UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MYLENE RADMILA DE OLIVEIRA SOUZA
ANÁLISE ENERGÉTICA DOS FÁRMACOS ZANAMIVIR E OSELTAMIVIR ASSOCIADOS A NEURAMINIDASE SELVAGEM E COM A MUTAÇÃO HIS274TIR
Natal 2020
MYLENE RADMILA DE OLIVEIRA SOUZA
ANÁLISE ENERGÉTICA DOS FÁRMACOS ZANAMIVIR E OSELTAMIVIR ASSOCIADOS A NEURAMINIDASE SELVAGEM E COM A MUTAÇÃO HIS274TIR
Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco
NATAL-RN 2020
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Souza, Mylene Radmila de Oliveira.
Análise energética dos fármacos Zanamivir e Oseltamivir associados a neuraminidase selvagem e com mutação HIS274TIR /
Mylene Radmila de Oliveira Souza. - Natal, 2020. 67 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.
1. H1N1 - Dissertação. 2. Mutação - Dissertação. 3. DFT - Dissertação. 4. MFCC - Dissertação. 5. Energia de interação - Dissertação. I. Fulco, Umberto Laino. II. Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSCB CDU 616.921.5 Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
Defesa da dissertação de mestrado da discente Mylene Radmila de Oliveira Souza, intitulada: “Análise energética dos fármacos Zanamivir e Oseltamivir associados a neuraminidase selvagem e com a mutação HIS274TIR”, orientada pelo Prof. Dr. Umberto Laino Fulco, apresentado à banca examinadora designada pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFRN, em data.
Os membros da Banca Examinadora consideram a candidata ______________________________________________.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Prof. Dr. Umberto Laino Fulco
Departamento de Biofísica e Farmacologia _________________________________________
Dr. Francisco Ferreira Barbosa Filho Universidade Federal do Piauí
_________________________________________ Me. Katyanna Sales Bezerra
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me conceder saúde, sabedoria e permitir que eu realizasse mais este sonho. Obrigada por ser meu guia em toda a minha trajetória.
Aos meus pais, Milson e Francilene, por todo apoio e incentivo em todos os momentos da minha vida. Por acreditarem em mim e não medirem esforços para a concretização dos meus sonhos. Sem vocês nada seria possível.
Ao meu Prof. Dr. Umberto Fulco pela oportunidade de realizar este trabalho. Obrigada pela confiança, orientação, competência, profissionalismo e todo conhecimento compartilhado ao longo de todos esses anos.
A doutoranda Katyanna pela amizade, ensinamentos e ajuda fundamental em todas as etapas deste projeto. Obrigada pelo seu esforço e dedicação.
A minha amiga Dalila, que é um exemplo para mim, e hoje, agradeço por ter me incentivado e ajudado a seguir no caminho da pós-graduação.
Aos meus colegas do laboratório de Biofísica e Simulação Computacional, pela agradável convivência e conversas produtivas.
A todos os professores da Pós-Graduação em Ciências Biológicas por ter contribuído para o meu aprendizado.
Aos professores da banca examinadora, pela disponibilidade e valiosas sugestões.
À CAPES pelo apoio financeiro
, pois o presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001Por fim, a todos aqueles que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização desta dissertação, o meu sincero agradecimento.
“Por mais inteligente que alguém
possa ser, se não for humilde, o seu melhor se perde na arrogância. A humildade ainda é a parte mais bela da sabedoria.”
RESUMO
A influenza A (H1N1) é uma virose respiratória aguda e contagiosa. Sua cepa foi reconhecida no início do ano de 2009, e constitui pelo menos a metade das causas de pandemias de gripes em humanos. O mecanismo de infecção do vírus se dá por meio das duas glicoproteínas de superfície, a hemaglutinina e a neuraminidase. A hemaglutinina liga-se aos receptores do ácido siálico, induzindo a incorporação do envelope viral pela célula e a neuraminidase age clivando o ácido siálico dos receptores celulares. Esse mecanismo impede o agrupamento viral e, por esse motivo, tornou-se um importante alvo para fármacos antivirais. Atualmente, o Oseltamivir e o Zanamivir são os agentes de escolha para o tratamento e profilaxia da gripe por apresentar vantagens em relação aos outros fármacos, entretanto, já foram descritos casos de resistência a eles, o que se tornou motivo de preocupação para os profissionais de saúde. Tal resistência é acarretada por substituições de aminoácidos que se localizam no sítio ativo da neuraminidase, o que pode influenciar na afinidade e especificidade da ligação ao receptor. A substituição da histidina por uma tirosina (HIS274TIR) é a mais encontrada. A partir da obtenção das estruturas cristalográficas das proteínas escolhidas (3TI6), (3CL0), (3TI5) e (3CKZ) foi calculada a energia de interação do Zanamivir e Oseltamivir co-cristalizado à neuraminidase selvagem e com a mutação His274Tir, através de técnicas computacionais de modelagem molecular, com base na abordagem da Teoria Funcional da Densidade (DFT) associada ao Método de Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC). Os resultados obtidos constataram que os resíduos com os valores energéticos mais significativos estão situados no sítio ativo da neuraminidase interagindo com os dois antagonistas estudados, tal fato enfatiza a importância de mantê-los preservados com o objetivo de não comprometer a afinidade entre eles. Com esse conhecimento, é possível realizar um aprimoramento no design dos fármacos para que estes possam ser mais específicos e eficientes no combate à disseminação da gripe.
ABSTRACT
Influenza A (H1N1) is an acute and contagious respiratory disease. Its strain was approved in early 2009, and was less than half the causes of pandemics in humans. The virus infection mechanism provides the medium for the two surface glycoproteins, a hemagglutinin and a neuraminidase. A hemagglutinin binds to sialic acid receptors, inducing the incorporation of viral envelope by the cell and an age of neuraminidase cleaving sialic acid from cellular receptors. This mechanism prevents viral clustering and, therefore, has become an important target for antiviral drugs. Currently, Oseltamivir and Zanamivir are the agents of choice for the treatment and prophylaxis of influenza because they have advantages over other drugs, however, cases of resistance to them have already been described, which has become a reason for concern for healthcare professionals. Cheers. Such resistance is caused by substitutions of amino acids that are located in the neuraminidase active site, which can influence the affinity and specificity of the binding to the receptor. The replacement of histidine with tyrosine (His274Tir) is the most commonly found. From the crystallographic structures of the chosen proteins (3TI6), (3CL0), (3TI5) and (3CKZ), the interaction energy of Zanamivir and Oseltamivir co-crystallized with the wild neuraminidase and with the His274Tir mutation was calculated using techniques models of molecular modeling, based on the Functional Density Theory (DFT) approach associated with the Molecular Fractionation Method with Conjugated Covers (MFCC). The results obtained found that the residues with the most significant energy values residues are located in the neuraminidase active site interacting with the two angonists studied, this fact emphasizes the importance of keeping them preserved in order not to compromise the affinity between them. With this knowledge, it is possible to improve the design of drugs so that they can be more efficient in combating the spread of influenza.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Propagação do Influenza A: Número de casos confirmados em laboratório
e óbitos. ... 16
Figura 2 – Estrutura do vírus influenza. ... 23
Figura 3 - Representação esquemática do shift antigênico. ...18
Figura 4 - Reconhecimento dos resíduos de ácidos siálicos. ...20
Figura 5 - Ciclo de vida do vírus influenza. ...20
Figura 6 - Estrutura da NA vista de cima. A caixa ampliada mostra o sítio de ligação a qual o receptor do resíduo de ácido siálico se liga. ...21
Figura 7 - Neuraminidase e seus quatro domínios estruturais. ...22
Figura 8 - Mecanismo de infecção da NA. ...23
