Noções Básicas na Prática Microbiológica. Microbiologia Clínica Prof. Thiago Marconi Cardoso

Noções Básicas na Prática

Microbiológica

Microbiologia Clínica – 2012.1

Prof. Thiago Marconi Cardoso

Pedido do Exame Preparo do paciente Obtenção da amostra Procedimento de medição Procedimento pós-analítico Resultado

Avaliação médica do resultado

Pré-analítico Analítico Pós-analítico Frequência de erros ~60-70% ~20-30% ~10%

Requisição Médica

• Envolvimento do médico com laboratório pode ser útil • Microbiologia envolve etapas interpretativas (flora

normal)

• Suspeita clínica é importante para direcionar os testes • Requisição deve conter maior número de informações

Condições de Segurança

• Um profissional de laboratório nunca deve realizar qualquer procedimento sem antes conhecer as

condições de segurança necessárias à execução de suas tarefas:

– Normas de biossegurança

– Cuidados com derramamentos

– Cuidados com materiais pérfuro-cortantes – Cuidados com respingos

– Cuidados com aerossóis

Coleta

• Todo resultado liberado pelo laboratório é conseqüência da qualidade da amostra recebida

• O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso investigado

• A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico, favorecendo o desenvolvimento de flora contaminante e induzindo a um tratamento não apropriado

Procedimento de Coleta

• Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível • Instruir claramente o paciente sobre o procedimento

• Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos

• Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado

• Considerar o estágio da doença na escolha do material • Colher quantidade suficiente de material para permitir

Transporte e Conservação de

amostras

• Deve assegurar a sobrevivência e

isolamento do microrganismo

• Evitar erro de interpretação de culturas

quantitativas

• Antes da coleta verificar a disponibilidade

dos meios de transporte

Temperatura de transporte

Temperatura Ambiente Líquor

Aspirado de joelho Swab vaginal

Swab cervical

Secreções anaeróbias

35º C - Estufa Hemoculturas

Secreção ocular em placa

2 a 8º - Geladeira Urina Fezes Escarro

Critérios de Rejeição de

Amostras

• Discrepância entre a identificação da

amostra e o pedido médico

• Falta de identificação da amostra

• Origem da amostra ou tipo de amostra

não identificada

Amostras Inadequadas

• Material colhido em formol

• Frascos não estéreis

• Swab seco

• Presença de vazamentos, frascos quebrados ou

sem tampa, com contaminação na superfície

externa.

• Culturas para anaeróbios recebidas em condições

não apropriadas

• Urinas colhidas há mais de 24 horas, que ficaram

guardadas em geladeira, ou colhidas há mais de

duas horas, sem refrigeração

Procedimentos no laboratório

de Microbiologia

• Microscopia

– Preparo de esfregaços – Exame direto a fresco

– Exames diretos corados (Gram e Ziehl) – Exame direto em campo escuro

• Inóculo

– Seleção de meios de cultura

• Incubação

– Atmosfera – Tempo

Procedimentos no laboratório

de Microbiologia

• Morfologia colonial

• Contagem de colônias

• Identificação bacteriana

• Provas bioquímicas

• Antibiograma

• Métodos não convencionais

– Automação

• ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de

Infecção em Serviços de Saúde. Brasília: Editora ANVISA, 2004;

• Guder, WG. Coleta de amostras: do paciente para o laboratório:

o impacto das variáveis pré-analíticas sobre a qualidade dos resultados laboratoriais. São Paulo: Editora Câmara Brasileira

do Livro, 1996;

• Oplustil, CP. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2. ed. São Paulo: Editora SARVIER, 2004.

Staphylococcus sp

Streptococcus sp

Cocos Gram positivos

Microbiologia Clínica – 2011.1 Prof. Thiago Marconi Cardoso

-Staphylococcus sp

Família Micrococcaceae

• Staphylococcus

• Micrococcus

Principais Espécies

• S. aureus

• S. epidermidis

Fatores de virulência

• Proteína “A”

Componente da parede celular

Liga-se à porção Fc da IgG

Reduz opsonização e fagocitose e tem

efeitos quimiotáticos

• Cápsula

Fatores de virulência

Toxinas e enzimas

• Coagulase: converte fibrinogênio em fibrina

• Catalase: catalisa a remoção do peróxido de hidrogênio

• Hialuronidase: hidrolisa o ácido hialurônico no tecido conjuntivo, promovendo a disseminação dos Staphylococcus nos tecidos

