Síntese verde de nanopartículas contendo prata e uma fração da Alga Spatoglossum schröederi composta por ácido algínico e fucana A: caracterização físico-química e avaliação da atividade antiproliferativa frente às células de melanoma (B16F10)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. LARISSE ARAÚJO DANTAS. SÍNTESE VERDE DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO PRATA E UMA FRAÇÃO DA ALGA Spatoglossum schröederi COMPOSTA POR ÁCIDO ALGÍNICO E FUCANA A: CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA FRENTE ÀS CÉLULAS DE MELANOMA (B16F10). NATAL 2017.

(2) LARISSE ARAÚJO DANTAS. SÍNTESE VERDE DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO PRATA E UMA FRAÇÃO DA ALGA Spatoglossum schröederi COMPOSTA POR ÁCIDO ALGÍNICO E FUCANA A: CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA FRENTE ÀS CÉLULAS DE MELANOMA (B16F10) Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Leandro Silva Costa Co-Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre Oliveira Rocha. NATAL 2017.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB. Dantas, Larisse Araujo. Síntese verde de nanopartículas contendo prata e uma fração da Alga Spatoglossum schröederi composta por ácido algínico e fucana A: caracterização físico-química e avaliação da atividade antiproliferativa frente às células de melanoma (B16F10) / Larisse Araujo Dantas. - Natal, 2017. 95 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Leandro Silva Costa. Coorientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre Oliveira Rocha. 1. Algas marrons - Dissertação. 2. Polissacarídeos ácidos Dissertação. 3. Nanotecnologia - Dissertação. 4. Compostos antitumorais - Dissertação. I. Costa, Leandro Silva. II. Rocha, Hugo Alexandre Oliveira. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 561.272.

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(5) Dedico esta obra As pessoas que mesmo em outro plano estão tão felizes quanto eu com esta realização, in memoriam, aos meus avós, Maria Nalva, Inácia e Miguel, e ao meu tio Antônio Marcos, tenho certeza que vocês estão orgulhosos.. Aos meus pais, Maria Lúcia e Hélio, pelo suporte emocional, pela compreensão nos momentos difíceis e pela dedicação de parte de suas vidas para a minha formação.. À minha irmã, Laíze, que dividiu de perto comigo todas as alegrias e tristezas ocorridas durante esses dois anos..

(6) AGRADECIMENTOS. A DEUS, pelo infinito amor e piedade que permitiu concluir esta etapa dos estudos. Grande és tu meu pai. A minha mãe, por ser sempre uma mainha de força, coragem e brabeza, me inspiro em você para lutar por tudo que sonho. A meu pai, meu painho quieto mas sempre atento aos mínimos sinais de tristeza de minha parte, obrigada pelo apoio único e incondicional durante esses dois anos. A minha irmã, Laíze baby, minha irmã caçula com preguiça de comprar comida que me atura com todas as TPMs, estresses e loucuras durante os 365 dias do ano. Ao Professor Hugo, pela paciência para com a realização deste trabalho, confiança, broncas, ensinamentos e brincadeiras. Acredito que ambos aprendemos um pouco sobre nossas diferentes características durante esses quatro anos de convivência, encontrando os pontos positivos e lapidando as deficiências. Não espero precisar atendê-lo como médica um dia, pois prefiro encontrá-lo pulando no Carnaval de Caicó, mas caso aconteça será uma grande oportunidade de retribuir por tudo que você me ensinou. Obrigada por tudo de verdade. A família BIOPOL( é muita gente!!!!): Jailma , Mariana, Rafael, Raniere, Leandro (Orange orientador), Ruth, Popó, Lucas, Carla, Maria do Socorro, Adriana, Maíra, Samanta, Leonardo, Gabriel, Moacir, Joanna, Pablo, Karol, Éder, Cínthia, Jefferson, Dayanne, Cíntia, Letícia, Talita, Arthur, Vinícius, Maxsuell, Cauê, Rony, Marília, Monique, Mônica, Pablo, Danielle, Jefferson, Almino Afonso, Jéssyka, Poliana, Fabiana, Ana Karina e Ivan. A Daynnnn (sinônimo de belos looks) e Karol ( minha doidinha de coração cute) por terem me acompanhado nos testes celulares e no Carnaval 2016 ( Bloco da cubeta). A Jailma (Jajáaaa melhor pessoa ever), Marília (Lila Sereia) e Monique (Monicat forrozeira) pelo apoio imenso e enorme carinho recebido de vocês diariamente, adoro vocês girls. A Moacir (gordinho dono de um dos melhores abraços do mundo), Vinícius ( Brother te adoro mesmo você sendo vida loka) e Gabriel (vulgo Tião) por sempre me darem carona, emprestarem Money e rirem das besteiras da vida comigo. A toda a minha turma de mestrado, em especial a Rayana, Jéssyka, Angelicat, Carol, Raffa, Vladimir, Fábio e Rapha, pelos intensos e calorosos momentos vividos no primeiro ano de disciplinas e depois também..

(7) As minhas florzinhas de coração Paloma, Maria do Carmo, Lorena, Andreza, Ana Luíza, Edinha, Vanessa, Julías (1 e 2), Tatá, Laryssa, Renatinha e Nathy Thuany, obrigada por todos os momentos de descontração que vivenciamos. A minha turma de fitdance maravilhosa e aos meus professores de inglês.. A minha banca de qualificação, Profª Adriana Uchoa, Léo Nobre e Popó ( I speak English), pelas excelentes colaborações. A Profª Kátia e ao Profº Pablo, por aceitarem participar da minha banca de defesa. A Edjane Barroso e Vinícius Campelo, por cederem fotos das algas de seus arquivos pessoais.. Aos demais colegas, funcionários e professores do departamento de bioquímica pela atenciosidade e respeito.. A CAPES e o CNPq pelo financiamento que permitiu a execução deste trabalho.. A todos não foram citados aqui, mas que me ajudaram, rezaram e torceram por mim meus agradecimentos..

(8) I shall be telling this with a sigh Somewhere ages and ages hence: Two roads diverged in a wood, and I— I took the one less traveled by, And that has made all the difference. “The road not taken”, Robert Frost..

