Estudo das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4 no carcinoma diferenciado de tireoide

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

LAIS HELENA PEREIRA AMARAL

ESTUDO DAS PROTEÍNAS ID1, ID2, ID3 E ID4 NO CARCINOMA DIFERENCIADO DE TIREOIDE

CAMPINAS 2017

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LAIS HELENA PEREIRA AMARAL

ESTUDO DAS PROTEÍNAS ID1, ID2, ID3 E ID4 NO CARCINOMA DIFERENCIADO DE TIREOIDE

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na área de concentração Clínica Médica.

ORIENTADOR: LAURA STERIAN

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA

ALUNA LAÍS HELENA PEREIRA AMARAL, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. LAURA STERIAN.

CAMPINAS 2017

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BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

LAÍS HELENA PEREIRA AMARAL ORIENTADOR: PROFª. DRª. LAURA STERIAN MEMBROS: 1. PROF[A]. DR[A]. LAURA STERIAN 2. PROF[A]. DR[A]. RITA DE CASSIA FERREIRA 3. PROF[A]. DR[A]. ICLEIA SIQUEIRA BARRETO

Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

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Dedico esta dissertação:

Aos meus pais, Isabel e Ailton, pela educação, incentivo e apoio dados a mim durante toda a minha vida. Vocês são e sempre serão meus exemplos de vida.

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AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Isabel e Ailton, por terem me incentivado a entrar no mestrado e estarem ao meu lado me apoiando durante todo o seu desenvolvimento.

À minha orientadora, Dra. Laura Ward, por ter me aceitado como sua aluna, acreditado na minha pesquisa e por ter depositado em mim confiança para colocar seu nome nela.

À Natássia por ter me guiado por todo o meu período de estágio no laboratório e por toda a ajuda dada durante o desenvolvimento da minha pesquisa. Obrigada por ter acreditado na minha pesquisa, ajudado a encontrar as saídas quando chegávamos a algum problema e pelos conselhos.

À Jacqueline, por ter me ensinado várias das técnicas, permitido que participasse da sua pesquisa, pelos conselhos e incentivos durante todos os anos que estive no laboratório.

À Karina, por ter me ajudado durante todo o desenvolvimento do meu mestrado. Obrigada pela ajuda na realização das técnicas e companhia as idas ao A C Camargo para coleta de dados.

Às minhas amigas Amanda, Caroline, Luara e Ana Luíza, pelo apoio, incentivo, força e por estarem ao meu lado não só durante o mestrado.

Ao meu namorado Matheus, por ter me incentivado, estar ao meu lado e ouvido durante as horas, principalmente as de desespero e preocupação.

Aos meus familiares, pelo apoio dado.

À Dra. Icléia, por toda a ajuda e tempo dedicados à mim e à minha pesquisa. Ao Dr. Hugo, pela ajuda na coleta de dados dos pacientes do A C Camargo. Ao A C Camargo Cancer Center, por permitir a utilização do material biológico e também dos dados dos pacientes avaliados neste estudo.

A todos os pacientes e voluntários que doaram material e acreditaram que o desenvolvimento de pesquisas pode ajudar não só a eles, mas a outros pacientes também.

À pós-graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp e CAPES/CNpQ, pela bolsa de pesquisa.

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RESUMO

Nódulos tireoidianos malignos e benignos são cada vez mais frequentes, tornando o câncer de tireoide a neoplasia endócrina mais frequente encontrada na população. Assim, existe a premente necessidade de se procurar por novos marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico. As proteínas Inibidoras da ligação do DNA (ID) pertencentes à família dos fatores de transcrição helix-loop-helix tem um papel fundamental no desenvolvimento, progressão, proliferação e migração tumoral e celular, além de agirem tanto como oncogenes quanto como supressores tumorais em diversos tipos de carcinomas. Também estão envolvidas no controle do ciclo celular e regulação de vias de transcrição como PI3K/AKt e NF-κB, já relacionadas com o desenvolvimento do Câncer Diferenciado de Tireoide (CDT). O objetivo deste estudo foi verificar a expressão das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4 e sua utilidade como possíveis marcadores moleculares capazes de diagnosticar, caracterizar e definir o prognóstico do Carcinoma Diferenciado da Tireoide (CDT). Para tanto foram coletadas 194 amostras de tecido nodular, sendo 68 bócios nodulares, 16 adenomas foliculares, 75 carcinomas papilíferos da variante clássica (CPTVC), 18 carcinomas papilíferos da variante folicular (CPTVF), 5 carcinomas foliculares, 1 carcinoma anaplásico e 11 tecidos normais. Eram amostras de 36 homens e 142 mulheres, com uma média de 14,9 ± 45,2 anos de idade. Os 99 portadores de neoplasias malignas foram submetidos a um mesmo protocolo de tratamento e foram seguidos por 12 a 87 meses. A análise de expressão gênica foi realizada por qPCR e a imunoistoquímica foi realizada com utilização de anticorpos ABCAM. Os dados obtidos foram relacionados com dados clínicos e de evolução dos pacientes. Demonstramos que a expressão das IDs foi capaz de diferenciar nódulos benignos de malignos e se associou com ausência de características de agressividade tumoral. Encontramos maior expressão proteica nuclear de ID3 em células benignas do que malignas (5,2 ± 0,9 vs 3,0 ± 1,8 UA, Mann-Whitney, p<0,0001). Ao contrário, a expressão citoplasmática desta proteína foi maior em células malignas do que benignas (5,7 ± 1,5 vs 4,0 ± 1,4 UA, Mann-Whitney, p<0,0001). Não conseguimos correlacionar as proteínas estudadas com a evolução ou com o prognostico dos pacientes. Sugerimos que a expressão das IDs, principalmente da ID3, pode ajudar no diagnóstico e na caracterização de agressividade de lesões malignas da tireoide. Palavras-chave: ID, Carcinoma diferenciado da tireoide, HLH.

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ABSTRACT

Thyroid nodules malignant and benign have become increasingly frequent making Thyroid Cancer the most frequent endocrine neoplasia found in the population. Therefore, there is a necessity for searching new molecular markers for prognosis and diagnosis. The Inhibitory of the DNA binding proteins (ID) belonging to the helix-loop-helix transcription factors family have demonstrating to play a key role in the development, progression, proliferation and tumor cell migration, as such as act both as oncogenes and tumor supressor in several types of carcinomas. They are also involved in cell cicle controll and regulation of transcription pathways such as PI3K/Akt and NF- κB , already related with the development of Differentiated Thyroid Cancer (DTC). For this reason the aim of this study is to verify the expression of ID1, ID2, ID3 and ID4 proteins and potention utility as molecular markers able to diagnose, characterize and define prognosis of DTC. For that purpose, we collected 194 thyroid nodules samples: 68 goiters, 16 follicular adenomas (FA), 75 classic papillary thyroid carcinomas (CPTC), 18 follicular variant of papillary thyroid carcinoma (FVPTC), 5 follicular thyroid carcinoma (FTC), 1 anaplastic thyroid carcinoma and 11 normal thyroid tissues. Was extracted RNA from all the samples. Gene expression analysis was performed by real time PCR and the immunohistochemistry was performed following the standard protocol using ABCAM antibody. The data obtained were correlated to clinical and pathological features and to patient’s outcomes. We demonstrated that IDs expression was capable of differentiate benign from malignant nodules being associated with absence of tumor aggressiveness features. We found a higher ID3 nuclear protein expression in benign cells compared to malignant cells (5,2 ± 0,9 vs 3,0 ± 1,8 AU, Mann-Whitney, p<0,0001). In contrary, the cytoplasmic expression of this protein was higher in malignant than benign (5,7 ± 1,5 vs 4,0 ± 1,4 AU, Mann-Whitney, p<0,0001). We suggest that IDs expression, mainly ID3, may help in the diagnosis and In the characterization of aggressiveness in malignant thyroid lesions.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes estimados para 2016 por sexo, exceto pele não melanoma ... 18 Figura 2: Regulação da expressão das proteínas ID e sua função na biologia do câncer ... 21 Figura 3: Análise de Score de positividade e intensidade segundo o método de

