Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Diagnóstico de mastites subclínicas em caprinos
Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Ana Margarida Amaral Sequeira
Orientador
Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho
Coorientador
Dr. Hélder Miranda Pires Quintas
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Diagnóstico de mastites subclínicas em caprinos
Ana Margarida Amaral Sequeira
Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho
Dr. Hélder Miranda Pires Quintas
Composição do júri:
Professora Doutora Maria da Conceição Medeiros Castro Fontes
Professor Doutor João Carlos Caetano Simões
Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho
iii Dissertação apresentada à Escola de Ciências Agrárias e Veterinárias - Departamento de Ciências Veterinárias - da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária.
v “Aprenda como se fosse viver para sempre. Viva como se fosse morrer amanhã.”
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar gostaria de agradecer à Professora Doutora Ana Cláudia Coelho por ter aceitado orientar a minha dissertação e por toda a motivação, simpatia e disponibilidade demonstradas.
Ao Dr. Hélder Quintas, que aceitou coorientar este trabalho. Obrigada por todo o seu empenho, transmissão de conhecimentos, incentivo, paciência e conselhos dispensados.
Ao Professor Doutor Álvaro Mendonça por me permitir fazer parte deste estudo e no qual tive imenso gosto em cooperar.
Ao Professor Rui Abreu e toda a equipa do laboratório de bioquímica do CIMO, no IPB, em especial à Inês, por todo o apoio e esclarecimento de dúvidas.
Um agradecimento especial a toda a equipa da ACRIGA, pela forma maravilhosa como me receberam e integraram, por todos os conhecimentos partilhados e empatia.
Ao Dr. Rui Guedes Marques e à enfermeira Joana por toda a paciência e instrução durante o meu estágio na Clínica Veterinária Vet Lamego.
Aos meus amigos que me acompanharam nos últimos 6 anos. Cathy, Sónia, Lipa, Vânia, Sara V., Sara C., Joh, Leo, Cláudia, Rafa, Lita, João, Agostinho e Ricardo. Tenho a certeza absoluta que sem vocês nada disto seria possível. A vocês o meu eterno obrigada, vão estar para sempre no meu coração.
A ti, Zé Diogo, por me fazeres acreditar em mim e ajudares a ultrapassar inúmeros obstáculos.
À minha mãe, por seres quem és. Por seres o meu porto seguro e um exemplo a seguir.
Ao meu pai, talvez o grande responsável pela minha paixão pelos animais e pela veterinária.
À Iris, por me mostrares que cada esforço valeu e vale a pena.
E por fim, de modo a não cair em injustiças quero agradecer a todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a pessoa que sou e permitiram a concretização deste projeto.
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RESUMO
Existem vários métodos disponíveis para o diagnóstico de mastites subclínicas. No entanto, é necessário ter em consideração que há diferenças entre espécies, principalmente no que diz respeito às contagens de células somáticas. Assim, a extrapolação dos resultados verificados em ovinos e bovinos pode conduzir a erros na deteção de casos de inflamação da glândula mamária em caprinos.
Com este estudo pretendeu-se avaliar, comparativamente, a utilidade da contagem bacteriana por cultura (PCA-Plate Count Agar), do Teste Californiano de Mastites (TCM), da contagem de células somáticas pelo método fluoro-opto-eletrónico (Fossomatic) e do doseamento de Amilóide A do leite através de um ensaio imunoenzimático no diagnóstico de mastites em caprinos. Adicionalmente, estimou-se a ocorrência de mastites subclínicas segundo o número de lactações dos animais e a influência do número de partos na contagem de células somáticas. Avaliou-se, ainda, a variação das contagens destas células durante o período em que decorreu o estudo.
Para a realização deste trabalho foram utilizadas 144 amostras, correspondentes a uma metade mamária de 12 cabras Serranas, recolhidas semanalmente, durante 6 semanas consecutivas, no período da manhã e previamente à ordenha.
O número de metades mamárias infetadas obtido foi de 37 (25,7%). Verificou-se uma associação entre os resultados da cultura e do TCM. Segundo os valores obtidos, as metades mamárias com resultado igual ou superior a 2 são diagnosticadas como infetadas, com uma sensibilidade de 43,2% e especificidade de 77,6%, o que sugere que este teste é mais eficiente em identificar úberes sem infeção do que infetados.
A média aritmética da contagem de células somáticas das metades mamárias sem infeção foi superior às infetadas, 3472.000 e 1999.000 células/mL, respetivamente. Já o valor da média geométrica foi superior nas glândulas mamárias com resultado positivo na cultura bacteriana, 1261.000 células/mL, face às que apresentaram resultados negativos, 920.000 células/mL, porém as diferenças encontradas não foram estatisticamente significativas.
Os resultados das concentrações de Amilóide A do leite mostraram diferenças significativas entre as glândulas mamárias saudáveis e as que apresentavam mastites subclínicas e entre o grupo com mastites subclínicas inespecíficas e os restantes grupos.
Neste estudo as fêmeas multíparas apresentaram uma ocorrência de infeção intramamária (32%) superior às primíparas (13%). Animais com maior número de lactações revelaram contagens de células somáticas significativamente mais elevadas do que os mais
x jovens. Todavia, durante o período em decorreu o estudo, não possível verificar uma variação marcada na contagem de células somáticas.
Palavras-chave: cabra, mastites subclínicas, cultura bacteriana, Teste Californiano de Mastites, contagem de células somáticas, Amilóide A do leite.
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ABSTRACT
There are several methods available for the diagnosis of subclinical mastitis. However, it is necessary to take into account that there are differences between species, particularly with somatic cells count. Thus, the extrapolation of the results in sheep and cattle can lead to mistakes in detecting cases of inflammation of the mammary gland in goats.
The aim of this study was to comparatively evaluate the utility of bacterial counting by culture (PCA-Plate Count Agar), California Mastitis Test (CMT), the somatic cells count by the fluoro-opto-electronic method (Fossomatic), and the measuring of milk Amyloid A through the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) to diagnose mastitis in goats. Additionally, we estimated the occurrence of subclinical mastitis according to the number of lactations and the influence of the number of births in somatic cells count. We also evaluated the variation of these cells counts during the period of the present study.
In this study 144 samples were analysed, corresponding to one udder half of 12 Serranas goats, collected weekly for 6 consecutive weeks, in the morning and prior to the milking.
The number of infected udder halves was 37 (25.7%). There was an association between the results of the culture and CMT. According to the obtained values, the udder halves results in equal or higher than 2, these are diagnosed as infected with a sensitivity of 43.2% and specificity of 77.6%, suggesting that assay is more efficient to identify healthy udder halves that infected.
The arithmetic mean of the somatic cells count of udder halves non-infected was higher comparing to the infected halves, 3472.000 and 1999.000 cells/mL, respectively. The geometric mean was higher in mammary glands with positive results in bacterial culture, 1261.000 cells/mL, comparing to those samples with negative results, 920.000 cells/mL, but the differences were not statistically significant.
The results of milk Amyloid A concentrations showed significant differences between healthy mammary glands and mammary glands with subclinical mastitis, and between the group presenting non-specific subclinical mastitis and the other groups.
In this study, multiparous females showed an intramammary infection occurrence (32%) higher than the primiparous (13%). Animals with the largest number of lactations revealed a somatic cells count significantly higher than the younger ones. However, during the period of the study, it was not possible to detect an important variation in the somatic cells count.
xii Keywords: goat, subclinical mastitis, bacterial culture, California Mastitis Test, somatic cells count, milk Amyloid A.