(9) RESUMO Nanopartículas de prata (AgNPs) possuem diversas aplicações biomédicas, dentre elas destaca-se o potencial antiproliferativo. Inúmeros tipos de síntese de nanopartículas de prata encontram-se descritos na literatura, no entanto, um tipo de síntese menos agressiva e mais economicamente viável, a síntese verde, tem ganhado importância dentre as demais. Neste processo de síntese é necessário o uso de um agente redutor e estabilizante que não sejam tóxicos para as células animais e para o meio ambiente. Nesse contexto, a associação de biomoléculas de origem marinha com atividades biológicas já descritas, como os polissacarídeos ácidos de algas, às AgNPs ganham importância. Muitos polissacarídeos ácidos (PA) extraídos de algas marinhas destacam-se por exibir diversas atividades, como exemplo as fucanas da alga Spatoglossum schröederi. Estas fucanas apresentam atividade antioxidante, antiangiogênica, antitumoral, dentre outras. Devido aos poucos relatos de síntese de AgNPs envolvendo polissacarídeos de algas, este trabalho teve por objetivo sintetizar AgNPs com uma fração rica em ácido algínico e fucana A da alga S. schröederi por um processo de síntese verde, e testar as AgNPs obtidas frente à linhagem de melanoma B16F10. Os PA da alga S. schröederi foram extraídos por um processo de digestão proteolítica e fracionados com acetona. A fração de maior rendimento e rica em ácido algínico e fucana A, a F0.5 v, foi empregada para a síntese das AgNPs. A caracterização das AgNPs obtidas contemplou a análise de absorção de luz UV, composição química, diâmetro médio, polidispersão, potencial zeta, espectroscopia de infravermelho (FTIR) e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de força atômica (MFA). As análises por espectroscopia de UV-visível na faixa entre 400 e 440 nm confirmaram a formação das AgNPs, estas apresentaram diâmetro de 196 ± 13 nm, valores de polidispersão abaixo de 0,4 e potencial zeta negativo. As dosagens químicas, o FTIR e o EDS revelaram que a maior parte das AgNPs é composta por polissacarídeos ácidos. As imagens obtidas por MEV e MFA indicaram um formato esférico para as AgNPs. A atividade antiproliferativa foi avaliada pelo método do MTT frente às linhagens celulares B16F10 e fibroblastos 3T3, e por citometria de fluxo foi investigado sua ação na morte e no ciclo celular. As AgNPs afetaram a capacidade de redução do MTT das linhagens 3T3 e B16F10, sendo esta mais evidenciada para a B16F10, pois as AgNPs (0,5 mg/mL) conseguiram reduzíla em torno de 50%, enquanto a prata iônica e a F0.5 v em nenhuma das concentrações influenciaram na redução do MTT. As análises por citometria de fluxo apontaram uma elevada taxa de marcação para anexina V e iodeto de propídio para as células B16F10 expostas às AgNPs, além de um aumento na porcentagem das células em Sub-G1 em detrimento às outras fases. Estudos adicionais são necessários para elucidar completamente o mecanismo de ação antiproliferativo das AgNPs e descobrir outras propriedades da fração que são intensificadas pela síntese de nanopartículas. Entretanto, pode-se concluir que é possível sintetizar AgNPs com polissacarídeos ácidos de S. schröederi usando um método verde e que essas AgNPs apresentaram atividade antiproliferativa mais pronunciada que seus percussores.. PALAVRAS-CHAVE: Algas marrons, Polissacarídeos ácidos, Nanotecnologia, Compostos antitumorais..

(10) ABSTRACT. Silver nanoparticles (AgNPs) have several biomedical applications, among them the antiproliferative potential. Numerous types of synthesis of silver nanoparticles are found in the literature, however, a type of synthesis less aggressive and more economically viable, a green synthesisl, has gained value among the others. In this synthesis process, it is necessary to use a reducing agent and stabilizer which are non-toxic to animal cells and to the environment. In this context, an association of biomolecules of marine origin with biological activities already described, such as the polysaccharide acids of algae, to the AgNPs gain importance. Many acidic polysaccharides (PA) extracted from marine algae are distinguished by their different activities, such as the algae Spatoglossum schröederi. These fucans have antioxidant, antiangiogenic, antitumor activity, among others. Due to the few reports of AgNPs synthesis involving algae polysaccharides, the objective of this work was to synthesize AgNPs with a rich fraction of alginic acid and fucan A from the S. schröederi algae by a green synthesis process and to test the AgNPs obtained on the lineage of melanoma B16F10. The PA of the S. schröederi algae was extracted by a proteolytic digestion process and fractionated with acetone. The higher yield fraction rich in alginic acid and fucan A, F0.5 v, was used for synthesis of the AgNPs. The characterization of the AgNPs obtained contemplated an analysis of UV light absorption, chemical composition, average diameter, polydispersity, zeta potential, infrared spectroscopy (FTIR), dispersive energy spectroscopy (EDS), scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM). The analyzes by UV-visible spectroscopy in the range between 400 and 440 nm confirmed the formation of AgNPs, they presented 196 ± 13 nm diameter, polydispersion values below 0.4 and negative zeta potential. The chemical dosages, FTIR and EDS revealed that most AgNPs are composed of acidic polysaccharides. The images obtained by SEM and AFM indicated a spherical format for AgNPs. The antiproliferative activity was evaluated by the MTT method against B16F10 cell lines and 3T3 fibroblasts, and by flow cytometry, its action on death and cell cycle was investigated. The AgNPs affected the ability to reduce MTT from the 3T3 and B16F10 lineages, but these were evidenced for a B16F10, the AgNPs (0.5 mg/mL) were able to reduce by around 50%, while a silver ion and F0.5 v at any of the concentrations influenced the reduction of MTT. Flow cytometry analyzes indicated a high labeling rate for annexin V and propidium iodide for the B16F10 cells exposed to AgNPs, in addition to an increase in the percentage of cells in SubG1 in detriment to the other phases. Additional studies are needed to fully elucidate the mechanism of antiproliferative action of AgNPs and to discover other properties of the fraction that are enhanced by the synthesis of nanoparticles. However, it can be concluded that it is possible to synthesize AgNPs with acidic polysaccharides from S. schröederi using a green method and that these AgNPs showed more pronounced antiproliferative activity than their precursors.. KEYWORDS: Brown Algae, Acid Polysaccharides, Nanotechnology, Antitumor compounds..

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Exemplares de macroalgas marinhas. .......................................................... 25 Figura 2 - Características estruturais do alginato. ........................................................ 26 Figura 3 - Estrutura da fucana A proposta por Leite e colaboradores (1998). ............. 28 Figura 4 - Alga Spatoglossum schröederi (C.Agardh) Kützing. Fonte: Arquivo pessoal de Edjane Maria de Azevedo Barroso. ......................................................................... 32 Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 0,6% das frações polissacarídicas obtidas da alga marrom S. schröederi. ........................................................................................... 42 Figura 6 - Imagem dos espectros de UV-visível das nanopartículas sintetizadas com S. schröederi no tempo inicial (linha preta) e após o período de síntese de uma hora (linha cinza).. ................................................................................................................ 43 Figura 7 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura das nanopartículas sintetizadas com a F0.5 v da alga S. schröederi. .......................................................... 45 Figura 8- Imagem de microscopia de força atômica das nanopartículas sintetizadas com a F0.5 v da alga S. schröederi. .............................................................................. 47 Figura 9 - Avaliação da estabilidade das AgNPs pela técnica de DLS ao longo de quatro meses a 4°C. ...................................................................................................... 48 Figura 10 - Análise das posições dos picos obtidos por espectroscopia de infravermelho (FTIR) para a F0.5 v e para as AgNPs.. ................................................ 50 Figura 11 - Influência da F0.5 v, AgNPs e prata (proveniente de nitrato de prata) sobre a capacidade de redução do MTT de células das linhagens de fibroblasto 3T3 (A) e de melanoma B16F10 (B) após 24 horas de incubação.. .................................................. 52 Figura 12 - Microfotografias das células B16F10 visualizadas em microscópio invertido de contraste de fase (ampliado 400x) após 24 horas de incubação. .............. 54 Figura 13 - Análise da marcação das células B16F10 com anexina V e iodeto de propídio por citometria de fluxo.. ................................................................................. 56 Figura 14 - Análise do ciclo celular por citometria de fluxo após 24 horas de incubação com cisplatina e nanopartículas em linhagem de melanoma B16F10. ........ 58.

