Stella Borges da Silva
“Avaliação das condições de saúde bucal e expressão de mediadores inflamatórios na gengivite em pessoas com doença falciforme”
Uberaba- MG 2018
Stella Borges da Silva
“Avaliação das condições de saúde bucal e expressão de mediadores inflamatórios na gengivite em pessoas com doença falciforme”
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, área de concentração: “Patologia Humana”, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profª Drª Denise Bertulucci Rocha Rodrigues
Coorientador: DrMarcos Vinicius da Silva
Uberaba, MG 2018
Stella Borges da Silva
“Avaliação das condições de saúde bucal e expressão de mediadores inflamatórios na gengivite em pessoas com doença falciforme”
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, área de concentração: “Patologia Humana” da Universidade Federal do Triângulo Mineiro como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Uberaba-MG, 9 de fevereiro de 2018. Banca Examinadora:
____________________________________________ Prof.ª Drª Denise Bertulucci Rocha Rodrigues - Orientadora
Universidade Federal do Triângulo Mineiro ____________________________________________
Prof. Dr. Helioswilton Sales de Campos
Universidade Federal do Triângulo Mineiro ______________________________________________
Prof. Dr. Paulo Roberto Juliano Martins
Universidade Federal do Triângulo Mineiro _____________________________________________
Prof.ª Drª Polyanna Miranda Alves
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Triângulo Mineiro
_______________________________________________
Prof.ª Drª Priscilla Barbosa Ferreira Soares Universidade Federal de Uberlândia
DEDICATÓRIA
Por toda paciência, carinho e incentivo durante esta caminhada, dedico este
trabalho:
A meus pais, Antônio e Norma e meus irmãos, Borginho, Lívia, André,
Paulinho, Áulus, Eduardo e Renata;
À amiga/irmã Márcia Helena Almeida, companheira de todas as horas;
Aos demais familiares e amigos queridos.
Com todo meu amor e eterna gratidão.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente, a Deus, Pai de amor e bondade, pela oportunidade da existência terrena e através dela o aprendizado constante rumo à perfeição.
Aos familiares e amigos queridos, encarnados e desencarnados, pela paciência, amparo e incentivo em todos os momentos dessa trajetória, bons ou ruins.
À minha orientadora Profa. Dra. Denise Bertulucci Rocha Rodrigues pela confiança e amizade, tornando possível esta conquista.
Ao meu coorientador Dr. Marcos Vinicius e ao Prof. Dr. Virmondes por conduzirem com exatidão as etapas laboratoriais e a análise estatística na metodologia desse trabalho.
Aos pacientes com Doença Falciforme e voluntários do grupo controle que participaram desse estudo. Sem vocês este trabalho não seria possível.
À amiga Isabela Rios, por todo auxílio nas etapas de correção e redação do artigo e tese. Às amigas Glaucia e Aline, companheiras de doutorado, por tudo que ajudaram para a conclusão desse trabalho.
Aos amigos, professores e pós-graduandos, da Disciplina de Hematologia por todos os momentos de alegria e troca de conhecimentos e por me acolherem nesta grande família. Aos alunos de iniciação científica Priscilla e Gabriel pela pronta disponibilidade em ajudar. Aos professores membros da comissão examinadora da qualificação e da defesa por todas as contribuições para a melhoria desse trabalho.
Aos colegas do Serviço de Odontologia da UFTM, especialmente Amauri pelo auxílio nas etapas de coleta e tratamento, bem como às auxiliares, se tornando além de colegas de trabalho, amigos queridos.
Às técnicas do laboratório de Imunologia, Betânia e Mônica, pela atenção e carinho em me atender nas necessidades.
Aos secretários da pós-graduação, Tuane e André, pelo trabalho desempenhado, estando sempre prontos para ajudar e sanar dúvidas.
À Universidade Federal do Triângulo Mineiro/CEFORES através de sua diretoria Prof. Paulo e Prof.ª Terezinha pelo incentivo me proporcionando um período de afastamento laboral e pelo uso das dependências dos Consultórios Odontológicos e Laboratório de Imunologia para a realização deste trabalho; e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pela oportunidade de realizar este curso.
Ao Hemocentro de Uberaba/Fundação Hemominas por diagnosticar e encaminhar ao Serviço de Odontologia da UFTM os pacientes portadores de Doença Falciforme, objeto desse estudo. E aos órgãos de fomento Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
“E vós também, pondo nisto mesmo toda a diligência, acrescentai à vossa fé a virtude e à virtude a ciência...” Pedro.
RESUMO
Doença Falciforme (DF) é uma doença hemolítica geneticamente hereditária caracterizada por oclusão vascular, hemólise e inflamação crônica podendo afetar todo o organismo, incluindo a cavidade oral. Citocinas contribuem para sua fisiopatologia, mas os mecanismos envolvidos não são bem compreendidos. Os objetivos desse estudo foram identificar as condições de saúde bucal e avaliar a expressão de mediadores inflamatórios (IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8) na saliva e no fluido crevicular gengival (FCG) associados à gengivite e ao uso de hidroxiureia em pacientes com DF, antes e depois do tratamento periodontal. Foram incluídos no estudo 35 indivíduos com DF (GF) e 28 controles (GC). Foi realizado exame clínico oral e coleta de dados através de questionário. As citocinas/quimiocina foram dosadas utilizando-se da técnica de Cytometric Bead Array (CBA), conforme instruções do fabricante. A análise estatística foi realizada por meio do programa Statview (Abaccus) e Teste t de Student pareado com resultados significativos para p<0,05. Os resultados demonstraram uma média de idade significativamente menor do GF (23,31 anos); com predominância do sexo feminino (62,86%), etnia não branca (77,14%) e genótipo HbSS (57,14%).Deste grupo, 60% tinham palidez de mucosa oral; 51,43% língua despapilada; 51,43% tinham maloclusão; 42,86% pigmentações em dentes ou gengiva; 31,43% anquiloglossia; 8.5% com hipoplasia de esmalte e 15 pacientes com DF reportaram fazer uso de hidroxiureia. A média do índice de dentes cariados, com extração indicada e obturados (ceo-d) do GF foi 2,2 e a média do índice de dentes Cariados, Perdidos e Obturados (CPO-D) 10,80; para o GC a média do índice CPO-D foi 11,04. Gengivite foi observada em 80% do GF e 96,42% do GC. A IL-1β apresentou níveis significativamente menores na saliva do GF antes do tratamento periodontal comparado ao GC (p=0.02), porém sem diferença significativa após o tratamento. No GC, a IL-1β demonstrou significativa redução na saliva após o tratamento (p=0.008). No fluido crevicular gengival, a IL-8 apresentou níveis significativamente menores no GF após o tratamento (p=0.0002). Em indivíduos com gengivite dos dois grupos, a expressão de IL-1β foi significativamente maior na saliva antes e após o tratamento, comparado àqueles sem gengivite, (p=0.009 e p=0.02), assim como no FCG (p=0.01 e p=0.003), respectivamente e os níveis de IL-8 estavam significativamente maiores no FCG em indivíduos com gengivite antes e depois do tratamento (p=0.01e p=0.001) respectivamente. A IL-10 e a IL-12 não foram detectadas em nenhuma das amostras. Não houve expressão significativa das citocinas dosadas (IL-1β; IL-6 e IL-8) associadas ao uso de hidroxiureia. Concluiu-se que as condições de saúde bucal do GF foram semelhantes ao GC e os níveis significativamente menores de IL-1β e IL-8 na saliva e no FCG dos pacientes do GF sugerem uma resposta inflamatória menos intensa na cavidade oral destes pacientes, não agravando o processo inflamatório nesse local.
