FACULDADE EVANGÉLICA MACKENZIE DO PARANÁ HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO MACKENZIE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRINCÍPIOS DA CIRURGIA
Eros Luiz de Sousa
ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA.
Curitiba
2019
2
Eros Luiz de Sousa
ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA.
Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Princípios da Cirurgia, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor.
Orientador: Professor Dr. Osvaldo Malafaia
Coordenador: Professor Dr. Osvaldo Malafaia
Curitiba
2019
3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicaçâo (CIP)
(Biblioteca da Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná)
S725 Sousa, Eros Luiz de.
Estudo experimental da inibição do VEGF na regeneração hepática / Eros Luiz de Sousa. — Curitiba, 2019.
Orientador : Prof. Dr. Osvaldo Malafaia.
Tese (doutorado) – Instituto Presbiteriano Mackenzie, Faculdade
Evangélica Mackenzie do Paraná, Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, 2019.
1. Regeneração hepática. 2. Bevacizumab. 3. Fígado. I. Título.
CDD 616.362
4
Quem são esses que me olham de longe com olhos que já foram meus?
Helena Kolody
5 AGRADECIMENTOS
• Ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia (IPEM) da Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná, representado pelo Prof. Dr. Osvaldo Malafaia, quem me orientou nessa jornada e com muito carinho me recebeu.
• Ao Hospital Angelina Caron, representado pelo Coordenador do Centro de Ensino e Pesquisa, Dr. João Carlos Domingues Repka, o qual
compartilhou sua sabedoria e sua vasta experiência sem restrições, com a nobreza de um verdadeiro pesquisador.
• Ao Dr. Daniel Dantas Ferrarin, pelo apoio incondicional.
• Aos profissionais do programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, do Instituto de Pesquisas Médicas, Bruno e Erika pelas competência,
gentileza e disponibilidade constantes.
• Aos animais que pelas suas mortes contribuíram para promoção da vida de outras espécies.
• Aos familiares e amigos pelo apoio.
• À CAPES pelo apoio neste estudo e na pesquisa brasileira.
6 RESUMO
Introdução: extensas ressecções e transplantes de partes do fígado são possíveis, graças à sua capacidade regenerativa que é dependente da ativação do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) o qual também regula angiogênese. O bevacizumabe (BV), anticorpo monoclonal inibidor do VEGF é um neoadjuvante amplamente utilizado no tratamento de cânceres restringindo a densidade microvascular, podendo causar efeitos indesejáveis na cicatrização pós-operatória e na regeneração hepática. Objetivo: avaliar a regeneração hepática (RH), pós hepatectomia a 70%, sob ação de uma dose (5mg/kg) de BV num modelo experimental murino, durante 15 dias. Métodos: utilizaram-se 32 ratos Wistar submetidos à hepatectomia parcial (HP), separados em dois grupos conforme o tratamento controle (C) tratados com solução fisiológica e BV tratados com BV, subdivididos conforme o tempo de observação (48 horas e 15 dias) em C48, BV48 e C15, BV15. Os efeitos do BV na RH foram avaliados nas avaliações ponderais, função hepática (albumina, transaminases, bilirrubinas e relação APRI). No fígado remanescente avaliaram-se atividade mitótica, densidade microvascular (angiogênese), proliferação nuclear, histopatologia para investigar fibrose, edema e congestão. Empregaram-se ANOVA e T-Student com p≤0,05 para as análises estatísticas. Resultados: no décimo quinto dia pós-HP e tratamento com BV, não ocorreram diferenças nas avaliações ponderais (p=0,0691), na função hepática e nos índices mitóticos (p=0,1576). Porém, houve diminuição na viabilidade celular (p=0,0000), densidade microvascular (p=0,0162) e piora na ocorrência de alterações histopatológicas como fibrose, edema e congestão hepáticas. Conclusão: a dose única de BV, não causou, ao décimo quinto dia de evolução, alterações ponderais, bioquímicas séricas (albumina, bilirrubinas e transaminases) e dos índices mitóticos. Contudo induziu diminuição da densidade microvascular, viabilidade celular e alterações histopatológicas hepáticas como edema, congestão e fibrose.
Descritores: Regeneração hepática, angiogênese, bevacizumab, VEGF, ratos Wistar.
7 ABSTRACT
Background: extensive liver resections and transplants of liver parts are possible thanks to its regenerative capacity which is dependent on vascular endothelial growth factor (VEGF) activation which also regulates the angiogenesis. Bevacizumab (BV), a monoclonal antibody VEGF inhibitor, is a neoadjuvant treatment of cancers widely used, restricting microvascular density and may cause undesirable effects on postoperative healing and liver regeneration (LR). Objective: to determine the effect of a single dose (5mg/kg) of BV in LR. Methods: 32 rats submitted to partial hepatectomy (PH) were separated into two groups according to saline solution (C) or BV (BV) treatment. According to the observation time (48h and 15 days) they were subdivided in C48 and BV48 and C15 and BV15 sub-groups. In LR, the BV effects were evaluated by weight variation and liver function (albumin, transaminase, bilirubin and APRI ratio) and in remaining liver were evaluated, mitotic activity, microvascular density (angiogenesis), nuclear proliferation, histopathology for fibrosis, edema and congestion. For statistical analysis, the ANOVA and T-Student test was used (of statistical significance when p≤0.05). Results: on the fifteenth day after PH and BV treatment, there were no differences in weight evaluations (p=0.0691), liver function and mitotic indexes (p=0.1576). However, there was a decrease in cell viability (p=0.0000), microvascular density (p = 0.0162) and worsening in the occurrence of histopathological changes such as liver fibrosis, edema and congestion. Conclusion: a single BV dose, on the fifteenth day of evolution has no significant effect in weight evolution, serum biochemical evaluations (albumin, bilirubin and transaminases) and mitotic index. However, it induced microvascular density decreased, cell viability and liver histopathological changes such as fibrosis, edema and congestion.
Key words: Hepatic regeneration, angiogenesis, bevacizumab, VEGF, Wistar rats.
