FIXAÇÃO:
BACTÉRIAS LIVRES: Existem três grupos de bactérias que são capazes de fixar nitrogênio. No primeiro grupo estão as fotossintéticas. Todas as bactérias fotossintéticas são capazes de fixar N2. No segundo grupo estão algumas aeróbicas facultativas como o Azobacter e o Spirillum. No terceiro grupo estão algumas anaeróbicas como o Clostridium. Em termos absolutos a quantidade fixada não é grande, devido ao alto custo energético. Elas devem gerar energia muito mais dificilmente do que as outras bactérias
CIANOBACTÉRIAS: As cianobactérias realizam fotossíntese e por isso suas células apresentam uma alta concentração de O2, que inibe a nitrogenase, a enzima responsável pela fixação de N2. Por isso somente algumas células especializadas podem fixar o nitrogênio molecular. Essas células são denominadas de o heterocisto. O heterocisto não realiza fotossíntese e possui uma parede celular mais espessa, que restringe a entrada de O2, protegendo Nitrogenase.. A energia para fixação vem da fotossíntese das células vizinhas, que fornecem maltose para o heterocisto funcionar. Entre os exemplos podemos citar a Nostoc, a Anabaena e a Calotrix.
ASSOCIAÇÃO SIMBIÓTICA PLANTA-MICROORGANISMO: Nesta categoria
são incluídas três tipos básicos de associação simbiótica, de acordo com o microorganismo e com a planta.
No primeiro grupo está a associação das Leguminosas o Rhizobium, além do Bradyrhizobium e Azorhizobium. São bactérias gram-negativas, que vivem saprofiticamente no solo, enquanto não formam associação com as plantas. O Rhizobium forma associação quase exclusivamente com leguminosas, sendo a única exceção conhecida a Parasponia, uma árvore tropical. Ex.: R. japonicum, que nodula predominantemente com soja e R.
phaseolae que predomina em feijão. Entre as nativas brasileiras há muitas leguminosas que podem formar associação com Rhizobium, entre elas o jacarandá-da-baia (Dalbergia nigra), a bracatinga (Mimosa scabrella), o amendoim (Arachis hypogaea), o maricá (Mimosa bimucronata), o tachi branco (Tachigalia alba), a Andira spp., a embira-de-sapo (Lonchocarpus muehlbergianus) e o angico-do-cerrado (Anadenantera falcata). O principal local para formação de nódulos são as raízes, mas pode haver nodulação também no caule, como no caso da simbiose entre a leguminosa aquática do gênero Aeschynomene e Bradyrhizobium.
No segundo grupo estão plantas não leguminosas que formam associação com actinomicetes (bactérias filamentosas). Nesta categoria, há associações externas e internas, sendo que nessas últimas pode haver formação de nódulos. Na simbiose externa podemos citar a associação de Azobacter com cana-de-açúcar e Spirillum com milho. As bactérias se concentram, formando uma mucilagem que encapa a raiz. Existem variedades de cana-de-açúcar e milho (além de sorgo, arroz, batata-doce) que estabelecem associação com bactérias endofíticas, que vivem nos espaços intercelulares (da raiz, caule e folhas) e nos tecidos vasculares (xilema). Não formam nódulo, e não há nenhuma outra modificação anatômica. Entre as bactérias endofíticas podemos citar a Acetobacter diazotrophicus que forma associação com a cana, com a grama Cameron e a batata-doce; o Herbaspirillum ssp que forma associação com milho, sorgo e arroz e o Azospirillum lipoferum com Poaceae. Estas bactérias são endofíticas obrigatórias e são transmitidas por sementes ou por propagação vegetativa. Outra associação endofítica importante é a simbiose da bactéria Frankia com as angiospermas Casuarina, Coenothus e Alnus, entre outras.
Nesse tipo de associação ocorre formação de nódulos nas raízes, a exemplo do que ocorre entre leguminosas e o Rhizobium.