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ÍNDICE GERAL
1. INTRODUÇÃO ...1
2. MASTITES ...3
2.1. Definição ...3
2.2. Anatomia e fisiologia do complexo mamário ...3
2.3. Patogenia ...4
2.3.1. Reação inflamatória ...5
2.4. Tipos de mastites ...7
2.5. Importância das mastites ...8
2.6. Etiologia ...9
2.6.1. Agentes patogénicos contagiosos, ambientais ou oportunistas...9
2.6.2. Agentes patogénicos major ou minor ...10
2.6.3. Principais agentes etiológicos de mastites ...11
2.6.3.1. Staphylococcus aureus ...11
2.6.3.2. Staphylococcus coagulase negativos ...13
2.6.3.3. Streptococcus spp. ...14
2.6.3.4. Mycoplasma spp. ...15
2.6.3.5. Outros agentes bacterianos ...16
2.6.3.6. Mastites provocadas por fungos ...17
2.6.3.7. Vírus da artrite-encefalite caprina ...17
2.7. Fatores de risco na ocorrência de mastites e medidas de controlo ...18
2.7.1. Fatores de variação do animal ...19
2.7.2. Fatores ambientais e de maneio ...19
2.7.3. Vacinas ...21
2.8. Diagnóstico ...22
2.8.1. Exame clínico ...22
xiv
2.8.2.1. Exame bacteriológico ...23
2.8.3. Testes indiretos ...25
2.8.3.1. Contagem de células somáticas ...25
2.8.3.1.1. Valores limite das CCS...26
2.8.3.1.2. Fatores de variação da CCS ...27
2.8.3.2. Proteínas da fase aguda da inflamação ...31
2.8.3.3. Outros testes indiretos ...32
2.9. Tratamento ...32
2.9.1. Tratamento de mastites clínicas ...32
2.9.2. Tratamentos de mastites subclínicas ...34
3. OBJETIVOS ...37
4. MATERIAIS E MÉTODOS ...39
4.1. Animais e amostras ...39
4.2. Procedimentos ...40
4.2.1. Recolha de amostras ...40
4.2.2. Testes Californiano de Mastites ...41
4.2.3. Cultura bacteriana...42
4.2.4. Contagem de células somáticas ...43
4.2.5. Doseamento da concentração de Amilóide A do leite ...43
4.2.5.1. Grupos para avaliar o doseamento de Amilóide A do leite ...45
4.3. Análise de dados ...46
5. RESULTADOS ...47
5.1. Cultura bacteriana ...47
5.2. Teste Californiano de Mastites ...48
5.2.1. Cálculo da sensibilidade e da especificidade ...49
5.3. Contagem de células somáticas ...50
5.4. Doseamento da Amilóide A do leite ...51
xv
5.6. Influência do número de lactações/partos na CCS ...53
5.7. Variação das CCS durante o período do estudo ...54
6. DISCUSSÃO ...55
7. CONCLUSÃO ...61
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1- Complexo mamário, secção medial. ...3
Figura 2- Sinais cardinais da inflamação aguda e como são gerados. ...6
Figura 3- Fase precoce de uma mastite gangrenosa, com eritema e edema do úbere. ...12
Figura 4- Etiologia das IIM subclínicas caprinas. ...13
Figura 5- Média da produção leiteira diária de caprinos seropositivos e seronegativos a CAEV. ...18
Figura 6- Gânglio linfático mamário reativo, compatível com uma situação de mastite crónica. ...22
Figura 7- Leite mamítico. Secreção serosa com coágulos de caseína...23
Figura 8- Percentagem de falsos positivos de acordo com os resultados do diagnóstico bacteriológico a partir de amostras obtidas antes e após a ordenha. ...24
Figura 9- Efeito dos dias em lactação e do número de lactações na CCS no leite de cabra .29 Figura 10- Recolha das amostras. ...41
Figura 11- Teste Californiano de Mastites. ...41
Figura 12- Preparação das placas de Petri para cultura bacteriana com adição do meio PCA. ...42
Figura 13- Contador automático de células somáticas FOSS MilkoScan® 6000. ...43
Figura 14- Placa de 96 poços, utilizada no ensaio imunoenzimático, após adição da solução de paragem. ...45
Figura 15- Resultados da cultura bacteriana em PCA. ...47
Figura 16- Diferenças nas concentrações de Amilóide A do leite dos grupos das metades mamárias. ...52
Figura 17- Variação das médias geométricas das amostras, negativas ao exame bacteriológico, durante o período em que decorreu o estudo. ...54
xix
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1- Espécies de Staphylococcus encontradas no leite de cabra e a sua sensibilidade à
novobiocina. ...14
Tabela 2- Resultados das CCS do leite em animais sem e com infeção a nível da glândula mamária de acordo com diferentes estudos. ...26
Tabela 3- Resultado obtido no TCM e correspondente CCS. ...30
Tabela 4- Eficácia da distribuição dos agentes antibacterianos a nível da glândula mamária. ...33
Tabela 5- Idade, número de partos e classificação CCI dos animais que constituíram amostra. ...39
Tabela 6- Resultado do TCM correspondente à reação visível. ...42
Tabela 7- Preparação da curva padrão. ...44
Tabela 8- Percentagem de positividade na cultura bacteriana de acordo com as variáveis em estudo. ...48
Tabela 9- Distribuição dos resultados positivos em cultura pelas semanas em estudo. ...48
Tabela 10- Distribuição dos resultados positivos em cultura pelos resultados do Teste Californiano de Mastites. ...49
Tabela 11- Testes Californiano de Mastites versus resultados em cultura. ...49
Tabela 12- Médias aritméticas dos grupos estatísticos. ...50
Tabela 13- Médias geométricas dos grupos estatísticos em escala logarítmica. ...50
Tabela 14- Comparação das médias geométricas entre grupos (em escala logarítmica). ....50
Tabela 15- Ocorrência (%) dos grupos das metades mamárias. ...51
Tabela 16- Medidas de variabilidade, média, desvio padrão, erro padrão, valor mínimo, valor máximo e intervalo de confiança 95%, para a concentração de Amilóide A do leite nos diferentes grupos considerados. ...51
Tabela 17- Médias das concentrações de Amilóide A do leite dos grupos de metades mamárias avaliados, em escala logarítmica. ...52
Tabela 18- Comparação dos grupos das metades mamárias (em escala logarítmica). ...53
Tabela 19- Ocorrência de mastites subclínicas em fêmeas primíparas e multíparas. ...53
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS, SÍMBOLOS OU ACRÓMIOS
- Alpha
- Beta
L- Microlitros
g- Microgramas AA- Amilóide A
AC- Agalaxia contagiosa
ACTH- Hormona adrenocoticotrófica ADN- Ácido desoxirribonucleico
AINES- Anti-inflamatório não esteroide ARN- Ácido ribonucleico
CAEV- Vírus da artrite-encefalite caprina CCI- Concentração celular individual CCS- Contagem de células somáticas CS- Células somáticas
DP- Desvio padrão
ELISA- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EP- Erro padrão
EUA- Estados Unidos da América FAO- Food Agriculture Organization IC- Intervalo de confiança
iCCS- Contagem de células somáticas individual IDF- International Dairy Federation
Ig- Imunoglobulinas IIM- Infeção intramamária mL- Mililitro
NAGase- N-acetil-beta-D-glucosaminidase nm- Nanómetros
p- Nível de significância estatística PCA- Plate Count Agar
PFA- Proteínas da fase aguda
SCN- Staphylococcus coagulase negativos t- Valor do teste t de Student
xxii TS- Tryptone Salt Broth
UFC- Unidades formadoras de colónias χ2- Valor do teste qui quadrado
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1. INTRODUÇÃO
A cabra (Capra hircus) é um animal que apresenta uma enorme adaptabilidade e facilidade em prosperar sob condições ambientais e geográficas extremas (Smith e Sherman, 2009). Este fator, aliado à diversidade de produtos e subprodutos, resultantes da sua exploração, carne, leite, pelo e pele, fazem com que este animal seja considerado bastante rentável e atrativo (Haenlein, 2001). De acordo com os dados da Food Agriculture Organization (FAO), o número de cabras, a nível mundial, era de 464 milhões em 1980 tendo aumentado para 924 milhões em 2011 (FAO, 2014).
A ideia de que produção de caprinos, muitas vezes designados por “vacas dos pobres”, é sinónimo de pobreza e pouco desenvolvimento faz parte, cada vez mais, do passado. Na Europa, o leite de cabra tem um papel significativo na economia de vários países, sobretudo na zona mediterrânica, como é o caso da França, Itália, Espanha e Grécia (Haenlein, 2001). Em Portugal, estima-se que no ano de 2013, foram produzidos por caprinos cerca de 29,8 milhões de litros de leite (INE, 2014).