(12) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Biomoléculas de macroalgas marinhas utilizadas para a síntese de nanopartículas de prata e suas respectivas atividades biológicas................................. 23 Tabela 2-Resultados tabulados da análise de EDS das AgNPs.....................................46 Tabela 3 - Dados relativos ao diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta da F0.5 v da alga S. schröederi e das AgNPs obtidos por dispersão de luz dinâmica (DLS).............................................................................................................................47 Tabela 4 - Dosagens químicas referentes aos teores de açúcares totais, sulfato, ácidos urônicos, proteínas totais, compostos fenólicos e prata............................................... 49.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS 3T3. Células de fibroblastos de rato. A549. Células de adenocarcinoma de pulmão. AgNPs. Nanopartículas de prata. AuNPs. Nanopartículas de ouro. B16F10. Células de melanoma murino. CHO-K1. Células de ovário de hamster chinês. DH. Diâmetro Hidrodinâmico. DLS. Espalhamento Dinâmico da Luz. DMEM. Dulbecco's Modified Eagle Medium. DO. Densidade Óptica. EDS. Espectroscopia por Energia Dispersiva de raios-X. EROs. Espécies Reativas de Oxigênio. F0.5 v. Fração obtida da alga S. schröederi por meio da adição de 0.5 volumes de. acetona FTIR. Espectroscopia de Infravermelho Transformada de Fourier. GSH. Glutationa reduzida. HeLa. Células de câncer cervical. HepG2. Células de câncer hepático. HL60. Células de leucemia mieloblástica aguda. HL-7702. Células de linhagem normal hepática. HT29. Células de câncer de cólon. ICP-OES. Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry. MDA-MB-231 Células de câncer de mama MEV. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). MFA. Microscopia de Força Atômica. MFC-7. Células de câncer de mama humano. MTT. Brometo de 3-(4,5-Dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazol). NMs. Nanopartículas Metálicas. NPs. Nanopartículas. OMS. Organização Mundial da Saúde. PANC. Células de carcinoma pancreático.

(14) PBS. Tampão Fosfato Salino. PC3. Células de adenocarcinoma prostático. PDI. Índice de Polidispersão. PI. Iodeto de propídio. PVP. Polivinilpirrolidona. PZ. Potencial Zeta. RSP. Ressonância Plasmônica de Superfície. SFB. Soro Fetal Bovino. SiHa. Células de carcinoma cervical uterino. UV. Ultravioleta.

(15) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 13 1.1 Câncer ............................................................................................................................. 13 1.1.1 Melanoma ................................................................................................................. 14 1.2 Nanopartículas ................................................................................................................ 15 1.2.1 Nanopartículas metálicas.......................................................................................... 16 1.2.2 Nanopartículas de prata ............................................................................................ 17 1.2.3. Métodos de síntese das nanopartículas de prata ...................................................... 19 1.3 Algas marinhas e polissacarídeos ácidos ........................................................................ 24 1.3.1 Ácido algínico .......................................................................................................... 26 1.3.2 Fucanas ..................................................................................................................... 27 2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 31 2.1. Objetivos Específicos .................................................................................................... 31 3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 32 3.1. Alga marinha Spatoglossum schröederi ........................................................................ 32 3.2. Linhagens celulares ........................................................................................................ 32 3.3 Outros materiais .............................................................................................................. 33 3.3.1 Reagentes ................................................................................................................. 33 3.3.2 Equipamentos ........................................................................................................... 33 -. Agitador orbital, banho maria e estufa modelo 515 de 2013 foram adquiridos da. FANEM Ltda (Piracicaba, SP, Brasil); ............................................................................. 33 3.4. Extração da fração 0.5v ................................................................................................. 34 3.4.1. Obtenção do pó de algas delipidado ........................................................................ 34 3.4.2. Proteólise ................................................................................................................. 34 3.4.3. Fracionamento com acetona .................................................................................... 35 3.5 Síntese verde de nanopartículas de prata ........................................................................ 35 3.6. Caracterização físico-química das nanopartículas e da fração 0.5v .............................. 36 3.6.1 Espectroscopia de UV-visível .................................................................................. 36.

(16) 3.6.2 Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Análise de espectroscopia por energia dispersiva de raios-X (EDS)........................................................................... 36 3.6.3 Análise de microscopia de força atômica (MFA) .................................................... 36 3.6.4 Espalhamento dinâmico da luz (DLS) ..................................................................... 36 3.6.5 Eletroforese em gel de agarose a 0,6 % ................................................................... 37 3.6.6 Dosagem de ácidos urônicos .................................................................................... 38 3.6.7 Dosagem de sulfato .................................................................................................. 38 3.6.8 Açúcares totais ......................................................................................................... 38 3.6.9 Proteínas totais ......................................................................................................... 38 3.6.10 Compostos Fenólicos ............................................................................................. 38 3.6.11 Teor de prata........................................................................................................... 38 3.6.12 Espectroscopia de Infravermelho Transformada de Fourier (FTIR) ...................... 38 3.7 Ensaios celulares ............................................................................................................. 39 3.7.1 Análise da viabilidade celular pelo método colorimétrico – MTT .......................... 39 3.7.2 Análise da marcação das células B16F10 com anexina V-FITC/iodeto de propídio ........................................................................................................................................... 39 3.7.3. Análise do ciclo celular ........................................................................................... 40 3.8 Análises estatísticas ........................................................................................................ 41 4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 42 4.1 Eletroforese em gel de agarose 0,6% .............................................................................. 42 4.2 Análise do espectro de absorção de luz UV-visível ....................................................... 43 4.3. Análises de microscopia ................................................................................................ 44 4.3.1 Análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) ............................................................................................................... 44 4.3.2 Análises de microscopia de força atômica ............................................................... 46 4.4 Análises de tamanho, polidispersão e potencial zeta das AgNPs por DLS .................... 47 4.5 Análise de estabilidade das nanopartículas ..................................................................... 48 4.6 Análises químicas ........................................................................................................... 48.

(17) 4.6.1 Teores de açúcares totais, sulfato, ácidos urônicos, proteínas totais, compostos fenólicos e prata ................................................................................................................ 49 4.6.2 Análise da espectroscopia de infravermelho transformada de fourier (FTIR) ......... 49 4.7 Avaliação da capacidade de redução do MTT ................................................................ 50 4.8 Efeitos das AgNPs sobre as células B16F10 .................................................................. 53 4.8.1 Morfologia de células tumorais B16F10 tratadas com AgNPs ................................ 53 4.8.2. Análise da marcação das células B16F10 com anexina V e iodeto de propídio por citometria de fluxo ............................................................................................................ 55 4.8.3. Análise do ciclo celular ........................................................................................... 57 5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 59 6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 68 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 69.

(18) 13. 1. INTRODUÇÃO 1.1 Câncer Câncer é um conjunto de mais de 100 doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado das células que, além disso, conseguem migrar e atingir tecidos e órgãos (INCA, 2017). Os dados mais recentes da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2017) trazem o câncer como responsável pela morte de 8,8 milhões de pessoas no ano de 2015, sendo este número superado apenas por aquele referente ao das doenças cardiovasculares (17,5 milhões de mortes), além disso, a projeção da OMS é que em 2030 ocorrerão 12,6 milhões de casos. A estimativa para o Brasil (biênio 2016-2017) é de 600 mil casos novos de câncer (INCA, 2015) e para os Estados Unidos esse número é superior a um milhão (1,688,780) (ACS, 2017). A incidência do câncer depende da predisposição genética, exposição a agentes infecciosos e carcinógenos, obesidade, dieta, tabagismo, etilismo, histórico de inflamações crônicas ou lesões teciduais, hiperplasias e imunodeficiência. O risco para o desenvolvimento de um quadro de câncer depende da interação entre os fatores citados anteriormente, isto o torna uma doença de caráter complexo (KUMAR, ASTER & ABBAS 2016). Tanto que, o tratamento pode ser realizado por meio de cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou transplante de medula óssea, necessitando algumas vezes de combinações de dois ou mais tratamentos (INCA, 2017). De acordo com o tecido de origem do câncer, pode se classificar os tumores em: mieloma - células na medula óssea (células plasmáticas); sarcoma - células do tecido conjuntivo ou tecidos de suporte, podendo afetar o tecido adiposo, muscular, nervos, tendões e ligamentos e os tecidos ao redor das articulações; linfoma - sistema linfático; leucemia glóbulos brancos (leucócitos); carcinoma - tecido epitelial e adenocarcinoma – tecidos glandulares (CANCER RESEARCH UK, 2017). Uma porcentagem de 30% de todos os novos diagnósticos mundiais de câncer são do tipo câncer de pele, sendo esse um número crescente a cada ano (ARORA, et al., 2015). O câncer de pele pode ser dividido em: câncer de pele melanoma (Ver tópico 1.1.1) e câncer de pele não-melanoma (carcinoma basocelular e o carcinoma epidermóide). O melanoma é considerado o câncer de pele mais agressivo, pois possui elevadas chances de metastizar e é o causador da maior porcentagem de mortes (BASELGA et al., 2015)..