Figura 9 - Estrutura dos fármacos utilizados no tratamento e profilaxia da gripe. ....24
Figura 10 - Mecanismo de ação dos inibidores da neuraminidase. ...26
Figura 11 - (A) Estrutura da NA selvagem em interação com o oseltamivir, (B) Estrutura da NA mutante em interação com o oseltamivir, (C) Estrutura da NA selvagem em interação com o zanamivir e (D) Estrutura da NA mutante em interação com o zanamivir. ...33
Figura 12 - Curva de protonação (pka) mostrando as conformações dos fármacos oseltamivir e zanamivir. ...34
Figura 13 - Divisão dos ligantes Oseltamivir (A) e Zanamivir (B) em regiões enumeradas de acordo com o estado do ligante em pH fisiológico e suas respectivas densidades eletrônicas de DFT projetadas em um potencial eletrostático. ...35
Figura 14 - Esquematização dos cortes realizados para a aplicação do MFCC. (A) Subsistema completo. (B) Subsistema com ligante e caps. (C) Subsistema com resíduo e caps. (D) Subsistema com os caps. ...37
Figura 15 – Total da energia de interação em relação ao raio no decorrer do estudo de convergência, considerando os dois agonistas estudados: Oseltamivir (A) e (B) e Zanamivir (C) e (D) sob as constantes ε=10 e ε=40. ...42
Figura 16 – Gráficos com os valores energéticos dos resíduos mais relevantes que contribuem para a interação dos complexos. ...44
ÍNDICE LISTA DE ABREVIATURAS ... ix LISTA DE FIGURAS ... x 1- INTRODUÇÃO ... 12 1.1 Gripe H1N1 ... 13 1.2 O vírus influenza ... 16
1.3 Ciclo de vida do vírus ... 19
1.4 Estrutura e mecanismo de infecção da Neuraminidase ... 21
1.5 Inibidores da Neuraminidase ... 23 1.6 Neuraminidase mutante ... 26 1.7 Modelagem molecular...27 2- OBJETIVOS ... 30 2.1 Objetivos gerais ... 30 2.2 Objetivos específicos... 30 3- MATERIAIS E MÉTODOS ... 32 3.1 Dados cristalográficos ... 32 3.2 Otimização da estrutura ... 33
3.3 Método de fragmentação e cálculos das energias de interação ... 35
4- RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 40
5- CONCLUSÃO ... 53
6- PERSPECTIVAS...55
LISTA DE ABREVIATURAS
DFT – Teoria Funcional da Densidade
MFCC – Método de fracionamento molecular com caps conjugados HA – Hemaglutinina
NA – Neuraminidase
N1 – Neuraminidase subtipo 1 N2 – Neuraminidase subtipo 2
HIS274TIR – Mutação no resíduo histidina 274, a qual é substituída por uma tirosina RCSB/PDB – Research Collaboratory for Structural Bioinformatics - Protein Data Bank
DNA – Ácido Desoxirribonucleico RNA – Ácido Ribonucleico
ALA – Alanina ARG – Arginina ASN – Asparagina ASP – Ácido aspártico GLI – Glicina
GLU – Ácido glutâmico ILE – Isoleucina LEU – Leucina LIS – Lisina PRO – Prolina SER – Serina THR – Treonina TIR – Tirosina
TRP – Triptofano VAL – Valina
12
13 1 GRIPE H1N1
O termo influenza foi empregado pela primeira vez na Itália, no século XV, para nomear uma pandemia que, de acordo com os estudiosos da época, se deu por “influência das estrelas”. O primeiro relato apresentado de uma gripe ocorreu no ano de 1580 e, cerca de 4 pandemias aconteceram no decorrer do século XIX. No ano de 1918, um surto de gripe que se iniciou em um acampamento do exército americano, no Kansas, se disseminou por todo o mundo, atingindo aproximadamente 500 milhões de pessoas e dizimando cerca de 20 a 40 milhões. Esse episódio, denominado Gripe Espanhola ou até mesmo Gripe de 1918 foi uma das pandemias mais letais da história sendo causada pelo Influenza A (CLERCQ, 2006) da mesma forma, o Covid-19 está sendo responsável pela pandemia que estamos vivenciando atualmente.
No Brasil, a cepa do vírus influenza A foi detectada pela primeira vez em 1974, apesar da endemia na população de suínos ocorrer somente após a pandemia de 2009. Esta teve seu início no México, dentre os meses de março e abril, atingindo rapidamente alcance de proporções mundiais e, em junho desse mesmo ano, a Organização Mundial de Saúde (OMS) considerou a ocorrência uma pandemia em estagio 6 (alto nível de alerta), constatando a disseminação do vírus em pelo menos dois continentes (MANOHAR, 2011; ADAMS, et al., 2019).
Influenza A (H1N1)pdm09 é uma virose respiratória aguda e contagiosa, sendo caracterizada por uma sazonalidade complexa com influência de uma série de fatores populacionais (imunidade, convívio social, comportamental e cultural), virais (geração de novas linhagens) e ecológicas. O seu pico contagioso ocorre nos meses de maio a setembro nas regiões de clima temperado do Hemisfério Sul, entre dezembro e março nas regiões de clima temperado do Hemisfério Norte e durante todo o ano, com maior incidência no período chuvoso, nas regiões tropicais e subtropicais (MANOHAR, 2011).
Tais eventos provocam uma considerável desordem nos sistemas de saúde devido ao elevado número de casos e de óbitos e um enorme impacto econômico, em razão dos custos com prevenção, consultas médicas, tratamento, excesso de hospitalizações e absenteísmo no trabalho. O vírus é resultado de um rearranjo entre
14 quatro cepas, sendo duas de origem suína, uma humana e uma aviária, comumente conhecida como gripe A ou gripe suína. (HUSSAIN et al., 2017; OLSEN, 2002; NITHYA et al., 2017).
A transmissão ocorre de pessoa para pessoa através das gotículas respiratórias contendo as partículas virais que são expelidas pelo indivíduo infectado e por meio do contato com as secreções do doente, mas, neste caso, depende de alguns fatores como a temperatura ambiente, umidade, carga viral e o tempo entre a contaminação e o contato com a superfície (KUSHWAVA; TELI; MAHEN, 2014). O período de maior transmissibilidade acontece nas 24 horas antes do início do quadro clínico até 24 horas após o declínio da febre e o processo de replicação no trato respiratório ocorre até 48 horas após a infecção. Para a disseminação da gripe, os maiores fatores de risco são a convivência em creches, escolas, universidades e participação em grandes eventos sociais (ALTERTHUM, 2004).
A gravidade da doença durante as epidemias e pandemias é bastante variável, provocando quadros de doença respiratória leve retida na parte superior do trato respiratório ou pode evoluir para um quadro de desidratação, acometimento do trato respiratório inferior, pneumonia bacteriana secundária, e ainda depende de múltiplos fatores, incluindo a virulência da estirpe e o nível de imunidade pré-existente. Porém, a sintomatologia comum é caracterizada por febre acima de 39ºC, dor de garganta, corrimento nasal, tosse seca, dor de cabeça, dor muscular e fadiga. Além disso, ainda pode ocasionar uma ampla série de complicações não respiratórias, podendo afetar o coração, sistema nervoso central e outros sistemas de órgãos (DAWOOD et al., 2009; CORDERO et al., 2012).
A atenção dos órgãos de saúde está voltada principalmente para os grupos de risco, nos quais estão inclusas gestantes, crianças, obesos, diabéticos, pacientes imunocomprometidos e os que apresentam distúrbios neuromusculares (KRAMMER
et al., 2018). O diagnóstico não pode ser realizado com base apenas nos achados
clínicos, apesar de que na infecção por influenza, os sintomas são mais intensos do que nas outras síndromes gripais. As autoridades da área da saúde aconselham que o resultado laboratorial seja o mais rápido possível para não retardar o início da terapia antiviral e a confirmação da suspeita deve ser realizada através de RT-PCR (reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa) ou cultivo viral. Outras alternativas
15 são o sequenciamento genético e o teste rápido (RDIT – Rapid Influenza Diagnostic Test), porém, este apresenta menor sensibilidade e especificidade (WYLLER, 2017; STOIMENOV, G. M. et al, 2019).
Embora a vacinação seja o método mais efetivo de profilaxia contra as pandemias causadas pela influenza. O tempo se torna curto para a produção e distribuição das vacinas em razão dos surtos repetidos provocados pelo surgimento constante de novas cepas em um processo conhecido como desvio antigênico. Isto ocorre devido a erros na cópia do genoma acarretada pela polimerase viral e a seleção desses mutantes, os quais possuem alterações nos sítios antigênicos que permitem que estes escapem da neutralização dos anticorpos (KUMAR et al., 2010).
