Analise comparativa das caracteristicas microscopicas da lesão liquenoide na GVHD cronica e no liquen plano de boca

CRISTINA CUNHA VILLAR

ANÁLISE COMPARATIVA DAS

CA~CTERÍSTIÇAS

MICROSCÓPIÇAS qA

LESAO

LIQ~ENOIDE

NA GVHD CRONICA E

NO LIQUEN PLANO DE BOCA.

I

Dissertação apresentada

à

Faculdade

de Odontologia de Piracicaba, da

Universidade Estadual de Campinas,

para obtenção do título de Mestre em

Estomatopatologia, com concentração

em Estomatologia.

CRISTINA CUNHA VILLAR

ANÁLISE COMPARATIVA DAS

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DA

LESÃO LIQUENÓIDE NA GVHD CRÔNICA E

NO LÍQUEN PLANO DE BOCA.

Este exemplar foi devidamente corrigido,

de acordo com a Resolução CCPG-036/83

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Dissertação apresentada

à

Faculdade de

Odontologia de Piracicaba, da Universidade

Estadual de Campinas, para obtenção do

título de Mestre em Estomatopatologia, com

concentração em Estomatologia.

Orientadora: Prof. Ora. Maria Letícia Cintra

Co-orientador: Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Heron Fernando de Sousa Gonzaga

Prof. Dr. Mareio Ajudarte Lopes

Prof. Ora. Maria Letícia Cintra

PIRACICABA

2001

- -

---V712a

Ficha Catalográfica

I

Villar, Cristina Cunha.

I

Análise comparativa das características 'microscópicas da lesão liquenóide na GVHD crônica e no líquen plano de boca. I Cristina Cunha Villar. --Piracicaba, SP: [s.n.], 2001.

XX, 97p. : il.

Orientadores : Prof" Dr' Maria Letícia Cintra, Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, F acuidade de Odontologia de Piracicaba.

I. hnunohistoquimica. 2. Mastócitos. 3. Macrófagos. 4. Medula óssea - Transplante. I. Cintra, Maria Letícia. H. Almeida, Oslei Paes de. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.

Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marilene Girello CRB/8-6159, da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP.

UNICAMP

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de MESTRADO, em sessão pública realizada em 12 de Março de 2001, considerou a candidata CRISTINA CUNHA VILLAR aprovada.

l. Profa. Dra. MARIA LETICIA CINTRA

GONZAGA·---~~-·--~---fi~~~~~~·--,

DEDICATORIA

Aos meus pais, Isabel e José Francisco, pelo imenso amor, incentivo e compreensão, e por uma vida toda de dedicação, agradeço a vocês por tudo que sou e tenho conquistado.

À

minha avó Maria Antonio, exemplo de vida e força, que muito me incentivou, orou e torceu pelos meus objetivos.

Aos meus irmãos Luciano e Luís Fernando, que enchem meu coração de amor e orgulho, e que tanto torcem por mim.

AGRADECIMENTOS

À

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, pela

concessão do auxílio financeiro que viabilizou a execução deste trabalho.

À

Prof. Dra. Maria Letícia Cintra, pela orientação científica, por sua

serenidade e atenção.

Ao Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida, pela orientação científica e dedicação

constante à Patologia, pela confiança em mim depositada e oportunidade de

realizar este trabalho.

Ao Prof. Dr. Antonio Fernando Martorelli de Lima, pela orientação em minha

Iniciação Científica, que foi o primeiro passo deste caminho.

Ao Prof. Dr. Antonio Bento Alves de Moraes, por sua atenção e torcida por

meus objetivos.

À

Prof. Maria Elvira Pizzigatti Corrêa, por compartilhar sua experiência e pelo

grande estímulo prestado durante o desenvolvimento deste trabalho.

Aos professores da Área de Patologia e Semiologia da Faculdade de

Odontologia de Piracicaba/UNICAMP, Bozzo, Edgard, Hipólito, Jacks, Mareio,

Pablo e Ricardo, pela orientação e amizade.

Aos funcionários da Área de Patologia, pelo convívio e auxílio. Em especial à

Ana Cristina do Amaral Godoy, pela colaboração fundamental na parte

experimental deste trabalho.

Aos professores e funcionários do Departamento de Anatomia Patológica do

HC-FCM/UNICAMP,

pela colaboração e

utilização dos recursos do

Departamento.

Aos médicos e à equipe de enfermagem do TMO, pelo carinho e dedicação aos

pacientes.

Aos médicos e funcionários do HEMOCENTRO/UNICAMP, pelo convívio e

oportunidade de aprendizado.

Aos colegas de estágio do HEMOCENTRO /UNICAMP, especialmente ao André

Leonardo de La Corte, Fabio Biasin e Humberto Rennó, pelo companheirismo.

Aos colegas pós-graduandos do Departamento de Diagnóstico Oral, Ana Lúcia,

Ana Paola, Cíntia, Cláudio, Danyel, Eduardo, Karina, Fábio Alves, Fábio Pires,

Halbert, Hercílio, Paulo Bonan e Rogério, com quem convivi durante estes

últimos anos. Em especial ao Cleverton Roberto de Andrade e Paulo Rogério de

Faria, pela amizade e ajuda prestada durante a elaboração do trabalho, Addah

Regina da Silva Freire e Renata Helena Bueno, pela amizade sincera.

Aos amigos de graduação Fábio Pacheco, Flávia Martão Flório, Henrique e Rui Barbosa de Brito Junior, pela amizade e constante presença.

À Isabella Gomes e Márcia Casanova, pela amizade e convivência em Piracicaba.

Aos amigos da Periodontia, Adhemar Mendes Duro Junior, Daniela Bazan Palioto e Julio Cesar Joly, pelos constantes conselhos e incentivo.

Às amigas Hannah Carmem Carlos Ribeiro Silva, Luciane Torrecilas Sarraf e Melissa Feres Damian, por todo carinho e amizade.

À am1ga de infância Carolina Drummond Corrêa, pelo constante incentivo e apoio.

À grande amiga Fabiano Mantovani Gomes, que sempre esteve ao meu lado, desde a graduação e cuja amizade tem valor inestimável.

Aos meus padrinhos Maria José e Francisco Cunha, pelo imenso carinho compartilhado.

Aos primos Laura, Toninho, Fábio, Flávia e Fernando Robles, pela constante ajuda e amizade.

Ao meu namorado, Gustavo Piras de Oliveira, o meu sincero agradecimento por

seu infinito carinho e companheirismo, apoio e incentivo, que são muito

importantes para mim.

E a todos aqueles que não foram citados, mas contribuíram de alguma forma na

realização deste trabalho.

Não basta abrir a janela

para ver os campos e o rio.

Não é bastante não ser cego

para ver as árvores e as flores.

É

preciso também não ter filosofia

nenhuma.

Com filosofia não há árvores: há idéias

apenas.

Há só cada um de nós, como uma cave.

Há só uma janela fechada, e todo o mundo

lá fora;

e um sonho do que se poderia ver se a

janela se abrisse ...