• Fibrinolisina: dissolve coágulos de fibrina • Lipases: hidrolisa lipídeos

• Nucleases (DNAse): hidrolisa DNA • Penicilinase: hidrolisa penicilinas

Fatores de virulência

Exotoxinas

Três mais importantes:

* Enterotoxina: causa intoxicação alimentar, vômitos e diarréia. É resistente ao calor

O alimento é (1) cozido, (2) Manipulado (portador) e (3) deixado resfriar lentamente a bactéria produz e secreta a toxina mesmo que o alimento seja reaquecido, a toxina não é destruída

* Toxina da Síndrome do Choque Tóxico: mulheres menstruadas (absorvente interno) ou pacientes com infecções de feridas

* Esfoliatinas (5% das cepas de S. aureus)

- Ação localizada Impetigo Bolhoso ( Bolhas na pele)

- Ação generalizada Síndrome da Pele Escaldada (toxina é produzida no sítio de infecção e levada pela corrente circulatória)

S. Aureus – agente mais comum de infecções piogênicas

Intoxicações

• Decorrente de um processo infeccioso: 1. Síndrome da pele escaldada

- Deslocamento de extensas áreas da epiderme - Toxina esfoliatina ou epidermolisina

2. Impetigo bolhoso (ação localizada) • Na ausência de processo infeccioso:

1. Intoxicação alimentar

- Ingestão de toxinas previamente formadas em alimento contaminado pelo S. aureus

- Chamadas enterotoxinas (superantígenos) – são termostáveis 2. Síndrome do choque tóxico

- Geralmente mulher no período menstrual

- Febre alta, eritema com descamação da pele, insuficiência renal, diarréia, etc.

S. aureus

Pele

Foliculite – Infecção de um folículo piloso em decorrência de sua obstrução

Furunculose – Infecção de folículos pilosos ou glândulas sebáceas obstruídas, com envolvimento de tecido celular subcutâneo. Carbúnculo – Furúnculo com vários sítios de drenagem localizado

na nuca ou parte superior das costas.

Terçol – Infecção de glândula sebácea marginal das pálpebras.

Indivíduos debilitados

Bacteremia – Pode ter origem em qualquer infecção estafilocócica localizada

Endocardite – Pode surgir em decorrência de bacteremias, ou em conseqüência de próteses e processos cirúrgicos cardíacos. Pneumonia – Mais freqüente no primeiro ano de vida. As viroses

S. epidermidis

* Bacteremia

* Infecções de próteses valvulares ou articulares

* Infecções de ferimentos cirúrgicos

* Endocardite

S. saprophyticus

• Mecanismos de patogenicidade: aderência ao epitélio urinário

• Causa infecção urinária em mulheres jovens sexualmente ativas

Staphylococcus

Diagnóstico - Cultura

• Placa de Ágar Sangue, a 35º C, 24 - 48 horas

• Crescimento rápido em condições aeróbicas ou

microaerófila

• Em meios sólidos, as colônias são redondas, lisas,

elevadas, cremosa, brilhantes, amarela ou branca

• As colônias de S. aureus são amarelo-ouro,

normalmente ß-hemolíticas

• As colônias de S. epidermidis apresenta coloração

branca não hemolítica

Hemólise em AS

Diagnóstico - Catalase

– Diferencia Streptococcus

(-) de

Staphylococcus

(+)

– Reagente: H

O

a 3%

– Reação: 2H

O

_{+ Catalase  2H}

O + O

– Procedimento:

• Gotejar 1ml do reativo sobre o crescimento bacteriano. O meio não poder conter sangue;

• Alternativamente pode-se fazer o teste em lâmina, retirando-se uma porção da colônia da placa,

Cocos Gram

positivos CatalaseTeste da Teste da Catalase Catalase Positivo Catalase Negativo Catalase Negativo Staphylococcus Streptococcus Streptococcus

Diagnóstico - Coagulase

– Diferencia S. aureus

(coagulase +) de outras

espécies

– Reagente: Plasma não diluído de coelho

– Procedimento:

• Emulsionar alça cheia de bactéria em solução salina

• Adicionar 1 gota do plasma e homogeneizar

• Resultado positivo é indicado por aglutinação em 10-15’’

Cocos Gram

positivos Teste da Catalase Teste da Catalase Catalase Positivo Catalase Negativo Catalase Negativo Staphylococcus Streptococcus Streptococcus Teste da Coagulase Teste da Coagulase Coagulase Positivo Coagulase Negativo Coagulase Negativo S. aureus Staphylococcus Coagulase negativo