ABSTRACT
Sickle Cell Disease (SCD) is a genetically hereditary hemolytic disease characterized by vascular occlusion, infarction, hemolysis and chronic inflammation that can affect the whole organism, including the oral cavity. Cytokines contribute to its pathophysiology but the mechanisms involved still not well understood. The objectives of this study were to identify the oral health conditions and to evaluate the expression of the inflammatory mediators (IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8) in the saliva and gingival crevicular fluid (GCF) associated to gingivitis and to the use of Hydroxyurea in patients with SCD, before and after the periodontal treatment. A clinical oral examination and questionnaire were performed for 35 subjects with SCD (SG) and 28 healthy controls (CG). Cytokines/chemokine were dosed by the Cytometric Bead Array (CBA) technique, according to the producer’s instructions. The statistical analysis was realized by the program Statview (Abaccus), with significant results for p<0.05. The results showed a mean age significantly lower of the SG (23.41 years); prevalence of the feminine gender (62.85%), non-white ethnicity (77.14%) and 57.14% presented HbSS. From this group, 60% had pallor of the oral mucosa; 51.43% presented depapillated tongue, 51.43% had malocclusion, 42.86% had pigmentation in teeth or gingiva; 31.43% presented ankyloglossia; 8.5% with enamel hypoplasia and 15 patients with SCD (42.86%) reported using Hydroxyurea. The mean decay-missing-filled teeth index (DMFT) of patients with sickle cell disease was 10.80 and the mean deciduous decay teeth index with indicated extraction and filled (dmft) was 2.2. For the control group, the mean DMFT was 11.04. Gingivitis was observed in 80% of the SG and 96.42% of CG. IL-1β levels were significantly lower in SG in saliva before treatment compared to CG (p=0.02) but showed no significant difference after the treatment. In CG, IL-1β levels showed significant reduction in saliva after treatment (p=0.008). IL-8, in GCF, had significantly lower levels in SG after treatment (p=0.0002). In subjects with gingivitis, of both groups, levels of IL-1β were significantly higher before and after periodontal treatment in saliva (p=0.009 and p=0.02), as well as in the GCF (p=0.01 and p=0.003), respectively and IL-8 levels were significantly higher in GCF in individuals with gingivitis before and after periodontal treatment (p=0.01 and p=0.001) respectively. IL-10 and IL-12 were not detected in any of the samples. There was no significant difference on cytokines levels (1β; IL-6 e IL-8) associated with the use of hydroxyurea. It is concluded that the conditions of oral health of the SG were similar to CG, and patients with SCD developed less intense levels of inflammatory response, presenting lower IL-1β and IL-8 expression in saliva and GCF which does not aggravate the inflammatory process in this local.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Hemácias falciformes em sangue periférico de paciente com anemia falciforme...17
Figura 2 - Fisiopatologia da anemia falciforme...20
Figura 3 - Expressão de IL-1β na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal...38 Figura 4 - Expressão de IL-1β na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (gengivite)...38 Figura 5 - Expressão de IL-8 na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal...39 Figura 6 - Expressão de IL-8 na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (gengivite)...40 Figura 7 - Expressão de IL-6 na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal...41 Figura 8 - Expressão de IL-6 na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (gengivite)...41 Figura 9 - Expressão de TNF-α na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal...42 Figura 10 - Expressão de TNF-α na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (gengivite)...43 Figura 11 - Expressão de IL-1β na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (uso de HU)...44 Figura 12 - Expressão de IL-6 na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (uso de HU)...45 Figura 13 - Expressão de IL-8 na saliva e no fluido crevicular antes e depois do tratamento periodontal (uso de HU)...46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Distribuição da média de idade, gênero e etnia...35 Tabela 2 – Distribuição de genótipos de pacientes com doença falciforme...35 Tabela 3 – Manifestações clínicas e hábitos de higiene bucal dos pacientes com doença falciforme comparados com o grupo controle...36 Tabela 4 – Características específicas dos pacientes com doença falciforme...37
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS < menor > maior α alfa % por cento °C grau centígrado μl microlitro
AAP: Academia Americana de Periodontologia AF: Anemia Falciforme
AVC: Acidente vascular cerebral
BPC: Benefício de Prestação Continuada
Ca++: Cálcio
ceo-d: Dentes Cariados, com extração indicada e Obturados (para dentição decídua) Cl-: íon cloro
CPO-D: Dentes Cariados, Perdidos e Obturados DF: Doença falciforme
DNA: Ácido desoxirribonucleico DP: Doença periodontal
EPIs: Equipamentos de Proteção Individual FCG: Fluido crevicular gengival
FDA: Food and Drug Administration GC: Grupo controle
GF : Grupo falciforme Hb: Hemoglobina
HbA: Hemoglobina adulta
HbF: Hemoglobina fetal
HbS: Hemoglobina S HbSC: Hemoglobina SC HbSD: Hemoglobina SD
HbSE: Hemoglobina SE
HbSS: Hemoglobina S homozigótica HbSS/β: Hemoglobina S beta
HbSß0tal: Hemoglobina S beta talassemia HbSß+tal: Hemoglobina S beta + talassemia
HIV+ : positivo para o vírus da imunodeficiência humana HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Resolução
HU: Hidroxiureia
ICAM-1: Molécula de adesão intercelular 1 IPV: Índice de Placa Visível
ISG: Índice de Sangramento Gengival
IEF: Eletroforese por Focalização Isoelétrica IL-1β: Interleucina 1 beta
IL-4:Interleucina 4 IL-5: Interleucina 5 IL-6: Interleucina 6 IL-8: Interleucina 8 IL-10: Interleucina 10 IL-12: Interleucina 12 IL-13: Interleucina 13 IL-17: interleucina 17 IFN-γ: Interferon gamma K+: íon potássio
LPS: lipopolissacarídeos ml: mililitro
mm: milímetro
NUPAD: Núcleo de Ações e Pesquisa em Apoio Diagnóstico NF-kB: Fator nuclear Kappa B
NK: Natural Killer
OMS: Organização Mundial da Saúde
pg/ml: Picograma por mililitro
PlGF: Fator de crescimento placentário
PNTN: Programa Nacional de Triagem Neonatal Th1: Linfócito T auxiliar ou Helper classe um Th2: Linfócito T auxiliar ou Helper classe dois TNF-α: Fator de necrose tumoral alpha
TLR4: Toll like receptor 4 U: Teste de Wilcoxon
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais UFTM: Universidade Federal do Triângulo Mineiro VCAM-1: Molécula de adesão celular vascular 1
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...15 2 JUSTIFICATIVA... 27 3 HIPÓTESE...28 4 OBJETIVOS...29 4.1 OBJETIVO GERAL...29 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...29 5 MATERIAL E MÉTODOS...30 5.1 CASUÍSTICA...30
5.2 COLETA DOS DADOS...30
5.3 EXAME CLÍNICO ORAL...31
5.4 COLETA DE AMOSTRAS- ANTES E DEPOIS DO TRATAMENTO PERIODONTAL...32
5.5 DOSAGEM DE CITOCINAS NA SALIVA E NO FLUIDO CREVICULAR GENGIVAL...33
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA...34
5.7 NORMAS PARA A CONFECÇÃO DO MANUSCRITO...34
6 RESULTADOS...35 7 DISCUSSÃO...47 8 CONSIDERAÇÕES FINAIS...55 9 CONCLUSÕES...56 REFERÊNCIAS...57 APÊNDICES...65
1- INTRODUÇÃO
A doença falciforme (DF) originou-se nos países do centro-oeste africano, da Índia e do leste da Ásia, há cerca de 50 a 100 mil anos, entre os períodos paleolítico e mesolítico (NAGEL et al., 1985). A primeira descrição na literatura médica de um caso clínico de DF foi observando hemácias alongadas no esfregaço sanguíneo de Walter Clement Noel, jovem negro, originário de Granada (Índias Ocidentais), estudante de odontologia do primeiro ano do Chicago College of Dental Surgery, admitido no Presbyteriam Hospital com um quadro de anemia, icterícia, úlceras nos membros inferiores e complicações pulmonares, em 1910. Este paciente foi tratado pelo Dr. Herrick, médico cardiologista de Chicago, o qual utilizou o termo “formato de foice” para descrever a aparência peculiar das células vermelhas encontradas no sangue desse jovem (HERRICK, 2001).