8 LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - PROMETEU. ESCULTURA DE NICOLAS-SÉBASTIEN ADAM, 1762, MUSEU DO LOUVRE – PARIS/ FRANÇA ... 20 FIGURA 2 - ILUSTRAÇÃO ORIGINAL PROPOSTA POR FOLKMAN EM 1971
DEMONSTRANDO A ANGIOGÊNESE TUMORAL ... 49 FIGURA 3 - AMBIENTE CIRÚRGICO DEMONSTRANDO A MONTAGEM DA
MESA CIRÚGICA... 56 FIGURA 4 - CORTE HISTOLÓGICO (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO
CORADO PELA HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS
DETALHES AS FIGURAS DE MITOSES ... 60 FIGURA 5 - CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE
RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, APÓS 48 HORAS DE
HEPATECTOMIA PARCIAL... 61 FIGURA 6 - CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE
RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, APÓS 48 HORAS DE
HEPATECTOMIA PARCIAL ... 62 FIGURA 7 - CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE
RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO TRICRÔMICO DE GOMORI, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO ÁREAS DE
FIBROSE NOS DETALHES “A” E “B”... 63 FIGURA 8 - CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE
RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS. NO DETALHE
“A” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE HEMORRAGIA E INFLAMAÇÃO INTRAPARENQUIMATOSAS. NO DETLAHE ¨B¨, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE CONGESTÃO INTRAPARENQUIMATOSAS, E NO DETALHE “C” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL
OBSERVA-SE INTENSA PROLIFERAÇÃO DUCTAL ... 64
9 LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO PONDERAL DOS SUB-
GRUPOS ... 66 GRÁFICO 2 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA
DOS SUB-GRUPOS ... 67 GRÁFICO 3 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS ... 68 GRÁFICO 4 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA
(TGP) DOS SUB-GRUPOS ... 69 GRÁFICO 5 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DO ÍNDIC APRI DOS SUB-
GRUPOS ... 70 GRÁFICO 6 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES
MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS ... 71 GRÁFICO 7 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELO ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR
(PCNA) DOS SUB-GRUPOS ... 72 GRÁFICO 8 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA DENSIDADE
MICROVASCULAR DOS SUB-GRUPOS ... 73 GRÁFICO 9 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO OCORRÊNCIA DE FIBROSE NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS ... 74 GRÁFICO 10 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE
CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO
PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS ... 75
10 LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - DEMONSTRATIVO DA ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DO
ESTUDO E PROCEDIMENTOS REALIZADOS ... 55 TABELA 2 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS PESAGENS DOS SUB-
GRUPOS AVALIADOS ... 66 TABELA 3 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE
ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ... 67 TABELA 4 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE
BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-
GRUPOS AVALIADOS ... 68 TABELA 5 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE DE
TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E
GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS 69 TABELA 6 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DO
ÍNDICE DA RELAÇÃO ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE /
PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ... 70 TABELA 7 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES
DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ... 71 TABELA 8 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE
CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA 72 TABELA 9 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS AVALIAÇÕES DA
AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE PELA PESQUISA
IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34 ... 73 TABELA 10 - PESAGENS DOS RATOS ... 99 TABELA 11 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS PESAGENS DOS RATOS NOS
TEMPOS 0, 48HORAS E 15 DIAS ... 99 TABELA 12 - ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO E AVALIAÇÃO
ESTATÍSTICA DAS MÉDIAS DE PESOS ... 100 TABELA 13 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA
DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ... 110 TABELA 14 - RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS
(MG/DL) ... 110 TABELA 15 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE
BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV
48 E BV 15 ... 112 TABELA 16 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE
11 BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV
48 E BV 15 ... 113 TABELA 17 - RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE
TRANSAMINASES (mg/dl) ... 115 TABELA 18 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE
TRANSAMINASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15,
BV 48 E BV 15 ... 115 TABELA 19 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DOS ÍNDICES ASPARTATO-
AMINOTRANSFERASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48,
C15, BV 48 E BV 15 ... 116 TABELA 20 - RESULTADOS DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES DA
RELAÇÃO ASPARTATO AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS
(APRI) CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ... 117 TABELA 21 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS
ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ... 119 TABELA 22 - RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE
FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS
ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS... 120 TABELA 23 - RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE
CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE
RATOS ... 124 TABELA 24 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE
RATOS ... 125 TABELA 25 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS
MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS
ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ... 128 TABELA 26 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS
ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ... 129 TABELA 27 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95%
E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO
TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE
12 RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-
GRUPOS DE RATOS ... 131 TABELA 28 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM
LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-
GRUPOS DE RATOS ... 132 TABELA 29 - EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA
HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS, CONFORME OS SUB-
GRUPOS DE RATOS ... 134 TABELA 30 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM
LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA
HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS ... 135
13 LISTA DE ABREVIATURAS
µg - Micrograma µl - Microlitro µm - Micrômetro
® - Marca Registrada
ALR - Aumentador da Regeneração Hepática (Augmenter of Liver Regeneration) ALT - Alanina Aminotransferase
APRI - Índice Aspartato Aminotransferase / Plaquetas AST - Aspartato aminotransferase
bFGF - Fator Básico de Crescimento Endotelial Vascular BV - Bevacizumabe
Ca++ - Cálcio bivalente
CD31 - Clone de diferenciação 31 CD34 - Clone de diferenciação 34
CEPA - Comitê de ética em pesquisa em animais cm - Centímetro
CMET - Receptor do Fator de Crescimento de Hepatócito COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CTGF - Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo DNA - Ácido Desoxirribonucleico
EGF - Fator de crescimento epidérmico FGF - Fator de crescimento de fibroblasto
FIB - Índice de Fibrose Baseado e Quatro Fatores Flt-1 - Precursor 1 do receptor VEGF
g - Grama
G1 - gap 1 - Pré-síntese G2 - gap 2 - Pós-síntese GGT - Gama Glutamil-transferase
GPR - Relação Gama Glutamil-transpeptidase em relação a plaquetas HAC - Hospital e Maternidade Angelina Caron
HCV - Vírus da Hepatite C HE - Hematoxilina-eosina
HGF - Fator de Crescimento de Hepatócitos IL - Interleucina
kD - Kilo-Daltons - Unidade de massa molecular
14 kg - Quilograma
Ki-67 - Antígeno Ki-67 M - Mitose
MAB - Anticorpo Monoclonal MEC - Matriz Extracelular mg - Miligrama
mg/kg - Miligrama por quilograma ml - Mililitro
MMP - Metaloproteinases da Matriz
NDAPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida NFKB - Fator Nuclear Kappa B
nmol/mg - Nanomol por miligrama O2 - Oxigênio
ºC - Graus Celsius ON - Óxido nítrico
PAF - Fator ativador plaquetário PBS - Solução tampão fosfatos
PCNA - Antígeno Nuclear de Proliferação Celular PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF - Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas pH - Potencial hidrogeniônico
PHx - Hepatectomia Parcial de 2/3 PMN - Polimorfonucleares
RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro ROC - Receiver Operating Characteristic RTKs - Receptores de Tirosinaquinases S - Replicação do DNA
TAP - Tempo de Ativação da Protrombina TGF - Fator de crescimento transformador TGF-β - Fator de Crescimento Transformador Beta TGO - Transaminase glutâmico-oxalacética
TIMPs - Inibidores Teciduais das Metaloproteinases da Matriz TNFα - Fator de necrose tumoral alfa
TNF-α - Fator de Crescimento de Necrose Tumoral Alfa TPO - Trombopoetina
TTPA - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada VEGF - Fator de Crescimento Endotelial Vascular
15 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1 OBJETIVO ... 18