(19) 14. 1.1.1 Melanoma O melanoma é um tipo de câncer originado nos melanócitos, as células responsáveis pela produção da melanina. A prevalência deste tipo de câncer entre as pessoas de pele clara cresce mundialmente, de acordo com Ferlay e colaboradores (2015), 230 mil novos casos surgiram em 2012 e os números de óbito contabilizados foram de 55 mil. No Brasil, ele é o câncer mais frequente e corresponde a 30% dos tumores malignos registrados, sendo estimados 5,6 mil novos casos no país em 2016 (INCA, 2016). Os principais fatores de risco para o melanoma são: pele clara, histórico familiar de melanoma, presença de inúmeras manchas marrons (conhecidas como nevos) (INCA, 2017), exposição demasiada ao sol ou a luzes UV artificiais (PFEIFER & BESARATINIA, 2012; GARBE et al., 2016) e possuir a doença xeroderma pigmentoso (INCA, 2017). A mais recente classificação dos tipos de melanoma divide a doença em quatro diferentes grupos. “Exposição solar contínua” é o tipo de melanoma localizado no tronco e extremidades, geralmente está acompanhado de mutação no gene BRAF (45% dos casos de melanoma diagnosticados); “Melanoma dos sítios expostos diariamente” é o tipo presente na cabeça e pescoço, mutações nos genes NRAS e RAS são comuns; outro grupo é caracterizado por mutações no gene NF1; e por fim, o grupo do “melanoma não relacionado ao sol”, este tipo ocorre nas mucosas e podem apresentar mutações em CKIT. O diagnóstico e o estadiamento do tumor são realizados a partir das biópsias, análises histopatológicas e observação dos critérios clínicos do melanoma: pigmentos atípicos, pontos irregulares marrom-pretos, marcas e pigmentação com múltiplas cores distribuídas assimetricamente. (GARBE et al., 2016). Os tipos de tratamento disponíveis incluem a excisão cirúrgica do tumor ou linfonodo; a imunoterapia com interferon alfa (TSAO, ATKINS & SOBER, 2004) e interleucina 2 (MELLMAN, COUKOS & DRANOFF, 2011); radioterapia e quimioterapia (dacarbazina, temozolomida e fotemustina) e mais recentemente o interferon α-2b, o ipilimumab e o medicamento Vemurafenib (LEE, MUKHI & LIU, 2012). Os tratamentos muitas vezes precisam ser combinados e isso provoca mais reações indesejáveis ao paciente, tais como, alopecia, náuseas, perda de apetite, anemia, dentre outros (INCA, 2017). Uma promissora novidade é uma vacina em fase clínica três, ela está sendo desenvolvida e promete junto às outras terapias melhorar as chances de sobrevivência e diminuir os efeitos tóxicos do tratamento no paciente (SLINGLUFF et al., 2013; CLINICAL TRIALS, 2016). Devido à complexidade do câncer, inserindo-se aí os diferentes tipos de melanoma, é extremamente importante aumentar o arsenal terapêutico para combatê-lo. Isto impulsiona a.

(20) 15. busca por novos agentes antitumorais e meios de entregá-los mais eficazmente. Nesse contexto, as nanopartículas surgem como agentes que podem ser desenhados especificamente para um alvo, minimizando os efeitos colaterais de uma terapia e aumentando sua eficácia (PARVEEN, MISRA & SAHOO, 2012; GOVINDARAJU et al., 2015). 1.2 Nanopartículas A nanotecnologia é a ciência que estuda os materiais em escala nanométrica (1 nm = 10-9 m). Este conceito surgiu em 1959, durante uma palestra da Sociedade Americana de Física proferida por Richard Feynman, ele a definiu como um processo em que cientistas manipulariam e controlariam moléculas e átomos (NNI, 2017). Em 1974, o engenheiro japonês Norio Taniguchi cunhou o termo nanotecnologia utilizado atualmente (TANIGUCHI, 1974). Com a invenção do microscópio de tunelamento em 1981, os átomos puderam ser visualizados individualmente e assim a nanotecnologia moderna nasceu (NNI, 2017). Os nanomateriais podem ter propriedades biológicas, químicas e físicas diferentes dos seus homólogos maiores, isto permite um maior número de aplicabilidades (FARAMARZI & SADIGHI, 2013). Nos últimos anos, as aplicações dos nanomateriais cresceram na área da medicina, principalmente, quando envolvem nanopartículas (WANG & WANG, 2014). As nanopartículas (NPs) são colóides estáveis, com tamanho variando entre 10 a 1000 nm (BRIGGER, DUBERNET & COUVREUR, 2002). As NPs podem ser sintetizadas com diferentes materiais e assim apresentarem uma diversidade de tamanhos, formatos e funcionalidades (WANG & WANG, 2014). As nanopartículas podem ser classificadas de acordo com a principal classe de material que as compõem, podendo ser poliméricas, lipossomais, magnéticas ou metálicas. As NPs poliméricas podem ser constituídas por quitosana, ácido poliglicólico ou outros polímeros, as NPs lipossomais são vesículas esféricas formadas por duas camadas de lipídios que podem conter polímeros associados. As NPs magnéticas são sintetizadas com os óxidos de ferro, sendo os mais comuns, a magnetita - Fe3O4 e a maguemita - Fe2O3. Por fim, têm-se as NPs metálicas compostas por metais como ouro, prata, cobre zinco ou estrôncio (CHO et al., 2008; PARVEEN, MISRA & SAHOO, 2012). As NPs estão presentes nas indústrias aeroespacial, química, eletrônica, energética, cosmetológica (STARK et al., 2015), alimentícia, ambiental e biomédica, dentre outras (MULLER, SHEGOKAR & KECK, 2011). Na área biomédica, as NPs estão sendo estudadas quanto ao uso como sensores em plataformas tipo SERS (Surface-Enhanced Raman Scattering) para detecção de moléculas como a hemoglobina, toxinas, vírus e proteínas ligadas ao câncer (VALDEZ et al., 2016;.

(21) 16. QIAN & NIE, 2008); no diagnóstico por imagem, como agentes liberadores de fármacos (MANIVASAGAN et al., 2016) e como agentes citotóxicos frente ao câncer (GOVINDARAJU et al., 2015). As nanopartículas são consideradas um dos avanços da nanotecnologia na terapia anticâncer, isso porque elas são capazes de direcionar a entrega de fármacos, especificamente às células neoplásicas, conseguindo acumular-se dentro dos tecidos tumorais devido ao efeito de permeabilidade e retenção aumentada (do inglês EPR - enhanced permeability and retention effect). Isto diminui a quantidade de fármaco direcionada aos tecidos normais, aumentando a farmacocinética dos agentes quimioterápicos (JAIN et al., 2016). Dentre as nanopartículas, as de natureza metálica destacam-se por suas aplicações citotóxicas frente às neoplasias (HOSTA-RIGAU, 2010; ARORA, et al., 2015; JANG et al., 2016). Estas NPs possuem tamanhos menores quando comparadas aos outros tipos citados anteriormente, além de uma ampla área de superfície reativa que permite a interação com outras moléculas de interesse e/ou fármacos. Por causa disto, são mais vantajosas em relação aos outros tipos de nanopartículas citados (PARVEEN, MISRA & SAHOO, 2012).. 1.2.1 Nanopartículas metálicas As nanopartículas metálicas (NMs) possuem em média tamanhos inferiores a 200 nm e podem ser sintetizadas utilizando métodos simples e menos agressivos ao meio ambiente, sendo, por isso, mais ecológicos (JANG et al., 2016). As NMs podem ser sintetizadas com o uso de diferentes metais (níquel, silício, cobre, zinco, titânio, manganês, alumínio, ouro e prata), sendo a escolha do tipo de metal utilizado ligada à funcionalidade da nanopartícula. As NMs podem ser utilizadas como agentes catalisadores (CHEN & HSIEH, 2002; JIANG et al., 2013; TAMMAM et al., 2015), sensores (SLOWING et al., 2007; RAZA & SAHA, 2014), aditivos em roupas e cosméticos (BECHERI et al., 2008; WEIR et al., 2012), no tratamento da água (XIONG et al., 2015), além das inúmeras aplicações na área biomédica (RAO et al., 2016; CHEN, YAN & WU, 2015). As nanopartículas sintetizadas com ouro (AuNPs) e prata (AgNPs) possuem aplicações mais direcionadas à área biomédica, elas estão sendo estudadas quanto as propriedades antimicrobiana (ZHOU et al., 2012), antidiabética (DAISY & SAIPRIYA, 2012), antimalárica (SANTHOSHKUMAR et al., 2011), antitumoral (PATRA et al., 2010; HUO et al., 2013; AMORIM et al., 2016) e antiviral (MORI et al., 2013). Isto porque esses metais possuem uma maior facilidade de ligação às biomoléculas e/ou fármacos. Por.