Em 1927, Hanh e Gillepsie descobriram que a falcização dos eritrócitos ocorria como consequência da exposição das células a uma baixa tensão de oxigênio (FIGUEIREDO, 1993). Em 1945, hipotetizou-se que a doença poderia ser originada de anormalidades na molécula de hemoglobina (Hb) e, quatro anos mais tarde em 1949, a hipótese foi demonstrada por uma diferença na velocidade de migração eletroforética entre a HbS e a HbA (PAULING et al, 1949). Posteriormente, em 1956, elucidou-se a natureza bioquímica desta doença, quando, através de um processo de eletroforese bidimensional associada com cromatografia, fracionou-se a hemoglobina e estudaram-se os seus peptídeos dando origem ao conceito de doença molecular. Em 1978 novo impulso foi dado ao estudo da HbS com a introdução de técnicas de biologia molecular (NAOUM, 1997).
Assim, a Doença Falciforme é uma doença de caráter genético sendo frequente, mas não exclusiva, em indivíduos de origem africana. Foi trazida às Américas pela imigração forçada dos africanos entre os séculos XVII e XVIII (ZAGO; FIGUEIREDO; OGO, 1992).
No Brasil dos anos de 1930 e 1940, a vinculação da doença falciforme à raça negra foi frequentemente acrescida da visão de que a miscigenação provocava uma epidemiologia singular da doença no país. Tal interpretação revelou exata consonância com a ideia, que então se começava a elaborar, de que a singularidade do Brasil exprimia-se por sua larga população miscigenada (CAVALCANTI; MAIO, 2011).
Hoje, é encontrada em toda a Europa e em grandes regiões da Ásia. No Brasil é mais frequente nas regiões sudeste e nordeste sendo uma doença de caráter endêmico com tendência a atingir uma parcela cada vez mais significativa da população, devido ao alto grau de miscigenação (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1997).
Pode se apresentar na forma homozigótica (HbSS), denominada anemia falciforme ou em combinação com outro alelo mutante, mais comumente o alelo C (HbSC), ou com um alelo β-talassêmico (HbS/ß tal) e menos frequentemente com os alelos D (HbSD) ou E HbSE). (POWARS; CHAN; SCHROEDER, 1990; BUNN et al., 1986; STEINBERG, 2009).
Todas essas doenças têm manifestações clínicas semelhantes, porém com graus variados de gravidade. A interação da HbS com a hemoglobina normal (HbA) caracteriza o portador do traço falciforme (AS), que é assintomático não apresentando os sinais e sintomas da doença (BUNN et al., 1986).
A Anemia Falciforme (HbSS) e a Sß0 -talassemia são as formas mais graves da doença falciforme, enquanto a HbSC e a Sß+ talassemia são condições, que apesar de significativa morbidade, têm manifestações clínicas mais brandas (POWARS; CHAN; SCHROEDER, 1990). Genótipos que produzem uma menor concentração de HbS ou uma elevação de hemoglobina fetal (HbF), que não interage com as moléculas de HbS, dificultam a polimerização e a falcização, reduzindo a gravidade e intensidade das manifestações clínicas (ZAGO; PINTO, 2007).
Além dessas interações, temos ainda, dentro de um mesmo genótipo HbSS, graus diferentes de gravidade gerados por polimorfismos na região do gene da beta globina. Esses polimorfismos determinam diferentes haplótipos classificados de acordo com regiões de origem, através de estudos antropológicos e moleculares. São conhecidos atualmente os haplótipos República Centro-Africana (CAR) ou Bantu, Benin, Senegal, Camarões, Árabe-Indiano e Atípico (FIGUEIREDO et al., 1994).
A distribuição dos haplótipos no Brasil reflete padrões do comércio de escravos. O haplótipo Bantu é o mais prevalente em nosso país (66,2%), seguido dos haplótipos Benin, Senegal e Atípicos (ZAGO; FIGUEIREDO; OGO, 1992). Não foi encontrado o haplótipo Árabe-Indiano no estudo brasileiro, evidenciando a distribuição heterogênia desses haplótipos pelo mundo (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1997).
Os diferentes haplótipos estão relacionados a níveis variáveis de hemoglobina fetal (HbF) e, consequentemente, a características clínicas variadas. Senegal e árabe-indiano estão associados a altos níveis de HbF e um curso mais ameno da doença; Benin e Camarões, aos níveis medianos de HbF e um curso clínico intermediário; Bantu ou CAR mostra níveis reduzidos de HbF e sinais clínicos mais graves (HIROKAWA K. et al; 1995).
Foi realizado um estudo na região do Triângulo Mineiro, Minas Gerais para determinar a frequência dos haplótipos de pacientes com anemia falciforme e sua correlação com o perfil clínico e hematológico. As associações entre haplótipos e a presença de
complicações clínicas não apresentaram diferença significativa, mas indivíduos Bantu foram mais encontrados (50,8%) e apresentaram maior frequência de eventos clínicos (LEAL et al.,2016).
O diagnóstico da doença falciforme é baseado em resultados laboratoriais. Com a inclusão das hemoglobinopatias no Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN), foi possível o diagnóstico precoce e consequentemente um melhor acompanhamento dos casos (BRASIL, 2007). Minas Gerais foi o primeiro estado brasileiro a incluir a doença no Programa Estadual de Triagem Neonatal (PETN-MG) e outras hemoglobinopatias, em 1998. O programa mineiro, que serviu de modelo para outros estados brasileiros, é realizado pelo Laboratório de Triagem Neonatal do Núcleo de Ações e Pesquisa em Apoio Diagnóstico (NUPAD) – órgão da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).
Todas as pessoas diagnosticadas com doença falciforme devem ser matriculadas num programa de atenção integral e serem tratadas de acordo com os protocolos do Ministério da Saúde (BRASIL, 2007). Em Minas Gerais os Hemocentros Regionais são os Centros de Referência para assistência às pessoas com Doença Falciforme. Enquanto aquelas diagnosticadas com traço devem ter direito a orientação e informação genética, conforme preconizado no protocolo de Orientação e Informação Genética em Doença Falciforme do Ministério da Saúde (BRASIL, 2007).
O diagnóstico ao nascimento (teste do pezinho) possibilitou entender melhor o comportamento e a evolução da doença falciforme na nossa população, mas apesar dos avanços terapêuticos obtidos nos últimos anos, ela continua a causar significante morbidade (PLATT et al., 1994).
Assim, a Doença Falciforme é um termo genérico que engloba um grupo de anemias hemolíticas hereditárias que possuem como característica em comum a herança da hemoglobina S (HbS), que é o resultado da substituição da base nitrogenada adenina pela timina no sexto códon do gene da ß-globina localizado no cromossomo 11 (GAG → GTG). A letra S deriva da palavra inglesa sickle, que em português traduz-se como foice (BALLAS; MOHANDAS, 1996; NAGEL; STEINBERG, 2001; ALEXY et al., 2010).
A nova estrutura hemoglobínica possui uma forma tridimensional modificada, e consequentemente, propriedades físico-químicas diferentes da hemoglobina normal (HbA) (BUNN et al., 1986). A troca de bases nitrogenadas no DNA, ao invés de codificar a produção do aminoácido ácido glutâmico, irá, a partir daí, determinar a produção do aminoácido valina, que entrará na posição 6 da sequência de aminoácidos que compõem a cadeia β da
hemoglobina, modificando sua estrutura molecular (BUNN et al., 1986). Tal modificação provoca grandes alterações na solubilidade e estabilidade da hemoglobina, levando à sua polimerização quando desoxigenada e distorção da membrana eritrocitária mostrando um aspecto de foice quando visualizada em microscópio de luz (BUNN et al., 1986). O ácido glutâmico é carregado negativamente, enquanto a valina é um aminoácido neutro. Isso permite a aproximação das moléculas de hemoglobina no estado desoxigenado, através de interações hidrofóbicas tornando a HbS insolúvel (HOOVER et al., 1979). Ocorre então a polimerização de milhares de hemoglobinas existentes no interior de cada glóbulo vermelho (NOGUCHI; SCHECHTER, 1981). Os polímeros formados são compostos por fibras de desoxiemoglobinas, enoveladas entre si que progridem com o alongamento e alinhamento de mais fibras, criando uma estrutura multipolimérica, na forma de um eixo axial no interior da célula. Está criado assim o mecanismo de transformação da clássica forma discoide do eritrócito em uma nova estrutura celular no formato de foice, daí o nome falciforme (BUNN, 1997) (Figura 1).