Allred...33 Figura 4: A: expressão gênica da ID1 nas amostras de tecidos tumorais tireoidianos analisadas. B: comparação entre o número de amostras que apresentaram

hiperexpressão e hipoexpressão em nódulos benignos e

malignos...38 Figura 5: Expressão gênica da ID1 em nódulos benignos e malignos da tireoide (p=0,2780) ...39 Figura 6: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da expressão gênica da ID1 na identificação de nódulos malignos de benignos...40

Figura 7: A: expressão gênica da ID2 nas amostras de tecidos tumorais tireoidianos analisadas. B: comparação entre o número de amostras que apresentaram

malignos...43

Figura 8: Expressão gênica do ID2 em nódulos benignos e malignos da tireoide (p<0,0001)

...44

Figura 9: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da expressão gênica da ID2 na identificação de nódulos benignos de malignos...45

Figura 10: A: Expressão gênica do ID3 nas amostras de tecidos tumorais tireoidianos analisadas. B: comparação entre o número de amostras que apresentaram

malignos...46

Figura 11: Expressão gênica da ID3 em nódulos benignos e malignos da tireoide (p<0,0001) ...47

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Figura 13: Correlação entre tamanho do tumor e expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4, onde a expressão de ID3 e ID4 se relacionam negativamente com tamanho do tumor, quanto maior o tumor, menor seus valores de expressão (p=0,0056 e p=0,0217, respectivamente) ...49

Figura 14: A: expressão gênica da ID4 nas amostras de tecidos tumorais tireoidianos analisadas. B: comparação entre o número de amostras que apresentaram hiperexpressão e hipoexpressão em nódulos benignos e malignos. ...50

Figura 15: Expressão gênica da ID4 em nódulos benignos e malignos da tireoide (p<0,0001). ...51

Figura 17: A: Expressão proteica de ID1 em bócio tanto no núcleo quanto no citoplasma. B: Expressão proteica de ID1 em CPT no núcleo e citoplasma...55

Figura 18: Diferença de expressão da proteína ID1 no núcleo e citoplasma de nódulos benignos e malignos. ...56

Figura 19: Expressão proteica nuclear da ID1 em nódulos benignos e malignos (p<0,0001)...56

Figura 20: Expressão proteica citoplasmática da ID1 em nódulos benignos e malignos (p=0.1637)...57

Figura 21: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da expressão proteica nuclear da ID1 na identificação de nódulos benignos de malignos...58

Figura 22: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da expressão da proteína ID1 no citoplasma, na identificação de nódulos benignos de malignos...58

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Figura 23: A: Expressão proteica de ID3 predominantemente nuclear em bócio. B; Expressão proteica de ID3 predominantemente citoplasmática em CFT e CPT...60

Figura 24: Diferença de expressão da proteína ID3 no núcleo e citoplasma de nódulos benignos e malignos...60

Figura 25: Expressão proteica nuclear da ID3 em nódulos benignos e malignos (p<0,0001)...61

Figura 26: Expressão proteica citoplasmática da ID3 em nódulos benignos e malignos (p<0,0001)...61

Figura 27: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da expressão da proteína ID3 no núcleo, na identificação de nódulos benignos de malignos...62

Figura 28: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da expressão citoplasmática da proteína ID1, na identificação de nódulos benignos de malignos...63

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Sondas utilizadas nas reações de quantificação de RNAm dos genes ID1,ID2, ID3, ID4 e GAPDH...30 Tabela 2: Anticorpos utilizados nas reações de imunoistoquímica das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4, e suas

diluições...32

Tabela 3: Anticorpos utilizados nas reações de imunoistoquímica das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4, e suas diluições...36

Tabela 4: Características clínico patológicas dos indivíduos analisados de acordo com a expressão da ID1...41

Tabela 5: Características clínicas de pacientes com hipoexpressão e hiperexpressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4...42

Tabela 8: Características clínico patológicas dos indivíduos analisados de acordo com a expressão da ID4...53

Tabela 9: Características clínicas analisadas de pacientes comparando os grupos com nódulos benignos e malignos na imunoistoquímica...54

Tabela 10: Características clínico patológicas dos indivíduos analisados de acordo com a expressão da proteína ID1 no núcleo e citoplasma das células...59

Tabela 11: Características clínico patológicas dos indivíduos analisados de acordo com a expressão da proteína ID3 no núcleo e citoplasma das células...63

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AF Adenoma folicular

AKT AKT serine/threonine kinase 1

bHLH Helix-Loop-Helix

cDNA Complementary DNA

CDT Carcinoma Diferenciado da Tireoide CFT Carcinoma Folicular da Tireoide CFT Carcinoma Folicular de Tireoide

CPVC Carcinoma Papilífero Variante Clássica CPVF Carcinoma Papilífero Variante Folicular

CT Câncer de Tireoide

DNA Ácido desoxirribonucléico

ETS Proto oncogene ETS

EWS Proteína EWS

FFPE Formalin Fixed Parafin Embebed

FOXO3 Forkhead box O3

GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

HE Hematoxilina-eosina

ID Inhibitor of DNA Binding Family

ID1 Inhibitor of DNA binding protein 1 ID2 Inhibitor of DNA binding protein 2 ID3 Inhibitor of DNA binding protein 3 ID4 Inhibitor of DNA binding protein 4 INCA Instituto Nacional do Câncer

MYC Proto oncogene MYC

NFkB Nuclear factor kappa B

P16 Proteína 16

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p53 Proteína p53

PAX2 Paired box 2

PAX5 Paired box 5

PAX8 Paired box 8

PCR Reação em cadeia polymerase

PI3K Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase

RAS Proto oncogene GTPase RAs

RB Retinoblastoma

RNA Ácido Ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

ROC Receiver operating characteristic

RT Reverse Transcriptase

TCLE Termo de Consentimento Livre e esclarecido

Tg Tireoglobulina

TGF Transforming growth factor

TMA Tissue Microarray

UA Unidades Arbitrárias

VPN Valor preditivo Negativo

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LISTA DE SÍMBOLOS

± Mais ou menos c2 Qui-quadrado % Porcentagem â Registrado ä Trade Mark ¥ Infinito < Menor > Maior

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...18 1.1 Câncer de Tireoide...18 1.2 As Proteínas ID...19 1.3 ID1...22 1.4 ID2...23 1.5 ID3...24 1.6 ID4...24 2. OBJETIVOS...26 2.1 Objetivo Geral...26 2.2 Objetivo Específico...26 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS...27 3.1 Casuística...27 3.1.2 Seguimento...28

3.2 Análise de expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4...28

3.2.1 Extração de RNA de parafina...28

3.2.2 Reação de transcrição reversa...29

3.2.3 PCR quantitativo (qPCR) – Real Time PCR...30

3.3 Análise de expressão das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4...31

3.3.1 Tissue Microarray (TMA)...31

3.3.2 Imunoistoquímica...31

3.4 Análise Estatística...33

4. RESULTADOS...35

4.1 Análise da expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4...37

4.1.1 ID1...37

4.1.2 ID2...43

4.1.3 ID3...46

4.1.4 ID4...50

4.2 Análise da expressão das proteínas ID1 e ID3 pela técnica de imunoistoquímica...53

(17)

4.2.2 Expressão proteica de ID3...59

5. DISCUSSÃO...64

6. CONCLUSÃO...68

7. REFERÊNCIAS...69

(18)

1.INTRODUÇÃO

1.1 Câncer de tiroide

O câncer de tireoide (CT) representa cerca de 1-2% de todas as neoplasias humanas. Porém, no sistema endócrino representa 95% de todas as neoplasias e sua incidência tem aumentado continuamente nas últimas décadas (1-3).