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 19
2.1 A REGENERAÇÃO HEPÁTICA ... 20
2.2 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA ... 25
2.3 ANGIOGÊNESE E VASCULOGÊNESE ... 30
2.4 FATORES DE CRESCIMENTO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA ... 33
2.4.1 As plaquetas e a regeneração hepática ... 33
2.4.2 A serotonina e a regeneração hepática ... 35
2.4.3 O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a regeneração hepática ... 36
2.4.4 O fator de crescimento de hepatócito (HGF) e a regeneração hepática ... 38
2.4.5 O fator de necrose tumoral (TNFα) e a regeneração hepática ... 39
2.4.6 Fator de crescimento epidérmico (EGF) e a regeneração hepática ... 39
2.4.7 Interleucina 6 (IL6) e a regeneração hepática ... 39
2.4.8 Fator de Crescimento de Fibroblastos Ácido (FGFα) e a regeneração hepática .. 40
2.4.9 Substância estimuladora hepática (HSS) e a regeneração hepática ... 40
2.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HEPATECTOMIAS PARCIAIS ... 41
2.5.1 Anatomia do fígado de ratos ... 41
2.5.2 Técnicas de ressecção hepática ... 44
2.6 O BEVACIZUMABE ... 47
3 MÉTODO ... 55
3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 55
3.2 EXPERIMENTO ... 56
3.2.1 Anestesia ... 57
3.2.2 Hepatectomia parcial ... 57
3.3 TRATAMENTOS ... 57
3.4 INTERRUPÇÃO DO EXPERIMENTO E COLETA DE AMOSTRAS ... 58
3.5 AVALIAÇÕES ... 58
3.5.1 Avaliação ponderal ... 58
3.5.2 Avaliações bioquímicas séricas ... 59
3.5.2.1 Dosagem de Albumina ... 59
3.5.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta ... 59
3.5.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico- pirúvica (TGP) ... 59
3.5.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI) ... 59
16
3.5.3 Avaliações microscópicas ... 59
3.5.3.1 Determinação do Índice Mitótico ... 60
3.5.3.2 Avaliação da densidade viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) ... 61
3.5.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ... 62
3.5.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ... 63
3.5.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático ... 64
3.5.4 Avaliações estatísticas ... 65
4 RESULTADOS ... 66
4.1 AVALIAÇÃO PONDERAL ... 66
4.2 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS SÉRICAS ... 67
4.2.1 Dosagem de Albumina ... 67
4.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta ... 68
4.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica (TGP) ... 69
4.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI) ... 70
4.3 AVALIAÇÕES MICROSCÓPICAS ... 71
4.3.1 Determinação do Índice Mitótico ... 71
4.3.2 Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) ... 72
4.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ... 73
4.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ... 74
4.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático ... 75
5 DISCUSSÃO ... 76
5.1 O MODELO EXPERIMENTAL ... 76
5.2 ANGIOGÊNESE E REGENERAÇÃO HEPÁTICA ... 77
5.3 A VIABILIDADE CELULAR, ANGIOGÊNESE E A FUNÇÃO HEPÁTICA ... 78
5.4 OS ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS E A REGENERAÇÃO HEPÁTICA ... 81
5.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 84
6 CONCLUSÕES ... 85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 86
ANEXO ... 96
1. PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISAS EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO ... 96
APÊNDICES ... 98
1. Protocolo para pesagens de ratos ... 98
2. Protocolo para Anestesia em ratos ... 100
3. Procedimentos para cirurgias experimentais do laboratório da coordenação de ensino e pesquisa do Hospital Angelina Caron - Hepatectomia parcial a 70% em ratos ... 101
17
4. Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia ... 105
5. Dosagem de Albumina ... 109
6. Dosagem de Bilirrubinas ... 111
7. Dosagem de amino-transaminases glutâmico-oxalacética (AST/TGO) e glutâmico- pirúvica (ALT/TGP) ... 114
8. Determinação do Índice da relação aspartato aminotransferase / plaquetas (APRI) ... 116
9. Determinação do Índice Mitótico ... 118
10. Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) ... 121
11. Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ... 126
12. Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ... 130
13. Avaliação histopatológica do parênquima hepático ... 133
17
Os produtos biológicos e biotecnológicos têm ocupado um lugar central no âmbito da pesquisa e do desenvolvimento terapêutico, especialmente a partir da década de 1980, quando a farmacologia se reinventou com o surgimento de produtos elaborados por nova rota, a biotecnológica, objetivando oferecer opções voltadas à medicina personalizada e à terapia direcionada para células tumorais (SILVA, SILVA e OSORIO-DE-CASTRO, 2016; VIDAL, FIGUEIREDO e PEPE, 2018).
No Brasil a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) distingue seis principais grupos de produtos biológicos: vacinas, soros hiperimunes, hemoderivados, biomedicamentos obtidos a partir de fluidos biológicos, tecidos de origem animal ou a partir de procedimentos biotecnológicos, medicamentos contendo microrganismos vivos, atenuados ou mortos e anticorpos monoclonais (mABs). Os mABs são anticorpos derivados de um mesmo clone de linfócito B, cuja clonagem e propagação se efetuam em linhas de células contínuas e sob elevada sofisticação tecnológica (ANVISA). Muitos mABs são produzidos para identificar e se ligar a antígenos específicos de certos tipos de células tumorais e exercer citotoxicidade seletivamente sobre estas, preservando as células não tumorais, sendo esta a grande vantagem quando comparados às terapias quimiocitotóxicas convencionais (REICHERT e DHIMOLEA, 2012). Com o advento destes medicamentos biológicos, a sobrevida dos doentes aumentou, influenciada também pelo aprimoramento das técnicas cirúrgicas e das terapias sistêmicas modernas (BILCHIK e HECHT, 2008).
Entre os biológicos aplicados na terapia anticâncer o bevacizumabe (BV), um
anticorpo da subclasse IgG
1, monoclonal humanizado recombinante, com 93% de
sequência de aminoácidos de origem humana e 7% de origem murina, tem como
18
alvos as isoformas do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), sendo assim classificado como uma droga anti-angiogênica (FOLKMAN, 1995).
O papel bem estabelecido do VEGF na promoção de angiogênese tumoral e na patogênese de tumores humanos serviu de estímulo para que o BV, um anti- receptor de VEGF capaz de inibir a angiogênese e consequentemente o crescimento tumoral, passasse a ser incorporado no tratamento de pacientes, adjuvando outras opções quimioterápicas em tratamentos pré-operatórios. Entre as indicações cirúrgicas oncológicas no fígado, se sobressaem as ressecções de metástases em pacientes portadores de carcinoma colorretal.
O progresso na terapia anti-VEGF revelou paulatinamente seus possíveis efeitos adversos relacionados ao inadequado fornecimento de sangue para os tecidos, o que levou à indicação de interrupção do seu uso antes ou depois de intervenções cirúrgicas. No entanto, estas questões não foram ainda completamente elucidadas para os diferentes órgãos (PAVLIDIS et al., 2010). Os efeitos da inibição da angiogênese nos complexos fenômenos inerentes à regeneração hepática não são bem claros (HURWITZ et al., 2004; FUH et al., 2006; MILLET et al., 2012;
AUSSILHEU et al.,2009; ZORZI et al. 2008; DUPRE et al., 2012).
Considerando que os estudos clínicos não permitem análise precisa da regeneração hepática e a escassez de estudos experimentais neste domínio específico, desenvolveu-se o presente estudo com o objetivo abaixo citado.
1.1 Objetivo:
Avaliar a influência da BV na dose de 5mg/kg na regeneração hepática em
ratos Wistar hepatectomizados à 70%, através dos seguintes indicadores: evolução
ponderal dos ratos, índice mitótico, angiogênese, viabilidade celular, histopatologia
do parênquima hepático e avaliação de parâmetros bioquímicos.
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Não é surpreendente que as vias de sinalização ativadas durante a regeneração do fígado se assemelhem fortemente às da cicatrização de feridas, observadas em outros tecidos. A diferença com o processo clássico de cicatrização de feridas é que as alterações observadas no fígado ocorrem em todo o órgão e que alguns dos sinais podem ser derivados em parte da circulação periférica. Em um cenário típico de cicatrização de feridas, a lesão do tecido resulta na ruptura das redes vasculares capilares e extravasamento de sangue, acompanhada de liberação local de fatores de coagulação, plaquetas, fatores de crescimento, entre outras. Este não é claramente o caso após hepatectomia a 2/3 na qual três lobos hepáticos são removidos cirurgicamente sem danificar os dois lobos remasnescentes.
Mesmo que não haja danos ao tecido remanescente, neste há grandes mudanças nos padrões de fluxo sanguíneo. Há considerável literatura sugerindo que as alterações hemodinâmicas precoces após a hepatectomia são importantes e, mesmo não havendo extravasamento de sangue total, as alterações hemodinâmicas após a hepatectomia induzem um espectro global de eventos em todo o fígado que se assemelha a uma resposta cicatricial.
O componente arterial do suprimento de sangue por unidade de tecido hepático não muda após a remoção de 2/3 do fígado, a distribuição do sangue portal por tecido unitário, no entanto, triplica e a veia porta continua a transportar todo o fluxo do estômago,intestino, baço e pâncreas. O fluxo integral agora precisa atravessar um leito capilar cuja seção transversal é matematicamente até 1/3 do original, Os capilares hepáticos têm células endoteliais fenestradas que permitem o acesso direto do plasma através das células endoteliais aos hepatócitos (MICHALOPOULOS, 2007).