SUMÁRIO LISTA DE TABELAS ... 1 LISTA DE FIGURAS ... 3 LISTA DE ABREVIATURAS ... 5 RESUMO ... ? ABSTRACT ... 9 1.1NTRODUÇÃ0 ... 11 2. REVISÃO DA LITERATURA ... 13 2.1. Líquen Plano ... 13 2.2. Reação Liquenóide ... 23

2.3. Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro ... 24

3. PROPOSIÇÃ0 ... 31 3.1. Justificativa ... 31 3.2. Objetivos ... 31 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 33 5. RESULTADOS ... 47 6. DISCUSSÃ0 ... 73 7. CONCLUSÃ0 ... 87 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 89

i

Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca. LISTA DE TABELAS TABELA 1- TABELA2- TABELA3- TABELA4- TABELAS- TABELA6-TABELA 7- TABELAS- TABELA9-TABELA 10-TABELA 11- TABELA12-TABELA

13-Classificação do acometimento da mucosa oral na GVHDc segundo HORN TD, 1995 ... 28 Dados clinicas de 40 pacientes com líquen plano bucal e 31 com GVHDc de boca. O tempo corresponde ao número de dias desde o TMO até a realização da biópsia ... 36 Anticorpos primários e suas especificidades, diluições e fontes ... .44 Freqüência das alterações epiteliais e do tipo de ceratinização observada no LP (n=40) e na GVHDc (n=31 ) ... 51 Média e desvio padrão da área epitelial, espessuras do epitélio e perimetros epiteliais externo e interno, no LP (n=40) e na GVHDc (n=31 ). Os valores lineares foram expressos em ;tm e o de área em ;tm2. Cada valor da espessura epitelial foi

obtido a partir de 25 regiões medidas por lâmina, os valores de perimetro e área foram obtidos a partir de 5 medidas por lâmina. A espessura epitelial média foi calculada a partir dos valores da espessura epitelial maior e menor ... 51 Freqüência e intensidade das projeções em dentes de serra no LP (n=40) e na GVHDc (n=31 ). , ... 52 Freqüência de alterações na interface epitélio-conjuntivo e no tecido conjuntivo do LP (n=40) e da GVHDc (n=31) ... 52 Análise semi-quantitativa das alterações da camada basal no LP (n=40) e na GVHDc (n=31) ... , ... 53 Análise semi-quantitativa das células inflamatórias e da distribuição do infiltrado inflamatório subepitelial no LP (n=40) e na GVHDc (n=31 } ... 54 Média e desvio padrão da área e espessuras do infiltrado inflamatório, no LP (n=40) e na GVHDc (n=31). Os valores lineares foram expressos em ;tm e o de área em ;tm2. Cada valor do infiltrado inflamatório foi obtido a partir de 25 regiões

por lâmina, os valores de área foram obtidos a partir de 5 medidas por lâmina. A espessura média do infiltrado foi calculada a partir dos valores da espessura maior e menor do infiltrado ... 55 Número de mastócitos no LP (n=40) e na GVHDc (n=31) de mucosa bucal. Os dados expressam as médias das contagens em 5 campos de 0,0049 mm2, no

epitélio, infiltrado inflamatório subepitelial e tecido conjuntivo profundo, num aumento de 1000x ... 61 Número de células CD68 positivas encontradas no LP (n=40), na GVHDc (n=31) e no controle (n=8). Os dados expressam as médias das contagens em 5 campos de 0,032 mm2, no compartimento epitelial e no infiltrado inflamatório subepitelial, num

aumento de 400x ... 65 Número de células de Langerhans positivas para S100, no compartimento epitelial do LP (n=40), da GVHDc (n=31) e do controle 1n=8). Os dados expressam as médias das contagens em 5 campos de 0,032 mm , num aumento de 400x ... 68

Análise comparativa das caracteristicas microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1A- Traçado da espessura epitelial maior (a), espessura epitelial menor (b), espessura menor do infiltrado (c) e espessura maior do infiltrado (d) (H&E, objetiva de 10x)40 FIGURA 1B- Traçados do perímetros das superfícies externa (e) e interna (f) do epitélio (H&E,

objetiva de 1 OOx) ... .40 FIGURA 2- Traçados da área epitelial (g) e da área do infiltrado inflamatório (h) (H&E, 1 00x)40 FIGURA 3- Corte de mucosa bucal com sinais morfológicos de LP. Infiltrado inflamatório intenso, disposto em banda subepitelial, com exocitose leve e discreta vacuolização da camada basal do epitélio (H&E- objetiva de 6.3x) ... 56 FIGURA 4- Corte de mucosa com sinais morfológicos da GVHDc. Observa-se a vacuolização

dos ceratinócitos, desorganização da camada basal, corpos de Civatte, exocitose e infiltrado linfocitário leve difuso (H&E- objetiva de 6.3x) ... 56 FIGURA 5- Corte de mucosa de boca com LP, nota-se a hiperortoceratose (H&E- objetiva de

40x) ... 57 FIGURA 6- Corte de mucosa labial com sinais morfológicos da GVHDc. Clivagem entre o

epitélio e o tecido conjuntivo subjacente, nota-se o infiltrado inflamatório moderado (H&E- objetiva de 6.3x) ... 57 FIGURA 7- Corte de mucosa de boca com LP. Nota-se hiperortoceratose e espessamento da

ZMB, visualizado como deposição de material hialino, e o infiltrado inflamatório denso subepitelial (H&E- objetiva de 16x) ... 58 FIGURA 8- FIGURA 8 - Presença de incontinência pigmentar no infiltrado inflamatório do LP

(H&E- objetiva de 40x) ... ., ... 58 FIGURA 9- Aspecto histopatológico do LP, vacuolização dos ceratinócitos basais, discreta

desorganização da camada basal do epitélio pavimentoso estratificado, e infiltrado inflamatório moderado, em banda subepitelial, predominantemente linfocitário (H&E- objetiva de 16x) ... , ... 59 FIGURA 10- Alterações histopatológicas na GVHDc, vacuolização e necrose de ceratinócitos, desorganização da camada basal, com perda do limite entre o epitélio e o tecido conjuntivo, e infiltrado inflamatório subepitelial difuso (H&E- objetiva de 16x) ... 59 FIGURA 11 - Mastócito metacromático no infiltrado inflamatório do LP. Nota-se grânulos

citoplasmáticos esparsos (Azul de Toluidina- objetiva de 100x) ... 62 FIGURA 12- Mastócito no infiltrado inflamatório difuso da GVHDc. Observa-se grânulos

metacromaticos de coloração pálida (Azul de Toluidina-objetiva de 100x) ... 62 FIGURA 13- Mastócito no tecido conjuntivo profundo do LP. A metacromasia é intensa, devido

a grande quantidade de grânulos citoplasmáticos (Azul de Toluidina-objetiva de 100x) ... 63 FIGURA 14- Macrófagos (CD 68+) no epitélio e no infiltrado inflamatório da GVHDc.

Observa-se grande quantidade de células na interface epitélio-tecido conjuntivo (lmunoperoxidase- objetiva de 40x) ... 66 FIGURA 15- Macrófagos (CD 68+) no infiltrado inflamatório subepitelial do LP

(lmunoperoxidase- objetiva de 40x) ... 66 FIGURA 16- Células de Langerhans intra-epiteliais no LP. Nota-se a presença de dendritos que

partem do corpo celular (Imunoperoxidase-objetiva de 40x) ... 69 FIGURA 17- Padrão continuo da laminina na membrana basal em mucosa de boca sem lesão

(Imunoperoxidase-objetiva de 16x) ... 71 FIGURA 18- Expressão da laminina na membrana basal do LP, nota-se o espessamento da

: i

I

Análise comparativa das caracteristicas microscópicas da lesão fiquenóide na GVHDc e no LP de boca.!

' _ _ _ j LISTA DE ABREVIATURAS O- ausente +-leve ++ - moderado +++ - intenso

ABO - sistema sangüíneo ABO CD - cluster de diferenciação CL - célula de Langerhans

GVHD - doença do enxerto contra o hospedeiro

GVHDa - doença do enxerto contra o hospedeiro aguda GVHDc - doença do enxerto contra o hospedeiro crônica HCI - ácido clorídrico

H&E - hematoxilina e eosina

HLA - antígeno leucocitário humano ICAM - molécula de adesão intercelular y-IFN- gama interferon

LFA- antígeno de função linfocitária LP - líquen plano

L T - linfócito T M- mucosa

MB - mucosa bucal

MHC - Complexo de Histocompatibilidade Maior NK - natural killer

PBS -tampão fosfato salino SOE - sem outra especificação

TCR-ap - receptor de célula T da família alfa-beta TCR-yõ - receptor de célula T da família gama-beta TCR-Vp -receptor de célula T da família V-beta TMO - transplante de medula óssea

TNF - fator de necrose tu moral

TNF-a- fator de necrose tu moral alfa ZMB - zona da membrana basal

, I i Análise comparativa das características microscópicas da lesão líquenóide na GVHDc e no LP de boca.!