Nos Estados Unidos estimativas para o CT para o ano de 2017 é de que ocorram cerca de 2.010 mortes de CT e cerca de 56.870 novos casos (4) . No Brasil, estimativas do INCA para a incidência do CT indicam cerca de 1.090 e 5.870 novos casos para homens e mulheres respectivamente, por 100 mil habitantes em 2016, tornando-o o 8º câncer mais incidente entre mulheres e estando presente pela primeira vez entre os cânceres mais incidentes entre homens, ocupando a 14ª colocação (figura 1) (5) .

Figura 1: Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes estimados para

2016 por sexo, exceto pele não melanoma (5).

Muitas doenças tireoidianas podem apresentar nódulos. Aproximadamente 4 a 7% das mulheres e 1% dos homens possuem nódulos tireoidianos palpáveis (6, 7). Entretanto, a prevalência de nódulos indicados por exames de ultrassom (US) é maior, podendo chegar a até 68% da população (8, 9). Apesar da maioria dos nódulos tireoidianos serem benignos a possibilidade de uma malignidade deve ser considerada e a maior parte dos tumores malignos são carcinomas bem diferenciados (CDT), que compreendem o carcinomas

(19)

papilíferos variante clássica (CPVC) e carcinoma papilífero variante folicular (CPVF) (1, 10).

O CT é comumente diagnosticado em uma idade mais jovem do que a maioria dos carcinomas. Cada 2 de 3 casos são encontrados em pessoas com idade menor do que 55 anos (4). No Brasil e no mundo todo, exames de imagem como a ultrassonografia estão se tornando incrivelmente acessíveis para a população, assim aumentando o número de indivíduos diagnosticados com pequenos nódulos que, mesmo quando confirmados como malignos, exibem uma progressão incerta (11).

A maioria dos pacientes com CDT exibem boa progressão quando são apropriadamente tratados. Entretanto, uma reincidência ocorre em uma boa porcentagem dos casos, e, alguns desses casos param de responder ao tratamento convencional e, eventualmente, morrem pela doença. O desafio, entretanto, é identificar os indivíduos que precisam de uma abordagem mais agressiva enquanto que, ao mesmo tempo e, igualmente importante, poupar a maioria dos pacientes de tratamentos e procedimentos desnecessários (12).

Nosso grupo tem demonstrado a importância de vários fatores na susceptibilidade ao CDT e descrito uma série de marcadores de diagnóstico e de prognóstico do CDT (13-16).

1.2 As proteínas ID

As proteínas ID tem sido reconhecidas como inibidoras funcionais dos fatores de transcrição da família helix-loop-helix (bHLH) (17, 18). Existem 4 membros conhecidos da família ID nos vertebrados, chamadas ID1, ID2, ID3 e ID4. O atributo bioquímico crucial de cada um dos quatro membros da família ID é sua ligação com fatores de transcrição bHLH e sua inibição da ligação do DNA por esses fatores, os efeitos de alteração da ligação desses fatores varia com o tipo celular (19, 20). Pesquisas estabeleceram que a inibição de diferenciação é uma função biológica associada com a habilidade das proteínas ID de aumentarem a proliferação celular e preservar a multipotencialidade das células (18, 21). Quando presentes as proteínas ID, os fatores de transcrição não são mais capazes de se ligarem à sequência alvo do DNA e ativar a transcrição (22).

(20)

Proteínas ID são proteínas de vida curta, com uma meia vida de geralmente <30 min e que, normalmente, se translocam entre o núcleo e o citoplasma, com o último funcionando como um compartimento inativo (23).

O aumento da expressão de combinações variáveis de proteínas ID tem sido descritas em vários tipos de tumores humanos e tem sido frequentemente associado com perda de diferenciação (anaplasia), aumento de malignidade e comportamento clínico agressivo (24). Essas observações apoiam o envolvimento das proteínas ID na maioria dos traços fenotípicos que identificam estado de malignidade da célula e determinam o estágio de prognóstico de tumores humanos. Além de contribuições bem estabelecidas das proteínas ID para proliferação e diferenciação de células normais e tumorais, também tem sido relacionadas com formação de novos vasos sanguíneos contribuindo assim para progressão, aumento tumoral e processo metastático. Dependendo do tipo celular e do estágio de seu desenvolvimento, essas proteínas podem ter diferentes resultados funcionais, agindo tanto como oncogenes quanto como supressoras tumorais (18, 20).

Desde a identificação inicial, os genes ID têm sido classificados como genes de resposta inicial (25). Vários fatores transcricionais têm sido implicados na regulação da expressão do gene ID. Alguns desses fatores são oncoproteínas bem estabelecidas [RAS, MYC, b-catenina, RB, EWS, ETS] que se tornam ativadas em tumores humanos específicos e levam uma acumulação da proteína ID (18, 24, 26). As proteínas ID também inibem membros da subfamília de fatores de transcrição que compreende PAX2, PAX5 e PAX8 (27, 28) e podem ser reprimidas por p53, FOXO3, inibidores de sinais de crescimento TGF, e sensíveis ao fator transformador de crescimento β (TGF) (27, 29) (figura 2).

(21)

Figura 2: Regulação da expressão das proteínas ID e sua função na biologia do câncer

(28).

Concentrações anormais das proteínas têm sido associadas com a hiperregulação de uma série de fatores proliferativos e de sobrevivência como as ciclinas D1 e E, PI3K-AKt, fator nuclear κB (NF-κB), e a inibição de inibidores ciclinas dependentes de kinase (CKI) p16INK4A, p21waf1, p27Kip1 e pRb. Também tem sido demonstrado que a super expressão dessas proteínas promovem o crescimento tumoral, metástase e resistência à drogas. Por isso, acredita-se que moduladores negativos da função das proteínas ID seriam candidatos promissores para a terapia ao câncer (30-32).

O interesse de pesquisas biomédicas na biologia das ID tem sido intensificado pela atividade multifacetada das proteínas ID no câncer. As proteínas ID são consideradas alvos muito eficientes para novas drogas anti câncer com potencial para neutralizar a progressão tumoral. A noção de que as proteínas ID são anormalmente produzidas pelas células tumorais e endotélio tumoral, sendo geralmente ausentes em tecidos normais adultos, podem apontar um alvo ideal para a terapia do câncer. Este conceito tem sido reforçado pela demonstração de altas concentrações das proteínas ID direcionarem múltiplos

(22)

Hallmarks de progressão tumoral e frequentemente conferirem uma evolução clínica desfavorável para os pacientes (18, 20, 24) .

1.2.2 ID1

O gene ID1 foi identificado há 23 anos atrás e seu papel no desenvolvimento e na tumorigênese é melhor caracterizado do que o dos outros genes ID. Evidências têm aumentado de que o gene ID1 é um regulador importante da biologia celular de diferentes tumores. Ele também aumenta a proliferação celular e inibe a diferenciação em diversos tipos celulares. Fatores de crescimento celular e ativação de vias de transdução dos sinais mitóticos aumentam a expressão desse gene (33, 34).

No geral, a expressão do gene ID1 está ausente ou em pequena quantidade em diferentes tecidos normais, mas está elevado em uma grande variedade de neoplasias benignas e malignas. Já foi demonstrado que uma expressão elevada deste gene em tumores malignos é um marcador fenotípico de agressividade, pior prognóstico e aumento de angiogênese tumoral, indicando um papel no processo metastático (35).

Múltiplas evidências sugerem que ID1 seja realmente um oncogene. É regulado em vários carcinomas incluindo os cânceres de mama, próstata, pulmão, cervix e ovário. Foi visto ainda que, o aumento da concentração de expressão da proteína ID1 está relacionada com agressividade tumoral, além de aumentar a habilidade de proliferação e invasão das células cancerígenas e inibir a expressão de p21. Foi sugerido que é um efetor da via de resposta a danos do DNA dependente de p53 (36).

É a única proteína da família das IDs já estudado em tecida tireoidiano, con superexpressão em carcinomas papilíferos e medulares, se comparado com fragmentos tireoidianos normais dos mesmos pacientes. Em carcinomas medulares o nível de expressão desse gene foi relacionado com proliferação e diferenciação celular (37, 38).