Essas modificações antigênicas repetidas acompanhadas da alta taxa de transmissibilidade do vírus geram a necessidade de reformulação anual da vacina. A determinação da sua composição é fundamentada em análises filogenéticas, experimentais e em dados epidemiológicos estabelecidas pela rede mundial de laboratórios da Organização Mundial da Saúde, que apresentam quais linhagens virais são pertinentes naquele período. Diante desses fatos, existe a necessidade de buscar novas formas de terapia, incluindo os medicamentos inibidores da neuraminidase que demonstraram uma maior eficiência, reduzindo a duração da infecção, a gravidade da doença e a letalidade (Adams
et al., 2019).
Além disso, podem ser tomadas algumas medidas preventivas que minimizam o risco de infecção como: realizar higiene das mãos, manter distância de indivíduos infectados, evitar aglomerações e manter o ambiente ventilado. O tratamento dos indivíduos em estágios iniciais é de grande importância, pois evita complicações como respiração mecânica e necessidade de UTI para o paciente (RIMMELZWAAN, 2009). Essa pandemia causa anualmente 1 bilhão de casos de gripe, desses, são registrados 3-5 milhões de casos de doença grave e 300.000 a 500.000 mortes no mundo todo, devido a sua alta virulência e facilidade de disseminação. Em maio de 2009, o primeiro mês considerado suspeito de epidemia pela H1N1, a infecção foi anunciada em 48 países, totalizando 13.398 casos confirmados laboratorialmente e 95 mortes, de acordo com os dados da World Health Organization (Figura 1). As áreas mais atingidas foram a Europa, Norte da África e o Sudeste da Ásia. No Brasil, houve
16 uma maior incidência nas regiões Sul e Sudeste. Na região Sul, a taxa de incidência da Síndrome Respiratória Aguda Grave causada pela gripe H1N1 foi de 66,2 casos para cada 100 mil habitantes (HUSSAIN et al., 2017; MARON et al., 2013).
Figura 1 - Propagação do Influenza A: Número de casos confirmados em laboratório e óbitos. Adaptado de OMS (Maio de 2009).
1.2 O VÍRUS INFLUENZA
O Myxovirus influenzae, também denominado vírus influenza, é o agente etiológico da gripe e se apresenta sob a forma de três tipos: A, B e C, os quais são os únicos que pertencem à família Ortomyxoviridae, mas somente os tipos A e B são relevantes sob o ponto de vista clínico. O tipo A é mais susceptível a variações antigênicas e possui a capacidade de realizar recombinação genética gerando novas cepas e de atingir um grande espectro de reservatório de animais, entre mamíferos e aves, por esse motivo, apenas ele é responsável pelos processos epidêmicos, enquanto o tipo B contém vírus que causam infecções somente em humanos e o tipo
17 C são os menos comuns e podem causar infecções leves em crianças (TRABULSI, L. R., 2004; MURRAY, 2009).
Uma cepa é caracterizada pelas estruturas das duas glicoproteínas do envelope lipoproteico: a hemaglutinina (HA), distribuída em grande quantidade na superfície viral (aproximadamente 80%) e a neuraminidase (NA), segunda mais abundante (aproximadamente 17%) , os quais são os principais alvos dos anticorpos e podem existir de diversas formas - 16 subtipos de HA (H1-16) e 9 subtipos de NA (N1-9) são reconhecidos, podendo ser combinadas e dando origem a 198 tipos diferentes de mutações, as quais são estudadas frequentemente com o objetivo de garantir uma prevenção segura e impedir uma nova pandemia (ITZSTEIN, 2007; HUSSAIN et al., 2017).
O vírus influenza é constituído também pela proteína de membrana, sendo revestido internamente pela proteína da matriz (Figura 2) e são pleomórficos, de aparência globular, com aproximadamente 80 a 120 nm de diâmetro (TRABULSI, 2004). Além disso, possui um RNA de hélice única e polaridade negativa, o qual é segmentado em oito fragmentos nos tipos A e B e sete fragmentos no tipo C. Cada segmento se apresenta como um vírus independente que contém o seu próprio capsídeo e um complexo RNA polimerase, formando um nucleocapsídeo para cada segmento do genoma (MURRAY, 2009; NAYAK, et al., 2009).
18 O vírus influenza depende de dois mecanismos evolutivos fundamentais para garantir sua sobrevivência: o drift antigênico e o shift antigênico, os quais permitem que ele possa superar a imunidade pré-existente e se adaptar a novos hospedeiros, dando origem a uma nova epidemia (MEDINA; GARCÍA-SASTRE, 2011). Esses processos possibilitam a evolução antigênica viral através da modificação de aminoácidos nas glicoproteínas HA e NA. No caso do influenza A (H1N1)pdm09, ocorreu um shift antigênico, o qual significa a infecção simultânea de uma mesma célula por duas cepas de origens distintas, resultando em uma mistura dos segmentos genômicos dos dois vírus que leva a formação de rearranjos genéticos e dão origem a novas cepas, o que ocorre com frequência em aves e suínos (Figura 3) (MCAULEY, J. et al., 2019; MURRAY, 2009).
Estas recombinações frequentes tornam as vacinas cada vez mais ineficazes devido à natureza segmentada do genoma viral, sendo necessária atualização constante das estirpes usadas na fabricação e, consequentemente, gerando altos gastos (NICOLSON et al., 2016).
19 1.3 CICLO DE VIDA DO VÍRUS
Ao penetrar no sistema respiratório através das células da mucosa nasal, os vírus buscam uma célula hospedeira na qual consigam se fixar, acarretando o aumento da produção de secreção que se manifesta por meio da coriza. Duas enzimas virais participam nesse processo de infecção: a hemaglutinina e a neuraminidase, as quais possuem capacidade de atuar como antígenos e definem a classificação dos tipos e subtipos da influenza. Ambas as enzimas reconhecem e possuem alta afinidade pelos resíduos de ácidos siálicos, também conhecidos como ácido N-acetilneuramínico, que são expressos por glicoproteínas ou glicolipídeos na superfície celular (Figura 4) (MEDINA; GARCÍA-SASTRE, 2011).
A hemaglutinina reconhece e liga-se aos receptores de ácido siálico da superfície celular, induzindo a fusão do vírus com a membrana plasmática da célula alvo. Logo, o vírus entra na célula via endocitose e trafega para o lisossomo, onde a acidificação ativa o canal viral da proteína da matriz seletiva de prótons (M2). Isso provoca a fusão da membrana e dissociação do núcleo da ribonucleoproteína viral (RNP), que é então transportada para o núcleo e, em conjunto com as três subunidades da polimerase ( Polimerase básica 2 - PB2, Polimerase básica 1 - PB1 e Polimerase ácida - PA), promove a replicação e transcrição do RNA viral. Em seguida, as cópias dos vírus são exportadas do núcleo para o citoplasma pela proteína de exportação nuclear e pela proteína da matriz, e são montadas na membrana plasmática. E então, os vírus saem da célula infectada a partir da clivagem do ácido siálico induzida pela catálise da neuraminidase, a qual impede a ligação do vírus de volta a célula hospedeira, permitindo a liberação eficiente da sua progênie e a disseminação para novos alvos celulares (Figura 5) (FÁTIMA et al., 2005; ITZSTEIN, 2007).
20
Figura 4 – Reconhecimento dos resíduos de ácidos siálicos. Adaptado de MCAULEY, J. et al., 2019.
21 1.4 ESTRUTURA E MECANISMO DE INFECÇÃO DA NEURAMINIDASE
Neuraminidase, uma das glicoproteínas da superfície do vírus Influenza, se localiza ancorada no envelope viral pela extremidade hidrofóbica. É um tetrâmero com quatro polipeptídeos idênticos, cada um com aproximadamente 470 resíduos de aminoácidos, em forma de cogumelo, que se divide em quatro domínios estruturais distintos: i) Cauda citoplasmática; ii) Região transmembranar; iii) Caule; e iv) Cabeça catalítica (Figura 6 e 7). Estes sítios ativos possuem uma cavidade de tamanho significativo compostos por 8 resíduos altamente conservados que interagem diretamente com ácidos siálicos (Arg118, Asp151, Arg152, Arg224, Glu276, Arg292, Arg371, Tyr406) e ainda existe uma camada externa de 10 resíduos, os quais não interagem com o ácido siálico, mas possuem um papel estrutural fundamental (Glu119, Arg156, Trp178, Ser179, Asp198, Ile222, Glu227, Glu277, Asn294 e Glu425).