i 1

RESUMO

O líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea crônica, de causa desconhecida, que freqüentemente afeta a mucosa oral. Histologicamente, o LP

apresenta diferentes graus de acantose e atrofia, com desorganização da camada basal e infiltrado inflamatório subepitelial em banda, composto principalmente de linfócitos T. Lesões semelhantes ao líquen plano, chamadas reações liquenóides, podem acometer a mucosa oral. As reações liquenóides podem estar associadas

à

desordens sistêmicas, como na doença do enxerto contra o hospedeiro crônica (GVHDc). Os achados histológicos da reação liquenóide associada à GVHDc são semelhantes aos encontrados no LP. O objetivo deste trabalho foi comparar as características microscópicas do LP e da GVHDc em boca. As alterações epiteliais e no tecido conjuntivo foram avaliadas em 40 casos de LP e 31 de GVHDc, assim como a presença de mastócitos, macrófagos e células de Langerhans (CL). As maiores diferenças entre as lesões foram observadas na região da junção epitélio-tecido conjuntivo. No LP, o infiltrado inflamatório foi mais intenso, porém a desorganização e vacuolização das células da camada basal foram menos evidentes. Os mastócitos foram mais numerosos no LP, e apresentaram menor quantidade de grânulos quando observados no infiltrado inflamatório. As CL foram mais freqüentes no LP, e os macrófagos na GVHDc. A expressão de laminina foi similar nos dois grupos. Estes resultados mostram que a lesão liquenóide associada a GVHDc difere do LP, particularmente na junção epitélio-tecido conjuntivo. No LP, o infiltrado inflamatório é mais intenso, mas a expressão

( Análise comparativa das características microscópicas da lesão !iquenóide na GVHDc e no LP de boca.

ABSTRACT

Lichen planus (LP) is a chronic mucocutaneous disease of unknown etiology, that frequently affects the oral mucosa. Microscopically, LP is characterized by areas of epithelial acantosis and atrophy, with disorganization of the basal layer, and by a subepithelial band-like mononuclear inflammatory infiltrate. Lichenoid lesion are diseases that present a similar pattern to LP, that can affect the mouth and skin, as Lichenoid lesions may be associated with chronic Graft versus Host Disease (cGVHD). The objective of this work was to compare the microscopic characteristics of LP and those of cGVHD in the oral mucosa. Epithelial and connective tissue alterations were evaluated in 40 cases of LP and in 31 cases of cGVHD, as well as the presence of mast cells, Langerhans cells (CL) and macrophages. The main differences found between the two diseases were at dermal-epithelial junction area. In LP the inflammatory infiltrate was more intense, but disorganization and vacuolization of the epithelial basal cells were less evident. Mast cells were more numerous in lichen planus, and showed less granules when observed in the inflammatory infiltrated. LC were more numerous in lichen planus and macrophages in cGVHD. The laminin expression was similar in both groups. From these observations it was concluded that lichenoid lesions of cGVHD of the oral mucosa differs from LP, particularly at the dermal-epithelial junction region. In LP the inflammatory infiltrate is more intense, but the antigenic expression possibly is less than in cGVHD, causing a more discrete epithelial cells alterations.

i

Análise comparativa das características microscópicas da lesão fiquenóide na GVHDc e no LP de boca.

1. INTRODUÇÃO

O líquen plano (LP) freqüentemente afeta a mucosa oral (BROWN

et ai.,

1993), e estima-se que a lesão acometa 0,5% a 1,9% da população (BROWN

et

a/., 1993), sendo duas vezes mais prevalente em mulheres com 40 a 50 anos de idade (VINCENT

et ai.,

1990). Clinicamente, o líquen plano de boca é classificado nas formas reticular, atrófica (erosiva), bolhosa e em placa (BROWN

et ai.,

1993). Histologicamente, o líquen plano apresenta diferentes graus de hiperceratose e acantose, degeneração e desorganização da camada basal e infiltrado inflamatório crônico subepitelial em banda, composto principalmente de linfócitos T (SUGGERMANN

et

a/., 1996).

Lesões semelhantes ao líquen plano, chamadas de reações liquenóides, também podem acometer a pele e a mucosa oral (BOLEWSKA & REIBEL, 1989). Na boca, são consideradas como reações

à

estímulos, que embora semelhantes, clinicamente e microscopicamente ao líquen plano, regridem quando o fator etiológico é eliminado. As lesões liquenóides podem estar associadas a desordens sistêmicas, como na doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD), que afeta 45% dos pacientes que recebem o transplante de medula óssea (TMO) (NAKAMURA

et ai.,

1996). Os achados histológicos da reação liquenóide associada

à

doença do enxerto contra o hospedeiro crônica (GVHDc) são semelhantes aos encontrados no líquen plano. O objetivo deste trabalho foi comparar as características microscópicas do líquen plano e da reação liquenóide da GVHDc de mucosa bucal.

!

Análise comparativa das características microscópícas da tesão líquenóide na GVHDc e no LP de boca.!

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1.

Líquen Plano

O líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea inflamatória crônica, de origem desconhecida (BOLEWSKA & REIBEL, 1989; ZHAO et a/., 1997), que afeta pele e mucosas, principalmente a mucosa bucal (HOLMSTRUP et ai., 1990; BROWN et ai., 1993).

A primeira descrição do líquen plano foi feita em 1869, por ERASMUS WILSON, que relatou em 50 casos clinicos, lesões em forma papular, que acometiam várias partes da pele e apresentavam caráter crônico. O LP manifesta-se com grande variação clínica, podendo apremanifesta-sentar lesões em pele e mucosas, de forma isolada ou em combinação (BOISNIC et a/., 1990). O acometimento da mucosa bucal pode preceder, ocorrer concomitantemente, ou suceder o envolvimento dérmico. A mucosa oral é acometida em 70% a 75% dos casos de LP em pele, por outro lado, a ocorrência de lesões cutâneas é observada em 44% dos pacientes com acometimento bucal inicial (SCULL Y & EL-KOM, 1985). O LP de boca é mais persistente que o de pele, podendo durar 20 anos ou mais (CHIAPPELLI

et

a/., 1997), e apenas 20% sofre regressão completa (BROWN

et

a/, 1993). A evolução do LP de boca é crônica e o paciente pode não desenvolver manifestações cutâneas.

A localização mais comum do LP bucal é a mucosa jugal (VINCENT et ai.,

) Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHOc e no LP de boca

Entretanto, outras áreas podem ser acometidas, como gengiva, língua, lábio, assoalho bucal e palato (SILVERMAN et ai., 1985; BOUQUOT & GORLIN, 1986;

BROWN et a/., 1993; BURKHART et a/, 1996). O LP bucal pode assumir diversas formas clínicas, a partir das quais é classificado em reticular, atrófico e erosivo, em placa e bolhoso (LIND et a/., 1986; BROWN et a/., 1993; EVERSOLE, 1994; MARKOPOULOS et a/., 1997). O LP reticular é a forma mais freqüente, caracterizada pela presença de linhas ou estrias brancas, as estrias de Wickham (REGEZI & SCIUBBA, 1989; JUNGELL, 1991; BURKHART et ai., 1996). A forma

atrófica pode aparecer isolada ou em associação com o LP erosivo, sendo mais observada em pacientes idosos (REGEZI & SCIUBBA, 1989). No LP erosivo, as

erosões são superficiais, cobertas por pseudomembrana, rodeadas por eritema, com número variável de estrias de Wickham, podendo estar ausentes. O LP bolhoso

é

uma variante pouco freqüente, no qual observam-se bolhas intactas. O LP em placa manifesta-se como uma área branca, geralmente indistinguível da leucoplasia, e que geralmente acomete a língua, produzindo áreas brancas irregulares (SAPP et ai., 1997). É comum, o envolvimento de mais de uma área, principalmente na superfície dorsal da língua (SAPP et a/., 1997). As formas reticular e em placa, geralmente, são assintomáticas, enquanto que os tipos erosivo e bolhoso caracterizam-se por desconforto e dor (BROWN et ai., 1993).