Kebebew et al 2004, demonstraram em seus estudos que a expressão da proteína ID1 se encontra em menor quantidade em tecidos tireoidianos normais e em maior quantidade no carcinoma anaplásico tireoidiano.

(23)

Além disso, a proteína está mais elevada em tecidos tireoidianos malignos do que em bócios multinodulares, doença de Graves e células C hiperplásicas. Quando comparando tecidos normais com tecidos neoplásicos tireoidianos do mesmo paciente (carcinoma papilífero, carcinoma folicular, carcinoma medular e adenoma folicular), a expressão da proteína ID1 foi significativamente maior em tecidos neoplásicos (39).

1.2.4 ID2

A proteína ID2 possui papeis diferentes em diferentes tipos de câncer, como câncer de pâncreas, neuroblastoma, câncer de próstata, sarcoma, câncer de pulmão, ovário e carcinoma colorretal onde se encontram altos níveis de sua expressão. Sua expressão é geralmente baixa em tecidos normais e regulada em tumores. Sugere-se que ID2 tenha um importante papel na iniciação e progressão tumoral (40).

O gene ID2, é um fator oncogênico que promove progressão tumoral em algumas neoplasias malignas, porém também pode agir como um supressor tumoral participando na patogenia de alguns tumores incluindo câncer de fígado, mama e ocular. O duplo papel desta proteína pode ser atribuído a padrões de expressão tecido específicos em diferentes tecidos e órgãos durante a tumorigênese (40-43).

Somente a proteína ID2, dentre todas as proteínas ID, é capaz de desfazer os efeitos antiproliferativos de proteínas supressoras tumorais da família da proteína Retinoblastoma (Rb), assim permitindo a progressão do ciclo celular (40).

Os efeitos da ID2 são dependentes da via NF-κB/ciclina D1, com os inibidores e ativadores de NF-κB bloqueando e aumentando respectivamente a atividade da ID2 que ainda é capaz de induzir a transcrição do NF-κB (um fator de transcrição que está frequentemente envolvido com a oncogênese de várias células e é um alvo para o tratamento do câncer) que contribui para uma variedade de respostas celulares, incluindo proliferação celular ou apoptose, dependendo do estímulo ou das vias de sinalização aos quais está ligado. ID2 é altamente regulada em tecidos epiteliais do carcinoma epidermóide em cabeça e pescoço se comparado com tecidos normais quanto ao mRNA e com

(24)

expressão proteica. Já a expressão de seu gene nestas células aumenta a proliferação celular e os sinais oncogênicos, sugerindo que ID2 possui um importante papel na carcinogênese no carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (41, 42).

ID2 é considerada um marcador valioso de pior prognóstico para sobrevida em pacientes com câncer de mama (44).

1.2.5 ID3

A proteína inibidora de ligação do DNA 3 (ID3) tem sido relacionada com vários cânceres e doenças vasculares, com seu gene (ID3) podendo agir como oncogene. Quando combinada com ID1, são reguladoras positivas importantes da tumorigênese do câncer resultando em um pior resultado clínico em estadio III-N2, principalmente em câncer de pulmão, a cossupressão delas pode siginificativamente inibir a tumorigenicidade (45).

ID1 e ID3 ainda podem, juntamente, promover uma progressão da malignidade das células cancerígenas pelo facilitamento da angiogênese e pela supressão da apoptose, sendo consideradas não só como biomarcadoras de diagnóstico e prognóstico como também valiosos alvos para o desenho de estratégias biológicas apropriadas para uma terapia mais efetiva do câncer de pulmão (45).

Considerando o ciclo celular, ID3, assim como ID2, está relacionado com a diminuição da transcrição de inibidores ciclina dependentes de kinases (CDKIs) que leva ao aumento da proliferação celular. Também bloqueia a transcrição das CDKIs p21Cip1 and p16INK4 resultando em aumento da proliferação celular (46).

Esta proteína é uma importante molécula sinalizadora da angiogênese estimulada pelo estrógeno, já que essa aumenta a sua fosforilação e pode servir como um alvo terapêutico na prevenção e tratamento de distúrbios vasculoproliferativos dependentes de estrógeno (47).

I.2.6 ID4

(25)

diferencia dos padrões das outras proteínas ID sendo assim a proteína menos estudada da família (48) .

ID4 parece demonstrar propriedades tanto pró tumorais como anti tumorais. Silenciamento epigenético da proteína em leucemia, mama, câncer colorretal, leucemia linfocítica e carcinoma gástrico demonstraram uma atividade anti tumoral da proteína, enquanto em leucemia linfoblástica e bexiga sugerem que ela também pode possuir uma atividade pró tumoral sendo que cânceres que contem ID4 nuclear foram considerados mais metastáticos (49).

Em células cancerígenas que carregam a forma mutada da proteína p53, ID4 possui diferentes papéis. Em células proliferativas ela possui um papel de recrutamento de novos vasos sanguíneos assegurando assim a sobrevivência e a propagação das células tumorais. Também pode contribuir para a quimioresistência dessas células p53 mutadas que ativam o gene ID4 aumentando também o potencial angiogênico dessas células tumorais (50).

Quando relacionado ao câncer de mama, ID4 está expresso em células epiteliais normais da mama, mas se encontra suprimido em carcinomas e lesões neoplásicas da mama estrógeno positivas, indicando que ID4 pode agir como uma reguladora negativa do gene supressor tumoral BRCA1. O statos de metilação da ID4 também pode predizer precocemente recidiva tumoral podendo servir como um biomarcador de prognóstico para o câncer de mama (51).

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2.OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Verificar a expressão das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4 pela técnica de imunoistoquímica em lesões malignas e benignas de tireoide. Correlacionar tal expressão com dados clínicos, anatomopatológicos e laboratoriais que definem diagnóstico, caracterizam agressividade e determinam o prognóstico dos portadores de CDT.

Analisar a expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4 através da quantificação do RNAm em lesões benignas e malignas da tireoide e verificar se os dados de expressão obtidos se correlacionam com características clinicopatológicas dos tumores estudados.

2.2 Objetivos Específicos

Buscamos responder às seguintes perguntas:

A expressão das proteínas ID é diferente em nódulos malignos e benignos? Se for, elas podem auxiliar na detecção e caracterização dos diferentes tipos histológicos de nódulos tireoidianos?

A expressão das proteínas ID têm relação com a evolução dos pacientes?

Seriam estas proteínas indicadoras do prognóstico dos pacientes com câncer diferenciado de tiroide?

Os genes ID estão mais expressos em tecidos normais ou neoplásicos? Estão relacionados com melhor ou pior prognóstico ou com características tumorais?

(27)

3.CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Casuística

Este estudo retrospectivo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FCM/Unicamp (CAAE:38462414.2.0000.5404/948.744). Todos os participantes foram devidamente informados dos procedimentos e e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) fornecidos pelo A C Camargo Cancer Center.

As informações clínicas dos pacientes foram obtidas dos prontuários atualizados.

Foram excluídos deste estudo pacientes que possuíam histórico de exposição acidental ou médica à radiação ionizante e/ou antecedentes de outras malignidades. Também não houve participação de população vulnerável, como menores de idade ou pacientes desprovidos de compreensão plena.

Para análise da expressão gênica foram analisadas um total de 194 amostras (142 mulheres e 36 homens) com média de idade de 45,2 ± 14,9 anos, sendo as 194 amostras provenientes do A. C. Camargo Câncer Center, São Paulo, Brasil, que foram submetidos a tireoidectomia total. Foram utilizadas amostras de RNA extraídas de tecido a fresco e parafinado da tireoide do A C Camargo de 16 Adenomas Foliculares (AF), 68 Bócios, 5 Carcinomas Foliculares (CFT), 75 Carcinomas Papilíferos Clássicos (CPVC), 18 Carcinomas Papilíferos Variante Folicular (CPVF), 1 Carcinoma Anaplásico e 11 tecidos normais para definir a expressão normal das ID na tireoide.