Nas últimas décadas tem-se assistido a uma evolução e intensificação dos sistemas de produção de caprinos leiteiros que, em algumas situações, não foram acompanhadas por melhorias das instalações, maneio e rotinas de ordenha, favorecendo, assim, as infeções intramamárias e consequentemente a incidência de mastites (Jimenez-granado et al., 2014). As mastites são responsáveis por perdas económicas extremamente elevadas nos ruminantes leiteiros e deste ponto de vista, a forma subclínica é a mais preocupante (Mendonça et al., 2001). Esta provoca importantes diminuições na produção e qualidade do leite e para proceder ao seu diagnóstico é necessário recorrer a métodos laboratoriais (Persson e Olofsson, 2011).
O diagnóstico realizado de forma precoce e eficaz é uma das medidas mais importantes no controlo desta doença (Persson e Olofsson, 2011). No entanto, é necessário ter em consideração que existem diferenças entre os bovinos, ovinos e caprinos e assim sendo, o controlo das mastites requer uma abordagem singular para cada espécie (Contreras et al., 2007). A extrapolação sistemática dos resultados de investigações desenvolvidas em bovinos para os pequenos ruminantes, pode levar, não só, a erros no diagnóstico, mas também, conduzir a uma aplicação de normas, referentes à qualidade do leite, discriminatória para estes animais (Luengo et al., 2004). A principal particularidade dos caprinos, face aos ovinos e bovinos, prende-se com as diferenças fisiológicas na secreção leiteira que influenciam a contagem de células somáticas do leite. Para além deste facto, existem, também, inúmeros fatores de natureza infeciosa e não infeciosa que afetam a
2 concentração destas células (Souza et al., 2012). Deste modo, em caprinos, são necessários estudos que permitam melhorar o conhecimento e interpretação das ferramentas de diagnósticos disponíveis (Koop et al., 2012b).
Este trabalho inclui uma revisão bibliográfica focada nos meios de diagnóstico de mastites subclínicas em caprinos, bem como uma abordagem geral dos conhecimentos atuais acerca das mastites nesta espécie animal.
A parte de investigação deste documento é constituída por um estudo realizado em 12 fêmeas de raça Serrana, que faziam parte do efetivo da Escola Superior Agrária, do Instituto Politécnico de Bragança. As amostras foram recolhidas uma vez por semana, durante seis semanas consecutivas, perfazendo um total de 144 amostras. Este estudo teve como principal objetivo avaliar a utilidade da cultura bacteriana, da contagem de células somáticas, do Teste Californiano de Mastites e da mensuração de Amilóide A do leite na deteção de cabras com mastites subclínicas.
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2. MASTITES
2.1. Definição
Mastite ou mamite definem-se, de uma forma ampla, como uma inflamação da glândula mamária (Marjorie, 2006; Stubbs e Abud, 2009; Contreras e Rodríguez, 2011). Esta surge, na maioria dos casos, em resposta a uma infeção intramamária (IIM) por microrganismos, sobretudo bactérias (Koop, 2012), mas também por ação de toxinas bacterianas, traumatismos, irritações químicas e queimaduras térmicas (Corrales et al., 1997; Philpot e Nickerson, 2001). Trata-se de uma doença bastante complexa (Scott et al., 2011), em que é possível destacar como fatores determinantes a resistência do hospedeiro, o agente etiológico em causa e o meio ambiente (Erskine, 2001).
2.2. Anatomia e fisiologia do complexo mamário
A estrutura mamária da cabra encontra-se na região inguinal (Bragulla et al., 2012). Esta é composta por duas glândulas, metades, que são independentes do ponto de vista funcional e anatómico. Cada metade é suportada por um ligamento suspensor lateral e um ligamento suspensor medial, comum a ambas (Plummer e Plummer, 2012). O conjunto das duas glândulas é denominado por úbere ou corpo. O complexo mamário, representado na Figura 1, é constituído pelo úbere e teto (Constantinescu, 2010).
4 O úbere é formado por parênquima glandular (Bragulla et al., 2012) e encontra-se dividido em lobos que, por sua vez, se decompõem em lóbulos. Estes últimos são formados por um conjunto de alvéolos responsáveis por retirar do sangue as substâncias precursoras do leite e pela sua secreção (Constantinescu, 2010). Este processo é despoletado, antes do parto, através da diminuição dos níveis de progesterona e aumento do estrogénio, da hormona adrenocorticotrófica (ACTH) e da prolactina a nível sanguíneo (Park e Haenlein, 2010). Ao redor dos alvéolos estão localizadas as células mioepiteliais (Blowey, 1999; Constantinescu, 2010) que, ao contraírem por ação da oxitocina, tornam possível a transição do leite para os ductos alveolares (Park e Haenlein, 2010). No seu percurso até ao exterior, este é ainda transportado através dos ductos intralobulares, interlobular e galactóforos que convergem formando o seio galactóforo, também denominado por cisterna. A cisterna é constituída por duas porções, glandular e papilar (Constantinescu, 2010). É nesta separação que se encontra o anel venoso de Fürtenberg (Bragulla et al., 2012). A comunicação com o exterior dá-se através do orifício papilar que possui um anel muscular, esfíncter. Na união entre a cisterna papilar e o ducto papilar encontra-se uma mucosa pregueada, designada roseta de Fürtenberg. Verifica-se, ainda, a existência do ducto papilar, ou canal do teto, que no caso da espécie caprina possui uma forma cónica (Constantinescu, 2010).
A artéria pudenda externa, que se ramifica nas artérias mamárias medial e lateral, é a grande responsável pelo suprimento sanguíneo. Por sua vez, a drenagem venosa resulta da combinação da veia pudenda externa e ramos subcutâneos de veias abdominais e perineais (Plummer e Plummer, 2012). A drenagem linfática encontra-se a cargo dos gânglios linfáticos inguinais superficiais, também denominados por mamários (Bragulla et al., 2012).
A inervação da glândula é realizada pelo nervo genitofemoral com a contribuição superficial do nervo cutâneo lombar (a nível cranial) e do nervo pudendo (caudal) (Plummer e Plummer, 2012).
2.3. Patogenia
De uma forma resumida a patogenia das mastites pode ser dividida em três fases: invasão, infeção e inflamação (Singh et al., 2006).
Habitualmente, a invasão da glândula mamária por agentes patogénicos ocorre através do canal do teto (via ascendente) (Corrales et al., 1997). Para que ocorra uma mastite, por esta via, estes têm que transpor as barreiras anatómicas e fisiológicas do teto: o
5 esfíncter e a queratina, produzida pelo epitélio pavimentoso estratificado do canal. Esta última possui propriedades antibacterianas, resultado da sua composição em ácidos gordos e proteínas catiónicas e a sua acumulação pode resultar na obstrução física do canal. Estes fatores, aliados à constante descamação do epitélio constituem um obstáculo à invasão por agentes patogénicos (Amorena e Perez, 1998). No entanto, por via traumática, é também possível que os microrganismos alcancem a glândula mamária, veiculados por soluções de continuidade, resultantes de traumatismos, cirurgias, ou qualquer outra lesão do úbere e tetos (Radostits et al., 2007).
Com menor frequência, surgem ainda mastites, cujo agente advém de uma infeção com localização anatómica distinta da glândula mamária, mas que é eliminado através do leite (via descendente) (Contreras et al., 1997).
Na segunda fase, infeção, os organismos multiplicam-se velozmente e invadem o tecido mamário. Durante a multiplicação de determinados agentes patogénicos, como é o caso dos coliformes, ocorre a libertação de endotoxinas que conduzem a alterações sistémicas graves (Radostits et al., 2007).
Após os microrganismos alcançarem a glândula mamária, iniciam-se vários mecanismos inflamatórios com o objetivo de proceder à sua eliminação (Singh et al., 2006).