Figura 6 - Estrutura da NA vista de cima. A caixa ampliada mostra o sítio de ligação a qual o receptor do resíduo de ácido siálico se liga. Fonte: MCAULEY, J. et al., 2019.
22 Figura 7 - Neuraminidase e seus quatro domínios estruturais. Adaptado de MCAULEY, J. et al., 2019.
Os resíduos de argininas 118, 292 e 371 entram em contato com o carboxilato do substrato do ácido siálico. Arg152 se liga ao grupo acetamida no anel de glicose, enquanto o Glu276 interage com os grupos hidroxilas 8 e 9 da cadeia lateral do glicerol. O sítio ativo desta enzima é altamente conservado no que diz respeito à sequência e orientação espacial para manter a atividade da molécula. Dessa forma, NA se tornou um alvo de inibição ideal para as drogas (MCAULEY, J. et al., 2019).
A glicoproteína NA possui atividade enzimática e age clivando o ácido siálico dos receptores celulares. Esse mecanismo impede o agrupamento viral, provocando a liberação dos vírus que se originaram a partir da superfície celular infectada e, por esse motivo, tornou-se um importante alvo para fármacos antivirais (Figura 8). Portanto, é uma molécula de grande importância, pois sem esta, a infecção seria limitada a um ciclo de replicação insuficiente para causar doença, uma vez que o vírus permaneceria ligado à célula hospedeira, incapaz de invadir “novas” células (MURRAY, 2009; GOLAN et al., 2009).
Além disso, NA é dividida em dois grupos distintos: o grupo 1 contendo os sorotipos N1, N4, N5 e N8 e o grupo 2 contendo os sorotipos N2, N3, N6, N7 e N9. Estes grupos possuem uma diferença marcante em um domínio catalítico denominado “loop-150”, o movimento dessa estrutura durante as mudanças conformacionais
23 provocadas pela ligação do substrato ao sítio ativo forma uma cavidade, a qual é constituída pelos resíduos 147 a 152 (AMARO et al., 2011). A diferença entre os dois grupos está relacionada a flexibilidade e abertura desse “loop”, no grupo 1 ele é flexível e apresenta uma conformação mais aberta em comparação ao grupo 2. Vale destacar que a elaboração dos inibidores da neuraminidase foi baseada exclusivamente nas estruturas do grupo 2, logo, essa diferença estrutural pode ser explorada para inibir seletivamente a NA do tipo 1 do vírus influenza A através do bloqueio desta cavidade (RUDRAWAR, S. et al., 2016).
Figura 8 – Mecanismo de infecção da NA. Adaptado de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Neuraminidase_inhibitor_-_Machanism_of_action.png.
1.5 INIBIDORES DA NEURAMINIDASE
Os medicamentos antivirais são classificados conforme os seus alvos no mecanismo de replicação. Os que agem impedindo o reconhecimento de receptores e a endocitose são os inibidores da hemaglutinina; os que inibem a fusão do envelope viral na membrana celular são os bloqueadores do canal de prótons (M2); os que interrompem a produção de proteínas virais são inibidores das polimerases e os que impedem que os vírus recém-sintetizados possam infectar outras células são os inibidores da neuraminidase (LOREGIAN, et al., 2014).
24 Os fármacos aprovados para o tratamento ou profilaxia da gripe são os clássicos: amantadina e rimantadina, os quais são inibidores do canal iônico, e os antivirais de segunda geração: oseltamivir, zanamivir e peramivir os quais são inibidores da neuraminidase (Figura 9) (MOSCONA, 2005). No entanto, os fármacos da segunda geração são os únicos atualmente em uso devido ao baixo espectro de ação da amantadina e rimantadina (apresentam eficácia apenas contra a estirpe da influenza A), além disso, são mais susceptíveis à resistência e provocam reações adversas como transtornos do sistema nervoso central e gastrointestinal, portanto, houve restrição do uso destes fármacos na prática clínica (Fátima, et al., 2005; MAZZITELLI, et al., 2019).
Figura 9 – Estrutura dos fármacos utilizados no tratamento e profilaxia da gripe. Adaptado de Fátima et al., 2005.
Oseltamivir (Tamiflu®) é um pró-fármaco, absorvido no trato gastrointestinal e convertido na sua forma ativa (carboxilato de oseltamivir) no fígado. Sua distribuição se dá através da corrente sanguínea e atinge os locais alvos da infecção (mucosa nasal, pulmão e orelha média). É comercializado como uma cápsula, e administrado por via oral, possuindo uma boa biodisponibilidade. Durante a pandemia de 2009, pesquisas mostraram que esse fármaco se revelou muito eficaz, impedindo complicações e óbitos pelo vírus influenza A e desde 2011 foi disponibilizado pelo
25 Ministério da Saúde um estoque desse antiviral para todos os estados brasileiros em caso de necessidades (SAMSON et al., 2013).
Zanamivir (Relenza®) possui baixa biodisponibilidade oral, sendo, portanto, comercializado como um pó que atinge diretamente o trato respiratório através do uso de um inalador. Entretanto, a quantidade de droga que atinge o trato respiratório depende do fluxo de inspiração, o que representa uma limitação para o uso deste fármaco em alguns indivíduos, principalmente em pacientes intubados. Além disso, deve ser administrado duas vezes ao dia, durante 5 dias consecutivos, para atingir seu efeito máximo. Já o peramivir (Rapivab), é administrado por via intravenosa, fornecendo uma alternativa terapêutica interessante para pacientes que não responderam à terapia inalatória ou oral e para pacientes incapazes de tolerar outras vias de administração (CLERCQ, 2006; SAMSON et al., 2013).
A principal diferença estrutural entre os fármacos oseltamivir e zanamivir é que o primeiro possui um grupamento amina na posição C4, enquanto o zanamivir possui um grupamento guanidina nesta mesma posição (Figura 9). Devido a esse grupamento, o zanamivir torna-se semelhante à estrutura do ácido siálico, possibilitando que ele se encaixe melhor no sítio ativo com uma interação energética mais favorável, apresentando, consequentemente, um melhor desempenho no tratamento de pacientes infectados que já apresentam resistência ao oseltamivir (RUSSEL et al., 2006; VAVRICKA et al., 2011).
Os inibidores da neuraminidase agem interferindo na liberação das partículas virais que se encontram na superfície das células infectadas (Figura 10). Seu mecanismo de ação é baseado na competição com o substrato natural da NA, levando ao bloqueio do sítio ativo da enzima que, por consequência, impede as reações enzimáticas que liberam os vírus e provocam a disseminação da infecção no trato respiratório. As chances de combater a infecção são maiores quando o fármaco é administrado previamente, tendo em vista que o pico de replicação dos vírus da gripe acontece entre 24 a 72 horas após o início da doença. Além disso, esses fármacos também atuam na profilaxia da gripe por pessoas que tiveram contato com indivíduos infectados (MOSCONA, 2005; NICOLSON et al., 2016).
26 Figura 10 - Mecanismo de ação dos inibidores da neuraminidase. Adaptado de
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Neuraminidase_inhibitor_-_Machanism_of_action.png. 1.6 NEURAMINIDASE MUTANTE
A resistência do vírus da gripe aos inibidores é acarretada por substituições de aminoácidos que se localizam no sítio ativo da neuraminidase ou próximos a ele, o que pode influenciar na afinidade e especificidade da ligação ao receptor ou podem alterar a preferência do receptor pelo vírus pandêmico ou pelo seu precursor (MEIJER et al., 2014).