(22) 17. exemplo, Hosta-Rigau e colaboradores (2010) funcionalizaram AuNPs com um peptídeo antitumoral e um peptídeo alvo que reconhece um receptor superexpresso em células tumorais, assim eles conseguiram direcionar a nanopartícula ao local desejado com o bônus de aumentar a concentração do fármaco e assim potencializar a ação antitumoral frente à linhagem HeLa (câncer cervical). Huo e colaboradores (2013) estudaram o comportamento das AuNPs de 50 e 100 nm sintetizadas com tiopronina frente à linhagem neoplásica MFC-7 (câncer de mama humano), esferóides tumorais ex vivo e modelo de tumor tipo xenoenxerto in vivo. Eles observaram que as AuNPs de 50 nm apresentaram vantagens na captação e penetração pelos tecidos tumorais quando comparadas às de 100 nm e, ressaltaram a importância de estudar o comportamento das nanopartículas quando funcionalizadas com moléculas de interesse médico. Li et al. (2015) sintetizaram AgNPs funcionalizadas com ácido gálico e ao testarem frente à linhagem tumoral (HeLa) e à linhagem normal hepática (HL-7702) observaram uma redução da viabilidade celular restrita às células tumorais, devido principalmente à geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) no tipo celular tumoral. Além disso, também ocorreram diminuição do potencial de membrana mitocondrial e aumento na porcentagem de células marcadas por anexina-V e iodeto de propídio. As AgNPs embora pouco exploradas quanto à incorporação de fármacos e peptídeos, desencadeiam uma menor resposta imunológica (YEN et al., 2009; CHAKRABORTY et al., 2016), e possuem um melhor espectro antimicrobiano e antiviral (LARA et al., 2011). Sendo, por isso, promissores agentes na terapia anticâncer. Aiionar mais xpliaçõs sobr a ros. 1.2.2 Nanopartículas de prata As nanopartículas de prata (AgNPs) são agregados de átomos de prata que podem ser associadas a uma diversidade de moléculas, amplificando assim suas propriedades e características. As AgNPs são as nanopartículas mais utilizadas em produtos médicos, catéteres e bandagens, por exemplo, podendo serem utilizadas durante a cicatrização de feridas e queimaduras (SAMUEL & GUGGENBICHLER, 2004; ROE et al., 2008; JAIN et al., 2009). Além de estarem presentes em produtos consumíveis, como os sistemas de purificação de água, pastas de dente, xampus, tecidos e desodorantes (VIGNESHWARAN et al., 2007; SCHRAND et al., 2010). Dentre a miríade de aplicações das AgNPs, a ação contra bactérias é uma das mais discutidas na literatura. Porém, o mecanismo exato pelo qual as AgNPs desempenham esta.

(23) 18. ação ainda não é totalmente elucidado, mas os dados apontam para três eventos importantes: a) a interação das AgNPs com a membrana promove uma desestabilização da mesma, permitindo a entrada das AgNPs na célula bacteriana; b) produção de radicais livres pois as AgNPs funcionam como carreadores/liberadores dos íons prata, que irão interferir na cadeia respiratória, na síntese de ATP e na replicação do material genético; c) as AgNPs interagem com os grupos tióis das proteínas afetando a homeostase microbiana (PAL, TAK & SONG, 2007; LI et al., 2010; SIRITONGSUK et al., 2016). Diante de uma atividade tão discutida, surge a necessidade de se explorar outras aplicações para as AgNPs, como agentes auxiliares do tratamento do câncer, por exemplo. A atividade antitumoral das AgNPs foi observada in vitro frente às linhagens de câncer de mama (MFOUO-TYNGA et al., 2014; SATHISHKUMAR et al., 2016), câncer de útero (JEYARAJ et al., 2013), leucemia (GUO et al., 2016), câncer de pele (LIU et al., 2012; ANAND et al., 2015), câncer de cólon (DURAI et al., 2014) e de pulmão (GOVENDER et al., 2013; MFOUO-TYNGA et al., 2014). Castro-Aceituno e colaboradores (2016) observaram que as AgNPs reduziram a viabilidade celular e aumentaram a produção de espécies reativas de oxigênio nas linhagens de adenocarcinoma de pulmão (A549), MCF7 e câncer hepático (HepG2) . Sobre a linhagem A549 foi verificada uma indução da apoptose, devido aos achados de mudança na morfologia do núcleo, aumento da porcentagem de apoptose, aumento nos níveis do RNA mensageiro de p38 MAPK (proteína cinase ativada por mitógeno), JNK (Jun N-terminal cinase) e ERK (cinases reguladas por sinais extracelulares). Gurunathan e colaboradores (2015) avaliaram os efeitos das AgNPs sobre a linhagem de câncer de mama (MDA-MB-231) de forma mais específica. Eles relataram que a apoptose é a via celular de morte ativada, os ensaios de sinalização comprovam a ativação da p53 para que ocorra a produção das EROs, com consequente despolarização da membrana e ativação da caspase-3. De acordo com os trabalhos citados e com a literatura, o efeito antitumoral das AgNPs ocorre devido à geração de radicais livres causando um aumento nos níveis de glutationa reduzida (GSH), EROs e peroxidação lipídica. O aumento nos níveis das EROs promove o dano ao DNA resultando em apoptose ou necrose (ARORA et al., 2008; CARLSON et al., 2008; KIM et al., 2009; FOLDBJERG, DANG & AUTRUP, 2011)..

