Avaliação periodontal clínica e microbiológica em mães de prematuros: estudo caso-controle

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA. ERIKA VON SÖHSTEN MARINHO. AVALIAÇÃO PERIODONTAL CLÍNICA E MICROBIOLÓGICA EM MÃES DE PREMATUROS: ESTUDO CASO-CONTROLE. RECIFE-PE 2011.

(2) ERIKA VON SÖHSTEN MARINHO. AVALIAÇÃO PERIODONTAL CLÍNICA E MICROBIOLÓGICA EM MÃES DE PREMATUROS: ESTUDO CASO-CONTROLE. Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Odontologia com área de concentração em Clínica Integrada.. Orientador: Prof. Dra. Renata Cimões Co-orientador: Prof. Dra. Silvia Regina Jamelli. RECIFE-PE 2011.

(3) Marinho, Erika von Söhsten Avaliação periodontal clínica e microbiológica em mães de prematuros: estudo caso-controle / Erika von Söhsten Marinho. – Recife: O Autor, 2011. 33 folhas: il., fig.; 30 cm. Orientador: Renata Cimões Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Odontologia, 2011. Inclui bibliografia e anexos. 1. Periodontite. 2. Bactérias anaeróbias. Prematuro. I. Cimões, Renata. II.Título.. 617.64. CDD (20.ed.). 3.. UFPE CCS2011-226.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITOS PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÀO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Profª. Drª. Jurema Freire Lisboa de Castro PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA – CORPO DOCENTE Alessandra de Albuquerque T. Carvalho Arnaldo de França Caldas Júnior Anderson Stevens Leônidas Gomes Carlos Menezes Aguiar Claudio Heliomar Vicente da Silva Danyel Elias da Cruz Perez Edvaldo Rodrigues de Almeida Flávia Maria de Moraes Ramos Perez Geraldo Bosco Lindoso Couto Jair Carneiro Leão Jurema Freire Lisboa de Castro Liriane Baratela Evêncio Lúcia Carneiro de Souza Beatrice Luiz Alcino Monteiro Gueiros Renata Cimões Jovino Silveira SECRETÁRIA DA PÓS-GRADUAÇÃO Oziclere Sena.

(6) DEDICATÓRIA.

(7) DEDICATÓRIA. Aos meus pais Márcia von Sohsten Marinho e Fernando Luiz Falcão Marinho (in memoriam), que sempre me incentivaram e me orientaram na busca do conhecimento e desenvolvimento intelectual e moral; Ao meu Esposo Esio de Carvalho Coelho Junior por estar sempre presente em todos os momentos difíceis e compartilhar todas alegrias nestes últimos oito anos..

(8) AGRADECIMENTOS.

(9) AGRADECIMENTOS. A Deus, sempre presente em minha vida, que me proporcionou concluir mais uma grande etapa. À minha família, sempre presente em todos os momentos importantes da minha vida, pela paciência, incentivo, amor e por estarem sempre ao meu lado. À minha co-orientadora Silvia Regina Jamelli, professora e amiga, que com toda sua sabedoria, paciência, humildade e conhecimento ajudou-me em todos os passos desta pesquisa. À minha orientadora Renata Cimões por toda paciência, incentivo e apoio durante toda a pesquisa. Ao professor Manoel Adrião, sempre atencioso e paciente, que me ajudou a enfrentar os grandes desafios desta pesquisa. Aos professores Sônia Bechara e Ricardo Ximenes pelo valioso conhecimento compartilhado. À professora Ana Cláudia Araújo, por estar sempre disponível a ajudar-me, por todo seu apoio e atenção. Às companheiras e amigas Luciana Regueira e Manuelly Santos, que estiveram sempre ao meu lado, compartilhando as alegrias, preocupações e vitórias conquistadas. Aos queridos colegas de mestrado, pelo incentivo e conhecimentos compartilhados. À todos os colegas do Laboratório FAMA, pela paciência, humildade e apoio durante toda a fase laboratorial da pesquisa. Às enfermeiras e técnicas de enfermagem do Hospital das Clínicas da UFPE pelo apoio durante a pesquisa. À secretaria da Pós-graduação em Odontologia, pelo convívio e apoio..