Para análise da expressão proteica foram analisadas um total de 113 amostras com média de idade de 45,2 ± 14,9 anos, sendo 86 amostras de tecido benigno (85 bócios e 1 AF) e 27 amostras de tecido maligno (17 CPVC, 4 CPVF e 6 CF).

Todos os pacientes cujas amostras utilizamos seguiram um protocolo-padrão do A C Camargo e possuem uma ficha na qual constam, além de dados de identificação, idade ao diagnóstico, sexo, etnia, dados clínicos pré-cirúrgicos, exposição a agentes ambientais, dieta, tabagismo, uso de medicamentos e drogas, exames realizados (ultrassom, pesquisa de corpo inteiro com iodo131,

(28)

biópsia aspirativa), dados referentes à cirurgia e exame anatomopatológico (medida do tumor, tipo histológico, grau de diferenciação e presença de linfonodos metastáticos).

As amostras foram submetidas a análise histológica por um patologista experimente no momento do diagnóstico, na avaliação de lesões tireoidianas, com o objetivo de avaliar o tecido de interesse. Somente amostras com pelo menos 70% de células neoplásicas foram incluídas no estudo. Foram dissecadas manualmente as áreas que continham tecido não neoplásico, fibrose ou tecido adiposo. As amostras de tecido normal foram obtidas de tecido contralateral a nódulos benignos solitários e de tamanho pequeno, para minimizar as possibilidades de alterações celulares/genéticas.

3.1.2. Seguimento

Os pacientes com câncer foram acompanhados com pesquisa periódica de corpo inteiro com 131I, TSH sérico e medidas de tireoglobulina (Tg) de acordo com o protocolo de seguimento habitual do serviço, baseado nos consensos internacionais (52). O tempo de seguimento dos pacientes foi de 12 a 87 meses. Pacientes com altos valores de tireoglobulina (>2mg/dL) e/ou pesquisas de corpo inteiro suspeitas foram submetidos a uma busca por meio de exames de imagens. Essa pesquisa também incluiu Raio-X, ultrassonografia, tomografia computadorizada e outros procedimentos para detectar metástase à distância, de acordo com cada caso.

Os tumores foram definidos como recorrentes e/ou apresentando metástases a longa distância a partir do encontro de lesões nos exames de imagem e da persistência de valores ascendentes de Tg. Foram considerados pacientes assintomáticos e livres de doença aqueles que apresentavam Tg indetectável ou <2mg/dL.

3.2 Análise de expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4

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Foi realizada a extração de RNA de tecido tireoidiano dos blocos de parafina do A C Camargo Cancer Center. As áreas de interesse foram marcadas por uma patologista (Dra. Icléia Siqueira Barreto) e foram retiradas com o uso do aparelho de Tissue Microarray. O RNA das amostras foi extraído utilizando o kit Recover AllÔ Total Nucleic Acid Isolation Kit FFPE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), seguindo protocolo do fabricante. Durante a extração as amostras passaram por etapas de desparafinização, digestão de proteínas, isolamento do ácido nucleico e purificação do ácido nucleico. O RNA extraído foi armazenado à -20ºC até sua utilização.

Os RNAs provenientes do A C Camargo Cancer Center já extraídos, foram extraídos de tecidos à fresco após tireoidectomia e análise das áreas a serem extraídas por patologistas do centro, por profissionais do Biobanco do A C Camargo, sob os cuidados do gerente Dr. Antônio Hugo José Fróes Marques Campos seguindo protocolo interno do laboratório.

3.2.2 Reação de transcrição reversa

As amostras de RNA provenientes do A C Camargo Câncer center e do RNA obtido das amostras parafinadas, foram primeiramente quantificadas por espectrofotometria PicodropÒ (Picodrop, Hinxton, Reino Unido). Após sua concentração ser analisada, as amostras foram diluídas para uma concentração de 20ng/µl.

A fita-molde de cDNA foi obtida através de uma reação de transcrição reversa utilizando-se o kit SuperScript First-Strand – Synthesis System for RT-PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), seguindo as orientações do fabricante. Para a reação, foram utilizados 4µl de Buffer RT 5X, 1µl de dNTP 25X (100mM), 0,25µl de Randon primers RT 3µg/µl, 1 µl de Reverse Transcriptase (RevertAid enzyme), 1µg do RNA (volume variável de RNA eluído em água) e água suficiente para que a reação apresentasse volume final de 20µl. As amostras foram amplificadas em termociclador (Applied Biosystems, Foster City, EUA) com ciclos de 25°C por 10’, 50°C por 30’, 80°C por 5’ e 4°C ¥. O cDNA obtido foi utilizado na reação do PCR em tempo real.

Toda metodologia foi realizada a partir de protocolos otimizados no Laboratório de Genética Molecular do Câncer (GEMOCA) na Faculdade de

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Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas- UNICAMP, Campinas, São Paulo, Brasil.

3.2.3 PCR quantitativo (qPCR) – Real Time PCR

As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems, Foster City, EUA) que é constituído por um par de oligonucleotídeos e uma sonda marcada com um fluoróforo. Todas as sondas utilizadas (tabela 1) são inventoriadas e possuem padrão de qualidade já testado e garantido pela Applied Biosystems. Desta maneira, a expressão gênica é calculada através da quantidade de fluorescência emitida em cada reação.

Tabela 1: Sondas utilizadas nas reações de quantificação de RNAm dos genes ID1,ID2, ID3, ID4 e GAPDH.

Gene Código de Identificação da sonda

na Applied Biosystems Gene ID1 Hs03676575_s1 Gene ID2 Hs04187239_m1 Gene ID3 Hs00954037_g1 Gene ID4 Hs02912975_g1 Gene GAPDH Hs03929097_g1

O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno da reação, o qual serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras.

Para quantificação relativa dos genes em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 10µl de TaqMan Gene

(31)

Expression PCR Master Mix 2x, 1µl da solução de oligonucleotídeo e sonda, 5µl de água e 4µl de cDNA. Utilizamos os seguintes ciclos: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, 45 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Os resultados da expressão de mRNA da ID1, ID2, ID3 e ID4 foram comparados tomando esta expressão como uma variável quantitativa (medida em Unidades Arbitrárias – UA).

3.3 Análise de expressão das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4

3.3.1 Tissue Microarray (TMA)

Foram montados blocos de TMA com os blocos de parafina cedidos pelo A C Camargo Cancer Center com as áreas de interesse (tecidos malignos e benignos) selecionadas pela patologista Dra. Icléia Siqueira Barreto, a partir dos blocos de parafina. Para cada caso foram retiradas áreas de 2mm de diâmetro da região de interesse, com o uso de uma “caneta extratora”. As amostras retiradas foram transferidas em duplicata para outros blocos de parafina receptores. Em cada bloco foi colocada também uma amostra de tecido de placenta para ser o controle positivo da reação. Após a montagem dos blocos, foram cortadas lâminas e realizado hematoxilina-eosina (HE) para análise da qualidade.

Os TMAs prontos provenientes do A C Camargo Cancer Center foram fixados em formalina assim que as peças cirúrgicas foram retiradas e incluídos em parafina, para que lâminas de seção fossem cortadas e o diagnóstico confirmado. Um patologista analisou cada uma das lâminas de seção e, selecionou a área mais representativa de cada um dos tecidos que tiveram esta área marcada. As lâminas de TMA foram construídas, sempre em duplicata ou triplicata (quando possível), por um técnico no Departamento de Anatomia Patológica do A C Camargo Cancer Center, utilizando o equipamento Manual Tissue Arrayer (Beecher Instruments Microarray Technology, Silver Spring, CA, USA). Uma vez montadas, elas receberam um banho de parafina e foram colocadas em estufa à 110ºC durante uma hora para fixação das secções nas

(32)

lâminas. Passado esse tempo, foram armazenadas em freezer – 20ºC até o momento do uso.

3.3.2 Imunoistoquímica

A técnica de imunoistoquímica foi realizada no Laboratório de Investigação em Patologia (LIP), Faculdade de Ciências Médicas (FCM), UNICAMP.

