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EXTRATOS DE FUNGOS DA ANTÁRTICA: AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE CONTRA XANTHOMONAS CITRI SUBSP. CITRI
ANTARCTIC FUNGI EXTRACTS: ACTIVITY EVALUATION
AGAINST XANTHOMONAS CITRI SUBSP. CITRI
Juliano Henrique Ferrarezi(1) Gabrielle Vieira(2) Marina Vitti Vianna(3) Luana Galvão Morão(4) Lara Durães Sette(5) Henrique Ferreira(6) Daiane Cristina Sass(7)
Resumo
O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, é uma doença que ataca todas as espécies e variedades de citros de importância comercial. O Brasil por ser um dos principais produtores mundiais de laranja e por apresentar clima favorável para o desenvolvimento da bactéria sofre perdas econômicas significativas por causa do cancro cítrico. Atualmente o controle da doença inclui o uso de pulverizações das árvores com compostos bactericidas contendo cobre e a erradicação de plantas contaminadas. Entretanto, estas medidas causam uma grande perda de quantidade de árvores e impacto ambiental devido à acumulação de cobre no ambiente. Dessa maneira, torna-se necessário a busca de maneiras sustentáveis de combate ao cancro cítrico. Neste contexto, os metabólitos secundários tem despertado grande interesse como possíveis alternativas aos produtos químicos, apresentando, em muitos estudos, grande potencial para a aplicação no controle de pragas na agricultura. Suspeita-se que metabólitos secundários ainda desconhecidos possam ser produzidos por fungos que vivem em ambientes extremos como a Antártica. Neste trabalho foi avaliada a atividade de extratos intracelulares, produzidos por fungos isolados de amostras do solo abaixo de barra de ferro na Ilha Deception na Antártica, contra a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, causadora do cancro cítrico em frutas cítricas.
Palavras-chave: Cancro Cítrico, Xanthomonas citri subsp. citri, Fungos da Antártica
Abstract
1 Graduando em Ciências Biológicas. IB-UNESP de Rio Claro. julianoferrarezi@hotmail.com 2 Mestranda em Microbiologia Aplicada. IB-UNESP de Rio Claro. gabriellevieir@gmail.com 3 Mestranda em Microbiologia Aplicada. IB-UNESP de Rio Claro. marinavvianna@gmail.com 4 Doutoranda em Microbiologia Aplicada. IB-UNESP de Rio Claro. luanagm_bio@yahoo.com.br 5 Doutora em Microbiologia Aplicada. Docente do IB-UNESP de Rio Claro. larasette@rc.unesp.br 6 Doutor em Bioquímica. Docente do IB-UNESP de Rio Claro.henfer@rc.unesp.br
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The citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri, is a disease that attacks all species and varieties of commercially important citrus. The Brazil as one of the world's leading producers of orange and have a favorable climate for the development of bacteria suffer significant economic losses because of citrus canker. Currently, the control of the disease includes the use of spraying of trees with bactericidal compounds containing copper and eradication of infected plants. However, these measures cause a large loss in quantity of trees and environmental impact due to accumulation of copper in the environment. Thus, it becomes necessary to search for sustainable ways to combat citrus canker. In this context, secondary metabolites has aroused great interest as alternatives to chemicals, with, in many studies, great potential for application in pest control in agriculture. It is suspected that as yet unknown secondary metabolites can be produced by fungi that live in extreme environments such as Antarctica. In this study, we evaluated the activity of intracellular extracts, produced by fungi isolated from soil samples under iron bar at Deception Island in Antarctica, against Xanthomonas citri subsp bacteria. citri, causes citrus canker in citrus fruits.
Keywords: Citrus Canker, Xanthomonas citri subsp. citri, Antarctic fungi.
1 Introdução
O setor agrícola no Brasil tem apresentado cada vez mais importância para a economia do país. Entretanto o crescimento da produção de insumos agrícolas no país tem sido limitado por alguns fatores, dentre eles a ocorrência de diferentes tipos de doenças causadas por vírus, fungos e bactérias que resultam em perdas e diminuição da qualidade destes produtos (MICHEREFF, 2001). A cultura de citros é diretamente afetada por estas doenças, as quais além de comprometer a produtividade dos pomares (SANCHES et al., 2014), exigem investimentos em prevenção e controle que causam impactos diretamente na rentabilidade do citricultor e na economia do país, visto que o Brasil é o principal produtor mundial de laranja e responsável por cerca de 30% da produção da fruta (NEVES, 2011).
O cancro cítrico, causado pelo agente etiológico Xanthomonas citri subsp. citri, que ataca todas as variedades e espécies de citros e provoca lesões nas folhas, frutos e ramos é um dos principais problemas fitossanitários na cultura de citros no Brasil (SANCHES et al., 2014). O controle do cancro cítrico atualmente tem sido realizado através de pulverizações das árvores com compostos bactericidas contendo cobre e a erradicação de plantas contaminadas, causando uma grande perda de quantidades de árvores (SANCHES et al., 2014) e acúmulo de cobre no ambiente.