2.3.1. Reação inflamatória
Como resultado da inflamação da glândula mamária ocorre um aumento substancial do número de células somáticas. Por células somáticas entendem-se o conjunto dos leucócitos, sobretudo neutrófilos, macrófagos, linfócitos, uma pequena concentração de células epiteliais (Morn, 2009) e partículas citoplasmáticas (Jimenez-granado et al., 2014).
Os microrganismos fixam-se junto às células epiteliais dos ductos, utilizam nutrientes do leite e eliminam toxinas que alteram o epitélio glandular (Paape e Contreras, 2000). Inicia-se, assim, a defesa celular da glândula mamária. Os macrófagos, naturalmente presentes no leite e as células epiteliais, reconhecem os agentes patogénicos (Oviedo-Boyso et al., 2007) e libertam mediadores inflamatórios, citocinas e quimiocinas (Morn, 2009). Estes promovem a vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e a migração dos leucócitos do sangue para os tecidos lesados (Pacheco e Cardoso, 2007). Surgem, assim, os sinais clínicos característicos da inflamação aguda: rubor, calor, edema e dor (Tizard, 2004), esquematizados na Figura 2.
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Figura 2- Sinais cardinais da inflamação aguda e como são gerados (adaptado de Tizard, 2004).
Os neutrófilos ativados chegam ao foco inflamatório, reconhecem e fagocitam os agentes patogénicos (Pacheco e Cardoso, 2007).
Estas células imunitárias possuem dois mecanismos distintos para proceder à destruição dos agentes: mecanismos dependentes do oxigénio e mecanismos independentes do oxigénio. No primeiro, ocorre um processo denominado explosão respiratória (Pacheco e Cardoso, 2007), durante o qual são libertadas potentes moléculas antioxidantes que provocam, não só, a destruição dos microrganismos, mas também, a lesão de células epiteliais dos ductos e alvéolos mamários. No caso da destruição das células secretoras ser excessiva, verifica-se uma diminuição dos níveis de produção leiteira (Paape e Contreras, 2000).
Quanto aos mecanismos de destruição independentes do oxigénio, também designados por desgranulação, a ação é devida aos componentes antimicrobianos existentes no interior dos lisossomas, como a mieloperoxidase, gelatinase, lactoferrina e péptidos catiónicos, como as defensinas e bacteriocinas (Burton e Erskine, 2003).
Após concluírem as suas funções, os neutrófilos ingressam em morte celular programada (apoptose), são fagocitados e removidos pelos macrófagos (Morn, 2009).
Os macrófagos, tal como os neutrófilos, possuem a função destruir os agentes patogénicos, por explosão respiratória e desgranulação (Sordillo, 2005), fagocitar partículas estranhas e participar na apresentação de antigénios aos linfócitos (Amorena e Perez, 1998).
7 Da reação inflamatória fazem ainda parte os linfócitos T, B e células natural-killer que, devido às suas membranas ricas em recetores, encontram-se aptas para reconhecer uma grande variedade de estruturas antigénicas (Oviedo-Boyso et al., 2007).
Os linfócitos B atuam como produtores de anticorpos naturais, denominados imunoglobulinas (Ig), essencialmente, IgG1, IgG2 e IgM que participam na opsonização e IgA (Amorena e Perez, 1998). As IgA neutralizam toxinas bacterianas, aglutinam bactérias facilitando a sua eliminação através do leite e previnem a sua multiplicação e aderência ao epitélio (Singh et al., 2006).
A glândula mamária, para além das imunoglobulinas, possui ainda outros fatores bactericidas solúveis, como a lactoferrina e transferrina, proteínas que sequestram o ferro, impedindo que este seja utilizado pelas bactérias e a xantina oxidase, enzima bactericida através da produção de peroxidonitrito (Rainard e Riollet, 2006). Esta defesa é ainda constituída pelas enzimas lisozima e lactoperoxidase, que atacam a parede bacteriana e pelo componente C3 do complemento. Este age juntamente com a defesa celular na opsonização bacteriana (Amorena e Perez, 1998).
2.4. Tipos de mastites
Tendo em conta a existência ou não de sinais clínicos, as mastites podem ser divididas em dois grupos principais, as mastites subclinicas e mastites clínicas. As primeiras, que nos pequenos ruminantes, apresentam uma prevalência estimada de 5 a 30% (Contreras et al., 2007), caracterizam-se pela inexistência de sinais clínicos (Marogna et al., 2012). Assim, uma vez que não são reveladas através do exame físico do animal, torna-se necessário recorrer a testes laboratoriais para determinar a sua presença (Radostits et al., 2007), tais como a mensuração de células somáticas do leite (Miller et al., 2010). Mesmo na forma persistente, estas mastites não alteram o aspeto macroscópico do leite e apesar de provocarem a diminuição da produção leiteira, esta é gradual, o que dificulta a sua perceção (Contreras et al., 1997). Pelas razões apresentadas, durante a lactação, as mastites subclinicas raramente são detetadas e eliminadas (Bergonier et al., 2003).
Por sua vez, as mastites clínicas, também designadas por mastites “visíveis” (Contreras et al., 2007), assumem uma incidência menor que 5% por ano (Bergonier et al., 2003). Clinicamente caracterizam-se por alterações macroscópicas da secreção láctea, diminuição da produção leiteira (Marogna et al., 2012), sinais de inflamação do úbere e por vezes reações sistémicas, como febre e diminuição do apetite, tornando o exame físico suficiente para proceder à sua deteção (Contreras et al., 1997; Radostits et al., 2007). Estas
8 podem dividir-se, quanto à severidade, em: mastites subagudas, caracterizadas por uma inflamação moderada e alterações persistentes do leite; mastites agudas, descritas como uma inflamação grave da glândula mamária, sem manifestação sistémica marcada; e mastites hiperagudas, quando exibem uma inflamação severa e estão descritas alterações sistémicas graves, podendo mesmo conduzir à morte do animal (Radostits et al., 2007; Marogna et al., 2012).
Por outro lado, se o fator a ter em conta for a duração da inflamação, a divisão resulta em mastites agudas (Radostits et al., 2007), caracterizadas por um início súbito e sinais clínicos graves (Blowey e Edmondson, 2010) ou mastites crónicas. Estas correspondem a uma resposta inflamatória que persiste por um grande período de tempo e podem surgir na forma subclínica ou manifestar-se clinicamente (Marogna et al., 2012). Alguns autores consideram, ainda, um outro tipo, as mastites latentes, onde são detetados agentes bacterianos mas não se observa um incremento na contagem de células somáticas (CCS), nem qualquer outra alteração na secreção láctea. Segundo alguns autores, este conceito é ambíguo e deve ser evitado (Contreras et al., 1997).
2.5. Importância das mastites
A existência de mastites clínicas num rebanho é responsável por importantes perdas económicas, pois conduz à diminuição da produção leiteira e à rejeição do leite produzido, devido ao seu aspeto alterado, às elevadas CCS, ao tratamento e intervalo de segurança da medicação instituída. As mastites subclínicas podem provocar diminuições na produção superiores às verificadas nas mastites clínicas, no entanto, é complexo proceder à sua determinação. Alguns estudos apontam para reduções próximas de 20%, semelhante ao que acontece na espécie ovina (Contreras et al., 1997).
Outra repercussão importante é a quebra da qualidade do leite e consequentemente do seu preço. Este parâmetro pode ser avaliado segundo padrões bioquímicos, nomeadamente, pelas percentagens de gordura, proteína e extrato seco, que estão diminuídos em casos de mastites. O mesmo ocorre com os níveis de cálcio, fósforo e potássio e por oposição verifica-se um aumento dos componentes “indesejáveis”, como o cloro e o sódio. A qualidade higiénica (microbiológica) e sanitária do leite (CCS) também está comprometida (Contreras et al., 1997).
As mastites podem representar um perigo para a saúde dos consumidores, não só, pela presença de agentes zoonóticos eliminados através do leite, mas também, pela existência de determinadas toxinas resistentes aos tratamentos térmicos a que o leite é
9 submetido. Destas destacam-se as toxinas produzidas por Staphylococcus aureus, mas também por outras espécies de Staphylococcus. Outro potencial fator de risco está relacionado com a execução de medidas preventivas ou terapêuticas, de forma inadequada, que resultam na presença de resíduos no leite de antibióticos ou de produtos usados para desinfetar os tetos (Silanikove et al., 2010).