A mutação isolada principal que causa resistência apenas ao oseltamivir é a substituição do resíduo Histidina 274 pela Tirosina (His274Tir), a qual é específico para o grupo 1 (N1, N4, N5 e N8) e ocasiona uma alteração conformacional no sítio ativo da neuraminidase, impedindo a acomodação do fármaco neste local (FIGURA 6) (MOSCONA, 2009). No entanto, existem outras mutações de resistência relevantes que são: a substituição do ácido glutâmico 136 pela lisina (Glu136Lis), a substituição da asparagina 294 pela serina (Asn294Ser), a substituição da serina 246 pela asparagina (Ser246Asn) associada à mutação His275Tir, a substituição da isoleucina 223 pela arginina (Ile223Arg), a qual também é encontrada associada a mutação HIS275TIR, a substituição da isoleucina 222 pela valina (Ile222Val), a substituição do ácido glutâmico 119 pela glicina (Glu119Gli), a substituição do ácido glutâmico 119 pela valina (Glu119Val) e o aspartato 199 substituído pela glicina (Asp199Gli) (SAMSON et al., 2013).
27 1.7 MODELAGEM MOLECULAR
O complexo constituído por moléculas bioativas e os receptores dão origem às respostas biológicas e necessitam, principalmente, do reconhecimento molecular, cuja propriedade depende substancialmente da estrutura química. Logo, a necessidade de representar a estrutura da matéria a nível molecular levou a elaboração de uma nova área de pesquisa dentro da física e da química conhecida como modelagem molecular, fornecendo um conjunto de ferramentas para a construção, edição, visualização, análise e armazenamento de sistemas moleculares complexos (BARREIRO; FRAGA, 2008; RODRIGUES, 2001).
A execução de projetos por meio da modelagem molecular cresceu de forma significativa na última década e isso se deve, principalmente, ao desenvolvimento de recursos computacionais. Isso se refere tanto a construção de softwares de alta performance, precisão e velocidade com que os cálculos são executados, como para desenvolvimento de super computadores com processadores, memórias e placas gráficas cada vez mais eficientes e velozes, tornando-se possível as execuções destes programas (SANT’ANNA, 2009).
Esta técnica favorece uma melhor percepção do arranjo espacial dos átomos e uma descrição detalhada das estruturas e das interações intermoleculares dos sistemas biológicos, além da simulação do seu comportamento em ambiente fisiológico. O desenvolvimento da técnica de difração de raio X, possibilitou a exposição das estruturas tridimensionais e seus parâmetros estruturais, como comprimentos, ângulos de ligação e definição de propriedades atômicas (SANTOS, H. F., 2001). Estas características químicas e estruturais obtidas são essenciais no processo de reconhecimento molecular que constitui as bases essenciais para a potência, afinidade e seletividade dos fármacos por seus receptores-alvos (GUIDO, R. V. C., 2008; ORTOLAN, 2014).
Além disso, o estudo da mecânica quântica associada ao formalismo da Teoria do Funcional da Densidade (DFT) (HOHENBERG; KOHN, 1964), também está intimamente ligada a estas técnicas. Esta teoria permite a execução dos cálculos energéticos fundamentados na densidade eletrônica do sistema, sem precisar analisar
28 o movimento de cada elétron de forma individual, possibilitando resultados mais precisos e um menor custo computacional. Diante deste cenário, o conjunto entre as técnicas experimentais e computacionais assumiu uma fundamental importância no processo não só do planejamento de candidatos à novos fármacos, como também na otimização de estruturas já existentes (FERREIRA, C. et al. 2011; SANT’ANNA, 2009).
Portanto, a realização de pesquisas associadas à modelagem molecular por métodos computacionais, podem, futuramente, auxiliar no ajuste e/ou design de fármacos que possam ser desenvolvidos para atuar no combate à infecção da cepa mutante da influenza A.
29
30 2 JUSTIFICATIVA
A cepa H1N1 da influenza A é responsável por uma alta taxa de morbidade e mortalidade devido a sua alta transmissibilidade e as frequentes mutações que afetam seus antígenos de superfície.
Sabe-se que no decurso de uma pandemia, a produção de vacina se torna inviável devido ao fato de que não pode ser realizada com a velocidade necessária para interromper o progresso de uma nova cepa do vírus, portanto, os agentes inibidores da neuraminidase são vistos como recurso fundamental.
Nesse contexto, as técnicas computacionais de modelagem molecular são de importância fundamental no aprimoramento ou desenvolvimento no design de novos fármacos, visto que conhecendo a estrutura do alvo terapêutico, é possível projetar uma molécula que possa inibi-lo com eficiência.
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32 2 OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem a intenção de analisar as interações dos fármacos Zanamivir e Oseltamivir co-cristalizado à neuraminidase selvagem e com a mutação His274Tir por meio de técnicas de análise computacional de bioquímica quântica, buscando, a partir desses dados, identificar os aminoácidos de maior importância que estão envolvidos no quadro de resistência.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Avaliar quais são os aminoácidos da neuraminidase selvagem e mutante fundamentais no complexo de interação do Zanamivir e Oseltamivir;
● Identificar os aminoácidos com maior relevância energética da proteína, determinando as distâncias resíduo-fármaco.
● Analisar os tipos de ligações químicas que ocorrem entre os resíduos de aminoácidos mais importantes da neuraminidase (selvagem e mutante) e os fármacos, além de suas respectivas energias;
● Destacar as semelhanças e diferenças entre os mecanismos de atuação dos dois fármacos, com o intuito de coletar informações que contribuam para estudos futuros que promovam o desenvolvimento de fármacos mais eficientes.
33
MATERIAIS E MÉTODOS
34 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 DADOS CRISTALOGRÁFICOS
Para a execução da análise das interações fármaco-receptor foi necessária a obtenção da estrutura cristalográfica da proteína escolhida por meio do Research
Collaboratory for Structural Bioinformatics - Protein Data Bank (RCSB-PDB). Isso se
trata de um banco de dados utilizado para realização de experimentos, a nível atômico, de estruturas tridimensionais de macromoléculas biológicas como proteínas e ácidos nucleicos (ROSE, et al., 2017). Esse banco de dados é um recurso imprescindível para a simulação biomolecular (KAMP, et al., 2008). Os cristais analisados dispõem no PDB o código de identificação 3TI6, no qual refere-se à NA selvagem em interação com o oseltamivir (VAVRICKA, C. J. et al. 2011); 3CL0, no qual refere-se à NA mutante em interação com o oseltamivir (COLLINS, P. J. et al 2008); 3TI5, no qual refere-se à NA selvagem em interação com o zanamivir (VAVRICKA, C. J. et al. 2011) e 3CKZ, no qual refere-se à NA mutante em interação com o zanamivir (COLLINS, P. J. et al 2008) (Figura 11).
35 Figura 11 – (A) Estrutura da NA selvagem em interação com o oseltamivir, (B) Estrutura da NA mutante em interação com o oseltamivir, (C) Estrutura da NA selvagem em interação com o zanamivir e (D) Estrutura da NA mutante em interação com o zanamivir. Elaborada pela autora.
Os cristais utilizados apresentam resolução de 1.69 Å (A); 2.2 Å (B); 1.9 Å (C) e 1.9 Å (D). Estes foram obtidos através do método de difração de raios-X, o qual é uma técnica baseada na explanação dos detalhes atômicos das interações moleculares, através de feixes de ondas eletromagnéticas, que interagem com os elétrons dos átomos do cristal identificando a posição de cada um deles e dos elementos de interferência. Quando se dispõe do conhecimento da composição do cristal, é possível organizá-los de forma real, criando uma imagem que possibilita a visualização da molécula cristalizada de forma tridimensional (SHI, 2014). Dessa forma, a definição de uma estrutura cristalina exige a caracterização da disposição no espaço de todos os elementos químicos presentes na amostra.
3.2 OTIMIZAÇÃO DA ESTRUTURA
Os átomos de hidrogênio não são identificados ou são posicionados de forma incorreta em estruturas cristalográficas, uma vez que possuem densidade eletrônica mínima. Logo, os átomos presentes nos cristais foram fixados e em seguida foram adicionados os átomos de hidrogênios nas estruturas analisadas. Após esta adição foi realizada a otimização da estrutura através do software Discovery Studio versão
36 3.1, onde foi aplicado os parâmetros de cálculo campo de força CHARMm. Esse é um dos campos de força mais popular e amplo para simulações de moléculas biológicas e orgânicas (MOTTIN, et al., 2016), que utiliza princípios de física clássica e mecânica quântica (NAYAK; ROTH; MCGAVERN, 2014).