(24) 19. 1.2.3. Métodos de síntese das nanopartículas de prata As nanopartículas de prata podem ser sintetizadas por métodos físicos e químicos. Os métodos físicos mais utilizados na síntese desse tipo de nanopartícula são a ablação a laser, a evaporação-condensação e micro-ondas (VLĂSCEANU et al., 2016). A ablação a laser consiste em focalizar um feixe de laser pulsado, de alta potência, na superfície de um alvo submerso em líquido, a quebra da matéria gerada pelo laser forma o plasma. O plasma se expande e resfria, formando as nanopartículas, em seguida, bolhas de cavitação formam-se, expandem-se e colapsam. Após o colapso das bolhas, as nanopartículas formadas espalham-se pelo líquido, criando assim uma suspensão coloidal. O uso da síntese de nanopartículas pela técnica de ablação a laser vem crescendo nos últimos anos, devido à rapidez do processo, baixo custo, ausência de uso de agentes estabilizadores e de reagentes nocivos (DELL’AGLIO et al., 2016). Porém, o processo provoca modificações físicas do material devido à fragmentação, assim como pode alterar as características químicas da matéria (AMENDOLA & MENEGHETTI, 2013). Já a produção das AgNPs pelo método de evaporação/condensação consiste na geração de nanopartículas a partir de aerossóis. Inicialmente, ocorre a vaporização do material de origem dentro de um forno, sendo em seguida condensado de forma rápida em uma superfície resfriada. O procedimento ocorre de forma controlada, sendo realizado em vácuo com temperatura estável durante a maior parte do tempo. Isso permite a obtenção de nanopartículas com tamanhos uniformes e composição química definida. No entanto, o forno tubular, que é necessário para a síntese, consome muita energia e espaço, além do processo requerer certo tempo para atingir a temperatura ideal estável (KRUIS et al.,2000; JUNG et al.,2006;). A síntese de AgNPs com o uso de micro-ondas tem sido recentemente empregada como uma técnica eficaz para a obtenção de nanopartículas com tamanho uniforme e com baixas chances de agregação. As principais características da técnica são: aquecimento rápido e uniforme, tempo de reação curto, produção de alto rendimento, baixo custo e método econômico quanto ao gasto de energia. Esse método utiliza a água como solvente e pode utilizar polímeros de origem natural como a celulose, por exemplo, como redutor e estabilizador. Contudo, o uso de um micro-ondas é um obstáculo quando se pensa em produção de AgNPs em grande escala (LI et al., 2011; PENG et al., 2016). A necessidade de uso de equipamentos de grande porte como o micro-ondas e o forno tubular, juntamente com a ausência de controle da composição química durante a ablação a laser são fatores limitantes para o uso dessas técnicas na área biomédica..

(25) 20. Os métodos químicos são os mais relatados na literatura para a síntese de nanopartículas de prata (TRAN, NGUYEN & LE, 2013), dentre os inúmeros métodos químicos existentes, os mais citados com relação à sua potencial aplicação biomédica, são micro emulsão, foto redução por UV, eletroquímico, Tollens e redução química. A técnica de micro emulsão permite a síntese de AgNPs com tamanho controlado a partir de um sistema aquoso de duas fases (SOLANKI & MURTHY, 2011). O sistema é formado por água, um surfactante, um solvente não polar em quantidades específicas, sal de metal e um agente estabilizador (LU & AN, 2015). O início do processo ocorre com a separação dos reagentes (sal de prata e agente redutor) em duas fases bem distintas, seguido da formação de aglomerados de metal entre as duas fases a partir da interação com um sal de alquil-amônio quaternário. Estabilizadores recobrem esses aglomerados e os transferem para a fase orgânica do sistema. A necessidade de utilizar solventes orgânicos e surfactantes torna o processo oneroso, e a geração de resíduos tóxicos que precisam ser retirados ao final da reação é outra desvantagem deste método, por isso seu uso na área biomédica ainda é limitado (ZHANG, QIAO & CHEN, 2007). A foto redução por UV ocorre por meio da irradiação com luz ultravioleta do nitrato de prata dissolvido numa solução com derivados da sílica (HUANG & YANG, 2008), cálcio/fosfato (NAKAMURA et al., 2016), colágeno (ALARCON et al., 2012), citrato, ácido poliacrílico ou polivinilpirrolidona (PVP) (KORBEKANDI & IRAVANI, 2012). Nesta técnica, o tempo de irradiação é o principal fator que controla o tamanho das nanopartículas (KORBEKANDI & IRAVANI, 2012). As AgNPs também podem ser sintetizadas por métodos eletroquímicos, a partir da modificação dos parâmetros da eletrólise e/ou da solução eletrolítica é possível obter AgNPs com diferentes tamanhos (GRUMEZESCU, 2016). Neste método, a eletroredução dos íons prata compreende duas etapas simultâneas num mesmo cátodo: a formação das nanopartículas de prata e a deposição dos íons prata sobre o cátodo, sendo esta última etapa prejudicial ao cátodo e limitante para o rendimento da síntese. Por isso é necessário o uso de estabilizadores, como o PVP, por exemplo, estes que aceleram a taxa de síntese de formação das nanopartículas, ao diminuir a deposição dos íons sobre o cátodo e proteger as partículas da agregação (MA et al., 2004). O método de Tollens se baseia na redução do [Ag(NH3)2]+ em solução através do uso de um agente redutor como aldeídos, inclusive açúcares. Para se obter AgNPs com estabilidade por este método, é necessária a adição de agentes estabilizadores e que controlem o tamanho e a uniformidade das partículas (LE et al., 2010). YIN e colaboradores (2002).

(26) 21. sintetizaram AgNPs a partir de um kit comercial do reagente de Tollens, este kit consiste em três soluções aquosas: nitrato de prata e hidróxido de amônia (solução A), solução ativadora de hidróxido de sódio (solução B) e solução redutora de formaldeído e sorbitol (solução C). O processo ocorre pela adição da primeira solução à solução ativadora, ambas previamente diluídas, em seguida, a solução C é adicionada para reduzir os íons de prata em solução, todas as etapas ocorreram em banho-maria com sonicação. A redução química dos sais de metal é a técnica mais simples e comentada na literatura dentre todas as apresentadas até agora. Este método utiliza três componentes: sal de metal; um agente redutor, como o borohidreto, citrato, ascorbato, mercaptobenzimidazol, dodecil sulfato de sódio ou outros reagentes orgânicos; e um agente estabilizante (VENUGOPAL et al., 2017). O mecanismo de formação das AgNPs ocorre em duas fases: nucleação e crescimento. Durante a nucleação a redução dos íons Ag+ leva à formação de prata elementar (Ag0), que em seguida aglomera-se na forma de “clusters”. Estes, por sua vez, formam as nanopartículas de prata. As suspensões contendo as AgNPs têm uma cor amarela ou amarronzada com uma banda de absorção de luz UV na faixa de 400-450 nm, essa banda é atribuída à excitação coletiva dos elétrons das nanopartículas de prata , fenômeno conhecido como ressonância plasmônica de superfície (RSP) (SHARMA, YNGARD & LIN, 2009). Embora a redução química seja muito empregada na área da síntese de AgNPs, a utilização dos reagentes químicos tóxicos ainda limita seu uso na área biomédica. Diante desta realidade, surgiu a necessidade de desenvolver um método menos tóxico para os sistemas biológicos e que empregassem menos reagentes e equipamentos (DÍAZCRUZ et al., 2016). A síntese verde, também denominada síntese biológica, aparece como uma alternativa às rotas químicas (SINGH et al., 2015). As principais vantagens da síntese verde são: utilizar a água como solvente, a reação ocorrer em apenas uma etapa, poder ser utilizada em larga escala, dispensar o uso de substâncias químicas estabilizadoras e para o revestimento, além de ser de baixo custo (PARK, 2014). A síntese verde utiliza microorganismos e/ou biomoléculas de organismos no processo de produção das AgNPs (ELRAFIE, EL-RAFIE & ZAHAR, 2013). Os agentes estabilizadores e de revestimento para as nanopartículas são as próprias biomoléculas extraídas dos organismos e/ou sintetizadas a partir deles. O uso de compostos bioativos e dos organismos permite um menor uso de reagentes químicos e etapas de síntese, diminuindo assim a potencial toxicidade dos produtos finais e das AgNPs em si e trazendo novas perspectivas para o uso em seres humanos (RAVEENDRAN, FU & WALLEN, 2003)..