Existem, ainda, outras preocupações e custos associados à intervenção veterinária, à necessidade de aumentar a mão de obra e o tempo para proceder aos cuidados adicionais de prevenção de mastites, reposição de animais, refugo, morte e perda de potencial genético (Blowey, 1999). Animais que não ingerem o colostro tornam-se imunodeprimidos, por outro lado, se forem alimentadas com leite mamítico, a elevada concentração de agentes patogénicos pode provocar alterações locais, como estomatites e gastroenterites, septicémicas, ou até mesmo levar à morte da cria (Contreras et al., 1997).
2.6. Etiologia
As mastites caprinas, como já foi referido, possuem uma origem multifatorial. No entanto, as que apresentam natureza infeciosa devem-se, maioritariamente, a infeções bacterianas, podendo, também, surgir em resposta à presença de vírus e fungos (Corrales et al., 1997).
2.6.1. Agentes patogénicos contagiosos, ambientais ou oportunistas
Esta categorização apresenta como base o reservatório principal do agente e a sua forma de transmissão. Apesar de se tratar de uma divisão bastante simplista, esta estabelece o suporte para uma investigação de fatores de risco e criação de programas de controlo em rebanhos atingidos por esta doença (Corrales et al., 1997).
O reservatório principal dos agentes contagiosos é constituído pela glândula mamária ou teto. A transmissão torna-se possível quando ocorre o contacto do leite proveniente de uma glândula infetada com o teto de uma glândula desprovida de infeção. Este processo ocorre, fundamentalmente, durante a ordenha, através do leite residual presente nas tetinas da máquina de ordena, nas mãos dos ordenhadores e nas toalhas/panos usadas para limpar e secar múltiplos animais (Morn, 2009). A este grupo pertencem, por exemplo, Streptococcus (S.) agalactiae, Mycoplasma spp. e Staphylococcus (S.) aureus (Corrales et al., 1997).
10 Por sua vez, no caso dos agentes ambientais, tal como o próprio nome indica, o ambiente constitui o seu reservatório primário. A transmissão dos agentes, na maioria das vezes, ocorre de forma alheia ao período de ordenha, quando o teto entra em contacto com materiais contaminados, principalmente com fezes, mas também com o solo, camas, alimentos e águas contaminadas (Morn, 2009; Hogan e Smith, 2012). Neste grupo encontram-se os Streptococcus não agalactiae e os coliformes (Corrales et al., 1997).
São classificados como agentes oportunistas alguns microrganismos pertencentes ao género Staphylococcus (Corrales et al., 1997) que possuem como reservatório a pele do teto e do úbere. A sua designação resulta do facto, destes agentes, invadirem a glândula mamária quando as suas defesas se encontram comprometidas, ou associados a erros de higiene ou terapias aplicadas (Radostits et al., 2007). Bergonier et al. (2003) acrescentam, como exemplo de agentes oportunistas, as espécies Aspergilus fumigatus, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia e Serratia marcescens.
2.6.2. Agentes patogénicos major ou minor
Alguns autores apresentam, ainda, um outro sistema de divisão, também usado na espécie bovina (Radostits et al., 2007; Bradley et al., 2012), que organiza os principais agentes patogénicos segundo o grau de resposta inflamatória induzida a nível da glândula mamária (Souza et al., 2012). Nos bovinos, os agentes patogénicos major surgem associados a mastites clínicas, enquanto que os minor originam, essencialmente, inflamações subclinicas (Radostits et al., 2007).
Surgem, assim, discordâncias quanto à classificação de alguns agentes, nos caprinos, como é o caso dos Staphylococcus coagulase negativos (SCN). Para alguns autores, a definição de uma inflamação grave encontra-se intimamente relacionada com o aumento significativo da CCS. Estudos como o desenvolvido por Leitner et al. (2004a), mostram que este incremento verifica-se em glândulas mamárias infetadas com SCN, quando comparadas com sãs, o que leva à atribuir a estes agentes a designação de major. Porém, quando comparados com agentes patogénicos major como é o caso de S. aureus, a capacidade em originar elevações da CCS no leite é menor (Koop et al., 2012b; Souza et al., 2012) o que lhe confere, por parte de alguns autores, o estatuto de agente etiológico minor (Haenlein, 2002; Smith e Sherman, 2009).
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2.6.3. Principais agentes etiológicos de mastites
O conhecimento dos agentes etiológicos implicados facilita a decisão das medidas a tomar com o objetivo de diminuir a infeção no rebanho, bem como a escolha da terapia mais adequada (Paterna et al., 2013).
Em seguida é apresentada uma breve descrição dos agentes etiológicos mais frequentes nas mastites caprinas.
2.6.3.1. Staphylococcus aureus
Os agentes patogénicos responsáveis pelas mastites caprinas pertencem, maioritariamente, ao género Staphylococcus. Destes, é possível destacar S. aureus, considerado o agente mais prevalente nas mastites clínicas em caprinos, embora possa também gerar inflamações do tipo subclínico (Contreras et al., 2003).
Apresenta a forma de cocos, Gram positivo, catalase e coagulase positivo, tal como S. intermedius e S. hyicus (Smith e Sherman, 2009). A produção da enzima coagulase, que transforma o fibrinogénio em fibrina, parece favorecer a invasão bacteriana (Radostits et al., 2007).
É classificado como um agente contagioso embora, em comparação com as estirpes bovinas, estas apresentem uma menor prevalência e baixa transmissão entre animais (Contreras e Rodríguez, 2011). Para além do seu reservatório principal, a glândula mamária e tetos, pode ainda ser encontrado na pele do úbere e tetos, no orifício externo deste, nas camas, alimentos, equipamentos, noutras espécies animais, mãos dos operadores da ordenha, insetos e em águas contaminadas (Radostits et al., 2007).
Na espécie caprina, S. aureus provoca um aumento da contagem de células somáticas superiores aos SCN (Corrales et al., 1997). Num estudo realizado por Deinhofer e Pernthaner (1995), o valor obtido foi cerca de 6 vezes maior, quando comparado com animais isentos de infeção. Quando alcança a glândula mamária produz uma matriz proteica extracelular, constituída por fribronectina e colagéneo, conduzindo as células epiteliais a procedem à sua internalização. Este facto, bem como a sua capacidade em originar uma barreira de exoplolissacáridos formam uma proteção á resposta imunitária e ao tratamento farmacológico (Contreras et al., 2003).
Em resultado a uma terapia contínua com antibióticos β-lactâmicos surgem as formas L de S. aureus, que não possuem parede celular e contra as quais esta terapia antimicrobiana perde a efetividade (George et al., 2008). S. aureus possui, também, cápsula e uma proteína de superfície, denominada proteína A, que se liga às IgG, neutralizado a sua
12 função (Morn, 2009). Este agente com capacidade zoonótica é capaz de produzir leucotoxinas que destroem os neutrófilos e macrófagos (Contreras et al., 2007), leucocidinas responsáveis pela inativação dos neutrófilos e α e β-toxinas que destroem as células epiteliais facilitando a sua proliferação (Radostits et al., 2007).
Este agente é responsável por uma das mais graves formas de inflamação aguda da glândula mamária, as mastites grangrenosas (Figura 3), que podem, no entanto, ter uma origem bacteriana distinta de S. aureus (Corrales et al., 1997). Os sinais clínicos surgem nas primeiras semanas de lactação (Salerno et al., 2007), ou menos frequentemente na última semana, o que pode conduzir à perda do feto e do animal adulto (Smith e Sherman, 2009). Estes caracterizam-se por episódios de febre, anorexia, dispneia e sinais sistémicos de toxemia. Inicialmente o úbere encontra-se quente, doloroso, edematoso, eritematoso e numa fase mais avançada da doença frio, adquirindo uma coloração azul-escura ou azul esverdeada com uma linha que limita o tecido afetado. Verifica-se, ainda, uma secreção láctea aquosa e avermelhada com bolhas de ar. A morte pode ocorrer associada a uma má condição corporal, pneumonia, septicemia e/ou toxemia (Salerno et al., 2007).