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2.1 A REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Desde a antiguidade, já se conhecia o fenômeno da regeneração hepática através da tragédia grega escrita por Aeschylus, 470 a.C. Neste clássico da mitologia grega, Prometeu, um titã, filho de Jápeto e irmão de Atlas, foi um defensor da humanidade, conhecido por sua astuta inteligência, responsável por roubar o fogo de Héstia e o dar aos mortais. Zeus, que temia que os mortais ficassem tão poderosos quanto os próprios deuses, além de baní-lo o teria então punido por este crime, deixando-o amarrado a uma rocha no Monte Cáucaso por toda a eternidade, enquanto um grande abutre comia diariamente seu fígado (figura 1). Durante a noite o órgão sofria o processo de regeneração, o que proporcionava ao animal fonte eterna de alimento e também, mantinha Prometeu vivo para sua tortura eterna (PISTOI, 1996; MICHALOPOULOS, 2007; BARETTA et al., 2015).
FIGURA 1: PROMETEU. ESCULTURA DE NICOLAS-SÉBASTIEN ADAM, 1762, MUSEU DO LOUVRE – PARIS/ FRANÇA.
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O fígado é um dos órgãos mais complexos do corpo humano e está envolvido em cerca de 5.000 funções. Ele tem dois suprimentos de sangue diferentes e é composto de cinco tipos diferentes de células e uma estrutura extracelular complexa. É vulnerável a uma grande variedade de metabólicos, tóxicos, microbianos, insultos circulatórios e neoplásicos (BIONDO-SIMÕES et al., 2006; GODOY et al., 2006; MICHALOPOULOS, 2007; MAO e SCOTT, 2014; BARETTA et al., 2015).
A regeneração do fígado é amplamente estudada através de um procedimento cirúrgico que remove 2/3 da massa do fígado em roedores (ratos e camundongos), uma técnica conhecida como “hepatectomia parcial a 2/3 (PHx)”. Devido à estrutura de múltiplos lóbulos do fígado de roedores, três dos cinco lobos do fígado (representando 2/3 da massa do fígado) podem ser removidos por um procedimento cirúrgico fácil, sem causar nenhum dano tecidual aos dois lobos residuais. Os últimos crescem em tamanho para restaurar um agregado celular equivalente à massa dos cinco lobos originais. O processo, em ratos e camundongos, é concluído dentro de 5 a 7 dias após a cirurgia (MICHALOPOULOS, 2007).
A regeneração hepática tem início com a proliferação celular iniciada nas vinte e quatro horas que suscedem a cirurgia. Aproximadamente no oitavo dia ocorre uma onda de apoptose de células endoteliais, após a qual a proliferação de hepatócitos cessa. O fígado para de crescer em 10 dias. Contudo, se uma proteína angiogênica, como VEGF ou bFGF, é administrada sistemicamente, as células endoteliais continuam a proliferar e o fígado continua a crescer além do seu tamanho normal, Por outro lado, se um inibidor específico da proliferação endotelial for administrado, a regeneração hepática é evitada e o fígado permanece a 30% do seu tamanho normal, A descontinuação do inibidor endotelial é seguida imediatamente pela regeneração hepática completa em 10 dias (GREENE, et al., 2003).
Estes experimentos indicam que o tecido normal e a regeneração do fígado são controlados em parte pelo endotélio microvascular. Dada a extensão da proliferação celular necessária para restaurar a massa original após a hepatectomia, é intuitivo que virtualmente toda maquinaria celular seja ativada durante a regeneração e isso implica em centenas de
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caminhos. Estes se inciam por uma ativação inicial da cascata de citocinas nas células de Kupffer, que estimula o fator de crescimento e as vias metabólicas nos hepatócitos. Outras células não parenquimatosas (células estreladas, células endoteliais vasculares e biliares) proliferam após os hepatócitos, presumivelmente respondendo a outro conjunto de sinais (RIEHLE et al., 2011).
O termo regeneração, que é amplamente aceito, significa apenas a recuperação do volume do órgão e não a regeneração da parte perdida. O que realmente ocorre é a hiperplasia global de todo o parênquima. Sabe-se que este é um evento que promove um crescimento de tecido altamente ordenado e organizado até o fígado atingir o seu peso original, com uma pequena variação entre 5 e 10% (GREENE et al., 2003; PISTOI, 2006;
BIONDO-SIMÕES et al., 2006; FAUSTO et al., 2006; GODOY et al., 2006; MAO e SCOTT, 2014; BARETTA et al., 2015).
Talvez ainda mais extraordinário do que a capacidade de proliferação dos hepatócitos seja o fato de que essas células desempenham simultaneamente funções essenciais para manutenção da homeostase orgânica, como regulação do nível de glicemia, síntese de proteínas plasmáticas e fatores de coagulação, secreção biliar, ciclo da uréia e biodegradação de compostos tóxicos (GREENE, et al., 2003; BIONDO-SIMÕES et al., 2006; BARETTA et al., 2015; KARADENIZ et al., 2019).
Para se estudar o processo regenerativo é essencial que se entenda o ciclo celular.
Ele é constituído de quatro fases distintas: G1, S, G2 e M. A fase G1 ou gap 1 é a fase que as células preparam a síntese de DNA, e este processo preparatório não é visível ao microscópio ótico. A fase S se refere à síntese de DNA no ciclo celular. Durante esta fase ocorre a replicação comossomal de DNA na célula. A fase G2 ou gap 2 é a fase onde a célula se prepara para a mitose ou para a divisão celular física. A fase M, ou fase mitótica, é a fase do ciclo celular mais aparente e pode ser facilmente reconhecida ao microscópio ótico. Transpondo essas informações para a replicação dos hepatócitos, conclui-se que a cinética da resposta proliferativa inicia-se pela síntese de DNA, que ocorre 12 a 16 horas após a hepatectomia parcial, sendo o pico máximo observado em 24 a 26 horas após a
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cirurgia. O aparecimento de mitoses sucede o início da síntese de DNA em seis a oito horas, atingindo o ápice 48 horas depois da cirurgia (JESUS, WAITZBERG & CAMPOS, 2000;
PISTOI e MORELLO, 1996). Tendo em vista que dois terços do tecido hepático são ressecados, a restauração do número original de hepatócitos requer, teoricamente, 1,66 ciclos proliferativos por hepatócito residual. Assim, a maioria dos hepatócitos nos lobos residuais participará de apenas um ou dois eventos proliferativos (MICHALOPOULOS, 2007).
Embora o fígado seja o órgão com maior capacidade de proliferação celular, apenas 0,0012% a 0,01% dos hepatócitos sofrem mitose nos demais momentos da vida. Os hepatócitos são células de natureza epitelial, altamente diferenciada, que raramente se divide. Apenas um hepatócito entre 20.000 pode se dividir em algum momento, durante a vida, sendo que essa divisão pode ocorrer no máximo, uma ou duas vezes para cada célula Esta baixa taxa de ciclo celular em fígados saudáveis reflete em situações de agressões hepáticas tóxicas ou ressecções cirúrgicas, quando 3% do hepatócitos sofrem mitose. O desempenho adequado da regeneração hepática é complexo e dependente da interação de eventos, que envolve a regulação da matriz extra-celular, espaçamento do intervalo de junção intercelular, dissolução e ressíntese da membrana altamente especializada dos hepatócitos, além da liberação e alinhamento de mais de 150 cromossomos, entre os quais alguns que induzem a mitose (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000; KARADENIZ et al., 2019).
A evolução das hipóteses referentes aos mecanismos de regeneração hepática pode ser categorizada em três fases:
1ª) A hipótese original de que um único agente humoral poderia funcionar como uma chave, capaz de desbloquear todos os eventos necessários para a regeneração do fígado.
2ª) A hipótese de que a ativação de uma via envolvendo múltiplos componentes poderia ser responsável pela regeneração.
3ª) A hipótese mais recente de que a atividade de 1-3 vias múltiplas são necessárias para a regeneração do fígado.