A velocidade e a extensão da formação de polímeros no interior das hemácias dependem primariamente de três variáveis independentes: grau de desoxigenação, concentração intracelular de hemoglobina S e presença ou ausência de hemoglobina fetal (HbF) (BUNN, 1997).
Figura 1 – Hemácias falciformes em sangue periférico de paciente com anemia falciforme
Fonte:( REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010)
Uma das consequências da polimerização da HbS é a desidratação celular devida às perdas de íons potássio (K+) e de água. Os principais mecanismos destas perdas ocorrem pela ativação excessiva do canal de transporte dos íons potássio e cloro (K+Cl-), estimulados pela
acidificação e pelo edema celular (este canal está muito ativo nos reticulócitos, onde a desidratação desempenha papel importante na formação das células densas) (BALLAS; MOHANDAS, 1996). Assim, a polimerização da HbS resulta em alterações no equilíbrio de eletrólitos na hemácia com aumento do Ca++ no citosol que leva à ativação dos canais de K+ e água (canais de Gardos), levando à desidratação da hemácia e formação de células rígidas (CAPPELLINI, 2007).
Para que as moléculas de HbS se agreguem é necessário que, além de desoxigenadas, estejam em elevada concentração, o que facilita sua associação. Se a hemoglobina voltar a se oxigenar, a falcização não ocorre (ZAGO; PINTO, 2007). Assim, o afoiçamento das hemácias é inicialmente reversível, mas as constantes modificações (polimerização-despolimerização) lesam a membrana celular, tornando-a permanentemente alterada (BUNN et al., 1986).
Com a deformação e diminuição da flexibilidade, as hemácias ficam impedidas de transitarem livremente na microvasculatura apresentando maior tendência a formar agregados celulares na microcirculação concorrendo para o surgimento da oclusão dos vasos (NAHAVANDI et al., 2000; FRENETTE; ATWEH, 2007).
A vasoclusão é um evento complexo no qual estão envolvidos eritrócitosfalcizados e normais, reticulócitos, plaquetas, leucócitos assim como o envolvimento de proteínas plasmáticas e fatores inflamatórios, como citocinas inflamatórias (HOOVER et al., 1979). O conceito de vasoclusão evoluiu após a descoberta de que os eritrócitos falcizados têm uma forte propensão a aderir às células do endotélio (HEBBEL et al., 1982).
A ocorrência de vasoclusões, principalmente em pequenos vasos, é determinante na origem da maioria dos sinais e sintomas presentes no quadro clínico e alterações estruturais e funcionais nos mais diversos órgãos e sistemas do paciente com doença falciforme (DEAN; SCHECHTER, 1978; BALLAS; MOHANDAS, 1996). Vasoclusão leva a infarto, hemólise e inflamação; a inflamação aumenta a expressão de moléculas de adesão, aumentando ainda mais a tendência dos eritrócitos falciformes a aderir ao endotélio vascular (REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010). Essa adesão pode causar obstrução e hipóxia local, com agravamento da falcização, ao mesmo tempo em que desencadeia os fenômenos inflamatórios (ZAGO; PINTO, 2007). Assim, embora este processo requeira a polimerização de HbS, o evento que desencadeia a obstrução vascular por eritrócitos falciformes é frequentemente inflamatório (REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010).
Monócitos de indivíduos com DF encontram-se ativados devido, possivelmente, a fagocitose de células vermelhas falcizadas senescentes e micropartículas celulares. Esses monócitos ativados estimulam as células endoteliais através da liberação de citocinas
pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL-6 ( ZAGO; PINTO, 2007). Essas citocinas podem ativar o fator nuclear kappa B (NF-kB) nas células endoteliais resultando em maior expressão de moléculas de adesão, incluindo E-selectina, molécula de adesão intercelular (ICAM -1) e molécula de adesão celular vascular 1( VCAM-1), promovendo assim a adesão de leucócitos mononucleares a células endoteliais (ZHANG,2016). Outras interações adesivas do endotélio com as células vermelhas, leucócitos e plaquetas levam a uma ativação pancelular perpetuando um ciclo vicioso de repetida ativação celular, adesão celular e produção de moléculas inflamatórias que proporcionam um estado inflamatório crônico fundamental no processo de vasoclusão (CONRAN; FRANCO-PENTEADO; COSTA, 2009).
Assim, a fisiopatologia da doença falciforme liga-se a três mecanismos inter-relacionados: a adesão de eritrócitos, granulócitos, monócitos e plaquetas ao endotélio vascular; os fenômenos inflamatórios crônicos, exacerbados por episódios agudos com mobilização de células inflamatórias agudas (granulócitos) e crônicas (monócitos); e a produção de intermediários inflamatórios, como citocinas (ZAGO; PINTO, 2007) (Figura 2).
Figura 2 – Fisiopatologia da anemia falciforme Fonte: Steinberg, 1999.
Estudos recentes sugerem que o heme livre, que se acumula em decorrência da hemólise crônica, possa ser um importante mediador inflamatório na doença falciforme, através de sua capacidade de ligação aos receptores Toll like receptor 4 (TLR4) estimulando células endoteliais e induzindo a liberação de fator de crescimento placentário (PlGF) de glóbulos vermelhos. PlGF ativa os monócitos, levando à produção de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β que estimulam maior expressão de moléculas de adesão pelas células endoteliais (ZHANG,2016). Assim, a participação de citocinas séricas nesse processo
inflamatório tem um papel importante na propagação e manutenção do quadro clínico desses pacientes (SHIU; UDDEN; McINTIRE, 2000).
O TNF-α é considerado uma das principais citocinas relacionadas aos processos inflamatórios e imunes, agindo em diferentes partes do corpo compartilhando muitas atividades biológicas com a interleucina 1 (IL-1) (TATAKIS; KUMAR, 2005). Ele é secretado por macrófagos, linfócitos e monócitos, sendo a presença de lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos o principal estímulo para que isto ocorra. Quando liberado em baixas concentrações, o TNF-α age nas células endoteliais promovendo vasodilatação e estimulando-as a secretarem quimiocinestimulando-as como a interleucina 8 (IL-8). A principal ação da IL-8 é o estímulo migratório de células do sistema imune, principalmente neutrófilos, promovendo, desta forma, apoptose de células-alvo também desempenhando um papel importante na patogênese da inflamação (MOORE et al., 1996; BAGGIOLINI; DEWALD; MOSER et al., 1994; TSAI; HO; CHENG, 1995).
A IL-1 é uma citocina "multifuncional", pois afeta quase todos os tipos de células. É, portanto, uma citocina pro-inflamatória prototípica. Há duas formas de IL-1: IL-lα e IL-1β e na maioria dos estudos, suas atividades biológicas são indistinguíveis. É uma citocina altamente inflamatória (DINARELLO et al., 1997).
Níveis séricos elevados de IL-8, IL-1 e TNF-α foram encontrados em pacientes com doença falciforme tanto durante a fase estável quanto em crises vasoclusivas dolorosas (GONÇALVES et al., 2001; FRANCIS; HAYWOOD et al., 1992; MALAVE et al., 1993; KUVIBIDILA et al., 1997; PATHARE et al., 2004; SARRAY et al., 2015). Marcadores de fase aguda elevados durante o estado estacionário sugerem que esses pacientes podem apresentar isquemia microvascular subclínica, o que leva à lesão tecidual (STUART et al., 1993). O aumento de TNF-α e IL-8 está associado ao aumento na expressão de moléculas de adesão em células endoteliais, levando a adesão de leucócitos e de hemácias falcizadas ao endotélio, contribuindo desta forma, para potencializar a vasoclusão (PATHARE et al., 2004). Em áreas de lesão endotelial, a IL-8 ativa a integrina em hemácias falciformes e fibronectina associada à superfície endotelial, aumentando assim a adesão dessas hemácias ao endotélio (KEIKHAEI et al., 2013).