Figura 3- Fase precoce de uma mastite gangrenosa, com eritema e edema do úbere (Smith e
Sherman, 2009).
Em animais cronicamente afetados verifica-se uma diminuição da produção leiteira, destruição e fibrose do parênquima glandular (George et al., 2008) e formação de microabcessos, que constituem uma fonte de infeção para os outros animais (Plummer e Plummer, 2012) e uma barreira à ação fagocitária (Radostits et al., 2007).
Caso seja utilizado leite infetado para alimentação das crias, podem ocorrer situações de diarreia, pneumonia e morte (Smith e Sherman, 2009).
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2.6.3.2. Staphylococcus coagulase negativos
Os SCN são os agentes mais comuns nas mamites subclínicas em caprinos (Figura 4) (Onni et al., 2012), sendo possível destacar Staphylococcus caprae e S. epidermidis como as espécies mais prevalente (Koop et al., 2012a), seguidas de S. simulans, S. chromogenes e S. xylosus (Contreras et al., 2007). No entanto, devido aos diferentes sistemas de testes usados na identificação de espécies, podem ocorrer diferentes classificações, o que torna difícil a comparação da prevalência descrita na literatura (Smith e Sherman, 2009).
Figura 4- Etiologia das IIM subclínicas caprinas (adaptado de Bergonier et al., 2003).
Estes agentes são capazes de produzir mastites subclínicas persistentes durante toda a lactação e afectam, sobretudo, animais mais velhos e com lactações prolongadas (Smith e Sherman, 2009).
Apesar da sua menor patogenicidade, quando comparados com S. aureus, são capazes de produzir mastites clínicas, diminuição da produção leiteira, aumento significativo da CCS e enterotoxinas termoestaveis, passíveis de serem encontradas no leite e queijo de cabra (Vernozy-Rozand et al., 1996; Contreras et al., 2007).
Os SCN podem ser encontrados no ambiente (Plummer e Plummer, 2012), mas a maioria das espécies que originam IIM apresentam como reservatório principal a pele do úbere e tetos. Devido ao seu carácter oportunista, é possível verificar um aumento da sua prevalência quando existem falhas na ordenha e no maneio que favoreçam a sua introdução na glândula mamária. Deste modo, devido à existência de espécies sensíveis à novobiocina (Tabela 1), consideradas mais patogénicas, este antibiótico deverá ser incluído no plano terapêutico (Contreras et al., 2003).
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Tabela 1- Espécies de Staphylococcus encontradas no leite de cabra e a sua sensibilidade à
novobiocina (adaptado de Raynal-Ljutovac et al., 2007).
Sensiveis à novobiocina Resistentes à novobiocina
S. aureus S. cohnii S. hycus S. lentus S. intermedius S. sciuri S. capitis S. xylosus S. caprae S. chromogenes S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. lugdunensi S. saccharolyticus S. simulans S. warnei
No caso dos ovinos, na presença de SCN sensíveis à novobiocina é possível observar um incremento na CCS significativo e perdas consideráveis na produção leiteira, o que leva a designa-los por agentes etiológicos major. O mesmo não acontece com as espécies resistentes que agem como agentes minor. Surge, assim, a necessidade de estabelecer esta distinção. No entanto, nos caprinos apesar da CCS serem superior nos S. coagulase negativos sensíveis a esta substância, a diferença não é tão óbvia como nos ovinos. Deste modo, todas as espécies de SCN devem ser classificadas da mesma forma (Raynal-Ljutovac et al., 2007).
É, ainda, possível verificar-se uma diminuição de citoquinas e de neutrófilos à medida que a infeção por SCN avança, o que traduz uma relação de complexidade entre estas (Contreras et al., 2007).
2.6.3.3. Streptococcus spp.
Os microrganismos pertencentes ao género Streptococcus raramente são identificados como causa de mastites em caprinos (5-10%) (Contreras et al., 2003). No entanto, quando estão presentes, caracterizam-se por importantes elevações da CCS, tanto na forma clínica como subclínica e por alterações marcadas no leite (Corrales et al., 1997), sendo por isto considerados agentes patogénicos major (Haenlein, 2002).
Tal como o nome indica, estes microrganismos possuem a forma de cocos, Gram positivos e catalase negativos (Smith e Sherman, 2009).
15 As infeções por S. do grupo C podem provocar a síndrome da pseudo-agalaxia, uma vez que os sinais clínicos produzidos são semelhantes aos verificados na agalaxia contagiosa, como artrites e mastites agudas, acompanhadas por uma rápida diminuição dos níveis de produção, que podem evoluir para situações de fibrose acentuada, com possível perda de função (Contreras et al., 2003).
Por sua vez, S. agalactiae que tem uma grande importância em bovinos e ovinos, apenas, causa IIM de forma pontual na espécie caprina e pode transmitir-se entre animais durante a ordenha mecânica ou através de mãos contaminadas (Smith e Sherman, 2009).
2.6.3.4. Mycoplasma spp.
Este agente patogénico major (Raynal-Ljutovac et al., 2007), ocasionalmente, pode estar na origem de mamites subclínicas, mas encontra-se associado, fundamentalmente, com a produção da síndrome agalaxia contagiosa (AC) (Corrales et al., 1997). Trata-se de uma das doenças mais graves que afeta os pequenos ruminantes e pode ser encontrada em todos os continentes. Nos países mediterrânicos é uma doença endémica (Castro-Alonso et al., 2009), onde constitui uma das mais frequentes causas de mastites (Contreras et al., 2007) e surge, fundamentalmente, pouco depois do início da lactação (Smith e Sherman, 2009).
Tal como nos ovinos, o agente clássico desta doença é Mycoplasma agalactiae (cerca de 90% dos surtos), embora Mycoplasma mycoides subsp. mycoides grandes colónias, Mycoplasma putrefaciens e Mycoplasma capricolum subsp. capricolum possam, também, estar associados à sua origem (Castro-Alonso et al., 2009).
Os sinais clínicos variam desde uma hipoagalaxia transitória a uma situação de agalaxia abrupta (Castro-Alonso et al., 2009). Sistemicamente caracteriza-se pela possível presença de queratoconjuntivite, artrite, pneumonia e abortos (Gómez-Martín et al., 2013).
A introdução do agente num rebanho indemne à doença pode ocorrer pelo contacto com rebanhos infetados, partilha de pastagens, bebedouros, pessoas e veículos. Entre animais, o contágio ocorre principalmente por via oral em cabritos, quando ingerem o leite ou colostro de um animal infetado, ou nos animais adultos por via respiratória ou mamária, durante a ordenha. É, ainda, possível que ocorra transmissão ocular, genital, intradérmica e subcutânea (Corrales et al., 2007).
A agalaxia contagiosa provoca elevadas perdas económicas na indústria leiteira (Amores et al., 2012). Estas devem-se aos custos com tratamentos, assistência veterinária, vacinação, morte ou refugo dos animais doentes, que conduz a perdas de viabilidade
16 genética na exploração, mas principalmente às perdas na qualidade e produção leiteira (Contreras et al., 2008).
Animais com IIM por micoplasma apresentam amostras de leite com elevadas CCS, no entanto, em mastites subclínicas este facto não é tão evidente (Contreras et al., 2008).
Estes agentes merecem, ainda, uma atenção especial devido ao seu potencial zoonótico (Contreras e Rodríguez, 2011).
2.6.3.5. Outros agentes bacterianos
Os bacilos Gram negativos raramente surgem associados a mastites na espécie caprina. No entanto, podem ser responsáveis por mastites clínicas agudas, incluindo a forma gangrenosa, tal como acontece com Mannheimia haemolytica e produzem importantes elevações nas CCS. Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa são os bacilos Gram negativos isolados de forma mais frequente na espécie caprina (Contreras et al., 2003).