Diagnóstico - Novobiocina

• Teste de sensibilidade à Novobiocina

– Staphylococcus saprophyticus são resistentes

S. saprophyticus S. epidermidis

ou S. aureus

Diagnóstico - DNAse

• DNAse

» Incubar por 18-24 horas em meio específico » Adicionar ácido clorídrico após incubação

» Reação positiva: Presença de zona transparente ao redor do crescimetno bacteriano

S. aureus _{ positivo}

ESPÉCIE COAGULASE ou DNAse SENSIBILIDADE À NOVOBIOCINA

S. aureus + Sensível

S. epidermidis – Sensível

Tratamento

95% cepas resistentes á Penicilina G

* ß-lactamase

* Penicilina sensível à ß-lactamase (amoxicilina)

* Penicilina resistente à ß-lactamase (naficilina ou cloxacilina) e algumas cefalosporinas e vancomicina

* Associação de Penicilina sensível à ß-lactamase com ácido clavulânico (inibidor de ß-lactamase).

20% são resistentes a meticiclina (ou naficilina) – droga de escolha é a Vancomicina.

Streptococcus sp

Cocos Gram (+) Catalase (-)

• Família Streptococcaceae

• Principais Gêneros:

– Streptococcus

– Enterococcus

– Lactococcus

– Vagococcus

Epidemiologia

• Comumente encontrado como parte da flora normal

• Contaminantes de espécimes clínicos

• Espécies importantes:

• S. mutans • S. salivarius • S. mitis

Categorias de estreptococos de importância médica: 1. Estreptococos beta-hemolíticos (ou piogênicos) 2. Pneumococos

3. Estreptococos do Grupo D (S. bovis) 4. Estreptococos Viridans

Estes estreptococos podem ser facilmente identificados utilizando testes laboratoriais relativamente simples:

Características Grupo

Sorológico

Hemólise Bacitracina Optoquina Bile

Solub CAMP BE PYR 6,5%NaCl

S. pyogenes A b S (R) R - - - + -S. agalactiae B (b) R R - + - - (+) Grupos C e G C ou G b R R - - - - -S. bovis D g, a R R - - + - -S. pneumoniae - a R S + - - - -Viridans (-) g, a (R) R - - (-) - -Enterococcus -* a b, g R R - - + + +

Patogênese

• S. pyogenes

– Fatores de virulência:

• Estreptolisinas S e O: provoca produção de auto-anticorpos  febre reumática e glomerulonefrite

– Faringite  90% das faringites bacterianas

– Piodermites  Impetigo e erisipela

• S. agalactiae

– Infecções geniturinárias

– Meningite neonatal

Patogênese

• S. pneumoniae

– Pneumonia

– Meningite

– Septicemia

– Otite média

– Sinusite

– Vacina polissacarídica 23 valente

• S. bovis

– Bacteremia, meningite e endocardite

– Associado a carcinoma de cólon

Patogênese

• Grupo Viridans

– Bacteremia

– Endocardites

– Abscessos

– Infecções do trato geniturinário

– S. mutans  formação de placa dentária

• Enterococcus spp.

– Infecções nosocomiais

– Infecções urinárias

Diagnóstico Laboratorial

• Cultivo em AS, 35º C, 5 a 10% de CO

• Hemólise em AS

Ausência de hemólise Alfa Beta

S. penumoniae S. viridans Streptococcus Grupo D S. pyogenes Streptococcus Grupo B e D Streptococcus Grupo D

Cocos Gram

positivos CatalaseTeste da Teste da Catalase Catalase Positivo Catalase Negativo Catalase Negativo Staphylococcus Streptococcus Streptococcus

Sensibilidade à Bacitracina

• Discos de Bacitracina inibem o crescimento do

S.

pyogenes

em ágar sangue

• Sensível: formação do halo de inibição.

• Resistente: não há formação do halo de inibição

S. pyogenes S. agalactiae

Teste do PYR

(Pirrolidonil-β-Naftilamida)

• Avalia a capacidade da bactéria hidrolisar a

PYR.