Assim, a busca por novas alternativas de controle para o cancro cítrico, principalmente que sejam menos nocivas ao meio ambiente, vem se tornado cada vez mais frequente no Brasil e em outros países onde a doença também causa grandes prejuízos (PEIXOTO NETO et al., 2002; FRAVEL, 2005). Por estas razões, tem sido proposto o uso de antagonistas ou de
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metabolitos secundários como uma estratégia promissora para a proteção da planta (MURATE et al., 2015).
Estudos recentes demonstram a atividade significativa de metabólitos secundários produzidos por micro-organismos contra a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (MURATE et al., 2015; DE OLIVEIRA et al., 2011, LOPES et al., 2012; VASCONCELLOS et al., 2014).
Suspeita-se que novas espécies microbianas e novos metabólitos secundários podem ser identificados investigando micro-organismos provenientes de ambientes extremos ou inexplorados como o continente antártico (PIKUTA et al., 2007; FURBINO et al., 2014). Estudos reportados recentemente na literatura evidenciam o potencial de fungos do ambiente Antártico em produzir metabólitos secundários com ação antibacteriana contra algumas espécies de Xanthomonas (MONCHEVA et al., 2002; NEDIALKOVA e NAIDENOVA, 2005; ENCHEVA-MALINOVA et al., 2015; ENCHEVA-MALINOVA et al., 2014).
Dentro deste contexto o objetivo deste trabalho foi verificar atividade de extratos intracelulares, produzidos por fungos isolados de amostras do solo abaixo de barra de ferro na Ilha Deception na Antártica, contra a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, causadora do cancro cítrico em frutas cítricas.
2 Material e Métodos
Os micro-organismos estudados no presente trabalho (8 fungos filamentosos) (3-Fe; 5-Fe; 6-5-Fe; 7-5-Fe; 10.2-5-Fe; 11-5-Fe; 12-Fe e C-Fe) são provenientes de amostras do solo abaixo de barra de ferro coletados na Ilha de Deception na Antártica durante expedição PROANTAR (OPERANTAR XXXII) realizada em novembro/dezembro de 2013 no âmbito do projeto INCT Criosfera. Os micro-organismos fazem parte do acervo de fungos da coleção de pesquisa da Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Os fungos utilizados neste trabalho ainda estão sendo identificados (caracterização taxonômica).
Os fungos foram cultivados em placa utilizando meio de extrato de malte 2% e ágar 1,5% durante 10 dias a 15 ºC. Discos de 5 mm de ágar + micélio foram transferidos das placas de Petri para erlenmeyers contendo o meio líquido malte 2% e estes foram mantidos pelo período de 20 dias em agitação constante (150 rpm) a 15 ºC.
Após crescimento fúngico, a biomassa microbiana foi submetida à extração com metanol para a obtenção dos metabólitos secundários intracelulares. A fração orgânica
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(metanólica) foi concentrada e submetida ao bioensaio contra a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri.
O bioensaio foi realizado utilizando o ensaio de microplaca com resazurina (REMA) (SILVA e FERREIRA, 2013) da seguinte maneira: Os extratos intracelulares foram solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) 10% para obtenção de uma solução estoque com concentração de 20-30 mg/ml.
As soluções estoques dos 8 extratos intracelulares foram diluídas em meio N (peptona, extrato de levedura, glicerol e ágar) diretamente na placa de 96 poços, como apresentado na Tabela 1, sendo que na primeira fileira (fileira A) a concentração máxima avaliada para cada extrato foi de 2100 µg/ml e esta foi submetida a microdiluição seriada nas fileiras seguintes. Em seguida foi adicionado o inóculo bacteriano (padronizado para número de células viáveis inseridas no REMA igual a 105 células) (Observação: as células bacterianas foram cultivadas em meio N a 29ºC sob rotação de 200 rpm).
Tabela 1. Modelo de placa para avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos. CP (controle positivo): Canamicina; CV (controle do veículo); CN (controle negativo)
1 3-Fe 5-Fe 6-Fe 7-Fe 10.2-Fe 11-Fe 12-Fe C-Fe 10 11 12
A - 2100 2100 2100 2100 2100 2100 2100 2100 CP CN - B - 1050 1050 1050 1050 1050 1050 1050 1050 CP CN - C - 525 525 525 525 525 525 525 525 CP CN - D - 262,5 262,5 262,5 262,5 262,5 262,5 262,5 262,5 CP CN - E - 131,2 131,2 131,2 131,2 131,2 131,2 131,2 131,2 CV CN - F - 65,6 65,6 65,6 65,6 65,6 65,6 65,6 65,6 CV CN - G - 32,8 32,8 32,8 32,8 32,8 32,8 32,8 32,8 CV CN - H - 16,4 16,4 16,4 16,4 16,4 16,4 16,4 16,4 CV CN -
Para controle do veículo (CV) (fileiras E-H da coluna 10) utilizou-se DMSO 1% diluído em meio N e o controle negativo (coluna 11) consistiu em 10µL do inóculo (105 células/poço) diluídos em 90µL de meio N, e para controle positivo (CP) (fileiras A-D da coluna 10) foi utilizado 50 µL do composto canamicina (200 µg/ml) em 450µL de meio N. Nas colunas 1 e 12 para evitar a evaporação, foram adicionados apenas meio N e corante rezasurina. As placas foram incubadas a 29ºC por aproximadamente 16 horas e em seguida foi adicionada uma solução de resazurina para uma nova incubação a 29ºC por aproximadamente 2 horas. Após este período foi realizada a medida da fluorescência através do aparelho SPECTRAfluor Plus (Tecan).