O LP

é

mais freqüente entre 40 e 50 anos de idade (VINCENT et a/., 1990), sendo raro em crianças, jovens e após 70 anos de idade. A idade de acometimento difere entre os gêneros; no homem ocorre entre 40 a 49 anos de

I

Análise comparativa das caracterísNcas microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

idade, enquanto que a média de idade das mulheres é de 50 a 59 (ANDREASEN, 1968).

A predileção do LP por algum dos gêneros é controvertida, mas a literatura aponta maior incidência entre as mulheres, na proporção de 2:1 (SCULL Y & EI-KOM, 1985; VINCENT

et

a/., 1990).

Histologicamente, a presença do infiltrado inflamatório mononuclear, disposto em banda subepitelial, a perda da nitidez e a degeneração da camada basal são os aspectos mais importantes para o diagnóstico do LP. As alterações epiteliais, como hiperparaceratose ou hiperortoceratose, acantose, atrofia, aumento da camada de células granulosas, projeções em dentes de serra, presença de corpos de Civatte são achados típicos (BROWN

et

a/., 1993; SUGGERMANN

et

a/., 1996). Em alguns casos, nota-se a separação entre o epitélio e a lâmina própria (VINCENT

et

a/., 1990; BROWN

et

a/., 1993). Em geral, as lesões de LP apresentam achados histológicos clássicos, entretanto, algumas lesões não manifestam as características típicas (BOISNIC

et

a/., 1990).

O estresse é citado como fator de risco para o início e exacerbação das ·lesões de LP (McCARTAN, 1995; BURKHART

et

a/., 1996), principalmente das formas erosiva e bolhosa (ROJO-MORENO

et

a/., 1998). A maior incidência da doença na população urbana, permite relacioná-la com o grau de estresse emocional dos grandes centros. Os trabalhos apontam que o estresse provoca mudanças no sistema imunológico como redução de mitoses, alteração no número

I

Análise comparativa das caracterfsticas microscópicas da lesão líquenóide na GVHDc e no LP de boca.\

de linfócitos T-helper e T-citotóxico, tornando as pessoas rnais vulneráveis ao LP (BURKHART

et

a/., 1996).

Entretanto a relação estresse-líquen plano não é a explicação para todos os casos da doença e apesar do vasto número de trabalhos desenvolvidos, desde sua descrição inicial, a etiologia do LP permanece desconhecida (BECKER &

SCHUPPAN, 1995). Entende-se a lesão como um processo de imunidade celular mediado, principalmente, por linfócitos T (CD4 e CD8), com participação de células de Langerhans e ceratinócitos (EVERSOLE, 1994; BECKER &

SCHUPPAN, 1995), desta forma caracterizada como reação de hipersensibilidade tardia tipo IV (REGEZI

et

a/., 1985; EISENBERG

et ai,

1992; PORTER

et

a/., 1997). A interação entre linfócitos e ceratinócitos culmina na degeneração da camada basal (BOISNIC

et

a/., 1990).

Duas hipóteses explicam a interação linfócito-ceratinócitos no LP. Em uma, os ceratinócitos estimulados por eventos desconhecidos, apresentariam antígenos de superfície alterados, com capacidade de estimular a resposta imune. Na segunda hipótese, a reação imunológica primária causaria a alteração e degeneração dos ceratinócitos. Com o advento das técnicas de avaliação com anticorpos monoclonais, vários estudos imuno-histoquímicos examinaram os componentes intra-epiteliais e o infiltrado linfocitário subepitelial, para melhor entender a etiopatogenia do LP.

Grande parte da literatura sustenta que o LP depende de resposta imune mediada por células T, acompanhada por aumento local da expressão de

\ Anã!ise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

citocinas, importantes na manutenção da lesão (PORTER et ai., 1997), e de moléculas de adesão (EVERSOLE, 1994 ). Alterações antigênicas primárias ou reacionais na superfície do ceratinócito levariam

à

liberação de substâncias quimiotáticas, que desencadeariam maior migração de células T. As células de Langerhans e os macrófagos formam um componente menor no infiltrado e assumem importância como células apresentadoras de antígenos (ISHII, 1987). As células T citotóxicas acumulam-se na união derme-epiderme e apresentam associação com os ceratinócitos necróticos da camada basal.

No LP bucal, os ceratinócitos, em contraste

à

mucosa oral normal, expressam antígenos MHC 11 na superfície (JONTELL et ai., 1986b; ISHII, 1987; FARTHING & CRUCHLEY, 1989; BOISNIC

et

a/., 1990; WALSH

et

a/., 1990a), em resposta as citocinas, principalmente gama interferon (y-IFN), produzidas pelos linfócitos T (JONTELL et a/., 1986b). A presença de antígenos HLA-DR é observada na superfície dos ceratinócitos da camada basal e espinhosa (REGEZI

et

a/., 1985; JONTELL

et

a/., 1986b; BOISNIC

et

a/., 1990), enquanto a expressão de HLA-DQ, não é observada no LP (JONTELL

et

a/., 1986b; CHOU & DANIELS, 1989). A expressão de antígenos MHC 11, pelos ceratinócitos, sugere a habilidade destas células na apresentação de antígenos (ISHII, 1987), contribuindo na intensificação da resposta imune (BOLEWSKA & REIBEL, 1989). Os ceratinócitos da camada basal também expressam moléculas de adesão, principalmente ICAM-1. Tanto a molécula MHC 11, como a ICAM-1 atuam como fatores quimiotáticos

i

Anâlise comparativa das características microscópicas da lesão fiquenóide na GVHDc e no LP de boca.

'

para linfócitos (JONTELL

et ai.,

1986b), e demonstram correlação positiva com a distribuição e quantidade dos linfócitos presentes (JONTELL

et ai.,

1986b).

As células de Langerhans (CL) são importantes na patogenia do LP. Dispostas na camada parabasal e no tecido justaepitelial, estão envolvidas na apresentação de antígenos às células efetoras (REGEZI et

ai.,

1985; WALSH et

ai.,

1990b). O aumento do número das CL foi descrito em alguns estudos

(BOISNIC

et

a/., 1990). Entretanto, outros demonstraram apenas o aumento da expressão de antígenos de superfície, como HLA-DQ (CHOU & DANIELS, 1989; FARTHING et a/., 1990), HLA-DR (REGEZI et a/., 1985; ISHII, 1987) e HLA-DP (FARTHING et

ai.,

1990), em resposta ao y-IFN secretado por linfócitos T helper ou citotóxicos ativados (ISHII, 1987). Nestes estudos, o número das CL, avaliado pela expressão de CD1, permaneceu inalterado (ISHII, 1987; CHOU & DANIELS, 1989).

FARTHING

et

a/. (1992) observaram aumento do número e da expressão de CD4 pelas células de Langerhans (CD1+), nas áreas de ceratinócitos HLA-DR positivos, comparativamente às áreas sem expressão de HLA-DR pelos ceratinócitos, ou às de mucosa normal, que apresentaram o mesmo padrão. Desta forma, a distribuição das CL é influenciada pela expressão de HLA-DR pelos ceratinócitos.

Os macrófagos (CD68) são identificados em maior número no LP bucal, dispostos em banda, próximos à membrana basal (MATTHEWS et

ai.,

1985). Aproximadamente 61% dos macrófagos concentram-se numa zona de 125f!m de

!