– Reação positiva: Cor vermelha após 5’

• Enterococcus e Streptococcus Grupo A (S. pyogenes)

+

-Sensibilidade à Optoquina

• Discos de Optoquina inibem o crescimento do

S.

pneumoniae

em ágar sangue

• Sensível: formação do halo de inibição > 14 mm

Solubilidade em Bile

• Realizado quando inibição da optoquina fica entre 10 e 14 mm

• 20% dos pneumococos são resistentes à optoquina

– Teste positivo: Meio fica límpido  S. pneumoniae

– Teste negativo: Meio continua turvo  Enterococos, Grupo Viridans ou Grupo D

Teste de CAMP

– Identifica Streptococcus Grupo B (S. agalactiae)

– Inocula uma amostra de S. aureus produtor de beta lisina – Inocular as amostras testes em estrias perpendiculares

– As estrias devem estar próximas mas não encostar no S. aureus

S. aureus

S. pyogenes S. agalactiae

Hidrólise do Hipurato

• A enzima hipuricase hidrolisa o hipurato para produzir glicina, que é detectada por oxidação

• Reação positiva: Cor Azul escura

Meio de Bile Esculina Ágar

• Meio de cultura com 40% de Bile

• Reação positiva é detectada com a hidrólise da

esculina no meio, escurecendo o meio

Caldo Hipercloretado

(NaCl 6,5%)

• Avalia a capacidade de crescimento em

meio com altas concentrações de sal

– Positivo: Enterococcus spp.

COCOS

Gram-Positivo

Catalase

Staphylococcus Streptococcus

Morfologia colonial / hemólise

ß-hemolítico α-hemolítico Não-hemolítico

Micrococcus (+) ( - ) . . . . . . . . .

β β β β-Hemolítico Bacitracina PYR Bacitracina PYR Bacitracina (S) PYR (+) Bacitracina (S) PYR (+) S. pyogenes Grupo A S. pyogenes Grupo A Bacitracina (R) PYR (-) Bacitracina (R) PYR (-) Teste do CAMP Hidrólise do Hipurato Teste do CAMP Hidrólise do Hipurato Teste do CAMP (+) Hidrólise do Hipurato (+) Teste do CAMP (+) Hidrólise do Hipurato (+) S. agalactiae Grupo B S. agalactiae

Grupo B _{Hidrólise do Hipurato (-)}Teste do CAMP (-)

Teste do CAMP (-) Hidrólise do Hipurato (-)

Bile Esculina Bile Esculina Bile Esculina (+)

Bile Esculina (+) _{Bile Esculina (-)}Bile Esculina (-)

PYR / NaCl 6,5%

PYR / NaCl 6,5% Não Grupo A, B ou DNão Grupo A, B ou D PYR (+) / NaCl 6,5% (+) PYR (+) / NaCl 6,5% (+) PYR (-) / NaCl 6,5% (-) PYR (-) / NaCl 6,5% (-) Grupo D Grupo D Enterococos Enterococos

α αα α-Hemolítico Optoquina Optoquina Optoquina (S, >14 mm) Optoquina (S, >14 mm) S. pneumoniae S. pneumoniae Optoquina (I, 10-14 mm) Optoquina (I, 10-14 mm) Bile Solubilidade Bile Solubilidade Bile Solubilidade (+) Bile Solubilidade (+) S. pneumoniae

S. pneumoniae _{Bile Solubilidade (-)}Bile Solubilidade (-)

Bile Esculina Bile Esculina

Bile Esculina (+)

Bile Esculina (+) _{Bile Esculina (-)}Bile Esculina (-)

PYR / NaCl 6,5%

PYR / NaCl 6,5% Grupo ViridansGrupo Viridans PYR (+) / NaCl 6,5% (+) PYR (+) / NaCl 6,5% (+) PYR (-) / NaCl 6,5% (-) PYR (-) / NaCl 6,5% (-) Grupo D Grupo D Enterococos Enterococos Optoquina (R, <10 mm) Optoquina (R, <10 mm)

Não-Hemolítico

Bile Esculina Bile Esculina

Bile Esculina (+)

Bile Esculina (+) Bile Esculina (-)Bile Esculina (-)

PYR / NaCl 6,5% PYR / NaCl 6,5%

Outros Streptococcus não hemolíticos Outros Streptococcus não hemolíticos

PYR (+) / NaCl 6,5% (+)

PYR (+) / NaCl 6,5% (+) PYR (-) / NaCl 6,5% (-)PYR (-) / NaCl 6,5% (-)

Grupo D Grupo D Enterococos

Tratamento

• Casos de resistência bacteriana a

Penicilina são raros

• Tratamento de Primeira Escolha:

– Penicilina G

• Pacientes alérgicos:

– Eritromicina