A interleucina 6 (IL-6) também tem sido descrita na doença falciforme e seus níveis séricos elevados foram demonstrados em pacientes em crises vasoclusivas comparados aos controles saudáveis (HIBBERT et al., 2005; KEIKHAEI et al., 2013; SARRAY et al., 2015). A IL-6 é uma citocina com atuação tanto na resposta imune inata como na adaptativa se constituindo em importante marcador inflamatório. Ela é sintetizada por monócitos, células
endoteliais, fibroblastos e outras células em resposta a microrganismos e também à estimulação por outras citocinas, principalmente a IL-1 e TNF-α. É uma citocina amplamente expressa durante a reação inflamatória, sendo um dos maiores mediadores da fase aguda da inflamação (HEINRICH et al., 1990).
Por outro lado, tem sido sugerido que níveis séricos elevados de interleucina10 (IL-10) estão presentes na fase estável da doença falciforme e que níveis reduzidos dessa citocina são encontrados nos pacientes em crise (PATHARE et. al., 2004; SARRAY et al., 2015).
A IL-10 é considerada uma citocina imunomoduladora que possui funções anti-inflamatórias relevantes. Está relacionada com a supressão da resposta inflamatória, inibição de citocinas pro inflamatórias como a IL-6 e IL-8, bem como na inibição da migração de células imunes como monócitos, macrófagos e neutrófilos sendo fundamental para proteger o hospedeiro do dano tecidual durante as fases agudas das respostas imunes controlando a magnitude dessas respostas e consequentemente reduzindo o dano causado por citocinas inflamatórias (ROJAS et al., 2017).
Assim, os níveis séricos reduzidos de IL-10 e aumentados de IL-6 também estão associados ao desenvolvimento de crise vasoclusiva e sua gravidade em pacientes com doença falciforme (PATHARE et. al., 2004; SARRAY et al., 2015). Estudos demonstraram ainda, uma correlação positiva e significativa de IL-8 e interleucina 17 (IL-17) entre esses pacientes durante a crise vasoclusiva comparados com pacientes em condições estáveis da doença, sugerindo que estas citocinas, possam ser usadas como marcadores relacionados à gravidade da doença e, consequentemente, para intervenção terapêutica (KEIKHAEI et al., 2013).
A clínica da doença falciforme é muito variável, pois depende de fatores genéticos, sociais, culturais e ambientais (FIGUEIREDO, 2007). Os eventos clínicos são caracterizados como agudos e crônicos e estão presentes na vida do paciente intercalados de períodos sem manifestações clínicas, denominados fase estável da doença (SILVA FILHO et al., 2012). Pacientes com doença falciforme têm níveis menos intensos de inflamação durante o estado estável assintomático devido a eventos isquêmicos microvasculares. A isquemia microvascular é devida a um nível persistente e baixo de reticulócitos falciformes e aderências endoteliais anormais (MOORE et al., 1996). Acredita-se que estes pacientes apresentam esse estado inflamatório de baixo grau durante a fase estacionária produzindo moderadamente proteínas de fase aguda pelo fígado, tais como a proteína C-reativa e o amiloide sérico A e que apresentam aumentos significativos durante as crises vasoclusivas (STUART et al., 1994; MONNET et al., 1993).
Entre as manifestações clínicas sistêmicas das doenças falciformes, as seguintes são observadas frequentemente: crises álgicas, palidez da pele, icterícia, apatia, alterações cardíacas, alterações pulmonares (síndrome torácica aguda), convulsão, acidente vascular cerebral (AVC), alterações ósseas, osteomielite, anemia hemolítica crônica, crescimento prejudicado, baixo peso corporal, menor produção de testosterona, priapismo, atraso na maturação esqueletal e sexual, cefaleia, manifestações hepatobiliares, hematúria e propensão às infecções (DI NUZZO; FONSECA, 2004; FIGUEIREDO, 2007; BOTELHO et al., 2009; SILVA FILHO et al., 2012; MARTINS PR et al, 2015). As infecções são as complicações mais comuns que requerem hospitalização e também a causa de morte mais frequente na doença (DI NUZZO; FONSECA, 2004; FIGUEIREDO, 2007; SILVA FILHO et al., 2012).
As estratégias terapêuticas utilizadas e desenvolvidas para o tratamento da doença falciforme são baseadas em três pontos: diminuir a concentração intracelular de HbS com agentes que ativem a síntese de hemoglobina F (HbF) ou agentes que impeçam a falcização da hemácia; diminuir os eventos de adesão celular e, consequentemente, a vasoclusão e o terceiro ponto seria reduzir o processo inflamatório (WAILOO, 2017).
Nas últimas décadas, vários compostos têm sido estudados com o intuito de aumentar a concentração de HbF em pacientes portadores de AF. No entanto, apenas a hidroxiureia (HU) é aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da anemia falciforme, uma vez que ela é capaz de modificar o curso da doença (CHARACHE et al., 1995). Ela aumenta a produção de hemoglobina fetal (HbF) e níveis aumentados de HbF diminuem a quantidade de HbS disponível para a formação de polímeros intra-eritrócitos minimizando a gravidade clínica da doença (GOLDBERG et al., 1990).
Estudos sugerem que a HU também diminui a adesão das células vermelhas falciformes ao endotélio vascular podendo ser devido à diminuição da densidade de moléculas de adesão em células endoteliais vasculares reduzindo o número anual de crises (ADRAGNA; FONSECA; LAUF, 1994; WAILOO, 2017).
Outras terapias no tratamento da doença falciforme consistem em gerenciamento da dor, transfusão de sangue, imunização, profilaxia antibiótica e mais recentemente transplante de medula óssea (GOLDBERG et al., 1990).
Praticamente todos os órgãos e tecidos podem ser afetados pela oclusão vascular (PLATT et al., 1994). Os efeitos patológicos da doença falciforme demonstrados em outras áreas do corpo também ocorrem em tecidos orais (BOTELHO et al., 2009; HOSNI et al., 2008; JAVED et al., 2013). Os principais sinais da doença falciforme na cavidade oral descritos na literatura são: língua lisa e despapilada, palidez da mucosa oral, atraso na erupção
dos dentes, transtornos da mineralização do esmalte e da dentina (hipomaturação, hipoplasia e hipomineralização) que podem aumentar a susceptibilidade à cárie dental, deformidades dento faciais, hipercementose, osteomielite, necrose pulpar asséptica e neuropatia do nervo mentoniano (BOTELHO et al., 2009; JAVED et al., 2013; AL- JAFAR et al., 2016).
Têm-se considerado uma associação clínica entre doença gengival/periodontal e doença falciforme, porém, os resultados são contraditórios (AL-JAFAR et al., 2016). Foi encontrada uma prevalência significativamente maior de doença periodontal em pacientes com anemia falciforme quando comparados ao grupo controle (SINGH et al., 2013). Entretanto, outros autores, não encontraram diferença significativa ao comparar a doença gengival/periodontal em pacientes com anemia falciforme ao grupo controle (CRAWFORD, 1988; AROWOJOLU et al., 1999; GUZELDEMIR et al., 2011; PASSOS et al., 2012;AL-ALAWI et al., 2015) .
A possibilidade de uma condição bucal localizada como a doença periodontal (DP) ter efeitos sistêmicos está despertando o interesse de estudiosos do assunto. Nos últimos anos, surgiram evidências que apoiam a noção de que doenças infecciosas localizadas como a DP podem influenciar uma série de doenças sistêmicas (SCANNAPIECO, 2005). Várias condições como a Diabetes Mellitus, doenças cardiovasculares, infecções respiratórias, artrite reumatoide e a ocorrência de partos prematuros podem dar origem a uma maior prevalência, incidência ou gravidade da gengivite e periodontite (KINANE; MARSHALL, 2001).
As duas doenças periodontais mais prevalentes e mais investigadas são gengivite induzida por placa bacteriana e periodontite crônica (TATAKIS; KUMAR, 2005). Gengivite e periodontite são condições inflamatórias de natureza infecciosa (WILLIAMS, 1990). A evidência indica que a gengivite precede o início da periodontite; no entanto, nem todos os casos de gengivite se desenvolvem em periodontite. A razão para isso é que o acúmulo de bactérias na placa é necessário, mas não suficiente por si só para o desenvolvimento da periodontite: é necessário um hospedeiro suscetível (LINDHE; HAMP; LOE, 1973).