O estado de protonação assumido pelos ligantes em pH fisiológico foi determinado por meio do software Marvin Sketch® versão 6.2.2. Para NA selvagem em interação com o oseltamivir e NA selvagem em interação com o zanamivir foi calculado o valor de 6,5 e para NA mutante em interação com o oseltamivir e NA mutante em interação com o zanamivir foi calculado o valor de 8 (ver Figura 12). Buscando facilitar o entendimento da análise e interação entre ligante-resíduo, os ligantes foram divididos estrategicamente em três regiões. No fármaco oseltamivir, a região I é composta pelo grupamento carboxila e há presença de uma carga negativa; a região II possui uma amina com presença de carga positiva e uma amida e a região III possui um grupamento éter. Com o balanceamento das cargas, a molécula passa a ser neutra. Já no zanamivir, a região I é a que possui o grupamento carboxila com a presença de carga negativa; a região II possui um grupamento guanidina com presença de carga positiva e uma amida, por fim, a região III possui um grupamento éter e com balanceamento das cargas, a molécula também passa a ser neutra (Figura 13).
Figura 12 - Curva de protonação (pka) mostrando as conformações dos fármacos oseltamivir e zanamivir. Elaborada pala autora.
37
Figura 13 - Divisão dos ligantes Oseltamivir (A) e Zanamivir (B) em regiões enumeradas de acordo com o estado do ligante em pH fisiológico e suas respectivas densidades eletrônicas de DFT projetadas em um potencial eletrostático. Elaborada pela autora.
3.3 MÉTODO DE FRAGMENTAÇÃO E CÁLCULOS DAS ENERGIAS DE INTERAÇÃO
Foi utilizada a técnica de Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC) para a realização dos cálculos energéticos a fim de determinar as energias de interação entre os fármacos e os resíduos de aminoácidos da neuraminidase
38 selvagem e mutante. A técnica de MFCC tem como principal objetivo decompor uma molécula de proteína inteira em fragmentos de aminoácidos que são posteriormente tampados por um par de tampões conjugados (caps), introduzidos em cada quebra de ligação química com o intuito de fechar as valências que ficaram abertas. A energia de interação entre a proteína e o ligante é calculada de forma que as somas individuais de interação possam ser simplesmente calculadas com base na teoria ab initio (termo utilizado na área científica para análises fundamentadas em “primeiros princípios” físicos-matemáticos), para que ao final, seja definida a energia do sistema completo. Além disso, o cálculo baseado nessa teoria possibilita a obtenção de informações quantitativas detalhadas dos espectros das interações (ZHANG; ZHANG, 2005).
Foi delimitado um raio r a partir do ligante para o cálculo da energia de interação, a fim de limitar a quantidade total de resíduos para serem analisados sem que ocorresse a perda de interações importantes (COSTA et al, 2012). Neste trabalho, foram realizados cálculos ligante-resíduo iniciando no raio de 2 Å até o raio de 10 Å, variando de 0,5 Å. Desse modo, foram considerados 89 resíduos para a NA selvagem em interação com o oseltamivir; 93 resíduos para a NA mutante em interação com o oseltamivir; 87 resíduos para a NA selvagem em interação com o zanamivir e 95 resíduos para a NA mutante em interação com o zanamivir, nos quais foi aplicada a metodologia do MFCC e desenvolvidos subsistemas desses resíduos em estudo.
Para cada resíduo de aminoácido analisado foram realizados quatro cortes nos quais incluem: i) sistema total (ligante, caps e resíduos) ii) ligante e caps iii) caps e resíduo e iv) caps (Figura 14). O ligante recebeu a denominação L, o aminoácido em interação com o ligante foi denominado R e os tampões ou caps que antecedem e sucedem o resíduo como C1 e C2 respectivamente. Com esses valores foi aplicada a equação:
EI (L – R) = E (L + C1 R C2) – E (C1 R C2) – E (L + C1 C2) + E (C1 C2), (eq.1),
onde EI (L – R) equivale a energia de interação ligante-resíduo. O termo E (L + C1R C2) representa a energia total do sistema, E (C1 R C2) representa a energia dos resíduos e caps, E (L + C1 C2) representa a energia do ligante e caps e por fim, E (C1 C2) equivalendo-se a energia dos caps. As moléculas de água no sistema foram
39 consideradas quando estabeleceram ligações de hidrogênio com algum cap ou resíduo de interesse e adicionadas aos cortes.
Figura 14 – Esquematização dos cortes realizados para a aplicação do MFCC. (A) Subsistema completo (Ligante, caps e resíduos). (B) Subsistema com ligante e caps. (C) Subsistema com resíduo e caps. (D) Subsistema com os caps. Elaborada pela autora.
Concluída a etapa da fragmentação, a carga elétrica dos subsistemas foram ajustadas conforme os resíduos em questão, tendo em vista que o ligante e os resíduos (exceto os aminoácidos arginina e lisina carregados positivamente, com carga +1 e os aminoácidos glutamina e ácido aspártico carregados negativamente, com carga -1) foram estabelecidos neutros ou com carga zero. A reprodução do ambiente molecular real é uma das etapas indispensáveis para o estudo experimental das propriedades moleculares. Desse modo, os efeitos da reorientação dos dipolos são aproximados usando a constante dielétrica (KUKIC; NIELSEN, 2010). Para fins deste trabalho, foi aplicada a constante de ε=10 em comparação com a constante de
ε=40 no sentindo de atender a todos os fenômenos de polarização, estimando as propriedades de solvatação da água, ao invés de efetuar cálculos com as interações
40 eletrostáticas de milhares de moléculas de água que estão presentes no sistema e, dessa forma, alcançar resultados mais confiáveis (SCHUTZ & WARSHEL, 2001).
Os cálculos da energia de interação foram efetuados através da Teoria do Funcional da Densidade (DFT), o qual possibilita a execução de cálculos energéticos baseado na densidade eletrônica do sistema (HOHENBERG; KOHN, 1964), em vez de utilizar os movimentos individuais de cada elétron. Essa teoria torna possível uma concordância significativa com dados experimentais disponíveis e isso é explicado pelo fato de que sistemas moderados ou grandes possam ser avaliados com uma precisão química admissível, a um custo computacional que algumas vezes condiz a uma fração daquele obtido utilizando-se métodos correlacionados clássicos. Considerando que a energia de um conjunto de elétrons sob influência de um campo externo é um funcional único da densidade eletrônica, esta dependência aparece em dois termos da energia eletrônica: funcional de troca e funcional de correlação (SANT’ANNA, 2009).
Utilizou-se o módulo G09 para a execução dos cálculos das energias de interação (FRISCH et al., 2009) destinado a Teoria Funcional da Densidade (DFT). O funcional utilizado para descrever os termos de troca e correlação foi o B97D de escolha para combinações energéticas em sistemas não-covalentes. Na amplificação dos orbitais Khon-Sham foi escolhida as bases cc-pvtz para os cálculos (ZHAO; TRUHLAR, 2008).
41
RESULTADOS E
DISCUSSÕES
42 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Estima-se que o vírus da gripe H1N1 esteja presente na população humana há muitos séculos (WRIGHT, 2007), gerando transtornos na economia em virtude dos gastos com a profilaxia e tratamento (HUSSAIN et al., 2017), além de ser responsável por uma alta taxa de morbidade e mortalidade devido a sua alta transmissibilidade e as frequentes mutações nos seus antígenos de superfície (WU et L., 2017). Sabe-se que no decurso de uma pandemia, a produção de vacina se torna inviável devido ao fato de que não pode ser realizada com a velocidade necessária para interromper o progresso de uma nova cepa do vírus, portanto, os agentes antivirais são vistos como recurso fundamental (MOSCONA, 2005).
Embora o oseltamivir e o zanamivir, os quais pertencem à classe dos inibidores da neuraminidase, sejam atualmente os agentes de escolha por apresentar vantagens em relação aos outros fármacos, já surgiram casos de resistência a eles, o que se tornou motivo de preocupação para as autoridades governamentais responsáveis, por ainda não ter sido elaboradas outras alternativas que possam evitar a disseminação da doença. Portanto, o desenvolvimento de medicamentos antivirais está intimamente relacionado à neuraminidase mutante em complexo com seus alvos moleculares, logo, identificar os resíduos desses sistemas com as interações energéticas de maior relevância e comparar o mecanismo de atuação dos dois fármacos são os principais objetivos desse estudo.