Análise comparativa das características microscópícas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

I

espessura centrada na membrana basal, denominada zona juncional, enquanto apenas 11% ocupam o compartimento epitelial (MA TTHEWS et ai., 1985). Os macrófagos expressam antígenos MHC-11, DR (REGEZI et ai., 1985) e HLA-DQ (ISHII, 1987), confirmando sua função como célula apresentadora de antígenos no líquen plano (REGEZI et a/., 1985; ISHII, 1987; WALSH et a/., 1990b; REGEZI et a/., 1994). A atividade fagocitária também é observada junto aos produtos de apoptose dos ceratinócitos (ISHII, 1987; REGEZI et a/., 1994), o que explica sua disposição espacial associada às áreas de destruição de ceratinócitos. O dendrócito Xllla+, um subtipo de macrófago, está presente, em maior número, no LP bucal, distribuído no infiltrado inflamatório. Sua função está relacionada à apresentação de antígenos e ao controle da migração de leucócitos (REGEZI et a/., 1994). A célula dendrítica Xllla+ produz fator de necrose tumoral (TNF), que estimula a expressão de ICAM-1 por ceratinócitos e células endoteliais, responsável pelo recrutamento e retenção de linfócitos, macrófagos e células dendríticas.

Na lesão de LP bucal, há clara predominância de linfócitos T (CD3+) sobre linfócitos B (CD20+) no infiltrado inflamatório, correspondendo de 90% a 94,7% das células mononucleares observadas (GABRIEL et ai., 1985; ISHII, 1987; BOLEWSKA & REIBEL, 1989, BOISNIC et ai., 1990; ROBERTSON & WRAY,

1993). A literatura não é clara no que se refere à proporção entre os dois subtipos de LT, ou seja, a razão CD4/CD8. BOISNIC

et

ai. (1990) encontraram predominância de linfócitos CD4+ (80%) sobre os CD8+ (12%), na lâmina própria de lesões de LP. Outros trabalhos também relataram a predominância das células

! Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca. i

'

'

auxiliares no infiltrado (JONTEL et a/., 1986a). ISHII (1987) analisou a razão CD4/ CD8, em diferentes compartimentos da lesão de LP, e demonstrou que a migração dos linfócitos, dos vasos para a área subepitelial, não é seletiva. Entretanto, a migração subseqüente para o epitélio, é predominantemente de linfócitos CD8+, acompanhada da redução da razão CD4/CD8. O mesmo resultado foi obtido por GABRIEL et ai. (1985) que observaram a razão CD4/CD8 de 2:1 na lâmina própria, e 1:2 no epitélio. Entretanto, alguns estudos (TAKEUCHI et a/., 1988; ROBERTSON & WRAY; 1993) mostraram a predominância dos linfócitos

citotóxicos no infiltrado inflamatório.

Os linfócitos expressam moléculas de adesão em sua superfície, como a LFA-1. A interação adesiva entre a LFA-1 e a ICAM-1 expressa por células endoteliais, ceratinócitos, células de Langerhans e macrófagos permite a migração transepitelial, estabelecimento e manutenção do infiltrado inflamatório, e manutenção de linfócitos no compartimento epitelial (WALSH et a/., 1990b; EVERSOLE, 1994; WALTON

et

a/., 1994; REGEZI

et

ai., 1996; PORTER

et

a/., 1997).

É aceito que não há recrutamento seletivo de células TCR-a~ e TCR-yõ positivas, da circulação para o epitélio, no LP bucal (WAL TON et ai., 1996). Os linfócitos TCR-a~ e TCR-yõ positivos são detectados na camada basal e espinhosa do LP oral, e a proporção de células TCR-yõ (10%) é semelhante

à

da mucosa normal (WALTON

et

ai., 1996).

; í

f Análise comparativa das caracteristfcas microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca. j

O aumento da expansão clonal de linfócitos T, da família TCR-V~.

relacionados aos superantígenos, não é observado no LP bucal (BRATEL et ai., 1998). O número de células TCR-V~3.1 e TCR-V~6a representam 7% e 3%, respectivamente, do número total de células T, o que sugere, que os superantígenos não estão envolvidos na etiologia do LP bucal (BRATEL et ai., 1998).

Os mastócitos apresentam-se em maior número no LP bucal quando comparado

à

mucosa oral normal (JONTELL et ai., 1986a), dispostos, principalmente, no tecido conjuntivo profundo, ao redor de vasos, elementos neurais e membrana basal, com disposição espacial relacionada

à

laminina (ZHAO et ai., 1998). Sugere-se que os mastócitos participem no recrutamento dos linfócitos T (JONTELL et ai., 1986a) durante o desenvolvimento da lesão, e na regulação imunológica das lesões estabelecidas, pela liberação de citocinas e outros mediadores, que atuam principalmente nas células endoteliais (ZHAO et ai., 1997). A liberação de TNF-a, pelos mastócitos, induz a expressão de moléculas de adesão, E-selectina e ICAM-1, nas células endoteliais, capazes de se ligarem a leucócitos (ZHAO

et

ai., 1997; ZHAO

et

a/., 1998).

Em suma, os resultados das análises quantitativas das populações celulares envolvidas no LP apresentam alguns resultados conflitantes. Tais diferenças podem advir do emprego de diferentes métodos de identificação e contagem, bem como do estágio evolutivo das lesões estudadas. Lesões recentes demonstram

I

Analise comparativa das características microscópicas da lesão Hquenóide na GVHDc e no LP de boca.i

poucos macrófagos e um número elevado de células de Langerhans, enquanto que nas lesões antigas, a situação é inversa.

O potencial de transformação maligna do LP oral, particularmente nas formas erosiva e atrófica, tem sido discutido pela literatura (SILVERMAN et ai., 1985; BARNARD et ai., 1993), que aponta a ocorrência de tal evento em 1% a 10% dos casos (SILVERMAN et a/., 1985). Ora o LP parece favorecer transformações malignas, sem ser fator causal (KRUTCHKOFF et a/., 1978), ora ser apenas coincidente a carcinomas. A presença de alterações displásicas tem sido observada em casos de LP (ODUKOYA et ai., 1985). Entre as características mais descritas, encontram-se a hiperplasia da camada basal, perda da polaridade dos núcleos das células basais, aumento do volume do nucléolo (ODUKOYA et ai., 1985), projeção epitelial para o cório em forma de gota, estratificação epitelial irregular, aumento do número de mitoses, aumento da relação núcleo-citoplasma, hipercromatismo nuclear, ceratinização intracelular (disceratose) e perda de aderência celular (ODUKOYA et ai., 1985). Displasia moderada e intensa são encontradas em maior freqüência em lesões de língua e assoalho bucal (ODUKOYA et ai., 1985). Na manifestação da displasia moderada ou intensa, a lesão de LP pode ser considerada como de maior risco

à

transformação maligna (ODUKOYA

et

a/., 1985).

Dados da literatura mostram que não há maior risco de transformação maligna nas lesões cutâneas de LP, enquanto que pacientes com LP oral têm maior risco, ressaltando a importância da biópsia após o diagnóstico clínico

[ Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

(HOLMSTRUP & PINDBORG, 1979; BURKHART

et

a/., 1996). Entretanto, o assunto ainda é muito controverso.

2.2. Reação Liquenóide

Reação liquenóide é um termo genérico para um processo inflamatório crônico, que se desenvolve em resposta a estímulos, podendo acometer pele e mucosa oral. A lesão recebe tal denominação devido sua semelhança com o líquen plano (BOLEWSKA & REIBEL, 1989). Clinicamente, a lesão caracteriza-se pela presença de estrias brancas (LIND

et ai.,

1986). O diagnóstico clínico é confirmado histologicamente, pela presença de hiperceratose, acantose irregular, degeneração liquefativa da camada basal, infiltrado linfocitário subepitelial (LIND

et ai.,

1986; BROWN

et

a/., 1993), principalmente composto de linfócitos T (BOLEWSKA & REI BEL, 1989) e vacuolização de células epiteliais (WAL TON

et

a/., 1998).

A prevalência das. reações liquenóides está aumentando, devido ao reconhecimento desta entidade, em relação às formas tradicionais do LP (SAPP

et

a/., 1997). Fatores locais e sistêmicos estão relacionados ao desenvolvimento da reação liquenóide (HOLMSTRUP, 1991). Na cavidade bucal, a presença de restaurações dentais metálicas é considerada como o fator local de maior influência para o desenvolvimento da lesão (BOLEWSKA & REIBEL, 1989; ÓSTMAN

et

a/., 1996). Drogas como antibióticos, hipertensivos, anti-maláricos, diuréticos e antinflamatórios não esteróides (LIND

et

a/., 1986; SAPP

et

i

Análise comparativa das características microscópicas da lesão líquenóide na GVHDc e no LP de boca.

a/., 1997), desordens sistêmicas e reações imunológicas, como diabetes, anormalidades hematológicas e doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) estão associadas a estas lesões (LIND et a/., 1986; SKOGLUND & EGELRUD, 1991 ).