A gengivite, objeto de nosso estudo, é caracterizada clinicamente pela presença de sinais como: eritema e edema do tecido gengival, sangramento após sondagem, alterações no contorno e consistência, presença de cálculo e/ou placa bacteriana e sem evidência de perda óssea ou de tecidos de suporte do periodonto só atingindo os tecidos de proteção (AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, 2000) sendo uma condição inflamatória reversível associada à placa bacteriana (LOE et al., 1965). Nesse processo, há ativação e recrutamento de neutrófilos e monócitos para a região do sulco gengival por ação de citocinas liberadas no local (GRAVES; LI; COCHRAN, 2011) como a IL-6 e TNF-α e
citocinas/quimiocinas associadas a estágios iniciais da inflamação como IL-8 e IL-1β (YUCEL et al., 2013; BELSTROM et al., 2017).
Por muitos anos, o diagnóstico das doenças periodontais foi baseado somente nos métodos clínicos e radiográficos. Atualmente, a maioria dos testes de diagnóstico para doença periodontal tem o objetivo de estudar a resposta inflamatória do hospedeiro utilizando biomarcadores presentes no fluido crevicular gengival e, em descobertas mais recentes, na saliva (EMBERY; WADDINGTON, 1994; RATHNAYAKE et al., 2013; TAYLOR, 2014). Desta maneira, métodos imunológicos e biológicos podem identificar mediadores liberados na inflamação periodontal (CHIBEBE et al., 2008).
O FCG é o resultado da interação entre o biofilme bacteriano aderido à superfície do dente e as células do tecido periodontal. É uma complexa mistura de substâncias derivadas do soro sanguíneo, leucócitos, células estruturais do periodonto e microrganismos bucais. Estas substâncias detêm um grande potencial para servir como indicadores de doença periodontal e cicatrização pós-terapia (CHIBEBE et al., 2008).
A saliva é também um fluido de diagnóstico útil para doenças orais. Monitoramento de biomarcadores salivares para doenças bucais e sistêmicas podem tornar-se um complemento importante para exames clínicos em inquéritos epidemiológicos. O uso desses fluidos biológicos para avaliação de biomarcadores têm se mostrado promissor para a dosagem de citocinas envolvidas com a resposta imune (TAYLOR, 2014; RATHNAYAKE et al., 2013).
Níveis séricos elevados das interleucinas (IL) (IL-8, IL-10, IL-4, IL-5, IL-13) eTNF-α foram encontrados em crianças com anemia falciforme que apresentavam gengivite quando comparadas com crianças com gengivite, porém sem anemia falciforme. Embora os níveis séricos destas citocinas estivessem aumentados nos pacientes com doença falciforme, os autores não associaram esse aumento diretamente com a doença periodontal, não estabelecendo uma relação imunológica sistêmica com processos inflamatórios locais (VEIGA et al., 2013). Análises de mediadores inflamatórios em pacientes com doença falciforme têm sido feitas em amostras de sangue periférico, mostrando níveis séricos das citocinas dosadas.Essas citocinas e enzimas são detectáveis em fluidos orais como saliva e fluido crevicular gengival (FCG) (MILLER et al., 2006). Porém, não foram encontrados estudos mostrando dosagem de citocinas nesses fluidos em pacientes com doença falciforme.
No presente estudo, os mediadores inflamatórios (IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8) foram avaliados localmente, na saliva e no fluido crevicular gengival, antes e após o tratamento periodontal, analisando a reação inflamatória in situ, na gengivite de pacientes com doença falciforme comparada a indivíduos controles. Foi avaliada também a expressão
desses mediadores inflamatórios em indivíduos com e sem gengivite, independentemente da doença falciforme. Ainda foram dosadas as expressões de IL-1β, IL-6 e IL-8 na saliva e no fluido crevicular gengival, antes e depois do tratamento periodontal, dos pacientes com doença falciforme associada com o uso ou não da hidroxiureia.
Embora a literatura descreva aumento sérico de citocinas inflamatórias em pacientes com doença falciforme, em nosso estudo verificamos que há citocinas pro-inflamatórias diminuídas na saliva e no fluido crevicular gengival desses pacientes , quando comparados aos controles saudáveis, não agravando o processo inflamatório na cavidade oral, neste grupo de pacientes analisados.
2. JUSTIFICATIVA
Pessoas com Doença Falciforme podem apresentar manifestações e/ou complicações orais. Têm-se considerado uma associação clínica entre doença gengival/periodontal e doença falciforme, porém, os resultados são contraditórios.
Estudos têm sido realizados mostrando níveis séricos de citocinas inflamatórias associadas à doença falciforme não estabelecendo relação imunológica sistêmica com processos inflamatórios locais como a gengivite.
Não foram encontrados estudos mostrando dosagem dessas citocinas em saliva e fluido crevicular gengival de pacientes com doença falciforme. O papel de citocinas inflamatórias associadas às doenças gengivais desses indivíduos ainda não foi claramente esclarecido sendo necessário analisar a expressão dessas citocinas localmente.
Portanto, justifica-se o presente estudo de análise da reação inflamatória, na gengivite, in situ, dosando mediadores inflamatórios na saliva e no fluido crevicular gengival, antes e após o tratamento periodontal, de pacientes com doença falciforme comparada a indivíduos controles.
3. HIPÓTESE
Pacientes com Doença Falciforme têm saúde bucal comprometida com resposta inflamatóriaoral mais intensa em relação aos pacientes sem a Doença Falciforme.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
Avaliar as condições de saúde bucal e a expressão de mediadores inflamatórios associados à gengivite em pacientes portadores de Doença Falciforme (DF) atendidos no Serviço de Odontologia da UFTM.
4.2. Objetivos específicos
Identificar as condições de saúde bucal e principais manifestações orais nos pacientes com Doença Falciforme.
Avaliar a expressão de IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8 no fluido crevicular gengival de pacientes portadores de Doença Falciforme, antes e depois do tratamento periodontal e compará-la ao grupo controle.
Avaliar a expressão de IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8 na saliva de pacientes portadores de Doença Falciforme, antes e depois do tratamento periodontal e compará-la ao grupo controle.
Avaliar a expressão de IL-1β, IL-6 e IL-8 no fluido crevicular gengival e na saliva antes e depois do tratamento periodontal associada ao uso de hidroxiureia nos pacientes com Doença Falciforme.
Determinar a expressão de IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8 no fluido crevicular gengival de indivíduos com gengivite, antes e depois do tratamento periodontal e compará-la àqueles sem gengivite.
Determinar a expressão de IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNFα e IL-8 na saliva de indivíduos com gengivite, antes e depois do tratamento periodontal e compará-la àqueles sem gengivite.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Casuística
Este projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da UFTM- Uberaba (MG), e aprovado, sob o protocolo de número 44191715.8.0000.5154. Pacientes com diagnóstico de Doença Falciforme (DF) atendidos no Serviço de Hematologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) e Hemocentro de Uberaba foram encaminhados para o Serviço de Odontologia da UFTM para avaliação de saúde bucal e conduta odontológica. Foram incluídos no estudo, 35 pacientes com doença falciforme, portadores ou não de gengivite, e que concordaram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). O grupo controle foi constituído por indivíduos voluntários sem Doença Falciforme portadores ou não de gengivite que concordaram em participar do estudo e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Foram excluídos do estudo os pacientes portadores de Doença Falciforme que não realizavam acompanhamento médico, que não aderiram ao tratamento e que apresentavam crises agudas no momento da triagem. Excluiu-se do grupo controle, indivíduos com doenças associadas ao sistema endócrino como diabetes mellitus, tabagistas, além de mulheres grávidas ou em uso contínuo de anticoncepcionais. A recusa em assinar o TCLE, sorologia positiva para os vírus HCV, HBV e HIV e o não comparecimento para a segunda coleta foram critérios de exclusão para os dois grupos.
Assim, foram formados dois grupos: 35 pacientes com Doença Falciforme (GF) e 28 voluntários sem doença falciforme como grupo controle (GC) que cumpriram as duas etapas pré-estabelecidas:
1) Avaliação clínica, primeiras coletas e Terapia Periodontal não Cirúrgica (TPNC). 2) Retorno à consulta para avaliação gengival e segundas coletas.