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Esta última formulação ainda é uma simplificação excessiva de uma realidade mais complexa, pois a regeneração do fígado requer a ativação de múltiplas vias, mas essas vias não atuam independentemente umas das outras, sendo que uma proposta alternativa seria que o circuito essencial necessário para a regeneração hepática é composto por três tipos de vias: citocina, fator de crescimento e redes metabólicas que ligam a função hepática ao crescimento e à proliferação celular (FAUSTO et al., 2006). Um determinante crítico do resultado em pacientes submetidos à hepatectomia é o grau de regeneração do fígado que ocorre após a cirurgia. Estudos em animais demonstraram que a regeneração hepática depende do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e da angiogênese (VAUTHEY e ZORZI, 2009).
Em estudos experimentais, as massas hepáticas ressecada e remanescentes podem ser determinadas através da mensuração e cálculo dos pesos dos fígados através do peso dos animais. Obviamente, este método não está disponível para a prática clínica. Entretanto, a tomografia computadorizada e, mais recentemente, a ressonância magnética têm sido sugeridas como alternativas viáveis para este propósito. O problema é que o peso hepático varia muito de acordo com o depósito de lipídios, carboidratos e com a presença de células inflamatórias. Por estas razões, o cálculo da massa do fígado como um marcador de regeneração hepática esta confinada ao uso em estudos experimentais em animais de laboratório e raramente representa um parâmetro sólido (ASSY e MINUK, 1997;
BERTICELLI, 2005; BARETTA et al., 2015).
As plaquetas contêm numerosos fatores de crescimento que podem contribuir teoricamente para a regeneração hepática, havendo aparentemente um único estudo que contraria tal expectativa, dado que não identificou qualquer correlação entre as plaquetas e a regeneração hepática do rato, visto que esta ocorreu normalmente em condições de trombocitopenia. Contudo, grandes avanços técnicos e uso de outras abordagens experimentais ocorreram desde a publicação desse estudo, e vários estudos mais recentes demonstraram que a regeneração hepática é claramente influenciada pelo número de plaquetas (KUWASHIMA et al., 1990).
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No ano de 2000 surgiu o primeiro artigo dirigido especificamente ao papel das plaquetas na regeneração hepática. Desde então, os estudos experimentais com plaquetas evidenciam que elas contribuem expressivamente para a regeneração do órgão, sendo sua eficácia proporcional à sua quantidade na corrente sanguínea. Tais estudos identificaram aumentos significativos na velocidade de regeneração do órgão de cobaias portadores de trombocitose e contagem normal de plaquetas, quando comparadas com trombocitopênicos.
Ainda, alguns autores demonstraram aumento na sobrevida dessas cobaias em relação ao último grupo (SOBRAL et al., 2016).
2.2 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Nos estudos realizados com hepatectomia a 70%, as provas de função hepática permanecem dentro dos limites da normalidade. Porém, o estudo de Aguiar e colaboradores em 2011, mostrou que houve alteração da função hepática no fígado remanescente relacionada aos níveis de colesterol, proteínas totais, albumina e globulinas e o tempo de ativação da protrombina (TAP). As transaminases ALT e AST, a fosfatase alcalina, a gama glutamil transpeptidase, a glicemia, tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), bem como a excreção de bilirrubinas, apresentaram valores dentro da normalidade.
Alguns testes bioquímicos também podem ser usados para observar o perfil hepático, como dosagem da ALT, da AST, relação AST/ALT, gama-GT, fosfatase alcalina, tempo de protrombina, albumina e bilirrubinas. Contudo, a doença hepática grave ainda pode apresentar níveis normais das enzimas hepáticas, ou acarretar alterações de 1,5 a três vezes acima dos níveis de referência (ANTONELLO et al., 2010; AGUIAR et al., 2011, SILVA et al., 2015). A GGT é considerada como um preditor independente de inflamação hepática moderada a grave (WU et al.,2018).
A alanina aminotransferase é o marcador sérico mais comum para avaliar a lesão hepática. Recentemente, no entanto, o papel da ALT na previsão da inflamação do fígado
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tem sido questionado. Alguns pacientes com doença hepática moderada identificada na histologia podem apresentar uma ALT de nível normal. Estudos mostraram que, mesmo quando os pacientes com ALT normal ainda podem ter risco significativamente aumentado de doença hepática ou progressão da doença hepática. Essa reflexão foi citada por Wu e colaboradores em 2018, quando compararam diferentes marcadores não invasivos e aplicou o índice de fibrose baseado em quatro fatores (FIB-4), o índice de transaminase de aspartato em relação à taxa de plaquetas (APRI), a relação gama-glutamil transpeptidase em relação a plaquetas (GPR) e a distribuição da relação hemácias-plaquetas (RPR) foram analisados com curvas ROC (características operacionais do receptor), para avaliar sua capacidade de diagnosticar corretamente a inflamação do fígado. Em conclusão, o estudo mostrou que a ALT sérica não é robusta o suficiente para diagnosticar a inflamação do fígado. O APRI e o GPR parecem ser melhores marcadores para diagnosticar inflamação e fibrose hepática.
Em estudo semelhante realizado por Zhang e colaboradores em 2016, onde além de comparar métodos não invasivos, avaliaram a aplicação do método APRI e FIB-4 para avaliar a ocorrência de fibrose grave na cirrose em pacientes infectados pelo vírus da hepatite B, sendo que o FIB-4 ficou mais indicado para a previsão de cirrose. Concluíram que a utilidade clínica do FIB-4 e do APRI para fibrose precisa de mais validação externa em uma grande população antes de ser usada para predizer a fibrose em paciente com infecção pelo vírus da hepatite B. Segundo Wai e colaboradores em 2003 o APRI é capaz de confirmar a existência de fibrose significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível, como alternativa, na prática clínica.
A contagem de figuras de mitoses coradas pela Hematoxilina-Eosina (HE) é um dos parâmetros mais utilizados para avaliação da regeneração hepática por ser fácil de reproduzir com custo baixo, e dessa forma é considerado método de referência para estudos experimentais, porém há incovenientes como o tempo curto em que ocorre a mitose no ciclo celular (ASSY e MINUK, 1997; SILVA et al., 2015).
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ANDIRAN e colaboradores em 2000 utilizaram a contagem da média de mitoses após contagem de dez campos consecutivos de grande aumento corados pelo HE, e observaram concordância com demais resultados da literatura. Eles usaram apenas figuras mitóticas evidentes. SELZNER e CLAVIEN, em 2000, também utilizaram a média da contagem das figuras de mitose, por campo de grande aumento, corados pelo HE ao avaliarem a regeneração hepática em ratos obesos.
A maioria das técnicas imuno-histoquímicas são baseadas no uso de anticorpos contra moléculas endógenas como o Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA), o Ki- 67 e a DNA polimerase alfa, que são os métodos mais utilizados. O PCNA é uma proteína auxiliar da DNA polimerase delta e seu peso molecular é de 36kD. Em células eucarióticas ele é essencial para a replicação do DNA. Sua expressão é ciclo celular dependente e começa a ser detectado ao final da fase G1. Seu pico ocorre na fase S (THEOCHARIS, et al., 1997; GREENE, et al., 2003).
As técnicas de imuno-histoquímica são amplamente utilizadas para demonstrar PCNA nos hepatócitos. Os espécimes de fígado são incubados com anticorpo anti-PCNA monoclonal primário. Em seguida, são titulados com um segundo anticorpo. Estreptovidina conjugada com hidrogênio peroxidase é aplicada e as células com PCNA positivo coram os núcleos com coloração marrom-avermelhada. As áreas de tecido são avaliadas em aumento de 400 vezes no microscópio ótico e são contados, randomicamente, cinco a dez campos, aproximadamente 1000 células por secção. Núcleos fortemente corados são considerados em fase G1 ou G2 do ciclo celular (ASSY e MINUK, 1997).