(27) 22. A síntese verde de AgNPs utilizando bactérias, fungos e leveduras é bastante discutida na literatura, esses micro-organismos podem sintetizar AgNPs de dois modos: extracelular e intracelular (IRAVANI, 2011). A síntese extracelular ocorre a partir de uma cultura de microorganismos em condições ótimas, a mistura é centrifugada e o sobrenadante é recolhido, sendo então misturado com uma solução de sais de prata. A formação das nanopartículas é observada pela mudança de cor da suspensão para tons amarronzados. Após o período de incubação, as AgNPs podem ser obtidas por centrifugação, sendo posteriormente necessárias etapas de centrifugação com água/etanol ou água/metanol. Para a síntese intracelular também é necessária uma cultura de micro-organismos em condições ótimas, esta é centrifugada e a partir dela é obtido um precipitado. Este é unido à solução de nitrato de prata e o processo de formação é acompanhado como descrito anteriormente para a síntese extracelular. Após o tempo de síntese, a suspensão é submetida à sonicação para que ocorra a quebra da parede celular e liberação das nanopartículas. Em seguida, a suspensão passa por uma centrifugação para retirar as partículas suspensas e recolher as nanopartículas (BABU & GUNASEKARAN, 2009; BALAKUMARAN, RAMACHANDRAN & KALAICHELVAN, 2015; SINGH et al., 2016). Para a síntese das nanopartículas a partir de extratos vegetais podem ser utilizados extratos de raiz, folha, casca, sementes, flores e fruto. Os extratos são misturados a uma solução de sal de prata e deixados nas condições de síntese. A formação das AgNPs é acompanhada pela mudança de coloração. Decorrido o tempo de síntese, a mistura é centrifugada e as AgNPs coletadas (MOHAPATRA, KURIAKOSE & MOHAPATRA, 2015; KHAN, KHAN & NADHMAN, 2016; SINGH et al., 2016). Mais recentemente extratos e moléculas isoladas de algas também vêm sendo utilizadas para a produção de nanopartículas, como pode ser visto na Tabela 1. De acordo com esta tabela, o número de atividades exploradas para as AgNPs com compostos bioativos obtidos de algas ainda é reduzido à atividade bactericida. Diante disto, as algas são uma fonte de moléculas com atividades pouco exploradas na forma de nanopartículas, podendo serem reveladas e potencializadas pela nanotecnologia..

(28) 23 Tabela 1. Biomoléculas de macroalgas marinhas utilizadas para a síntese de nanopartículas de prata e suas respectivas atividades biológicas. -: nenhuma atividade testada.. Alga. Sargassum. Biomoléculas. Atividades. Referência. envolvidas. Biológicas. Proteínas. Antibacteriana. Govindaraju et al., 2009. Polissacarídeos. -. Leung et al., 2010. wightii Fucus vesiculosus. sulfatados Spatoglossum. Polissacarídeos. Citotoxicidade. Amorim et al., 2016. schröederi. sulfatados. Pithophora. Proteínas. Antibacteriana. Sinha et al., 2015. Cystophora. Metabólitos e. -. Prasad et al., 2013. moniliformis. compostos. oedogonia. fenólicos Caulerpa racemosa. Proteínas. Antibacteriana. Kathiraven et al., 2015. Turbinaria. Metabólitos. Antibacteriana. Vijayan et al., 2014. Nd. Antibacteriana. Dhas et al., 2014. Porphyra. Polissacarídeos. Antibacteriana. Venkatpurwar, e. vietnamensis. sulfatados. Pterocladia. Polissacarídeos. conoides Sargassum plagiophyllum. Pokharkar, 2011 Antibacteriana. Zahar, 2013. capillacae Jania rubins. Polissacarídeos. Antibacteriana. Ulva fasciata. Polissacarídeos. Antibacteriana. Polissacarídeos. Antibacteriana. Polissacarídeos. Antibacteriana. Colpmenia sinusa Gracilaria birdiae. El-Rafie, El-Rafie &. El-Rafie, El-Rafie & Zahar, 2013 El-Rafie, El-Rafie & Zahar, 2013 El-Rafie, El-Rafie & Zahar, 2013 Aragão et al., 2016. sulfatados Sargassum siliquosum. Polissacarídeos. Toxicidade in vivo. Vasquez et al., 2016.

(29) 24. Sargassum. Metabólitos. Antioxidante e. polycystum. Palanisamy et al., 2017. citotóxica. FONTE: Autoria própria.. 1.3 Algas marinhas e polissacarídeos ácidos Os oceanos abrigam a vida há cerca de 3,6 bilhões de anos e o número de espécies conhecidas que neles vivem corresponde a cerca de 50 % do número de espécies terrestres. (YENDE, HARLE & CHAUGULE, 2014). Essa biodiversidade marinha é constituída por um número abundante de organismos distintos que tem em comum a habilidade de sobreviver e evoluir em ambientes com adversidades como a variação de salinidade, temperatura, exposição a radiação, inconstância com relação aos nutrientes e sua disponibilidade, luz, etc. Dentre estes organismos é possível destacar as algas marinhas, seres vivos cujo número de espécies registradas varia muito entre os autores, podendo ser 1 ou até 10 milhões (IBAÑEZ & CIFUENTES, 2013). As algas marinhas podem ser divididas em dois grandes grupos: microalgas e macroalgas. Os dois tipos de algas são filogeneticamente muito diferentes, mas acredita-se que compartilham como característica mútua, os plastídeos, estruturas oriundas de um evento endossimbiótico entre uma cianobactéria fotossintética e uma célula eucariótica (COOPER & SMITH, 2015). As macroalgas são pluricelulares e podem ser encontradas nas zonas litorâneas entre marés e na região sub-tidal, já a maioria das microalgas são unicelulares e habitam as zonas bentônicas e águas profundas. Elas podem ser classificadas de acordo com a predominância de um ou mais pigmentos fotossintéticos. Logo, podem ser reunidas em: algas marrons ou pardas (filo Phaeophyta), por apresentarem o carotenóide fucoxantina como pigmento predominante; algas vermelhas (filo Rhodophyta), que detêm a ficoeritrina e a ficocianina como pigmentos característicos, e algas verdes (filo Chlorophyta) que apresentam as clorofilas “a” e “b” como pigmentos principais (O’SULLIVAN et al., 2010). Exemplares dos três tipos de algas citados anteriormente são expostos na Figura 1. Além disso, as macroalgas possuem compostos bioativos com estruturas diferentes das encontradas em outros seres vivos e com atividades funcionais seletas (YENDE, HARLE & CHAUGULE, 2014)..

(30) 25. A. C. B. Figura 1 - Exemplares de macroalgas marinhas. A: Hypnea musciformis (filo Rhodophyta); B: Dictyota menstrualis (filo Phaeophyta); C: Codium isthmocladum (filo Chlorophyta). Fontes: ALVES (2015); COSTA (2014); arquivo pessoal de Vinícius Campelo Soeiro, respectivamente.. Muitas espécies de algas são utilizadas como alimento pelas populações orientais do Japão, China e Coréia do Sul, podendo constituir uma porcentagem de até 25 % da dieta. Quando as populações orientais migraram para os países ocidentais, o consumo da alga se popularizou e sob as formas de sushi, saladas, biscoitos e sopas, as algas passaram a ser consumidas com mais frequência (McHUGH, 2003). Além de servir como alimento, as algas são fonte de polímeros amplamente utilizados pela indústria. Como exemplo, as agaranas e as carragenanas extraídas das algas vermelhas, elas são utilizadas na indústria de cosméticos para a fabricação de sabonetes e hidratantes. A indústria alimentícia utiliza esses polímeros como agentes estabilizantes/espessantes em sorvetes e gelatinas, além da farmacêutica que os emprega na produção do ágar bacteriológico (RASMUSSEM & MORRISSEY, 2007). O alginato, um tipo de polissacarídeo carboxilado, encontrado nas algas marrons é utilizado na indústria do papel, como agentes estabilizantes de cremes dentais e alimentos (TELIS, 2012; FAWZY et al., 2017). As macroalgas possuem diversas moléculas bioativas, como proteínas, ácidos graxos, vitaminas, carotenoides e polissacarídeos (PARJIKOLAEI et al., 2016). Os polissacarídeos se destacam por constituírem a maior porcentagem do peso seco das algas (KLOAREG & QUATRANO, 1988), dentre eles, os polissacarídeos ácidos são uma classe detentora de diversas. atividades. biológicas,. como. anticoagulante,. anti-inflamatória,. antiadesiva,. antiproliferativa e antiviral (FIDELIS et al., 2014). Os polissacarídeos ácidos, fucanas e ácido algínico, são uma classe de polissacarídeos aniônicos encontrados na matriz mucilaginosa das algas marrons. Eles têm a função de proporcionar rigidez à alga, proteger contra a desidratação e transtornos do meio como a maré forte, além de fornecerem flexibilidade suficiente para a alga crescer a captar os nutrientes necessários à sua sobrevivência (PERCIVAL & DOWELL, 1967; O’SULLIVAN et al., 2010; COSTA et al., 2014)..