5.2. Coleta dos dados
A coleta dos dados foi realizada no Serviço de Odontologia da UFTM, através de questionário, dividido em duas partes: 1ª parte (para os dois grupos) – informações gerais e epidemiológicas como: nome, idade, gênero, naturalidade e local de moradia atual, cor da pele, estado civil, escolaridade, profissão e comorbidades; 2ª parte (para o grupo de pacientes com DF) – composta de informações gerais relacionadas à doença de base como:
forma de doença falciforme, histórico de crises álgicas, infecções e transfusões de sangue, uso de medicamentos e frequência de internações a fim de conhecer a história médica pregressa destes pacientes. E ainda, questões sobre hábitos de higiene bucal como: frequência de escovação dentária; uso de fio dental e enxaguante bucal que foram respondidas pelos dois grupos. Foram utilizados respondentes próximos (mães ou responsáveis) para algum participante que não conseguiu responder às perguntas ou apresentou déficit cognitivo.
5.3. Exame clínico oral
Os exames orais foram realizados nos consultórios odontológicos da UFTM. Foram avaliadas as condições de saúde bucal através de exame clínico oral utilizando espelho clínico bucal plano n° 5, exploradores nº 5 e sonda periodontal milimetrada Williams preconizada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), observando todas as estruturas orais (tecidos moles e duros). As alterações foram identificadas e registradas em prontuários. As cáries dentárias foram medidas utilizando os índices de Dentes Cariados, Perdidos e Obturados (CPO-D) para dentição mista e permanente e dentes cariados, com extração indicada e obturados (ceo-d), para a dentição decídua, utilizando o dente como medida, preconizados por Klien e Knutson (1938) para os dois grupos.
Em ambos os grupos foram realizados levantamentos de índice de biofilme dental, segundo o índice de placa visível (IPV) e de sangramento gengival (ISG), propostos por Ainamo & Bay (1975). A primeira etapa desse exame verificou a presença ou ausência do biofilme supra gengival em todos os dentes presentes. Em seguida, foi realizada a avaliação do sangramento gengival, após sondagem do sulco gengival em quatro sítios: vestibular, lingual/palatino, mesial e distal, sendo excluídas as faces oclusais e incisais por não apresentarem relação com o sulco gengival.
Nesse exame, foram identificadas as características comuns às doenças gengivais como a presença de placa bacteriana visível, sangramento gengival na sondagem, aumento dos contornos gengivais (edema) e eritema, associadas a níveis estáveis do periodonto de sustentação. Nessa sondagem verificou-se perda ou não de inserção clínica sendo considerado como normal sulco com até 3 mm de profundidade.
Assim, a gengivite foi caracterizada como inflamação restrita ao periodonto de proteção com profundidade do sulco até 3 mm e com sinais clínicos de inflamação sendo
classificada como: gengivite induzida pela placa bacteriana, generalizada, nas intensidades: leve, moderada ou avançada.
Os padrões universais de biossegurança foram respeitados utilizando material descartável e equipamentos de proteção individual (EPIs) como luvas, gorro, máscara, avental e óculos de proteção visual .
5.4. Coleta de amostras
Para avaliação das citocinas, foi realizada coleta de fluido crevicular gengival (FCG) e saliva. As primeiras coletas foram feitas antes da terapia periodontal para os dois grupos. Foi coletada saliva total não estimulada em tubo de 15 ml com tampa rosqueável selecionado para esse fim, numa quantidade mínima de 3 ml. Os tubos com as amostras foram armazenados e mantidos em freezer a -70°C. A coleta do fluido crevicular gengival foi realizada utilizando cone de papel absorvente no sulco gengival dos dentes que apresentaram a mesma intensidade de processo inflamatório para os dois grupos. Para indivíduos sem gengivite a coleta do fluido gengival foi feita em sítios sem presença de sinais clínicos de inflamação gengival. Imediatamente após a coleta, os cones de papel absorvente foram colocados em tubo de 1,6 ml, armazenado e mantido em freezer a -70°C. Posteriormente, no momento das análises todos os cones foram ressuspendidos em 150ul de solução tampão para eluição do FCG.
Para os pacientes com doença falciforme, as coletas e o tratamento periodontal foram feitos na fase estável da doença com os pacientes sem crise no momento do atendimento. As coletas para esse grupo foram feitas em uma consulta prévia e a terapia periodontal não cirúrgica foi feita em consultas subsequentes, com profilaxia antibiótica. Pacientes com doença falciforme são particularmente susceptíveis a infecções secundárias à bacteremia transitória que alguns procedimentos odontológicos provocam. Para as crianças maiores de 5 anos, foi prescrito Amoxicilina (50mg/kg), e para os adultos, também Amoxicilina (2g), por via oral, uma hora antes do procedimento, conforme protocolo recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil (BRASIL, 2007).
Para os dois grupos, em casos de gengivite leve, foram feitos procedimentos de profilaxia e polimento coronário com taça de borracha e pasta profilática e posterior aplicação tópica de flúor em todos os dentes. Para gengivites moderadas e avançadas foi feita raspagem supra gengival com curetas Gracy e polimento coronário com taça de borracha e pasta profilática e posterior aplicação tópica de flúor em todos os dentes
presentes.
A segunda coleta foi feita aproximadamente 30 dias após a terapia periodontal, quando já se estabeleceu a resposta imune adaptativa, para ambos os grupos. As amostras de saliva e fluido crevicular foram realizadas de maneira idêntica à anterior e o material foi armazenado em freezer a -70°C.
As coletas e o tratamento periodontal não cirúrgico foram feitos no período de Novembro de 2015 a Julho de 2016. É um estudo prospectivo.
Todos os participantes da pesquisa receberam orientações quanto às técnicas de escovação e higiene bucal para controle de placa e noções de nutrição e dieta.
5.5. Dosagem de citocinas na saliva e fluido crevicular gengival
A análise dos níveis de IL-10; IL-12; IL-1β; IL-6, TNF-α e IL-8 foi realizada nos pacientes com doença falciforme e comparada com o grupo controle, tanto na saliva, como no fluido crevicular gengival em dois momentos, antes do tratamento periodontal (saliva 1 e F. crev 1) e após o tratamento periodontal (saliva 2 e F. crev 2). Foi analisada ainda a expressão desses mediadores inflamatórios nos indivíduos dos dois grupos, independentemente da doença falciforme, com e sem gengivite. Também foi avaliada a associação da IL-1β, IL-6 e IL-8 com o uso da hidroxiureia (HU) no grupo dos pacientes com doença falciforme.
As citocinas foram dosadas pela técnica de Cytometric Bead Array (CBA) (BD BIOSCIENCES- EUA), Kit, Cat: 551811, conforme instruções do fabricante. As amostras e as citocinas/quimiocina recombinantes foram incubadas com microesferas com distintas intensidades de fluorescência conjugadas com um anticorpo de captura específico para cada citocina/quimiocina.
Em seguida, foram adicionados anticorpos específicos para cada citocina/quimiocina conjugados com ficoeritrina (PE). Após incubação, as microesferas foram lavadas com solução própria do kit do fabricante e analisadas em citômetro FACSCalibur (BD BIOSCIENCES-EUA) utilizando o programa Cell Quest (BD BIOSCIENCES-EUA).
As microesferas específicas para cada citocina/quimiocina foram separadas por emitirem intensidades diferentes de fluorescência emitida à 660nm e a quantidade de citocina conjugada a cada uma delas pela intensidade de fluorescência emitida à 585nm.
Após aquisição dos dados das amostras e citocinas/quimiocina recombinantes, estes foram levados ao software FCAP Array 2.0 (SoftFlow-EUA) e as concentrações das
citocinas/quimiocina calculadas a partir da curva padrão.
5.6. Análise estatística
A análise estatística foi realizada por meio do programa Statview (Abaccus - EUA). As variáveis contínuas que apresentaram distribuição não normal foram expressas em mediana com valores mínimo e máximo e percentis. As variáveis que apresentaram distribuição não normal foram analisadas pelos testes de Mann-Whitney (T). Para comparar duas variáveis contínuas nos mesmos pacientes foi aplicado o teste de Wilcoxon (U). Foi realizado Teste t de Student pareado para média de idades. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando a probabilidade foi menor que 5% (p<0,05).