(10) NORMATIZAÇÃO.

(11) NORMATIZAÇÃO Este artigo está formatado segundo as normas do periódico: Journal of Oral Diseases (Anexo A).

(12) RESUMO.

(13) RESUMO. Objetivo: Determinar os parâmetros clínicos periodontais e a frequência de bactérias periodontopatogênicas no biofilme subgengival de mães de prematuros comparativamente às mães de bebês a termo. Materiais e Métodos: Foi realizado um estudo caso-controle envolvendo 40 mulheres. Foram incluídas 20 mães de prematuros no grupo caso, enquanto no grupo controle foram incluídas 20 mães de bebês a termo. Em até 48 horas após o parto, as participantes do estudo foram submetidas a uma entrevista, contendo dados de identificação, sóciodemográficos, hábitos de vida, história gestacional atual e pregressa, e um exame periodontal, onde foram coletados dados de profundidade de sondagem, sangramento à sondagem, Índice de placa e perda de inserção periodontal. Na análise microbiológica do biofilme subgengival foram analisadas a Tannerella forsythia, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans, realizada através da técnica da PCR convencional. Resultados: As médias da perda de inserção clínica e sangramento à sondagem mostraram-se significativamente superiores nas mães de bebês prematuros (p=0,049; p= 0,031, respectivamente). A Porphyromonas gingivalis mostrou-se significativamente mais frequente no grupo caso (p= 0,044). Conclusão: Sugere-se que a inflamação e perda de inserção periodontal bem como a presença da Porphyromonas gingivalis no biofilme subgengival possam estar associados à prematuridade.. Descritores: Periodontite; Bactérias Anaeróbias; Prematuro.

(14) ABSTRACT.

(15) ABSTRACT. Objective: The aim of this research was to determine periodontopathogens samples frequency in subgingival biofilm of pre-term delivery newborn mothers in comparison to women who experienced full-term delivery. Materials and Methods: Twenty pre-term delivery newborn mothers and 20 women with fullterm pregnancy were included in groups case and control, respectively. Up to forty-eight hours after the delivery, the patients were submitted to an interview, including identification, actual and late pregnancy history , life habits and a periodontal examination, which included probing depth, bleeding on probing, plaque index and clinical attachment loss. Microbiological analisys of the subgingival biofilm was carried out by conventional PCR technique to evaluate Tannerella forsythia, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Results: Clinical attachment loss and bleeding on probing means were significantly higher at case group (p=0.049; p = 0.031, respectively). Porphyromonas gingivalis was most frequent at the same group, with a significant difference (p=0.044). Periodontal disease was not associated to pre-term delivery. Conclusion: It can be suggested that periodontal tissues inflammation and the clinical attachment loss, as well as Porphyromonas gingivalis presence in subgingival biofilm may be associated to prematurity.. Key words: Periodontitis; Bacteria, Anaerobic; Infant, Premature.

(16) LISTA DE TABELAS.

(17) LISTA DE TABELAS TABELA 1 – Avaliação dos parâmetros clínicos periodontais segundo o grupo.....................26 TABELA 2 – Avaliação da frequência dos periodontopatógenos segundo o grupo............... 26.

(18) LISTA DE ABREVIATURAS.

(19) LISTA DE ABREVIATURAS PP – Parto prematuro PT – Parto a termo PS – Profundidade de sondagem SS – Sangramento à sondagem IP – Índice de placa PIC – Perda de inserção clínica PCR – Polymerase chain reaction Tf – Tannerella forsythia Pg – Porphyromonas gingivalis Td – Treponema denticola Aa – Aggregatibacter actinomycetemcomitans OR – Odds Ratio SPSS - Statistical Package for the Social Sciences.

(20) SUMÁRIO.