As lâminas de TMA passaram pelo processo inicial de desparafinização em xilol quente (100ºC) em estufa e por baterias de álcool 100%, 70% e 50%. Para bloquear a atividade da peroxidase endógena, as lâminas foram lavadas com água oxigenada 10 volumes, 6 vezes durante 2 minutos, seguida de lavagem em água corrente. Foram então colocadas em uma panela de vapor T-fallR (Franca) com a solução de citrato por 40 minutos, para recuperação antigênica. Após esta etapa, as lâminas foram mergulhadas em leite Molicoâ 3% por 30 min para que fossem bloqueadas reações inespecíficas. Os cortes foram então colocados em tampão PBS 1x com Tween para solubilização das amostras e possibilitar uma maior penetrância do anticorpo. Foram aplicados anticorpos primários específicos das proteínas ID1, ID2, ID3 e ID4 inventariados e com padrão de qualidade garantidos pela ABCAMÒ (Cambridge, MA, EUA), diluídos em DAB (3-3 ́-diaminobenzidine tetrahydrochloride, SIGMA, St. Louis – USA, código D5637) segundo análise de lâminas de imunoistoquímica de tecido controle (fígado) pela patologista Dra. Icléia Siqueira Barreto (tabela 2).

(33)

Tabela 2: Anticorpos utilizados nas reações de imunoistoquímica das proteínas ID1,

ID2, ID3 e ID4, e suas diluições.

Anticorpo Código de Identificação do anticorpo Diluição Anti-Id1 antibody [EPR7098] (monoclonal) ab134163 1/2000 Anti-Id2 antibody [4E12G5] (monoclonal) ab166708 1/200 Anti-Id3 antibody [10C3] (monoclonal) ab90055 1/300 Anti-Id4 antibody (policlonal) ab49261 1/50

Após a aplicação dos anticorpos, a lâminas ficaram 30 minutos na estufa à 37ºC e deixadas overnight em geladeira à 4ºC. As lâminas foram lavadas com PBS 1x, e o anticorpo secundário Advance (Dako-Agilent, Santa Clara, CA, EUA) e o revelador DAB+ (Dako-Agilent, Santa Clara, CA, EUA) para finalizar a reação. As lâminas foram coradas com hematoxilina de Harris, lavadas em água corrente e passadas rapidamente em amônia para que a coloração pela hematoxilina seja realçada. Para finalizar, os cortes passaram 3 vezes por álcool absoluto e 3 vezes por xilol.

Para análise dos resultados de imunoistoquímica serão considerados positivos: 1 (1/100 das células positivas); 2 (1/10 das células positivas); 3 (1/3 das células positivas coradas); 4 (2/3 das células positivas) e 5 (todas as células positivas coradas). A intensidade da coloração será graduada em categorias: negativa (0) e positiva: fraca (1), moderada (2) e forte (3) (figura 3). A partir da classificação da positividade e da intensidade de coloração das lâminas, foi feito um Score que é a soma desses dois critérios.

(34)

Figura 3: Análise de Score de positividade e intensidade segundo o método de Allred

(53).

3.4 Análise Estatística

A análise estatística foi realizada através do Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Ò software, versão 13.0. Foi realizada análise exploratória de dados através de medidas resumo (média, desvio padrão, mínimo, mediana, frequência e porcentagem). Os grupos foram comparados através do teste exato de Fischer, Qui-Quadrado (c2) ou Mann-Whitney. A correlação entre as proteínas e tamanho do tumor foi avaliada através do coeficiente de Spearman. Para mostrarmos os pontos de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos (VPP), valores preditivos negativos (VPN) e acurácia, utilizamos a curva ROC (Receiver operating characteristic), realizada através do software BioestatÒ, versão 5.3. O nível de significância adotado para todos os testes foi de 5% (p<0,05).

(35)

4 RESULTADOS

Foi feita uma primeira análise considerando todos os indivíduos analisados. O grupo de 99 pacientes com nódulos malignos não diferiu do grupo de 84 indivíduos com nódulos benignos em relação a sexo (79 mulheres e 19 homens vs 63 mulheres e 17 homens, respectivamente, p=0.7583) e etnia (45 brancos e 2 não brancos vs 62 brancos e 4 não brancos, respectivamente, p=1,0000).

Foi observada uma diferença de idade entre esses grupos, tendo o grupo de indivíduos com nódulos benignos, como esperado, uma média de idade maior que o grupo de indivíduos com nódulos malignos (49.1 ± 13.6 anos vs 42,0 ± 15.1 anos, respectivamente, Mann-Whitney, p=0.0002). O fator idade foi corrigido nas análises estatísticas em que poderia ser um fator confundidor.

Foi observada uma menor expressão de IDs no único carcinoma anaplásico analisado, ID1=0,01 UA, ID2=0,263 UA, ID3=0,026 UA e ID4=0,003 UA. Infelizmente, não foi possível obter outros carcinomas anaplásicos.

Não foi encontrada diferença estatística entre as amostras de tumores malignos e benignos quanto à multinodularidade, presença de cápsula ou de tireoidite linfocítica crônica concomitante (tabela 3).

(36)

Tabela 3: Características clínicas de pacientes comparando os grupos com nódulos benignos e malignos.

Características Clínico

Patológicas Benigno (N) Maligno (N) Total (N) p

Idade ao diagnóstico 49.1 ± 13.6 (82) 42.0 ± 15.1 (100) 45.2 ± 14.9 (182) 0.0002 Tamanho do Tumor 2.5 ± 2.1 (63) 2.2 ± 1.9 (99) 2.3 ± 2.0 (162) 0.4086 Sexo Feminino Masculino 78.8% (63) 21.3% (17) 80.6% (79) 19.4% (19) 79.8% (142) 20.2% (36) 0.7583 Etnia Branca Não Branca 93.9% (62) 6.1% (4) 80.06% (79) 19.4% (19) 79.8% (142) 20.2% (36) 1.000 Tumor Multinodular Não Sim 40.6% (28) 59.4% (41) 52.5% (52) 47.5% (47) 47.6% (80) 52.4% (88) 0.1272 Multifocalidade Não Sim 74.6% (50) 25.4% (17) 56.4% (44) 43.6% (34) 64.8% (94) 35.2% (51) 0.0220 Tumor encapsulado Não Sim 91.2% (52) 8.8% (5) 86.1% (62) 13.9% (10) 88.4% (114) 11.6% (15) 0.3679 Tireoidite Linfocítica Crônica

Ausente Presente 71.0% (44) 29.0% (18) 64.9% (50) 35.1% (27) 67.6% (94) 32.4% (45) 0.4499

(37)

Todos os pacientes tiveram uma boa evolução estando livre de doença até o momento da pesquisa, não apresentando recorrência ou metástase à distância durante observação por 12 a 87 meses.

4.1 Análise da expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4

A expressão gênica das ID1, ID2, ID3 e ID4 foi detectada em todas as amostras analisadas. Utilizando os valores de expressão, dividimos os nódulos em dois grupos utilizando com o seguinte critério: amostras que apresentaram valores de expressão menores do que o valor de expressão em tecido normal (valores menores que 1 UA) foram classificados como hipoexpressos. Valores acima deste limite, foram classificados como hiperexpressos.

Não foram realizadas comparações entre tipos histológicos (CPVC vs CPVF, CPVF vs Bócio, CPVC vs AF, etc..) devido ao baixo número de casos das variantes CPVF, CFT e AF, não suficientes para realizar a análise estatística.

4.1.1 ID1

Em uma análise geral dos nódulos (benignos + malignos), ID1 se encontrou hipoexpressa em 88,2% dos nódulos analisados (figura 4A). Em uma comparação entre nódulos benignos e malignos, a expressão de ID1 não diferenciou os nódulos (p=0.5740, figura 4B).

(38)

A

B

Figura 4: A: expressão gênica da ID1 nas amostras de tecidos tumorais tireoidianos

analisadas. B: comparação entre o número de amostras que apresentaram hiperexpressão e hipoexpressão em nódulos benignos e malignos.