2.3. Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro

A GVHD é uma doença resultante da resposta de linfócitos

T

da medula transplantada, que reconhecem como estranhos, os antígenos do complexo de histocompatibilidade do hospedeiro, proliferando e atacando o tecido do receptor (WOO et ai., 1997). O dano tecidual é resultado do ataque direto às células e da

liberação de citocinas. Histologicamente observa-se a degeneração de células epiteliais e infiltração de células mononucleares nos órgãos-alvo como, pele, trato gastrointestinal, fígado, cavidade bucal, glândulas salivares e olhos (FUJIWARA et a/., 1996).

A GVHD é dividida em duas fases; relacionadas à exposição e reconhecimento dos antígenos pelos linfócitos do doador, e posterior ataque aos órgãos-alvo (RAMSDELL et a/., 1989).

Duas formas de GVHD são consideradas, aguda (GVHDa) e crônica (GVHDc), diferindo quanto ao tempo de início e características clínicas (HIROKI et

a/., 1996; NAKAMURA et a/.,1996). A forma crônica foi descrita por STORB, na

década de 70, quando pacientes, submetidos ao TMO, sobreviveram tempo suficiente para a sua ocorrência. A doença apresenta características de

! Análise comparativa das características microscôpicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

I

autoimunidade e imunodeficiência, e é definida por ocorrer após 100 dias do TMO (SULLIVAN et ai., 1981 ). Pode se manifestar como continuação da forma aguda, (GVHDc progressiva), após a resolução da forma aguda (quiescente), ou como primeira manifestação da GVHD, não precedida da forma aguda (SULLIVAN et ai., 1981 ).

A incidência da GVHDc apresenta variação de 33% nos transplantes em que o HLA do hospedeiro e do doador são idênticos, a 64% nos transplantes alogênicos de indivíduos sem vínculo de parentesco. Tal variação também sofre influência do regime de condicionamento e da profilaxia para GVHDc (MA TTSSON

et ai., 1992).

O início ou agravamento da GVHDc, é comumente observado após infecções ou durante a imunossupressão, suportando a hipótese da importância do desequilíbrio imune na patogenia da lesão (WOO et ai., 1997). Entre os fatores de risco para GVHDc, citados na literatura, encontram-se: disparidades entre HLA, desenvolvimento prévio de GVHDa, idade avançada do receptor (ATKISON et ai., 1990; CARLENS et ai., 1998), doadoras do gênero feminino para receptores do gênero masculino e leucemia mielóide crônica, em comparação com as demais doenças de base (CARLENS et ai., 1998).

1 I

i

Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóíde na GVHDc e no LP de boca.j

Baseados no grau de envolvimento clínico e histopatológico dos tecidos, SULLIVAN et ai.(1981) propuseram um sistema que divide a GVHDc nas formas limitada e extensa:

- Limitada: envolvimento localizado da pele e/ou disfunção hepática.

Extensa: envolvimento generalizado da pele ou envolvimento localizado da pele e/ou disfunção hepática associados com hepatite agressiva crônica ativa, envolvimento ocular, envolvimento de glândula salivar ou de mucosa bucal.

Nos vários trabalhos que descrevem o acometimento da cavidade bucal pela GVHDc, os achados clínicos mais comumente observados incluem eritema, atrofia da mucosa, ulceração, alterações liquenóides, disfagia, perda de paladar e alteração de fluxo salivar (SCHUBERT et ai., 1984; REDDING et ai., 1998). Embora a redução do fluxo salivar seja encontrada em 40 a 60% dos pacientes com GVHDc, nem todos se queixam de xerostomia (HEIMDAHL et ai., 1985). Entretanto, alguns trabalhos demonstram a redução de fluxo salivar em pacientes submetidos ao TMO, autólogo ou alogênico, sem diferença significante em relação aos pacientes que desenvolveram GVHDc posteriormente (DENS et ai., 1994). A literatura relata casos de cáries rampantes em pacientes com GVHDc (HEIMDAHL

et ai., 1985; CURTIS & CAUGHMAN, 1994). A associação entre cárie rampante e

redução do fluxo salivar não é clara, desde que grande parte dos pacientes com acentuada redução de fluxo não apresentou cárie (HEIMDAHL et ai., 1985).

j Análise comparativa das caracteristicas microscópicas da lesão Jiquenóide na GVHDc e no LP de boca.

I

O dano tecidual local e a imunossupressão, observados nos pacientes com GVHDc, podem predispor a infecções virais (WOO et ai., 1997), sendo comum a presença, concomitante, de lesões infecciosas

à

GVHDc. A limitação de abertura bucal é descrita em pacientes com GVHDc, atingindo 73% em comparação aos 26% encontrados na população em geral (SCHUBERT et ai., 1984).

Dentre as manifestações bucais da GVHDc, a lesão liquenóide é a mais comum, observada em 30% dos pacientes com GVHDc em gerai(NAKAMURA et a/., 1996), e em 80% dos pacientes com acometimento da cavidade bucal pela GVHDc (MATTSSON et ai., 1992). O envolvimento é localizado principalmente em mucosa jugal e labial (NAKAMURA et ai., 1996; CORREA, 1999). Entretanto, toda a mucosa bucal pode estar afetada nos casos mais graves.

Clinicamente, a lesão se apresenta como pápulas filiformes radiadas, brancas ou acinzentadas, aveludadas, dispostas de modo linear, reticular ou anelar, fonmando áreas circunscritas, anéis e estrias na mucosa. A forma erosiva, semelhante ao que ocorre no líquen plano, também pode estar presente na manifestação clínica da GVHDc. Justapostas

à

área de atrofia, podem ser encontradas úlceras, que aparecem como áreas cruentas, doloridas, de tamanhos e formas variáveis (CORREA, 1999). A lesão liquenóide é o único sinal clínico, na mucosa oral, que apresenta relação estatística significante com o diagnóstico precoce da GVHDc (YAMADA et ai., 1997).

A realização de biópsia, na mucosa oral, para o diagnóstico da GVHDc iniciou-se com LAWLEY, na década de 70, em pacientes que apresentavam a síndrome sicca, encontrando um infiltrado inflamatório crônico na mucosa do lábio

I

Análise comparativa das características microscópicas da lesão Jiquenóide na GVHDc e no LP de boca.

e na glândula salivar menor. Posteriormente, foram propostos sistemas de classificação dos achados histopatológicos de GVHDc na boca, como o de HORN, de 1995 (TAB.1 ).

Os achados histológicos dessas lesões são atrofia epitelial, degeneração hidrópica da camada basal, edema intracelular em células epiteliais e infiltrado linfocitário, de forma similar ao do líquen plano oral (HIROKI et a/., 1994; FUJIWARA etal., 1996; McCARTAN & McCREARY, 1997).

TABELA 1

Classificação do acometimento da mucosa oral na GVHDc segundo HORN TD, 1995.

GRAU CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS

Grau 1: vacuolização das células basais, infiltrado linfocitário moderado; exocitose epitelial moderada.

Grau 2: vacuolização basal, células epiteliais disceratóticas, necrose de ceratinócitos com satelitose, infiltrado linfocitário na submucosa de moderado a intenso e exocitose epitelial moderada.

Grau 3: clivagem focal entre o epitélio e o cório, intenso infiltrado linfocitário no cório, células epiteliais disceratóticas e exocitose epitelial moderada. Grau 4: separação entre o epitélio e o cório.

I

Análise comparativa das características microscópicas da lesão fiquenóide na GVHDc e no LP de boca.!

' .