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A partir da medida de fluorescência das amostras é possível calcular os dados de porcentagens de células mortas a partir da seguinte fórmula:
% de células mortas = 100 x [(média das medidas de fluorescência do CN - fluorescência da amostra)/ média das medidas de fluorescência do CN]
3 Resultados e Discussão
Os oito fungos estudados neste trabalho (3-Fe; 5-Fe; 6-Fe; 7-Fe; 10.2-Fe; 11-Fe; 12-Fe e C-Fe) foram submetidos à fermentação em meio malte 2% e em seguida os metabólitos secundários intracelulares foram extraídos com metanol. Os extratos secos foram dissolvidos em DMSO 10% e os estoques dos extratos foram diluídos nos micropoços da placa, conforme descrito em materiais e métodos.
A análise de atividade antibacteriana contra a Xanthomonas citri subsp. citri foi realizada pelo método REMA (resazurin microtiter assay), que consiste em um ensaio de microtitulação com rezasurina (C12H7NO4), um corante que em presença de crescimento bacteriano sofre redução, de azul com baixa fluorescência para coloração rósea e altamente fluorescente (resorufina). Dessa maneira, quanto menor o crescimento bacteriano menor a leitura de fluorescência detectada, assim o teste do REMA permite determinar quantitativamente os resultados obtidos via leitura da fluorescência da resazurina, o sinal de fluorescência é monitorado usando comprimentos de onda de excitação 530-560 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. A Tabela 2 apresenta os resultados das leituras de fluorescência das amostras contidas na placa de 96 poços esquematizada na Tabela 1. Tabela 2. Resultado da leitura de fluorescência das amostras.
1 3-Fe 5-Fe 6-Fe 7-Fe 10.2-Fe 11-Fe 12-Fe C-Fe 10 (CP e CV) (CN) 11 12
A 1331 40359 45408 24400 31884 24393 8887 38965 17650 2405 32409 1521 B 1379 35733 38439 33503 19088 32012 18921 40902 24399 2522 29586 1526 C 1355 26133 29693 38747 41829 44759 36441 40336 33277 2848 31548 1513 D 1364 33384 31400 45786 35494 41782 38992 40280 35449 2625 38547 1508 E 1353 33089 39263 41747 30854 38778 40371 49106 37730 40806 35264 1511 F 1345 26213 35168 31848 39540 32872 39416 39741 42658 36969 33220 1499 G 1377 32076 31822 33291 34677 32114 41930 30290 42487 41671 36277 1496 H 1301 37473 33871 39589 37949 36006 42511 32174 26174 39081 38097 1505
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Os dados de fluorescência foram transformados em porcentagem de células mortas, conforme mostrado em materiais e métodos. A Tabela 3 apresenta as porcentagens de células mortas obtidas em cada poço para os testes realizados para as amostras (3-Fe – C-Fe) e para o controle positivo e de veículo (fileira 10) e para o controle negativo (fileira 11).
Tabela 3: Resultados da avaliação em porcentagem de células mortas encontradas em cada poço.
3 - Fe 5 - Fe 6 - Fe 7 - Fe 10.2-Fe 11 – Fe 12 - Fe C - Fe 10 11
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Dos extratos metanólicos intracelulares obtidos a partir da fermentação dos 8 fungos estudados neste trabalho, o que apresentou melhor resultado foi o extrato do fungo 11 – Fe (74% de inibição). Quando comparado com o controle positivo (média de 90% de inibição), o extrato não se torna uma opção viável para o controle da bactéria, porém considerando que a composição do extrato não foi ainda identificada, o resultado revela que o extrato contém compostos químicos ativos contra Xanthomonas citri subsp. citri, requerendo assim a separação e identificação dos constituintes desse extrato, e uma nova análise da atividade antibacteriana.
4 Conclusões
A partir dos dados apresentados neste trabalho foi possível concluir que o fungo 11 – Fe produziu extrato intracelular com compostos químicos ativos contra Xanthomonas citri subsp. citri. Outros bioensaios serão realizados futuramente com os constituintes do extrato 11 – Fe e com os extratos extracelulares dos fungos analisados neste trabalho. Estudos como estes apresentam caráter preliminar, mas se mostram como uma opção considerável do ponto de vista biotecnológico na obtenção futura de metabolitos bioativos com importância agronômica.
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FAPESP - 2015/20629-6 e 2015/18326-5
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