Os valores de expressão da ID1 foram similares em tumores malignos (média 0,5 ± 0,9 UA) e benignos (média 0,3 ± 0,4 AU; Mann-Whitney, p=0,2780), como demonstrado na figura 5. Foi construída uma curva ROC para avaliar a

(39)

acurácia da expressão da ID1 na identificação de malignidade (figura 6). ID1 não foi um bom parâmetro para diferenciar nódulos tireoidianos malignos de benignos, apresentando uma acurácia de 59,2%, sensibilidade de 46,5 %, especificidade de 74,7%, valor preditivo positivo (VPP) de 69,71% e 52,72% de valor preditivo negativo (VPN) e valor de corte de 0,210.

Figura 5: Expressão gênica da ID1 em nódulos benignos e malignos da tireoide

(40)

Figura 6: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da

expressão gênica da ID1 na identificação de nódulos malignos de benignos.

Quando analisadas características clínico patológicas, ID1 se associou com ausência de metástase ao diagnóstico, estando mais expressa em indivíduos que não apresentaram metástase quando comparado com indivíduos que apresentaram (0,70 ± 1,11 vs 0,30 ± 0,62 UA, respectivamente, Mann-Whitney, p=0,0012). Sua expressão também se relacionou com ausência de invasão extra tireoidiana, estando mais expressa em indivíduos que não apresentavam invasão do que nos que possuíram (0,62 ± 1,04 vs 0,29 ± 0,54 UA, respectivamente, Mann-Whitney, p=0,0027). A expressão de ID1 não se relacionou com a presença de tireoidite linfocítica crônica concomitante (tabela 4).

Relacionando características clinico patológicas com hipo e hiperexpressão da ID1, este gene se encontra hiperexpresso em 48% dos indivíduos que não apresentaram metástase ao diagnóstico, diferenciando

(41)

significantemente estes indivíduos dos que não apresentaram metástase (tabela 5).

Tabela 4: Características clínico patológicas dos indivíduos analisados de acordo com

a expressão da ID1. Características Clínico Patológicas (N) ID1 p Metástase ao Diagnóstico (97) Ausente Presente 0.70 ± 1.11 0.30 ± 0.62 0.0012 Tireoidite Linfocítica Crônica concomitante (77) Ausente Presente 0.60 ± 0.87 0.39 ± 0.63 0.0507 Invasão (98) Ausente Presente 0.62 ± 1.04 0.29 ± 0.54 0.0027

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Tabela 5: Características clinicas de pacientes com hipoexpressão e hiperexpressão dos genes ID1, ID2, ID3 e ID4.

Cacterísticas Clinico Patológicas

ID1 % (N) p ID2 % (N) p ID3 % (N) p ID4 % (N) p

Hipo Hiper Hipo Hiper Hipo Hiper HIpo HIper

Metástase ao Diagnóstico (97) Ausente Presente 80.85 (38) 19.15 (9) 96.0 (48) 4.0 (2) 0.0187 80.43 (37) 19.57 (9) 88.0 (44) 12.0 (6) 0.3078 91.49 (43) 8.51 (4) 100 (49) 0.0 (0) 0.0537 95.65 (44) 4.35 (2) 100 (50) 0.0 (0) - Tireoidite Linfocítica Crônica (77) Ausente Presente 84.0 (42) 16.0 (8) 88.89 (24) 11.11 (3) 0.7376 80.0 (40) 20.0 (10) 88.46(40) 11.54 (3) 0.5235 94.0 (47) 6.0 (3) 100 (27) 0.0 (0) 0.5478 96.0 (48) 4.0 (2) 100 (26) 0.0 (0) - Invasão Extratireoidiana (98) Ausente Presente 84.38 (54) 15.63 (10) 94.12 (32) 5.88 (2) 0.2075 79.37(50) 20.63(13) 94.12(32) 5.88(2) 0.0552 93.75(60) 6.25(4) 100 (33) 0.0 (0) 0.2960 96.83 (61) 3.17 (2) 100 (34) 0.0 (0) -

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4.1.2 ID2

Uma hipoexpresssão dominante de ID2 foi observada em 60,9% das amostras analisadas (figura 7A). Comparando os grupos com nódulos benignos vs malignos, ID2 se encontrava hiperexpressa em 67,1% dos tecidos benignos e em 15,2% dos tecidos malignos, diferenciando-os com significância (c2, p<0,0001, figura 7B).

A

B

(44)

Expressão da ID2 esteve mais presente em tecidos benignos, sendo capaz de diferencia-los com sucesso dos nódulos malignos (média 2,0 ± 1,9 UA vs média 0,7 ± 0,9 UA; Mann-Whitney, p<0,0001, como demonstrado na figura 8.

A análise da curva ROC da ID2 confirma a diferenciação de nódulos benignos de malignos com uma acurácia de 80,92%, sensibilidade de 84,70%, especificidade de 76%, 82,15% de VPP e 79,21% de VPN para um valor de corte de 0,939 (figura 9).

(45)

Figura 9: Curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da

expressão gênica da ID2 na identificação de nódulos benignos de malignos. A expressão gênica de ID2 não se associou a nenhuma das características clínico patológicas analisadas (tabela 6).

a expressão da ID2. Características Clínico Patológicas (N) ID2 p Metástase ao Diagnóstico (96) Ausente Presente 0.83 ± 1.21 0.57 ± 0.43 0.4499 Tireoidite Linfocítica Crônica (76) Ausente Presente 0.67 ± 0.61 0.82 ± 1.49 0.8011 Invasão (97) Ausente Presente 0.79 ± 1.07 0.51 ± 0.35 0.2026

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4.1.3 ID3

Com relação à expressão da ID3, foi observado que esta possui uma hipoexpressão predominante (60,9%, figura 10A). Comparando a expressão de ID3 entre os grupos benignos e malignos, ID3 se encontrou hiperexpressa em 16,9% dos indivíduos com nódulos benignos em comparação a 4% dos nódulos malignos (c2, p=0,0036, figura 10B).

A

B

(47)

Como demonstrado na figura 11, os valores de expressão da ID3 foram maiores em nódulos benignos do que em nódulos malignos distinguindo-os com significância (média 0,6 ± 0,6 vs 0,3 ± 0,3 UA, Mann-Whitney, p<0,0001). Analisando a curva ROC, construída para avaliar a acurácia da expressão da ID3 na identificação de malignidade, observamos que ID3 foi capaz de diferenciar nódulos malignos de benignos com uma acurácia de 65,35%, sensibilidade de 83,70%, especificidade de 43,20%, VPP de 64,02% e VPN de 68,70% e valor de corte de 0,454 (figura 12).

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Figura 12: curva ROC apresentando os pontos de sensibilidade e especificidade da

expressão gênica da ID3 na identificação de nódulos benignos de malignos.

Comparando a expressão da ID3 com características clínico patológicas, observamos correlação com a ausência de fatores de agressividade como: ausência de metástase ao diagnóstico (Mann-Whitney, p<0,0001), ausência de tireoidite linfocítica crônica concomitante (Mann-Whitney, p=0,0431) e ausência de invasão extra tireoidiana (Mann-Whitney, p<0,0001), demonstrado na tabela 7.

(49)

a expressão do ID3. Características Clínico Patológicas (N) ID3 p Metástase ao Diagnóstico (96) Ausente Presente 0.41 ± 0.36 0.17 ± 0.19 <0.0001 Tireoidite Linfocítica Crônica (77) Ausente Presente 0.38 ± 0.33 0.26 ± 0.20 0.0431 Invasão (97) Ausente Presente 0.37 ± 0.33 0.13 ± 0.17 <0.0001

ID3 apresentou também uma relação negativa ao tamanho de tumor, -0,27777 (Correlação de Spearman, p=0,0056), indicando que quanto maior o tumor, menos expressão gênica de ID3 há (figura 13).