As mastites de verão, produzidas por Trueperella pyogenes (Radostits et al., 2007), estão relacionadas com múltiplos abcessos no úbere. Afetam, sobretudo, animais no período seco e em casos crónicos deve proceder-se ao seu refugo e abate (Plummer e Plummer, 2012). Apesar da baixa prevalência, as elevações de CCS são significativas, bem como as alterações verificadas na secreção láctea. Além deste agente, existem outros bacilos Gram positivos que, embora de forma rara, são responsáveis por mastites em caprinos, tais como Corynebacterium spp., Bacillus spp. e Clostridium perfringens. Este último pode estar implicado em mastites clínicas graves, muitas vezes de carácter gangrenoso (Corrales et al., 1997).
Outros agentes, eliminados através do leite, em animais com doenças infeciosas, como Mycobacterium spp., Brucella spp., Clhamydia spp., Listeria monocytogenes e Leptospira spp., representam um potencial risco para a saúde pública, mesmo que possam não conduzir à ocorrência de mastites (Corrales et al., 1997). Para além dos agentes com capacidade zoonótica já citados, destacam-se, ainda, microrganismos como Salmonella spp. (Bergonier et al., 2003; George et al., 2008), Campylobacter jejuni, Coxiella burnetii (Plummer e Plummer, 2012) e a espécie Yersinia pseudotuberculosis (Radostits et al., 2007).
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2.6.3.6. Mastites provocadas por fungos
Embora o número de casos seja relativamente baixo (Contreras et al., 2007), tem ocorrido um crescimento de mastites provocadas por fungos. Estas surgem como resultado de tratamentos prolongados com antibióticos, prática que têm vindo a crescer com o objetivo de intensificar os efetivos de caprinos leiteiros (Corrales et al., 1997) e em consequência de aplicações incorretas de cânulas intramamárias (Contreras et al., 2003). Na sua origem pode estar presente uma grande diversidade de agentes, dos quais pode-se destacar Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Cryptococcus albidus, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis, Geotrichum candidum (Plummer e Plummer, 2012). As consequências destes agentes iatrogénicos verificam-se, preferencialmente, no período pós-parto, onde a exibição de sinais clínicos regressa em animais tratados, conduzindo ao refugo de uma grande percentagem de cabras em lactação (Contreras et al., 2003).
2.6.3.7. Vírus da artrite-encefalite caprina
O vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) encontra-se distribuído por todo o mundo (Leitner et al., 2010). Este lentivírus possui tropismo para a linha celular dos mónocitos-macrófagos o que resulta numa resposta inflamatória crónica e intensa que afeta diversos órgãos, como o cérebro, pulmões, articulações e glândula mamária. Este vírus possui uma replicação lenta e pode permanecer no hospedeiro por vários anos de forma latente até que ocorram manifestações clínicas (Martínez-Navalón et al., 2013).
As mastites produzidas por CAEV afetam o tecido intersticial, conduzindo a uma firmeza excessiva do úbere (“úbere duro”), fundamentalmente no período pós-parto, porém este apresenta-se isento de sinais de edema, calor ou eritema. Inicialmente a produção de leite pode ser nula ou muito reduzida, mas com o avançar do tempo a produção leiteira poderá aumentar. Apesar da aparência normal do leite produzido, este apresenta uma elevação significativa de CCS (Plummer e Plummer, 2012) e diminuição do seu teor de proteínas e gorduras. Alguns autores atestam, ainda, que os caprinos infetados com CAEV, além da diminuição da produção leiteira (Figura 5), apresentam uma redução da duração do período de lactação e crias menos pesadas ao nascimento. A diminuição da produção leiteira em animais infetados é um assunto que apresenta alguma controvérsia, pois algumas pesquisas mostram que não é possível encontrar diferenças na produção entre animais seropositivos e negativos a partir do segundo ciclo leiteiro, inclusive (Martínez-Navalón et al., 2013).
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Figura 5- Média da produção leiteira diária de caprinos seropositivos e seronegativos a CAEV
(adaptado de Martínez-Navalón et al., 2013).
A transmissão ocorre especialmente por ingestão do colostro ou leite contaminado, por parte das crias, mas também entre adultos, através das tetinas das máquinas de ordenha (Contreras et al., 2003), por via aerógena, venérea, através de inseminação artificial com sémen contaminado e por via materno-fetal (Souza et al., 2013).
Devido à elevada taxa de transmissão entre animais, aos obstáculos associados com a erradicação, tais como os custos da pasteurização do colostro, refugo de animais, entre outros e aos surtos com exibição de sinais clínicos, atribuem-se a esta doença relevantes perdas económicas (Leitner et al., 2010).
O tratamento para esta doença ainda não foi desenvolvido, tornando o refugo dos animais seropositivos a melhor opção (Smith e Sherman, 2009).
2.7. Fatores de risco na ocorrência de mastites e medidas de controlo
Para minimizar a prevalência de mastites e aumentar a saúde da glândula mamária é importante compreender os fatores principais que aumentam o risco de uma animal vir a desenvolver uma inflamação da glândula mamária (Koop, 2012).
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2.7.1. Fatores de variação do animal
Com o avançar da idade e consequentemente o número de lactações, verifica-se um aumento da prevalência de mastites. No entanto, este facto deve ser cuidadosamente interpretado, uma vez que pode ser difícil distinguir situações crónicas de uma nova situação de doença e também, porque os animais mais velhos podem ser mais resistentes (Bergonier et al., 2003). A grande maioria dos casos surge entre os 2 e os 5 anos, recomendando-se, assim, o refugo dos animais com idade superior a esta, que possuam baixas produções e valor genético reduzido (Sanchez et al., 1997).
Está também estabelecida a influência genética na suscetibilidade ou resistência do animal face às mastites. Assim, na escolha de reprodutores, devem ser tidos em atenção fatores como a CCS (Bergonier et al., 2003) e ainda, a anatomia do úbere e a morfologia dos tetos, uma vez que podem comprometer a eficácia da ordenha (Radostits et al., 2007).
Animais com alta produtividade favorecem o aparecimento de episódios de mastites. O mesmo acontece quando estão presentes doenças sistémicas que afetam diretamente a glândula mamária ou que debilitam o sistema imunitário do animal (Sanchez et al., 1997).
Quanto ao período de lactação, o período seco e o primeiro e último terços do período produtivo são os mais críticos. As mastites verificadas no primeiro terço da lactação devem-se, possivelmente, a infeções adquiridas no período seco, já as verificadas no terceiro terço ocorrem por sobreordenha dos animais. Durante o período seco existe um alto risco de infeção por agentes ambientais e por administrações incorretas do tratamento antibiótico, com cânulas intramamárias, que veiculam microrganismos até ao interior do úbere (Sanchez et al., 1997). O controlo destas situações pode ter como base o tratamento realizado durante o período seco, desenvolvido mais adiante (Plummer e Plummer, 2012).
As deficiências nutricionais em selénio, vitamina E, β-carotenos e vitamina A, podem predispor a inflamações da glândula mamária, devido à importância destes componentes na manutenção da integridade estrutural e função dos neutrófilos, sendo por vezes necessário recorrer à sua suplementação (Smith e Sherman, 2009).
2.7.2. Fatores ambientais e de maneio
A higiene das instalações e alojamento podem apresentar repercussões diretas na saúde do úbere. A humidade excessiva das camas e a sua renovação insuficiente aumenta a probabilidade do desenvolvimento de IIM. O mesmo acontece quando existe uma escassa ventilação do ar e em casos de densidade animal exagerada (Plummer e Plummer, 2012).
20 Também as crias, em sistemas de aleitamento natural, podem provocar lesões nos tetos que favorecem a entrada de microrganismos e ao mamarem em várias fêmeas representam uma fonte de contágio entre estas (Sanchez et al., 1998).
Ao contrário da espécie bovina, não foi encontrada uma associação entre a prevalência de mastites e a estação do ano na espécie caprina. No entanto, é possível supor que a mudança do espetro etiológico com a sazonalidade corresponda a uma relação escassa entre este dois parâmetros (Sanchez et al., 1997).
Os animais sujeitos a ordenha mecânica apresentam um risco 1,3 vezes mais elevado de contraírem uma infeção intramamária (Jimenez-granado et al., 2014).