O PCNA tem como vantagens a boa correlação com outros marcadores de proliferação celular, bem como pode ser usado em material de arquivo, possibilitando estudos retrospectivos. As desvantagens do PCNA incluem a grande variedade de células intralobulares, levando a super ou sub-estimativas, dependendo da zona avaliada; alteração da intensidade da coloração quando a lâmina é exposta ao calor e a falta de consenso sobre o que considerar positivo, qualquer núcleo corado ou somente aqueles com coloração mais intensa (ASSY e MINUK, 1997).
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O PCNA é método aceito e comumente usado para monitorar a atividade regenerativa, por ser de fácil reprodutibilidade e ter seus resultados comparados aos demais métodos de avaliação com sucesso (SELZNER e CLAVIEN, 2000). O PCNA tem meia vida de 20 horas, explicando o porquê ele permanece positivo quando o índice mitótico já está em declínio (THEOCHARIS et al.,1997).
Considerando que o pico da síntese de DNA ocorre em 24-48 horas, HASHIMOTO e SANJO em 1997 mostraram aumento do PCNA com 24 horas, em estudo da regeneração hepática de ratos submetidos à hepatectomia parcial. Estudos demonstraram que o PCNA pode ser comparado a timedina triciada, método consagrado de avaliação da regeneração hepática (ASSY et al.,1999)
Em 1994, THEOCHARIS et al., compararam a expressão do PCNA à incorporação de timedina triciada e atividade da timedinaquinase após hepatectomia parcial em ratos. Os autores encontraram estreita relação entre a incorporação da timedina e a expressão do PCNA, sugerindo que o PCNA poderia ser usado, com segurança, como marcador de regeneração hepática.
Dois estudos avaliando a regeneração hepática em fígados patológicos encontraram correlação entre o resultado da coloração do PCNA quando comparado com a incorporação de bromodeoxyuridina (BrdU) (ANDIRAN et al.,2000; SELZNER & CLAVIEN, 2000).
GAGLIO e colaboradores em 2002, mostraram a que os resultados do Ki-67, do índice mitótico e do PCNA foram semelhantes em estudo de regeneração hepática em modelo primata não- humano (Macaca mulata) após hepatectomia parcial.,
SELZNER e CLAVIEN (2000) relatam que há quebra no processo de regeneração em fígados esteatóticos. Prova disso é a redução na expressão do PCNA por estes fígados, o que indica falência na indução das proteínas do complexo polimerase necessárias para a síntese de DNA.
Ainda nesta discussão, CORBIN e colaboradores em 2002 demonstraram a existência de métodos não invasivos capazes de monitorar a atividade e a regeneração
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hepáticas com igual, ou melhor, credibilidade. Eles usaram a ressonância magnética associada à espectofotometria com fósforo marcado e compararam com métodos convencionais de avaliação da função hepática e chegaram a resultados similares, com a vantagem de poder ser utilizada na prática clínica.
JESUS, WAITZBERG e CAMPOS em 2000 separaram os eventos desencadeados após hepatectomia parcial de ratos Wistar em dois períodos distintos: o período pré- replicativo (de 0-14 horas) e o período replicativo (14-48 horas), caracterizando o processo de regeneração. Em estudos prévios diversos autores confirmaram que o pico de mitoses ocorre entre 24-48 horas para ratos após hepatectomia parcial. Este dado coincide com o pico máximo da síntese de DNA nos hepatócitos detectado pela timedina triciada (PISTOI e MORELLO, 1996; THEOCHARIS et al.,1997).
Para a avaliação da densidade vascular em um tecido, tem sido amplamente utilizado como indicador, a marcação imunoistoquímica com o anticorpo monoclonal contra o CD34, que é uma glicoproteína transmembranal, de cadeia única com peso molecular de 116 kDa (GUIMARÃES et al., 2013). É expresso em células imaturas progenitoras, linfóides e mielóides do tecido hematopoético, células endoteliais capilares, fibroblastos embrionários e raras células gliais do sistema nervoso e sua função é desconhecida. Tem maior capacidade de destacar vasos sanguíneos e praticamente não detecta os linfáticos, sendo expresso tanto em pequenos como em grandes vasos, com a mesma intensidade em tecidos normais e neoplásicos. O CD34 apresenta alta especificidade, apesar de ter alguma coloração linfática e estromal, porém, outros anticorpos marcadores podem ser usados para identificação da microvascularização, como o anti-CD31, anti-FVIII e anti-CD105 (HASAN, BYERS e JAYSON, 2002; SIEMERINK et al., 2012).
Nakamura e colaboradores em 2016, em estudo com transplante de células CD34 na regeneração hepática em ratos, revelaram o aumento de células endoteliais nos fígados dos animais que receberam as células CD34, avaliado por imunohistoquímica com marcação para PCNA e Ki67. Além disso, fizeram a comparação dose dependente do transplante autólogo de células CD34 com a marcação das células endotelias, afirmando o melhor
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desempenho da regeneração hepática pelo aumento de células endoteliais, ou seja, promoção da angiogênese. Desta forma pode-se avaliar a regeneração hepática quando se avalia a marcação com anti-CD34 no aspecto pró-angiogênico. Observaram também aumento das metaloproteinases (MMPs) e redução de Inibidores de MMps. Assim, é possível considerar que uma possível diminuição da marcação de CD34 reflete na concentração de MMps no tecido hepático, ou seja, a relação da fibrinólise é diretamente proporcional a marcação do CD34, sendo o CD34 um marcador de amplo espectro no estudo da regeneração hepática.
Vários estudos em modelos animais demonstram que o bloqueio do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) suprime a proliferação hepática após hepatectomia parcial (AUSSILHOU et al., 2009).
Um método padrão ouro de avaliação da regeneração hepática ainda não foi identificado. Todos os métodos apresentam vantagens e desvantagens, e ainda existe muita discrepância entre eles. Portanto, sempre que possível, deve-se utilizar pelo menos dois métodos diferentes para avaliar com segurança a regeneração hepática.
“...assim como toda rosa tem seus espinhos, cada método tem suas desvantagens...”
(ASSAY e MINUK, 1997).
2.3 ANGIOGÊNESE E VASCULOGÊNESE
Vasculogênese foi definida como a formação de novos vasos sanguíneos em local onde esses não existiam. Sua formação deve-se aos estímulos e proliferação dos angioblastos (células precursoras do endotélio), originários do mesoderma esplâncnico.
Entretanto, a angiogênese foi estabelecida como brotamento de novos vasos a partir de células endoteliais (CE) diferenciadas a partir de um vaso pré-existente, sendo o processo desenvolvido em duas fases: de brotamento e de maturação (YOSHIDA, 2005). A arteriogênese é um processo que consiste no desenvolvimento da circulação colateral,
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tendo como precursoras as anastomoses vasculares pré-existentes, que se desenvolveriam mediante estímulos de força de cisalhamento, citocinas, moléculas de adesão, entre outras (CONWAY, COLLEN e CARMELIET, 2001; AUSSILHOU et al., 2009).
A angiogênese ocorre naturalmente no organismo e é um mecanismo fundamental, tanto na promoção da saúde quanto no desenvolvimento e progressão de doenças. Atua na cicatrização de feridas, regeneração e reparo tecidual, vascularização de tecidos isquêmicos e restabelece o fluxo sanguíneo nos tecidos após a lesão. Nas fêmeas, também ocorre durante o ciclo reprodutivo mensal (para reconstruir o endométrio, a fim de amadurecer o óvulo durante a ovulação) e durante a gravidez (para construir a placenta, e a circulação entre mãe e feto). As principais etapas da angiogênese, a partir de vasos pré-existentes, incluem a vasodilatação, que em resposta ao óxido nítrico provoca o aumento da permeabilidade dos vasos preexistentes, induzidos pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). A seguir ocorre a degradação proteolítica da membrana basal do vaso original pelas metaloproteinases da matriz extracelular e o rompimento do contato célula- célula entre as células endoteliais, pelo ativador do plasminogênio. Posteriormente ocorre a migração das células endoteliais em direção ao estímulo angiogênico, seguida pela proliferação e maturação das células endoteliais e das células migratórias. Por fim, ocorre a inibição do crescimento e remodelagem em tubos capilares e o recrutamento de células periendoteliais (pericitos e células musculares lisas vasculares) para estabilizar o novo vaso sanguíneo (FOLKMAN, 1995; CARMELIET, 2004; CARMELIET, 2006; ADAMS e ALITALO, 2007; KERBEL, 2008; ROLAND et al., 2009; SOYSAL et al., 2014).