Figura 13: Correlação entre tamanho do tumor e expressão dos genes ID1, ID2, ID3 e

ID4, onde a expressão de ID3 e ID4 se relacionam negativamente com tamanho do tumor, quanto maior o tumor, menor seus valores de expressão (p=0,0056 e p=0,0217, respectivamente)

(50)

4.1.4 ID4

Assim como ID3, ID4 possui uma hipoexpressão predominante (92,9%, figura 14A), sendo o gene menos expresso dentre os estudados. Comparando sua expressão entre os grupos benigno e maligno, encontramos uma hiperexpressão deste gene em 12,9% dos indivíduos benignos e 2% dos indivíduos malignos (c2, p=0,0039, figura 14B).

A

B

(51)

Os valores de expressão do gene ID4 foram maiores em nódulos benignos do que em malignos, sendo capaz de diferenciá-los (0,7 ± 1,0 vs 0,2 ± 0,3, respectivamente, Mann-Whitney, p<0,0001, figura 15)

Em sua curva ROC, podemos observar que ID4 foi capaz de diferenciar nódulos malignos de benignos com uma acurácia de 75,17%, sensibilidade de 77,60%, especificidade de 72%, VPP de 78,33% e VPN de 71,14% (figura 16).

(52)

expressão gênica da ID4 na identificação de nódulos benignos de malignos.

A expressão da ID4 se relacionou negativamente com fatores de agressividade como ausência de metástase a distância (Mann-Whitney, p=0,0070) e ausência de invasão extra tireoidiana (Mann-Whitney, p<0,0001), como demonstrado na tabela 8. A expressão de ID4 também se relacionou negativamente com tamanho do tumor, -0,23165 (p=0,0217) (figura 13).

(53)

a expressão da ID4. Características Clínico Patológicas (N) ID4 p Metástase ao Diagnóstico (96) Ausente Presente 0.29 ± 0.30 0.17 ± 0.19 0.0070 Tireoidite Linfocítica Crônica (76) Ausente Presente 0.30 ± 0.29 0.23 ± 0.22 0.0752 Invasão (97) Ausente Presente 0.30 ± 0.29 0.10 ± 0.09 <0.0001

4.2 Análise da expressão das proteínas ID1 e ID3 pela técnica de imunoistoquímica

Apesar de termos realizado a técnica de imunoistoquímica em todas as proteínas pesquisadas (ID1, ID2, ID3 e ID4), não conseguimos resultados satisfatórios para a realização da estatística das proteínas ID2 e ID4 devido ao mau funcionamento dos anticorpos e à fraca reação obtida na imunoistoquímica, por isso somente analisamos e consideramos os resultados das proteínas ID1 e ID3.

Foram analisados 113 amostras, 86 nódulos benignos (Bócio) e 27 nódulos malignos (17 CPVC, 4 CPVF, 6 CF). 29,3% dos indivíduos com nódulos benignos, portadores de tireoidite linfocítica crônica expressaram mais proteínas, enquanto que somente 3,7% dos indivíduos com nódulos malignos portadores de tireoidite as expressaram (c2, p=0,0061).

Os indivíduos analisados não distinguiram significantemente quanto à idade, sexo e etnia (tabela 9). Não foi realizada análise comparativa entre tipos histológicos devido ao baixo número de casos de CPVF, CFT e AF.

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Tabela 9: Características clínicas analisadas de pacientes comparando os grupos com

nódulos benignos e malignos na imunoistoquímica.

Características Clínico Patológicas

Benigno (N) Maligno (N) Total (N) p

Idade ao diagnóstico 50.3 ± 15.6 (81) 46.0 ± 17.7 (27) 49.4 ± 16.1 (108) 0.2838 Tamanho do Tumor 0.7 ± 0.7 (55) 1.3 ± 0.8 (26) 0.9 ± 0.8 (81) 0.0033 Sexo Feminino Masculino 87.8% (72) 12.2% (10) 77.8% (21) 22.2% (6) 85.3% (93) 14.7% (16) 0.2187 Etnia Branca Não Branca 89.6% (69) 810.4% (8) 76.0% (19) 24.0% (6) 86.3% (88) 13.7% (14) 0.0858 Tireoidite Linfocítica Crônica Ausente Presente 70.7% (58) 29.3% (24) 96.3% (26) 3.7% (1) 77.1% (94) 22.9% (25) 0.0061

A expressão proteica da ID1 e ID3 foi observada tanto no núcleo quanto no citoplasma das células e por isso, dividimos nossa análise em citoplasmática e nuclear.

4.2.1 Expressão proteica de ID1

Foi encontrada a expressão proteica de ID1 tanto no núcleo quanto no citoplasma, tanto das células benignas quanto nas malignas (figura 17). Houve uma maior expressão de ID1 no núcleo das células benignas do que das malignas (4,6 ± 1,8 vs 0,7 ± 1,6 UA, respectivamente, Mann-Whtiney, p<0,0001) (figura 18, 19). Não houve diferença significativa da expressão proteica de ID1 em nódulos benignos e malignos no citoplamasma (4,4 ± 1,8 vs 5,3 ± 1,5 UA, Mann-Whitney, p=0,1637) (figura 20).

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A

B

Figura 17: A: Expressão proteica de ID1 em Bócio tanto no núcleo quanto no

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Figura 18: Diferença de expressão da proteína ID1 no núcleo e citoplasma de nódulos

benignos e malignos.

Figura 19: Expressão proteica nuclear da ID1 em nódulos benignos e malignos

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Figura 20: Expressão proteica citoplasmática da ID1 em nódulos benignos e malignos

(p=0.1637).

Foi feita a curva ROC para análise da expressão proteica de ID1 tanto no núcleo quanto no citoplasma. No núcleo, pudemos diferenciar a expressão em nódulos benignos e malignos com 90,13% de acurácia, 89,5% de sensibilidade, 90,30% de especificidade, 70,91 % de VPP e 97,02% de VPN (figura 21).

A curva ROC da expressão proteica de ID1 no citoplasma diferencia nódulos benignos de malignos com uma acurácia de 39,13%, sensibilidade de 80%, especificidade de 27,8%, VPP de 23,49%, VPN de 83,38% (figura 22).

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expressão proteica nuclear da ID1 na identificação de nódulos benignos de malignos.

expressão da proteína ID1 no citoplasma, na identificação de nódulos benignos de malignos.

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A expressão proteica de ID1 não se associou com nenhuma das características clínicas analisadas (tabela 10).

Tabela 10: Características histopatológicas dos indivíduos analisados de acordo com a

expressão da proteína ID1 no núcleo e citoplasma das células.

Características Clínico Patológicas (N)

ID1 Núcleo p ID1

Citoplasma p Tireoidite Linfocítica Crônica (72) Ausente Presente 4.76 ± 1.60 4.18 ± 2.15 0.6363 4.44 ± 1.63 4.05 ± 2.17 0.7244 Tamanho do tumor (48) < 2cm 2-4cm > 4cm 4.86 ± 1.42 4.63 ± 1.57 4.38 ± 2.88 0.7331 4.57 ± 1.57 4.79 ± 1.27 3.88 ± 2.53 0.5903

4.2.2 Expressão proteica de ID3

Encontramos a expressão proteica de ID3 tanto no núcleo quanto no citoplasma das células benignas e malignas (figura 23).

Encontramos uma maior expressão proteica nuclear significativa de ID3 em células benignas do que malignas (5,2 ± 0,9 vs 3,0 ± 1,8 UA, Mann-Whitney, p<0,0001) (figura 24, 25).

Ao contrário, com relação à expressão citoplasmática desta proteína, encontramos maior expressão em células malignas do que benignas (5,7 ± 1,5 vs 4,0 ± 1,4 UA, Mann-Whitney, p<0,0001) (figura 26).

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A

B

Figura 23: A: Expressão proteica de ID3 predominantemente nuclear em bócio. B;

Expressão proteica de ID3 predominantemente citoplasmática em CFT e CPT.

Figura 24: Diferença de expressão da proteína ID3 no núcleo e citoplasma de nódulos