O terceiro tipo de associação é que ocorre entre as cianobactérias e briófitas, pteridófitas, cicadáceas e angiospermas. O local na planta onde ocorre a associação é dependente do grupo. Nas briófitas e pterodófitas a bactéria se desenvolve na cavidade das folhinhas. Nas Cycadaceae a bactéria se desenvolve na parte externa das raizes colaróides. Nas angiospermas a associação é interna e se estabelece em tecidos glandulares, como glândulas secretórias na base de pecíolos. A cianobactéria Nostoc é notável pela facilidade de formar associação com vários grupos de plantas. Entre os exemplos podemos citar a associação da Nostoc com a briófita Antheros; com a pterodófita aquática Azolla; com as cicadáceas Cycas e Macrozamia e com a angiosperma Gunnera. A Anabaena também pode se associar à Azolla. A simbiose entre Azolla com as cianobactérias é especialmente importante em cultivo de arroz alagado, como fonte de nitrogênio.
A Nostoc também forma associação com fungos, compondo os líquens.
FORMAÇÃO DO NÓDULO NA SIMBIOSE RHIZOBIUM-LEGUMINOSA Para o estabelecimento da simbiose é necessário que ocorra ativação de vários genes, específicos. Os genes da bactéria envolvidos no processo são denominados de genes de nodulação (nod) e os da planta são denominados de nodulinos (Nod). Abaixo estão sumarizados todos os passos para a formação do nódulo:
1. As raízes normalmente exsudam substâncias, como flavonóides e betaínas que atraem o Rhizobium para a rizosfera (quimiotactismo positivo).
Em resposta a estas substâncias é induzida a expressão do gene NodD que por sua vez induz a expressão de outros genes nod. Estes codificam enzimas de síntese de mensageiros secundários, denominadas coletivamente de Fatores NOD (fatores de nodulação). Os fatores NOD conhecidos atualmente são lipo-oligossacarídeos, que são responsáveis, entre outras coisas, pelo
reconhecimento entre bactéria e planta hospedeira e pela indução de uma intensa divisão celular no córtex da raiz.
2. A seguir é induzida a síntese de lectinas (glicoproteínas de origem vegetal), que ao serem liberadas ligam-se facilmente aos polissacarídeos de parede celular da bactéria e da raiz. Ela parece interferir na especificidade do Rhizobium com a raiz.
3. A infecção pode ocorrer através do pêlo radicular, como em soja (Glycine max). Neste caso o Rhizobium excreta uma substância, provavelmente AIA, que causa o seu enrolamento. A infecção pode também ocorrer via axila da raiz secundária ou ferimentos na epiderme, como em amendoim (Arachis hypogea), ou ainda através da epiderme intacta, como em bracatinga (Mimosa scabrella).
4. A célula da raiz e a bactéria sintetizam enzimas proteolíticas que digerem a parede, mas não a plasmalema que é empurrada para dentro.
5. Forma-se o filamento, que é a própria plasmalema - que vai recebendo material adicional via vesículas de Golgi - mais a parede celular que se forma protegendo as células.
6. A bactéria não tem muita mobilidade e o filamento vai prosseguindo, por divisão da bactéria. Ou seja, não é o primeiro Rhizobium que se move dentro da célula, mas bactérias resultantes da divisão. O filamento penetra até à célula basal do pêlo.
7. Quando chega nesse ponto, a plasmalema do filamento funde-se com a extremidade posterior da célula basal.
8. Digere a parede da célula seguinte e empurra a plasmalema.
9. Este canal (com as bactérias dentro) pode percorrer o caminho intercelular ou pode voltar ao caminho intracelular.
10. A célula aonde as bactérias chegam, tornam-se tetraplóides. As outras por onde o filamento passou continuam 2n.
11. Na célula terminal não se forma parede adicional, só plasmalema, que começa a estufar liberando bactérias envolvidas com membrana, que podem ou não se dividir.
12. Quando já liberadas na célula ocorrem transformações morfológicas e fisiológicas e podem aumentar até 10 vezes o seu tamanho. A partir daí
passam a fixar N2. Ocupam quase todo o espaço da célula e passa e a estrutura interia passa a ser denominada de bacteróide.
Fonte: Taiz & Zeiger, 2004.
BIOQUÍMICA DA FIXAÇÃO DO N2
O N2 atmosférico penetra nas raízes e se difunde até os nódulos. No bacteróide, a nitrogenase (Nase) transforma o N2 em NH4+. Para que esta reação ocorra são necessários 8 elétrons e 16 Mg-ATP. A nitrogenase possui 2 subunidades Fe-proteína e Fe-Mo-proteína, ambas capazes de transportar elétrons.