(31) 26. 1.3.1 Ácido algínico O ácido algínico é um polímero linear, que pode ser encontrado na matriz extracelular das algas marrons e como polissacarídeo capsular em bactérias. Como pode ser observado na Figura 2, ele é formado por duas unidades de ácidos urônicos, uma unidade M de ácido β-Dmanurônico e uma unidade G de ácido α-L-gulurônico, unidas por ligações 1→4. Após uma hidrólise parcial do ácido algínico, são observados três diferentes blocos, dois homopoliméricos (M e G) e um heteropolimérico (MG) (RAHELIVAO et al., 2013). A relação entre a quantidade dos blocos MG e da distribuição das unidades M e G ao longo da cadeia depende da espécie da alga, e dentro de uma espécie isoladamente, ela também é influenciada pela porção da alga envolvida no processo de extração, bem como pelo habitat, estação do ano, etc. (MARTÍNEZ-GÓMEZ et al., 2016).. Figura 2 - Características estruturais do alginato. Os monômeros de alginato são formados por uma unidade M de β-D-manurônico e uma unidade G de ácido α-L-gulurônico (a). A conformação da cadeia em blocos GG e MM é também é representada (b), além da distribuição dos blocos MG (c). Fonte: DRAGET & TAYLOR, 2011.. Sob a forma de sal, o ácido algínico é amplamente utilizado como alginato na indústria. Devido à viscosidade das soluções de alginato, ele é empregado como agente estabilizante, espessante e gelificante em alimentos e produtos, como cosméticos (FAWZY et al., 2017). Os diferentes graus de viscosidade que os alginatos apresentam decorrem da forma de interação dos cátions divalentes, como o cálcio e o magnésio, com as carboxilas do polímero. Por causa da orientação das ligações glicosídicas, os blocos M adquirem uma conformação linear enquanto que os blocos G assumem uma forma ondulada. Quando íons divalentes se aproximam das regiões com blocos G e alternados MG ocorre o estabelecimento.

(32) 27. de ligações iônicas, formando assim uma estrutura semelhante à uma caixa de ovos (do inglês “egg box model”). Esta característica é a responsável pela capacidade dos alginatos em constituir géis (FARRÉS & NORTON, 2014; BRACCINI & PÉREZ, 2001). As propriedades do alginato exploradas pela indústria também são exploradas na área biomédica. Alguns medicamentos em forma de comprimidos possuem o alginato na composição, pois este forma um gel e protege os compostos ativos presentes no interior dos comprimidos dos efeitos do suco gástrico, o gel formado também age como barreira física impedindo o fluxo de convecção do suco gástrico. Por isso, o alginato também é utilizado em formulações para o tratamento da azia e refluxo, fazendo parte da composição de medicamentos como o Gaviscon ®. O alginato também pode ser aproveitado em forma de fibras em gazes e curativos (Sorbsan ®, Seasorb ®e Kaltostat®), para o tratamento tópico do pé diabético e feridas (DRAGET & TAYLOR, 2011). 1.3.2 Fucanas Segundo as regras regentes referentes a nomenclatura de polissacarídeos, o termo fucana deveria ser usado para identificar polissacarídeos ricos em fucose. Apesar dessa definição simples, esta terminologia nem sempre é aplicada. Como no caso de polímeros neutros ricos em fucose, encontrados em fungos, mas que não são denominados de fucanas. Por outro lado, diferentes polissacarídeos contendo fucose sulfatada são denominados de fucanas, inclusive polissacarídeos que contém outros monossacarídeos como o principal componente, como é caso de fucanas da alga Spatoglossum schröederi, que apresentam galactose (ROCHA et al., 2005; NOBRE et al., 2013) ou ácido glucurônico como o principal monossacarídeo (BARROSO et al., 2008; ALMEIDA-LIMA et al., 2010; AMORIM et al., 2016). Por isso a IUPAC recomenda o uso do termo fucana para polímeros cuja composição contenha 90% ou mais de α-L-fucose sulfatada, enquanto os demais polissacarídeos devam ser chamados de fucoidan (BERTEAU & MULLOY, 2003). Contudo, facilmente encontram-se autores utilizando o termo fucoidan para homofucanas (GUPTA & ABU-GHANNAM, 2011). Discussões sobre nomenclatura de fucanas à parte, nesta dissertação as fucanas serão definidas como polissacarídeos sulfatados cujo monossacarídeo mais representativo é a α-Lfucose sulfatada. Elas podem ser encontradas nas algas marrons e equinodermas, quando presentes nos equinodermas elas detêm estruturas simples, organizadas de forma linear com sequências repetitivas dos resíduos (PEREIRA et al.,1999). Já as fucanas existentes nas algas marrons, comumente, possuem estruturas heterogêneas, sendo bastante ramificadas, com.

(33) 28. diferentes tipos de resíduos e graus de sulfatação, variando de acordo com a espécie e entre as partes da alga (DIETRICH et al., 1995). Em 1995, Dietrich e colaboradores extraíram e caracterizaram os polissacarídeos ácidos das algas Dictyota mertensis, Padina gymnospora e Sargassum vulgare. Eles identificaram em cada alga três fucanas sulfatadas com padrões de migração eletroforética diferentes, sendo nomeadas de acordo com o perfil de migração no gel de agarose em bandas A, B e C. As diferenças na migração para cada banda sugerem estruturas definidas, estando assim os resíduos de sulfato e os monossacarídeos distribuídos de forma particular em cada banda. Assim como as algas utilizadas no trabalho de Dietrich e colaboradores (1995), a alga Spatoglossum schröederi possui três fucanas. Estas foram denominadas de fucanas A, B e C em alusão as bandas A, B e C descritas por Dietrich e colaboradores (1995). A fucana A foi caracterizada inicialmente por Leite e colaboradores (1998), por meio de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, metilação, hidrólises ácida, e enzimática (com o uso de glicosidases e sulfatases), espectroscopia de infravermelho, ressonância magnética nuclear. Esta fucana de 21 kDa é constituída por fucose, xilose, ácido glucurônico e sulfato, portanto uma xilofucoglucuronana, sua estrutura compreende uma cadeia central de ácido glucurônico unida por ligações do tipo β (1→3) com ramificações de fucose em C4. Algumas fucoses são substituídas por grupos sulfato em C4 e em C2 por dissacarídeos de xilose, que também podem estar sulfatadas como pode ser observado na Figura 3.. Figura 3 - Estrutura da fucana A proposta por Leite e colaboradores (1998).. Após a caracterização da fucana A, foram realizadas as identificações e caracterizações das fucanas B e C. A fucana B é uma xilofucogalactana com 21.5 kDa (ROCHA et al., 2005a), já a fucana C possui 24 kDa e é constituída principalmente por fucose, xilose, galactose e sulfato, sendo assim, também, uma xilofucogalactana (ROCHA et.