Os cálculos foram realizados utilizando as estruturas cristalográficas da neuraminidase selvagem e mutante ligadas aos fármacos oseltamivir e zanamivir, baseado em termos de energia livre de Gibbs, pois a interação entre fármaco-receptor trata-se de um processo espontâneo. Sabendo-se que a metodologia do MFCC decompõe uma molécula inteira de proteína em vários fragmentos de aminoácidos, é possível a partir dessa quebra, avaliar a anergia de ligação de cada aminoácido individualmente e visualizar as alterações que a mutação mais recorrente (His274Tir) causa nos dois fármacos.
43 A partir desse momento, os valores das energias de interação obtidos são na constante dielétrica de 40, a qual representa melhor o ambiente de solvatação (OURIQUE et al., 2016; NETO et al., 2018). Para o complexo da NA selvagem em interação com o oseltamivir, o raio (r) variou de 2,0 Å até 10,00 Å, no qual foram considerados 89 resíduos, correspondendo ao valor energético de -115.02 (Kcal/mol). Como podemos observar no gráfico da figura 15 – A, a convergência foi atingida no raio de 5 Å, ou seja, os valores energéticos dos resíduos de aminoácidos obtidos a partir desse raio não influenciaram mais nos resultados por serem variações irrisórias. Além disso, os resíduos de aminoácidos destacados foram responsáveis pelas maiores variações energéticas, Glu276 e Asp243 provocaram variações negativas e Glu227 provocou uma variação positiva. Para o complexo da NA mutante em interação com o oseltamivir, o raio (r) variou de 2,0 Å até 10,00 Å, no qual foram
considerados 87 resíduos, correspondendo ao valor energético de -110.74 (Kcal/mol). A convergência foi atingida no raio de 3,5 Å e os resíduos de aminoácidos Leu134 e Asp324 provocaram variações positivas, enquanto Ala180 e Asp198 provocaram variações negativas (figura 15 – B).
Para o complexo da NA selvagem em interação com o zanamivir, o raio (r) variou de 2,0 Å até 10,00 Å, no qual foram considerados 93 resíduos, correspondendo ao valor energético de -123.07 (Kcal/mol). A convergência deste sistema foi atingida no raio de 3 Å e todos os resíduos destacados (Arg292, Asn347, Gly405, Arg430) provocaram variações negativas (figura 15 – C). Por fim, para o complexo da NA mutante em interação com o zanamivir o raio (r) variou de 2,0 Å até 10,00 Å, no qual foram considerados 95 resíduos, correspondendo ao valor energético de -133.73
(Kcal/mol). A convergência também foi atingida no raio de 3 Å e o resíduo Ala177 provocou variação positiva e Arg292, Asp293 e Arg300 provocaram variações energéticas negativas (figura 15 – D).
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Figura 15 - Total da energia de interação em relação ao raio no decorrer do estudo de convergência,
considerando os dois agonistas estudados: Oseltamivir (A) e (B) e Zanamivir (C) e (D) sob as constantes ε=10 e ε=40. Os resíduos de aminoácidos destacados foram os responsáveis pelas regiões de maior variação negativa ou positiva.
Para o complexo da neuraminidase selvagem em interação com o oseltamivir, 9 resíduos de aminoácidos apresentaram energias de atração mais relevantes, os quais foram: Asp151 (-18.08 Kcal/mol) > Arg292 (-17.31 Kcal/mol) > Arg371 (-16.51 Kcal/mol) > Glu119 (-15.00 Kcal/mol) > Glu227 (-9.03 Kcal/mol) > Arg118 (-6.46 Kcal/mol) > Arg152 (-4.47 Kcal/mol) > Asn347 (-4.01 Kcal/mol). Já o que apresentou característica repulsiva mais importante foi somente a Arg156 (1.85 Kcal/mol). Destes resíduos, Arg118; Arg371; Arg292 e Asn347 se ligam a estrutura do oseltamivir através da região I, Glu119; Asp151; Arg152; Arg156 e Glu227 se ligam através da região II e His274 se liga através da região III (Figura 16 – A).
45 Em relação a neuraminidase mutante em interação com o oseltamivir, 9 resíduos de aminoácidos apresentaram energias de atração mais importantes, os quais foram: Arg371 (-19.03 Kcal/mol) > Glu119 (-13.14 Kcal/mol) > Arg292 (-13.03 Kcal/mol) > Asp151(-10.96 Kcal/mol) > Arg118 (-8.30 Kcal/mol) > Arg152 (-6.71 Kcal/mol) > Glu277 (-6.66 Kcal/mol) > Tir347 (-6.55 Kcal/mol) > Tir274 (0.63 Kcal/mol). Destes resíduos, Arg118; Arg371; Asp151; Tir347 e Glu277 se ligam a estrutura do oseltamivir através da região I, Glu119 e Arg152 se ligam através da região II e Arg292 e Tir274 se ligam através da região III (Figura 16 – B).
Os resultados demonstram, ainda, os resíduos dos aminoácidos da neuraminidase selvagem em interação com o fármaco zanamivir, , 13 apresentaram energias de interação mais importantes, os quais foram: Arg371 (-19.97 Kcal/mol) > Asp151 (-17.26 Kcal/mol) > Arg292 (-16.13 Kcal/mol) > Glu276 (-14.37 Kcal/mol) > Arg118 (-12.72 Kcal/mol) > Glu277 (-11.13 Kcal/mol) > Trp178 (-10.43 Kcal/mol) > Glu227 (-8.76 Kcal/mol) > Arg152 (-7.11 Kcal/mol) > Ser179 (-5.33 Kcal/mol) > Asn347 (-1.41 Kcal/mol) > His274 (-0.25 Kcal/mol). Apenas o resíduo Arg156 (3.56 Kcal/mol) apresentou energia repulsiva mais relevante. Destes resíduos, Arg118; Arg371; Arg292 e Glu277 se ligam a estrutura do oseltamivir através da região I, Asp151; Trp178; Arg152; Arg156; Ser179 e Glu227 se ligam através da região II e Glu276; His274 e Asn347 se ligam através da região III (Figura 16 – C).
E temos, por fim, os resíduos da neuraminidase mutante em interação com o zanamivir, no qual 12 resíduos de aminoácidos apresentaram energias de atração mais relevantes, os quais foram: Asp151 (-19.31 Kcal/mol) > Arg371 (-17.23 Kcal/mol) > Arg292 (-16.24 Kcal/mol) > Glu277 (-11.05 Kcal/mol) > Glu276 (-8.89 Kcal/mol) >
Arg118 (-8.57 Kcal/mol) > Arg152 (-8.44 Kcal/mol) > Trp178 (-8.07 Kcal/mol) > Glu227 (-6.66 Kcal/mol) > Tir347 (-6.26 Kcal/mol). Somente os resíduos Arg156 e Tir274 apresentaram características repulsivas mais importantes com energia de (1.30 Kcal/mol) e (0.17 Kcal/mol), respectivamente. Destes resíduos, Arg118; Arg371; Arg292; Tir347 e Glu277 se ligam a estrutura do oseltamivir através da região I, Asp151; Arg152; Arg156; Trp178 e Glu227 se ligam através da região II e Glu276 e Tir274 se ligam através da região III.(Figura 16 – D).
46 Figura 16 - Gráficos com os valores energéticos dos resíduos mais relevantes que contribuem para a interação dos complexos: (A) oseltamivir; (B) NAmutante-oseltamivir; (C) NAselvagem-zanamivir e (D) NAmutante-NAselvagem-zanamivir. As distâncias de cada resíduo em relação às drogas são apresentadas em angstrons (Å), com o detalhamento das regiões e os átomos dos ligantes que interagem com cada resíduo no local de ligação.