Estudos com anticorpos monoclonais permitiram a identificação das populações celulares observadas na lesão liquenóide associada

à

GVHDc. Os linfócitos T citotóxicos constituem a maior parte das células do infiltrado inflamatório (80-87%), sendo provavelmente as principais células envolvidas na patogenia da lesão (MATTSSON et ai., 1992), enquanto os macrófagos correspondem a menos de 1% do infiltrado (MA TTSSON et ai., 1992). De acordo com a literatura, a razão entre os linfócitos CD4 e CD8 é variável, desde 6:1 (MATTSSON et ai., 1992) até a predominância de linfócitos CD8. Os linfócitos T, TCR-yõ positivos e as células NK foram descritos como ausentes (MA TTSSON et

ai., 1992).

As células de Langerhans estão em número aumentado na lesão (MATTSSON et ai., 1992). A expressão de antígenos MHCII no epitélio ocorre entre 8 a 20% dos ceratinócitos (MATTSSON et ai., 1992). Entretanto, 90% das células do infiltrado inflamatório expressam antígenos DR, DQ e HLA-DP (MATTSSON et a/., 1992).

A densidade do infiltrado inflamatório, em mucosa bucal, apresenta correlação com a extensão da GVHDc em diversos órgãos (NAKAMURA et ai., 1996). Como as alterações histopatológicas da cavidade bucal, geralmente precedem as manifestações de GVHDc em outros órgãos, como fígado e pulmão, a sua identificação pode auxiliar no diagnóstico precoce da doença (NAKAMURA

!

i Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.J

' '

3. PROPOSIÇÃO

3.1.

JUSTIFICATIVA

A reação liquenóide na GVHDc tem características clínicas e histológicas semelhantes às do líquen plano, mas ocorre em pacientes com condições sistêmicas diferentes. O estudo comparativo das duas entidades pode contribuir para o melhor conhecimento dos mecanismos biológicos envolvidos nestas doenças.

3.2. OBJETIVOS

O objetivo deste estudo é comparar as características histológicas do líquen plano de boca e da reação liquenóide associada à GVHDc.

Análise comparativa das características microscópicas da lesão fiquenóide na GVHDc e no LP de boca.

4. MATERIAL E MÉTODOS

Foram usadas 31 lesões liquenóides associadas à GVHDc, 40 de líquen plano bucal e 8 amostras de mucosa oral normal, situadas, topograficamente, em diferentes regiões da cavidade bucal. As 31 lesões liquenóides associadas a GVHDc, eram biópsias de pacientes com 09 a 54 anos de idade, média de 32,6±11 ,4 anos. Todos receberam TMO de parentes, H LA-idênticos e ABO-compatíveis e regimes de condicionamento e profilaxia para GVHDc, conforme protocolos do serviço de Transplante de Medula óssea (TMO)- HEMOCENTRO-HC/UNICAMP (CORREA, 1999), e desenvolveram a manifestação crônica da GVHD, ao redor do dia +248 ±128,5 (TAB. 2). 22,5% das lesões de GVHDc foram obtidas na avaliação protocolar do dia + 100 pós TMO, a qual inclui biópsia de pele, mucosa em labio inferior (mucosa oral e glândula salivar acessória), teste de Schimmer, biópsia da medula óssea, avaliação hematopoiética, nutricional e de função pulmonar. No restante do grupo (77,5%), a lesão foi biopsiada posteriormente à avaliação protocolar do dia +100, estes pacientes foram reavaliados devido à suspeita de GVHDc e submetidos a nova triagem diagnóstica.

À

observação clínica, 80,6% das lesões apresentaram como aspecto típico estrias esbranquiçadas, características de reação liquenóide, e em 19,45% observou-se a presença de pequenas áreas ulceradas associadas às estrias. As biópsias das lesões da mucosa oral foram obtidas, sob anestesia local infiltrativa e "punch" n° 4.

Análíse comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.

I

O segundo grupo foi composto por 40 lesões de líquen plano em mucosa oral de pacientes sem outras queixas ou anormalidades nos exames físicos e laboratoriais, com 22 a 78 anos de idade, média de 50,4±15,3 anos (TAB 2). Clinicamente, as lesões apresentaram-se como placas esbranquiçadas (5%), áreas esbranquiçadas de aspecto reticular sem elevação (70%), e pela combinação de áreas estriadas, com região de atrofia associada (25%). As biópsias, com objetivo de diagnóstico, foram obtidas no OROCENTRO da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP).

Como controle, foram obtidas 08 amostras de mucosa oral desprovidas de qualquer tipo de lesão. A biópsia foi realizada na região da mucosa do lábio inferior, em pacientes até 72 horas pós-morte, 37,5% do gênero feminino e 62,5% do gênero masculino, com idade média de 54,5±12,0 anos. A causa de morte destes pacientes constituiu-se em complicações cardio-vasculares. Foram excluídos indivíduos que fizeram uso prévio de medicações usualmente relacionadas às reações liquenóides por drogas. As biópsias foram realizadas no Departamento de Patologia do HC/USP. Em todos os casos, cada biópsia correspondia a um paciente diferente. A seleção de todo material usado foi realizada de acordo com as normas éticas de pesquisa envolvendo seres humanos - deliberação do Comitê de Ética em Pesquisa de Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP).

!

Análise comparativa das características microscópicas da lesão Jiquenóide na GVHDc e no LP de boca.

<

Os fragmentos biopsiados foram fixados em formol a 10% e, os cortes de parafina de 5J.!m foram corados em H&E. Para imuno-histoquímica, foram usados cortes de 3J.!m.

1 Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.\ LP 1

12

3 TABELA2

Dados clínicos de 40 pacientes com líquen plano bucal e 31 com GVHDc de boca. O tempo corresponde ao número de dias desde o TMO até a realização da biópsia. Idade Gênero Localização GVHDc Idade Gênero Localização Tempo/dias

36 M M. jugal 1 131 M M. jugal 361 ~o F Língua

₁₂

[28 F M.jugal 250 52 M M. jugal 3 ~o M M. jugal 200 4 '54 F M. jugal _~ 127 M MB, SOE 240 5 35 F Língua 15 ₁₂₈ M M. jugal 480 6 \50 F M. jugal _~

₁₉

F M. juqal 100 7 [73 M Língua

17

121 M M. jugal 222 8 3 M Rebordo ₁₈ 150 F Lábio 250 9 58 F M. jugal 9 [43 M M. jugal 250 10 59 M Rebordo 10 32 M MB, SOE 246 11 32 M M. juqal 11 128 M Labio 100 12 39 F Língua 12 31 M MB, SOE 230 13 55 F M. juqal 13 143 F Labio 100 14 66 F Língua 14 [20 F M. jugal 248 15 47 M M. jugal 15 [40 M abio 100 16 54 F M. jugal 16 [40 M M. jugal 100 17 66 M M. jugal 17 18 M M. jugal 300 18 33 F M. juqal 18 30 M MB, SOE 248 19 34 M M. juqal 19 127 M M. juqal 100 20 78 F M. juqal 120 122 F M. jugal 100 21 48 M M. jugal [21 34 F M. jugal 340 22 68 F M. jugal 122 32 F MB,SOE 196 23 43 M M. jugal 123 [44 ,F M. jugal 1250 24 57 F M. jugal 24 34 M MB, SOE 600 25 39 F M. juqal 5 39 F M. juqal 325 26 54 F M. juqal 6 15 M M. iugal 277 27 18 F Rebordo 7 ~7 M M. jugal 213 28 58 F M. jugal [28 [44 F M. jugal 598 29 40 M M. jugal 129 \54 M M. jugal [200 30 26 M M. juqal 30 122 M Labio 214 31 63 F M. juqal 31 34 M M. juqal 1270 32 22 F Gengiva 33 69 F M.jugal 34 60 M M. jugal 35 66 F M. jugal 36 55 M

IM.

jugal 37 67 M M. juqal 38 41 F Gengiva 39 27 F M.jugal 40 62 F M. jugal

· Análise comparativa das características microscópicas da lesão liquenóíde na GVHDc e no LP de boca. j

Análise microscópica

Todos os 40 cortes de LP e 31 de GVHDc, corados em H&E, foram analisados considerando-se, a hiperceratose, acantose, atrofia e ulceração epitelial, presença de projeções em dentes de serra, corpos de Civatte, fenda focal e clivagem total entre o epitélio e o cório, espessamento da zona da membrana basal (ZMB) e pigmentação incontinente. Considerou-se também a desorganização da camada basal, vacuolização e degeneração das células epiteliais, assim como a exocitose. Na lamina própria o infiltrado inflamatório subepitelial e o infiltrado inflamatório perivascular foram também avaliados.