5.7. Normas para a confecção do manuscrito
Para a elaboração escrita do trabalho, foi consultado o Manual para Apresentação de Trabalhos Acadêmicos baseado nas normas de documentação da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), organizado pela biblioteca universitária da UFTM (ALVES; SILVA; ALMEIDA, 2013).
6- RESULTADOS
A média da idade dos 63 indivíduos avaliados foi de 29.46 anos (variando de 04 a 66 anos), sendo que no grupo falciforme foi significativamente menor que o grupo controle 23,31±16,07 e 37,14± 13,72 respectivamente. Quanto ao gênero, dos pacientes do grupo falciforme 22 (62,86%) eram do sexo feminino,enquanto no grupo controle o sexo feminino representava 75% (21). Quanto à etnia, 6 pacientes (17,14%) do grupo falciforme eram da etnia branca, 27 (77.14%) não branca e dois não informaram (5,71%). Do grupo controle, 19 (67,86%) eram da etnia branca e 9 (32,14%) não branca (Tabela 1).
Tabela 1– Distribuição da média de idade, gênero e etnia
Grupo Falciforme Grupo Controle
Total 35 28
Média de Idade 23,31±16,07 37,14± 13,72 *
Gênero Masculino 13 (37,14%) 7 (25%)
Gênero Feminino 22 (62,86%) 21 (75%)
Etnia Branca 6 (17,14%) 19 (67,86%)
Etnia não branca 27** (77,14%) 9 (32,14%)
* Teste t de Student pareado; p=0,0006 ** 2 não informaram.
Fonte: Elaborado pelo autor, 2017.
No que tange aos genótipos da doença falciforme, verificou-se que 20 (57,14%) apresentavam HbSS (anemia falciforme), 6 (17,14%) apresentavam Sβ talassemia, 7 (20,00%) apresentavam HbSC, 1 (2,86%) apresentou HbSF,1 (2,86%) apresentou HbS alfa talassemia (Tabela 2).
Tabela 2 – Distribuição de genótipos de pacientes com a doença falciforme Formas de doença falciforme Valor absoluto Valor relativo (%)
HbSS 20 57,14 HbS/ β talassemia 6 17,14 HbSC 7 20,00 HbFS 1 2,86 HbS/ Alfa talassemia 1 2,86 Total 35 100
Quanto às manifestações orais, 21 (60%) pacientes do grupo falciforme, se apresentaram com palidez de mucosa oral e 18 (51,43%) apresentavam-secom língua lisa e despapilada; 18 (51,43%) tinham maloclusão sendo a classe II a mais encontrada, 18 (51,43%) com icterícia; 15 (42,86%) apresentaram pigmentações em gengiva ou dentes; 11 (31,43%) com anquiloglossia, 3 (8,5%) tinham hipoplasia de esmalte (Tabela 3).
Os dois grupos apresentaram gengivite, 28 (80%) do grupo falciforme e 27 (96,42%) do grupo controle. A média do índice de Dentes Cariados, Perdidos e Obturados (CPO-D) dos pacientes do grupo falciforme foi de 10.80 e a média do índice de dentes decíduos cariados, com extração indicada e obturados (ceo-d) foi 2.2. Para o grupo controle a média do índice CPO-D foi de 11.04 (Tabela 3).
Quanto aos hábitos de higiene bucal, todos os pacientes dos dois grupos (100%) disseram fazer escovação diária dos seus dentes; 13 (37,14%) do grupo falciforme e 10 (35,71%) do grupo controle afirmaram fazer uso de enxaguante bucal sem clorexidina na formulação enquanto 16 (45,71%) do grupo falciforme e 19 (67, 86%) do controle fazem uso de fio dental (Tabela 3).
Tabela 3 – Manifestações clínicas e hábitos de higiene bucal dos pacientes com doença falciforme comparados com o grupo controle
Grupo falciforme Grupo Controle
Palidez de mucosa oral 21(60%) 1 (3,57%)
Língua lisa e despapilada 18 (51,43%) 0
Maloclusão 18(51,43%) 6 (21,43%) Icterícia 18 (51,43%) 0 Pigmentação 15 (42,86%) 5 (17,85%) Anquiloglossia 11(31,43%) 3 (10,71%) Hipoplasia de esmalte 3 (8,5%) 1 (3,57%) Gengivite 28(80%) 27 (96,42%) Média CPO-D(dentes cariados, perdidos e obturados) 10,80 11,04
Média ceo-d(dentes cariados com extração indicada e
obturados)
2,2 0
Uso de enxaguante bucal (sem clorexidina)
13(37,14%) 10(35,71%)
Uso de fio dental 16 (45,71%) 19(67,86%)
Fonte: Elaborado pelo autor, 2017.
Com relação às características específicas dos pacientes do grupo falciforme, 32 (91,43%) fazem uso de ácido fólico, 15 (42,86%) fazem uso da terapia com hidroxiureia (HU); 2 (5,71%) fizeram esplenectomia; 23 (65,71%) tinham histórico de transfusões de sangue frequentes, 19 (54,28%) com histórico de crises álgicas e 17 (48,57%) disseram já ter tido infecções em algum momento (Tabela 4).
Tabela 4 – Características específicas dos pacientes com doença falciforme
Uso de ácido fólico 32 (91,43%)
Uso de hidroxiureia 15 (42,86%)
Esplenectomia 2 (5,71%)
Relato de infecções 17 (48,57%)
Histórico de crise álgica 19 (54,28%)
Histórico de transfusão de sangue 23 (65,71%)
Fonte: Elaborado pelo autor, 2017.
Em relação à dosagem das citocinas, a IL-1β apresentou níveis significativamente menores na saliva do grupo falciforme antes do tratamento periodontal (saliva 1) quando comparado com o grupo controle (Mann Whitney; p= 0.02). Após o tratamento periodontal não foi encontrada diferença significativa na expressão de IL-1β comparando os dois grupos (Mann Whitney; p= 0,15).Ao comparar a expressão de IL-1β antes e depois do tratamento periodontal (saliva 1 e 2) no grupo falciforme não houve diferença significativa (Wilcoxon; p=0,17). Entretanto, no grupo controle, os níveis de IL-1β na saliva diminuíram significativamente após o tratamento periodontal (saliva 2) comparada com a saliva 1, antes do tratamento (Wilcoxon; p=0.008) (Figura 3).
No fluido crevicular gengival não houve diferença significativa nos níveis de IL-1β nos pacientes do grupo falciforme comparados com o grupo controle, antes e após o tratamento periodontal (F. crev. 1 e 2), (Mann Whitney; p= 0,30 e p= 0,13, respectivamente). Ainda, ao comparar a expressão dos níveis de IL-1β no FCG antes e após o tratamento periodontal (F. crev. 1 e 2) tanto no grupo falciforme como do grupo controle não houve diferença significativa (Wilcoxon; p=0,32; p=0,46 respectivamente) (Figura 3).
Figura 3 – Expressão de IL-1β na saliva e no FCG antes e depois do tratamento periodontal
Fonte: Elaborado pelo autor, 2017.
Expressão de IL-1β na saliva e no FCG dos pacientes com doença falciforme antes e depois do tratamento periodontal comparadas com o grupo controle. A linha horizontal representa a mediana, a barra o percentil de 25% a 75% e a linha vertical o percentil de 10 a 90%. p<0,05.
Todos os pacientes com gengivite (56 indivíduos), independentemente de ter ou não a doença falciforme, apresentaram níveis significativamente aumentados de IL-1β na saliva antes do tratamento (saliva 1) comparados com o grupo sem gengivite e esses níveis permaneceram elevados mesmo após o tratamento periodontal (saliva 2) (Mann Whitney; p= 0.009 e p= 0.02 respectivamente).
Da mesma forma, no fluido crevicular gengival os níveis de IL-1β foram significativamente maiores nos pacientes com gengivite antes (F.crev.1) e após o tratamento (F.crev.2) comparado àqueles sem gengivite (Mann Whitney; p= 0.01 e p= 0.003 respectivamente) (Figura 4).