No complexo da neuraminidase sem a presença da mutação em interação com o oseltamivir, 3 resíduos foram responsáveis pelas maiores energias de interação: o Asp151 com energia de -18.08 Kcal/mol, a uma distância mínima de 2.24 Å do ligante. Se comunica com este através da região II e possui ligação direta com o substrato no sítio catalítico (VARGHESE et al., 2016); o Arg292 com energia de -17.31 Kcal/mol, a uma distância mínima de 2.12 Å e Arg371 com energia de -16.51, a uma distância mínima de 1.68 Å. Os dois últimos comunicam-se com o oseltamivir através da região I e todos os 3 realizam ligações de hidrogênio. Em um estudo realizado, é demonstrado que, se Arg371 sofrer uma mutação, acarretará na diminuição da ligação receptor-ligante em 59 vezes (VAVRICKA, C. J. et al., 2011). Já no complexo da
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neuraminidase com a presença da mutação em interação com o oseltamivir, os 3 resíduos que apresentaram as maiores energias de ligação foram: Arg371 com energia de -19.03 Kcal/mol, a uma distância mínima de 1.72 Å do oseltamivir e se comunica com o mesmo através da região I; o Glu119 com energia de -13.14 Kcal/mol, a uma distância mínima de 1.91 Å e se comunica com o ligante através da região II, e por fim, o Arg292 com energia de -13.03 Kcal/mol, a uma distância mínima de 2.38 Å e se comunica com o ligante através da região III. Além disso, todos eles também realizam ligações de hidrogênio com o oseltamivir. Os resíduos Glu119 e Arg292 são de extrema importância no processo de sinalização fármaco-receptor (COLLINS, P. J.
et al., 2008).
Com relação ao complexo da neuraminidase selvagem em interação com o fármaco zanamivir, os 3 resíduos responsáveis pelas energias mais elevadas foram: Arg371 com energia de -19.97 Kcal/mol e se comunica com o ligante através da região I com uma distância mínima de 1.64 Å; o Asp151 com energia de -17.26 Kcal/mol e se comunica com o ligante através da região II a uma distância mínima de 1.97 Å e Arg292 com energia de -16.13 Kcal/mol que se comunica com o zanamivir através da região I a uma distância mínima de 2.29 Å. Todos eles se ligam à droga por meio de ligações de hidrogênio. Essas ligações estão envolvidas no reconhecimento fármaco-receptor, tal como para a estabilidade da interação (HU; WANG, 2013). E, ainda temos, os 3 resíduos com energias de interações mais elevadas do complexo da neuraminidase mutante em interação com o zanamivir, os quais são: Asp151 com energia de -19.31 Kcal/mol que se comunica com o ligante através da região II a uma distância mínima de 1.96 Å e ajuda a posicionar o ligante para se acoplar ao sítio ativo do receptor (RUDRAWAR, S. et al., 2016); Arg371 com energia de -17.23 Kcal/mol que se comunica com o ligante através da região I a uma distância mínima de 1.73 Å e Arg292 com energia de -16.24 Kcal/mol que também se comunica com o ligante através da região I a uma distância mínima de 2.38 Å. Além disso, todos eles também realizam ligações de hidrogênio com o zanamivir (Figura 17).
51 Figura 17 – Resíduos com energias de interação mais elevadas do complexo da NA selvagem – Oseltamivir (A); resíduos com energias de interação mais elevadas do complexo da NA mutante – Oseltamivir (B); resíduos com energias de interação mais elevadas do complexo da NA selvagem – Zanamivir (C) e resíduos com energias de interação mais elevadas do complexo da NA mutante – Zanamivir (D).
52 As ligações de hidrogênio são as mais importantes interações não-covalentes existentes nos sistemas biológicos. Essa ligação é formada entre o hidrogênio e os heteroátomos eletronegativos (Oxigênio, nitrogênio, flúor) (BARREIRO; FRAGA, 2008). Esse tipo de ligação não é tão forte como as ligações covalentes, porém, é mais longa e ocorre em maior quantidade criando uma estabilidade no sistema (VOLLHARDT et al., 1998). Os resíduos citados acima apresentam uma maior quantidade desse tipo de interação em relação aos outros, e devido a isso, se destacaram por apresentar as energias de interação mais elevadas.
As forças eletrostáticas são aquelas que resultam da interação entre dipolos e/ou íons de cargas contrárias e depende diretamente da constante dielétrica do meio e da distância entre as cargas. Em proteínas, esse tipo de interação acontece devido a presença de aminoácidos que se encontram ionizados em pH fisiológico, seja em caráter básico ou positivo (arginina, lisina, histidina) ou aminoácidos com caráter ácido ou negativos (ácido glutâmico e ácido aspártico). Nos sistemas em questão temos a arginina e histidina com cargas positivas e ácido glutâmico e ácido aspártico com cargas negativas interagindo com os grupos carregados dos fármacos oseltamivir e zanamivir. Um dos tipos de interação das forças de atração eletrostática é a dipolo-dipolo, na qual há interação entre dois grupamentos com polarizações de cargas opostas, essa polarização é explicada pela diferença de eletronegatividade entre um átomo de oxigênio e um átomo de carbono (BARREIRO; FRAGA, 2008). Tanto na estrutura do oseltamivir quanto na estrutura do zanamivir temos a presença do grupo funcional carbonil (C=O) em todas as regiões, além disso, no sítio ativo de interação entre a neuraminidase selvagem e mutante associada ao zanamivir, o resíduo Glu276 realiza esse tipo de interação, comunicando-se com o ligante através da região III, com distâncias mínimas de 2.58 Å e 2.53 Å e energias de -14.37 Kcal/mol e -8.89 Kcal/mol, respectivamente.
As forças de dispersão, como as interações de van de Walls, são caracterizadas pela proximidade de moléculas apolares que apresentam dipolos induzidos, normalmente, essas interações possuem fracas energias e ocorrem devido à polarização de ligações carbono-hidrogênio ou carbono-carbono. Entretanto, são de extrema importância para o processo de reconhecimento molecular do fármaco pelo
53 receptor, visto que formam várias interações e, quando somadas, provocam contribuições energéticas consideráveis (BARREIRO; FRAGA, 2008). No sítio ativo da neuraminidase selvagem e mutante associada ao oseltamivir, a Arg118 realiza esse tipo de interação, comunicando-se com o ligante através da região I, a uma distância mínima de 1,99 Å e 1,79 Å com energias de -6.46 Kcal/mol e -8.30 Kcal/mol, respectivamente. Já no sítio ativo da neuraminidase selvagem e mutante associada ao zanamivir, a Arg118 realiza ligações de van de Walls com o ligante através da região I, a uma distância mínima de 1.69 Å e 1.68 Å com energias de -12.52 Kcal/mol e -8.57 Kcal/mol, respectivamente. Este tipo de interação compensa a perda de hidrogênio sofrida por eles (TRAFALIS et al., 2006).
Como as forças de dispersão, as interações hidrofóbicas também são fracas e ocorrem em função da interação entre cadeias ou subunidades apolares. As cadeias hidrofóbicas presentes tanto no receptor, quanto no ligante, geralmente, estão solvatadas por moléculas de água e a importância desse tipo de interação é devido ao reconhecimento da micromolécula pela macrobiomolécula (BARREIRO; FRAGA 2008) A região III dos ligantes se caracterizam por serem apolares, por consequência, são as regiões que realizam interações hidrofóbicas no sistema. A importância da região se dá, possivelmente, por ela provocar um colapso na estrutura organizada da água do sistema e promover um ganho entrópico entre a neuraminidase e os fármacos que permitirá a interação desses devido a desorganização do sistema.
Diante dos resultados, a energia total de interação do zanamivir em interação com a neuraminidase mutante foi significativamente maior que a energia total de interação do oseltamivir em interação com a neuraminidase com a mesma mutação (His274Tir). De acordo com os dados da literatura, a substituição pelo resíduo de tirosina que é mais volumoso empurra o grupo carboxila do Glu277, o deixando 2 Å
mais distante do local de ligação, nesta posição, o grupo carregado bloqueia a bolsa hidrofóbica que normalmente acomoda o oseltamivir, induzindo o movimento dos seus carbonos C9 e C91, o que causa um reposicionamento na conformação do inibidor e impede que ele se ligue de forma correta no sítio ativo da neuraminidase. No entanto, tal mutação não provoca uma resistência total ao oseltamivir, embora não se ligue de forma adequada, ele ainda é reconhecido pela neuraminidase, visto que o sítio ativo estrutural é bem conservado e não há ocorrência de mutação. Com relação ao