A angiogênese é uma resposta à lesão hepática que leva ao remodelamento sinusoidal e com outros eventos reestabelecem a matriz extra-celular (MEC).
Consequentemente, muitos potentes mediadores angiogênicos estão envolvidos na resposta exagerada da cicatrização de feridas à lesão crônica do fígado, levando a um acúmulo excessivo de matriz extra-celular (MEC). A MEC também pode afetar indiretamente a função celular liberando citocinas. Estes incluem fator de crescimento transformador β (TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de
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hepatócitos (HGF), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fator de necrose tumoral α (TNF-α), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). A fibrose hepática é um processo dinâmico que resulta de um desequilíbrio entre a produção e a dissolução da matriz extracelular. O desenvolvimento de fibrose hepática é orquestrado por muitos tipos de células, incluindo células estreladas hepáticas. O remodelamento da MEC é fundamental na preservação da homeostase durante a regeneração hepática. Essa homeostase depende do equilíbrio entre as metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs) (ELPEK, 2014).
A compreensão das angiogêneses normal e anormal é necessária para desenvolver estratégias terapêuticas para combater patologias e estudar a regeneração. Uma vez que a angiogênese envolve a migração/invasão de células endoteliais para o estroma e ou tecidos circundantes, proteases, tais como as metaloproteinases da matriz, são criticamente importantes. Entretanto, há algum tempo ficou claro que o(s) papel(is) das MMPs na angiogênese é mais complexo do que simplesmente degradar a matriz extracelular (MEC) para facilitar as células endoteliais invasoras. Várias MMPs também são necessárias para liberar fatores pro-angiogênicos sequestrados pela MEC, processar fatores de crescimento e receptores, incluindo integrinas e receptores de adesão, e para gerar compostos antiangiogênicos endógenos. A MEC atua como um compartimento de sequestro / armazenamento de fatores de crescimento angiogênico, como o VEGF, o FGF básico (bFGF) e o TGF1, que podem ser liberados pela degradação proteolítica da MEC. Embora a degradação dos componentes da MEC para abrir uma avenida para a migração de células endoteliais seja um requisito essencial para as MMPs na angiogênese, as MMPs contribuem de muitas maneiras para os processos pró e antiangiogênicos. Na angiogênese, há um equilíbrio rigidamente controlado entre a sinalização do fator angiogênico, atividade / sinalização de MMP, inibidores de angiogênese endógena e inibidores de MMP. Isso pode explicar perfis de fibrose em distúrbios angiogênicos, visto não haver equilibrio (FOLKMAN, 2003; OH et al., 2004; RUNDHAUG, 2005).
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2.4 FATORES DE CRESCIMENTO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Vários fatores de crescimento estão envolvidos na estimulação do fígado para regeneração, por exemplo, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Vários investigadores identificaram o TGF-β1 como o principal inibidor da regeneração hepática. O conceito atual é que existem redes mediadas por citocinas e fatores de crescimento que promovem a regeneração de vários tipos de células intra-hepáticas. Muitos fatores relacionados à regeneração hepática foram extensivamente estudados, entre os quais a serotonina e as plaquetas fizeram recentemente avanços. A integração precisa de fatores de crescimento é necessária para a regeneração completa e sincronizada. A falha em ativar essas cascatas de sinalização pode resultar em atraso do início da regeneração, recuperação inadequada do volume do fígado e, eventualmente, sinais clínicos de insuficiência hepática (CLAVIEN et al., 2008; IBRAHIN et al., 2019).
2.4.1 As plaquetas e a regeneração hepática
Nos últimos cinco anos, vários índices não invasivos foram propostos para prever o grau de fibrose na hepatite viral. O índice relacionado entre a razão de plaquetas com a aspartato aminotransferase (APRI) apresenta alto grau de precisão na identificação de presença de fibrose e cirrose significativa em pacientes com hepatite C crônica (LAMBERTUCCI, SILVA e ANTUNES, 2007). O teste APRI é capaz de confirmar a existência de fibrose significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível, como alternativa, na prática clínica (AMARAL, et al., 2007; ANTONELLO et al., 2010; DERBALA et al., 2015). Os resultados do estudo de DERBALA e colaboradores em 2015 sugerem que os marcadores bioquímicos/hematológicos não invasivos como o APRI são sensíveis e específicos no diagnóstico do grau de fibrose e cirrose em pacientes com coinfecção do HCV e esquistossomose, em comparação com a biópsia.
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As plaquetas são partículas discóides não nucleadas que são essenciais para a hemostasia e a trombose. Além da coagulação, as plaquetas contribuem para a reação inflamatória após muitas formas de lesão tecidual. O fígado e as plaquetas exibem uma interconexão muito íntima, embora complexa. O fígado desempenha um papel crítico durante a síntese de plaquetas de megacariócitos por meio da trombopoietina (TPO). A TPO, o fator de crescimento hematopoiético mais importante na regulação do desenvolvimento de megacariócitos e produção de plaquetas, é produzido principalmente no fígado e rim. Portanto, não se espera que as plaquetas funcionem adequadamente nas alterações hepáticas (ROZMAN e BOLTA, 2007; CLAVIEN, 2008).
Várias proteínas que induzem efeitos opostos na regeneração hepática estão presentes nas plaquetas. Por exemplo, as plaquetas abrigam importantes fatores de crescimento para a execução da regeneração hepática como o HGF. Por outro lado, as plaquetas contêm TGF-α que é necessário para o término da regeneração hepática. Assim, é plausível que as plaquetas possam participar da orquestração da regeneração hepática por meio de estimulação harmonizada e inibição de sinais relacionados ao crescimento (CLAVIEN, 2008; PIETRAMAGGIORI et al., 2010).
Até 2006, não estava claro se as plaquetas seriam promotoras, inibidoras ou até mesmo ativas na regeneração hepática. Estudos in vitro demonstraram que as plaquetas contêm vários fatores de crescimento, que podem, teoricamente, contribuir para o processo de regeneração hepática. No entanto, o único estudo in vivo sobre o papel das plaquetas na regeneração hepática em ratos não identificou uma correlação entre as plaquetas e a regeneração hepática (ROZMAN e BOLTA, 2007).
Com a formação do coágulo durante a cicatrização, as plaquetas fornecem um arcabouço temporário para o crescimento de células e modulam a angiogênese, através de uma série complexa e indefinida de eventos mediados por fatores de crescimento e células.
O proteoma de plaquetas é rico em vários fatores pró-angiogênicos e anti-angiogênicos.
Descobertas recentes de que fatores pró-angiogênicos e antiangiogênicos são liberados das plaquetas de maneira seqüencial podem explicar como as plaquetas afetam a angiogênese
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e a cicatrização de feridas. Plaquetas quiescentes têm um papel crucial na estimulação da angiogênese e proliferação celular na cicatrização (PIETRAMAGGIORI et al., 2010)
Em estudo sobre a regeneração do fígado em ratos, observou-se que a esplenectomia aumenta a contagem de plaquetas e acelera a regeneração do fígado por meio de um mecanismo pouco claro. Num segundo passo, esgotaram as plaquetas para menos de 5% aplicando um anticorpo específico para plaquetas. Após 70% da ressecção hepática, esses ratos exibiram uma regeneração hepática significativamente comprometida, sugerindo que um fator contido nas plaquetas pode ser necessário para induzir ou manter a regeneração hepática (LESURTEL et al., 2006). Em outro estudo, camundongos trombocitóticos exibiram aumento da regeneração do fígado, enquanto um grupo trombocitopênico mostrou regeneração prejudicada (MURATA et al., 2007).