A hiperortoceratose foi definida como aumento da espessura da camada córnea, enquanto a hiperparaceratose como aumento da camada de ceratina com persistência de núcleos ou restos celulares. A acantose foi considerada como espessamento da camada espinhosa, podendo estar associada ao alongamento e confluência das papilas. A atrofia epitelial foi considerada como redução da espessura epitelial, freqüentemente associada

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retificação das cristas epiteliais. A fenda epitelial focal foi definida como qualquer separação entre o epitélio e o tecido conjuntivo, que não se estendesse ao longo de todo corte, e a clivagem total como a separação total entre os dois componentes. Tais achados foram expressos individualmente pela porcentagem de casos positivos em cada grupo.

As projeções em dentes de serra, característica comum no LP dérmico, foram consideradas como projeções das papilas epiteliais em forma de serra, e

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Análise comparativa das caracteristicas microscópicas da lesão liquenóide na GVHDc e no LP de boca.!

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classificadas subjetivamente como ausente (O), leve(+), moderada(++) e intensa ( +++ ), considerando-se o aspecto predominante.

O espessamento da zona da membrana basal (ZMB) foi definido pela presença de uma faixa estreita de material eosinofílico abaixo da camada basal. A pigmentação incontinente foi considerada como qualquer quantidade de melanima localizada na lâmina própria. Os eventos foram expressos pela porcentagem de casos positivos.

A vacuolização das células epiteliais foi identificada pela presença de vacúolos no interior dos ceratinócitos. A degeneração das células da camada basal, como células apoptóticas, e a desorganização da camada basal foi definida como perda da integridade da unidade estrutural, associada aos dois eventos anteriormente citados. Tais eventos também foram classificados subjetivamente como ausente O (O), leve (+),moderada (++) e intensa (+++), considerando o aspecto mais freqüente observado em cada corte.

Os corpos de Civatte (corpos hialinos ou citóide) foram identificados como massas eosinofílicas regulares ou não, às vezes circundadas por halo claro. A quantificação destes foi realizada em objetiva de 40x, em 5 campos por corte, a partir dos quais obteve-se o valor médio para cada lesão, que foi submetido à análise estatística pelo teste T.

A exocitose epitelial e o infiltrado inflamatório subepitelial foram avaliados subjetivamente segundo a intensidade, e foram classificados individualmente como, ausente (0), leve (+),moderado (++) ou intenso (+++), considerando-se o aspecto mais freqüentemente observado no corte. O infiltrado inflamatório

Anâlise comparativa das caracteristicas microscópicas da lesão fíquenóide na GVHDc e no LP de boca_

subepitelial também foi classificado segundo sua disposição, em banda ou disperso.

O infiltrado inflamatório perivascular, verificado no tecido conjuntivo profundo, foi definido como células inflamatórias ao redor de vasos sangüíneos, localizados abaixo do infiltrado inflamatório, e foi classificado subjetivamente pela freqüência destas células como ausente (O), leve (+),moderado(++) ou intenso(+++).

As porcentagens obtidas para cada evento e cada grau deste, encontradas nos dois grupos, foram submetidas

à

análise estatística comparativa pelo teste

l-A análise morfométrica computadorizada foi executada utilizando-se o sistema de análise de imagem Zeiss (KONTRON 400), em aumento de 100x. A espessura epitelial foi definida de duas maneiras: a primeira obtida pela distância entre a superfície externa do epitélio até a ponta da crista epitelial (a- espessura epitelial maior); e a segunda pela distância entre a superfície do epitélio até a zona da membrana basal localizada entre duas progessões epiteliais (b- espessura epitelial menor) (FIG. 1A). A partir das duas medidas foi estimado o valor da espessura epitelial média. A espessura do cório ocupado pelo infiltrado inflamatório foi definida como a distância entre as células inflamatórias próximas

à

extremidade da crista epitelial até a porção mais profunda acometida pelo infiltrado inflamatório (c- espessura menor do infiltrado) e a distância ocupada pelo infiltrado inflamatório com o acometimento da região papilar, definida como a distância entre as células inflamatórias do ápice da papila conjuntiva até a porção mais profunda do infiltrado inflamatório (d- espessura maior do infiltrado) (FIG. 1A), a

Análise comparativa das caracterfsticas mfcroscópícas da lesão Jiquenóide na GVHDc e no LP de boca,

partir das quais foi calculada a espessura média do infiltrado. Os perímetros da superfície externa (e) e da superfície interna do epitélio (f), também foram medidos (FIG. 1 8). A espessura epitelial e a espessura do infiltrado inflamatório foram avaliadas em 5 campos por corte, em cada campo analisou-se 5 regiões, totalizando 25 medidas. Assim como a área epitelial (g) e a área do infiltrado inflamatório (h) (FIG. 2), os perímetros da superfície externa e interna do epitélio foram avaliados em 5 campos. As médias obtidas para cada variável foram submetidas

à

análise estatística pelo teste Kruskai-Wallis ANOVA by Ranks.

FIGURA 1A - Traçado da espessura epitelial maior (a), espessura epitelial menor (b), espessura menor do infiltrado (c) e espessura maior do infiltrado (d) (H&E, objetiva de 1 Ox).

FIGURA 1 B - Traçados do perímetros das superfícies externa (e) e interna (f) do epitélio (H&E, objetiva de 1 OOx).

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Mastócitos

Os mastócitos foram evidenciados e quantificados, após coloração por técnica de histoquímica. As lâminas foram coradas com Azul de Toluidina

à

1%, pH 2,5 por 2 minutos. Após duas lavagens em água destilada, os cortes foram desidratados, diafanizados e montados. Os mastócitos foram avaliados morfologicamente, e quantificados em cada um dos três componentes analisados, epitélio, infiltrado inflamatório subepitelial e tecido conjuntivo profundo livre de inflamação, com auxílio da objetiva de 1 OOx. O número de mastócitos e respectivos desvios-padrão foram obtidos pelas contagens realizadas em 5 imagens computadorizadas de 0,0049 mm2, obtidas a partir de 5 campos, de cada um dos compartimentos. As medidas obtidas em cada compartimento do LP e da GVHDc foram submetidas

à

análise estatística pelo teste Kruskai-Wallis ANOVA by Ranks.

Análise imuno-histoquímica

O estudo dos macrófagos, células de Langerhans e laminina foi feito pela técnica de imuno-histoquímica com os anticorpos CD68, S100 e anti-laminina.

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CD68

O CD68 foi utilizado para a marcação de macrófagos, identificados como células positivas, de núcleo oval, sem a presença de dendritos. A avaliação foi realizada no compartimento intra-epitelial e no infiltrado inflamatório do tecido conjuntivo.

S100

As reações para evidenciação de CL foram realizadas com o anticorpo anti-S100 específico para células de Langerhans, melanócitos e células de Schwann. As células de Langerhans foram identificadas no componente intra-epitelial como células dendríticas, positivas para S100, contendo ao menos um dendrito e núcleo.

Laminina

A integridade da membrana basal (MB) foi analisada pela identificação de um de seus componentes, a laminina. Para todas as reações com este anticorpc, além da utilização de cortes de marcação sabidamente positiva (controle positivo), foi observada a marcação para laminina ao longo da MB dos vasos e nervos presentes no próprio corte analisado, que serviu como controle interno positivo para cada reação. A análise das lâminas buscou verificar o tipo de marcação da MB contínua ou interrupta, espessa ou delicadamente marcada.