Por sua vez, a ordem com que os animais são apresentados à ordenha torna possível minimizar o contacto de utensílios contaminados com cabras sãs. Assim, em primeiro lugar devem surgir os animais sãos por ordem crescente de idade (Bergonier et al. 2003), seguidos de fêmeas com histórias regressas de mastites subclínicas, animais com mastites clínicas e/ou com lesões nos tetos (Smith e Sherman, 2009).
Na espécie caprina, devido à menor incidência de mastites, ao tamanho dos rebanhos e às rotinas da ordenha, não é comum proceder-se à lavagem e desinfeção do úbere e tetos antes da ordenha, processo habitual nos bovinos (Bergonier et al., 2003). No entanto, em caso de problemas sanitários graves (agalaxia contagiosa, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus tipo C), ou tetos com sujidade excessiva recomenda-se a imersão dos tetos numa solução desinfetante (pré-dipping), tal como os compostos clorados e em seguida secar com toalhas individuais. Por sua vez, no período pós ordenha, de forma fisiológica o esfíncter do teto permanece aberto por tempo variável, o que justifica a desinfeção dos tetos. Vários desinfetantes, como os compostos iodados, clorhexidina e compostos de amónio quaternário, têm exibido excelentes resultados no controlo das mastites caprinas e a sua administração pode ser feita por imersão (pós-dipping), ou pulverização (Sanchez et al., 1997). Segundo Bergonier et al. (2003), esta prática reduz o número de novas infeções em 30-40%.
A ordenha mecânica pode possuir como consequências transitórias anomalias circulatórias a nível do teto, como edema, congestão, aumento temperatura e da espessura da sua parede, no entanto, estas podem tornar-se irreversíveis afetando os mecanismos de defesa, favorecendo as IIM (Alejandro et al., 2014). Deste modo, todos os constituintes da máquina de ordenha devem ser mantidos em bom estado de conservação, funcionamento e limpeza, de forma a evitar flutuações de vácuo, fluxo inverso e queda de tetinas, situações que favorecem a entrada de microrganismos. Deve, ainda, evitar-se a sobreordenha pois arrasta o epitélio queratinizado do teto e a subordenha, que provoca retenção de leite na
21 cisterna aumentando a sensibilidade do úbere aos agentes patogénicos (Plummer e Plummer, 2012), e antes de retirar as tetinas deve desligar-se o vácuo. Regularmente deve ser avaliada a qualidade da água usada para limpeza dos equipamentos (Contreras et al., 1997) e todos procedimentos devem ser realizados de forma a que o animal se mantenha o mais calmo possível, pois o nervosismo antes e durante a ordenha conduz a uma diminuição do teor de gordura do leite, da defesa celular e aumenta a queda de tetinas (Sanchez et al., 1997).
As pessoas que auxiliam na ordenha devem possuir formação, as mãos lavadas e a utilização de luvas descartáveis encontra-se recomendada (Smith e Sherman, 2009).
2.7.3. Vacinas
A vacinação contra S. aureus e SCN, em pequenos ruminantes, apesar de diminuir da gravidade dos sinais clínicos, não reduz o número de novas infeções. Assim, apesar da existência de vários estudos, surge a necessidade de desenvolver uma vacina decisiva para um controlo eficaz das mastites provocadas por estes agentes (Contreras et al., 2007; Smith e Sherman, 2009). Recentemente, Kautz et al. (2014) efetuaram um estudo cujo objetivo era determinar a eficácia, em caprinos, de uma vacina comercial Lysigin®, que tem demonstrado sucesso na prevenção de infeções por S. aureus e SCN em novilhas. Os resultados obtidos demonstraram uma redução na aquisição de novas IIM e CCS e aumento significativo de cura espontânea.
As estratégias de vacinação contra a agalaxia contagiosa não têm sofrido variações relevantes ao longo dos últimos anos. As vacinas frequentemente utilizadas, monovalentes ou polivalentes, inativadas ou mortas, diminuem a exibição dos sinais clínicos e a excreção do micoplasma, porém não impedem o animal de adquirir a infeção. No entanto, é relevante afirmar que os resultados clínicos mais positivos são verificados quando são usadas vacinas que possuem saponina como adjuvante ou agente inativador, devido ao tempo de ativação dos linfócitos T de memória (Nicholas et al., 2009; Gómez-Martín et al., 2013). Se o objetivo pretendido for a erradicação da doença no rebanho, a vacinação não deve ser uma opção pois não permite distinguir, serologicamente, os animais infetados dos vacinados (Corrales et al., 2007).
Apesar das mastites provadas por Escherichia coli serem relativamente raras nos caprinos, estes animais foram usados como modelo para averiguar a eficácia de vacinas contra este agente para bovinos. Os resultados mostraram uma redução na manifestação de sinais clínicos e na excreção dos microrganismos através do leite (Aslam et al., 2001).
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2.8. Diagnóstico
A detecão precoce de caprinos com IIM é importante para prevenir a transmissão dos agentes e diminuir as perdas na produção e qualidade do leite (Persson et al. 2014).
Para além das variações macroscópicas a nível da produção leiteira, as mastites clínicas evidenciam alteração patológicas a nível do úbere (Marogna et al., 2012). No entanto, o diagnóstico de mastites subclinicas torna-se mais complexo, uma vez que é necessário recorrer a testes laboratoriais (Radostits et al., 2007; Rovai et al., 2014).
Em seguida, é exposta uma breve discrição dos métodos utilizados, de forma mais frequente, para proceder à deteção e diagnóstico de mastites na espécie caprina.
2.8.1. Exame clínico
O exame clínico deve ser constituído por uma inspeção geral do úbere seguido do exame macroscópico da secreção láctea (Marogna et al., 2012).
A observação do úbere, realizada de ambos os lados e no sentido caudo-craneal, deve ser efectuada com o intuito de procurar assimetrias do úbere, resultado de uma glândula mamária edemaciada, no caso de uma inflamação aguda, ou atrofiada em condições crónicas. A palpação, para além destas situações, é relevante para avaliar a temperatura do úbere e a existência de dor ou abcessos. Deve, também, proceder-se à inspeção dos tetos para averiguar a presença de lesões e no caso de mastites agudas a existência de sinais sistémicos como febre, anorexia e depressão (Smith e Sherman, 2009). Ainda durante o exame clínico do animal, a procura de indícios de reatividade dos gânglios linfáticos mamários não deve ser descurada (Figura 6) (Marogna et al., 2012).
Figura 6- Gânglio linfático mamário reativo, compatível com uma situação de mastite crónica (fotografia do autor).
23 Um dos primeiros sinais das mastites clínicas prende-se com a diminuição da produção leiteira (Smith e Sherman, 2009). Porém, um exame clínico completo compreende o uso de uma caneca de fundo escuro, de preferência brilhante, para facilitar o exame macroscópico do leite (Figura 7) (Radostits et al., 2007). Assim, após observação do seu aspeto, é possível proceder à sua classificação em normal ou com alterações (secreção serosa, hemorrágica, purulenta, ou com presença de coágulos de caseína) (Marogna et al., 2012).
Figura 7- Leite mamítico. Secreção serosa com coágulos de caseína (fotografia do autor).
2.8.2. Testes diretos
Os métodos diretos, utilizados para diagnóstico da inflamação da glândula mamária, apresentam como base o isolamento e/ou identificação dos agentes patogénicos presentes numa amostra de leite (Peixoto et al., 2010).
2.8.2.1. Exame bacteriológico
O resultado positivo de uma cultura bacteriana, proveniente de uma amostra de leite recolhida de forma asséptica, constitui o método de diagnóstico padrão (gold standard) das mastites com origem bacteriana (Mcdougall et al., 2001; Sánchez et al., 2004). A amostra deve ser obtida antes de ser instituída uma terapia antibacteriana e pode provir de uma metade, das duas metades de um animal (Plummer e Plummer, 2012), ou do tanque onde é armazenado o leite. A microbiota do tanque pode ter como origem a glândula mamária dos animais, porém pode apresentar outras fontes, como bactérias ambientais presentes no