Matsuo e colaboradores em 2008 relataram que o contato direto entre plaquetas e hepatócitos é necessário para o efeito proliferativo. Esses autores concluíram que o contato plaqueta-hepatócito inicia a transdução de sinal envolvido na ativação do fator de crescimento. HGF, VEGF e fator de crescimento semelhante à insulina foram encontrados nas plaquetas e contribuem principalmente para a proliferação de hepatócitos. Murata e colaboradores em 2008 demonstraram que as plaquetas promovem a regeneração hepática mesmo sob condições de depleção de células de Kupffer, estimulando o HGF.
2.4.2 A serotonina e a regeneração hepática
O papel substancial da serotonina como neurotransmissor no sistema nervoso central, como um hormônio local no sistema vascular periférico e no trato gastrointestinal e como um mediador da conexão cérebro-intestino, está bem estabelecido. Com relação ao fígado, vários estudos já focaram a atenção no notável impacto da serotonina na perfusão microvascular hepática, no diâmetro dos sinusóides hepáticos, na adesão de plaquetas e leucócitos ao endotélio sinusoidal, na isquemia hepática, lesão por reperfusão e aloenxerto de células tumorais no fígado.
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A serotonina está presente em alta concentração nas plaquetas, onde se acumula a partir do plasma através de um sistema de transporte ativo (CLAVIEN et al., 2008). Estudos de Lesurtel e colaboradores em 2006, citados em Rudell, Mann e Ramm em 2008, identificaram as plaquetas como a principal fonte de serotonina que impulsiona a regeneração hepática em camundongos hepatectomizados.
Há uma grande variedade de isoformas de receptores de serotonina distribuídas nos neurônios entéricos, células do músculo liso gastrointestinal e possivelmente em enterócitos, tecidos imunes e hepatócitos (BONHAUS et al., 1995). Entre eles, sete tipos de receptores de serotonina foram identificados por Barnes e Sharp em 1999.
2.4.3 O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a regeneração hepática
O macrófago ativado é a principal célula efetora do processo de reparo tecidual, degradando e removendo componentes do tecido conjuntivo danificado, como colágeno, elastina e proteoglicanas. Além desse papel na fagocitose de fragmentos celulares, os macrófagos também secretam fatores quimiotáticos que atraem outras células inflamatórias ao local da ferida e sintetizam prostaglandinas, que funcionam como potentes vasodilatadores, afetando a permeabilidade dos microvasos. Os macrófagos produzem vários fatores de crescimento, tais como o PDGF, o TGF-β, o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e o VEGF (SANTOS e CLARK,1999).
O gene VEGF-A humano está organizado em oito exons. Splicing alternativo (remoção dos introns de uma molécula de RNA pré-mensageiro) de exons resulta na geração de quatro isoformas principais de VEGF, possuindo, respectivamente, 121, 165, 189 e 206 aminoácidos após a clivagem da sequencial, respectivamente VEGF121, VEGF165, VEGF189 e VEGF206. O VEGF165 é a isoforma predominante o qual é segregado, mas uma fração significativa permanece ligada à superfície celular e à matriz extracelular, em virtude das suas propriedades de ligação à heparina. Existem muitas evidências para indicar que o VEGF165 é a isoforma fisiologicamente mais relevante. A atividade característica do VEGF é a capacidade de promover o crescimento de células
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endoteliais vasculares derivadas de artérias, veias e até linfáticos. O VEGF é essencial para a vasculogênese e angiogênese embrionária normal, de tal forma que a inativação de um único alelo de VEGF em camundongos resulta em letalidade embrionária. Existem duas tirosina-quinases receptoras de VEGF (RTKs), Flt-1, conhecidas também como VEGFR-1 e KDR, Flk-1 ou VEGFR-2. Concorda-se de que o VEGFR-2 é o principal mediador dos efeitos mitogênicos, angiogênicos e de melhoramento da permeabilidade do VEGF (FERRARA, HILLAN e NOVOTNY, 2005; FOLKMAN, 2007; TADO et al., 2014; SHANG et al., 2018).
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um estimulante primário da angiogênese e é uma proteína quimiotática de macrófagos. A inibição do VEGF é benéfica em combinação com quimioterapia para alguns pacientes com câncer de mama. No entanto, o mecanismo pelo qual a inibição do VEGF afeta o crescimento do tumor parece envolver mais do que seu efeito sobre as células endoteliais (ROLAND et al., 2009; SHANG et al., 2018).
O VEGF aumenta a permeabilidade vascular e esta propriedade sustenta papéis importantes dessa molécula na inflamação e em outras condições patológicas (FERRARA, HILLAN e NOVOTNY, 2005). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um dos principais atores da angiogênese. O bloqueio da atividade do VEGF usando anticorpos específicos ou outras entidades proteicas para prevenir a ligação e a sinalização do VEGF através de seus receptores tem sido uma das muitas abordagens para reduzir o crescimento do tumor. O Bevacizumabe, um anticorpo que se liga ao receptor de VEGF humano com alta afinidade, foi aprovado para o tratamento de pacientes com câncer colorretal (FUH et al., 2006; AUSSILHOU et al., 2009).
A ativação da proliferação e angiogênese pelo VEGF é essencial para a regeneração do fígado e reparo de órgãos, ambos dependentes do suprimento de sangue para os hepatócitos. A onda inicial de proliferação hepática é seguida pela proliferação de células endoteliais e penetração de ilhas hepatocelulares avasculares levando à formação de novos sinusóides (BÖNNINGHOFF et al., 2012).
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2.4.4 O fator de crescimento de hepatócito (HGF) e a regeneração hepática
O HGF injetado sistemicamente é absorvido principalmente pelo fígado. A injeção de HGF na veia porta de ratos e camundongos normais causa a proliferação de hepatócitos e o aumento do fígado. A reserva intra-hepática de HGF é consumida durante as primeiras três horas após a hepatectomia parcial, seguida de nova síntese de HGF. O HGF exerce um efeito mitogênico direto nos hepatócitos. O receptor de HGF hepático é ativado 30 a 60 minutos após a hepatectomia parcial (CLAVIEN, 2008).
O HGF está presente na matriz hepática em quantidades relativamente grandes, como também é encontrado na matriz de outros órgãos, como pulmões, baço, placenta, cérebro, etc. O HGF injetado sistemicamente é sequestrado pelo fígado mais do que qualquer outro órgão. A eliminação genética do HGF ou seu receptor (cMet) está associada à letalidade embrionária envolvendo anormalidades em muitos órgãos, principalmente na placenta (MICHALOPOULOS, 2007; CLAVIEN et al., 2007).
O HGF foi implicado como envolvido na regeneração do fígado pelas seguintes razões:
1ª) Os níveis de HGF no plasma aumentam 10 a 20 vezes após a PHx .
2ª) O HGF ativo é consumido a partir de reservas intra-hepáticas nas primeiras 3 h após a PHx, seguido por nova síntese de HGF de 3 a 48 h (PEDIADITAKIS et al., 2001)
3ª) O HGF causa uma forte resposta mitogênica e expansão clonal de hepatócitos em cultura (BLOCK et al., 1996).
4ª) A injeção de HGF na veia porta de ratos e camundongos normais causa proliferação de hepatócitos e aumento do fígado (PATIJN et al., 1998).
5ª) O receptor do HGF do fígado (cMet) é ativado pela fosforilação da tirosina entre 30 e 60 minutos após a PHx (STOLZ et al., 1999).
6ª) A eliminação genética direcionada do cMet do fígado é associado com regeneração muito deficiente ou ausência de resposta (BOROWIAK et al., 2004; MONGA et al., 2002).