(21) SUMÁRIO. ARTIGO .................................................................................................................................... 9 ABSTRACT ......................................................................................................................... 11 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 12 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 13 RESULTADOS .................................................................................................................... 16 DISCUSSÃO........................................................................................................................ 17 REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 21 TABELAS ............................................................................................................................ 26 ANEXOS ................................................................................................................................. 27.

(22) 9. ARTIGO.

(23) 10. AVALIAÇÃO PERIODONTAL CLÍNICA E MICROBIOLÓGICA EM MÃES DE PREMATUROS: ESTUDO CASO-CONTROLE Condição periodontal e Prematuridade Periodontite; Bactérias Anaeróbias; Prematuro. Erika von Söhsten Marinho1 Silvia Regina Jamelli2 Renata Cimões3. 1. Pós-Graduação em Odontologia com área de concentração em Clínica Integrada,. Universidade Federal de Pernambuco 2. Departamento de Clínica e Odontologia Preventiva, Universidade Federal de Pernambuco. 3. Departamento de Prótese e Cirurgia Buco Facial, Universidade Federal de Pernambuco. Autor correspondente: Prof. Dra. Renata Cimões Universidade Federal de Pernambuco Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Recife-PE/CEP: 50670-901 Fax: + 55 81 2126 8836. renata.cimoes@globo.com. Data de submissão: 20 de Julho de 2011.

(24) 11. ABSTRACT Objective: The aim of this research was to determine periodontopathogens samples frequency in subgingival biofilm of pre-term delivery newborn mothers in comparison to women who experienced full-term delivery. Materials and Methods: Twenty pre-term delivery newborn mothers and 20 women with fullterm pregnancy were included in groups case and control, respectively. Up to forty-eight hours after the delivery, the patients were submitted to an interview, including identification, actual and late pregnancy history , life habits and a periodontal examination, which included probing depth, bleeding on probing, plaque index and clinical attachment loss. Microbiological analisys of the subgingival biofilm was carried out by conventional PCR technique to evaluate Tannerella forsythia, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Results: Clinical attachment loss and bleeding on probing means were significantly higher at case group (p=0.049; p = 0.031, respectively). Porphyromonas gingivalis was most frequent at the same group, with a significant difference (p=0.044). Periodontal disease was not associated to pre-term delivery. Conclusion: It can be suggested that periodontal tissues inflammation and the clinical attachment loss, as well as Porphyromonas gingivalis presence in subgingival biofilm may be associated to prematurity.. Key words: Periodontitis; Bacteria, Anaerobic; Infant, Premature.

(25) 12. INTRODUÇÃO A prematuridade, caracterizada pelo nascimento do recém-nascido com menos de 37 semanas completas de gestação, é a principal causa de bebês de baixo peso (< 2500g) (Wilder et al., 2007). Esta situação ocorre em aproximadamente 10% dos nascimentos, variando de acordo com a população estudada (Santos Pereira et al., 2007). No Brasil, a prevalência da prematuridade é de 6,86% (Ministério da Saúde, 2008). Múltiplos fatores têm sido associados ao parto prematuro (PP), destacando-se o abuso de álcool, tabaco ou drogas durante a gestação, alta ou baixa idade materna (> 34 anos ou < 17 anos de idade), baixo poder socioeconômico, cuidados pré-natais inadequados, baixo Índice de Massa Corporal Materna, hipertensão, infecções generalizadas, infecções do trato geniturinário, incompetência cervical, diabetes, fatores ambientais, genéticos, obstétricos, maternos e fetais (Skuldbol et al., 2006; Toygar et al., 2007), prematuridade prévia, infecções crônicas intra-uterinas e etnia não caucasiana (Santos Pereira et al., 2007). A prematuridade ainda é considerada o maior problema na medicina obstétrica e, apesar dos avanços na prevenção, diagnóstico e terapia, continua sendo a maior causa de morbidade e mortalidade entre as crianças recém-nascidas (Bosnjak et al., 2006). Muitos esforços têm sido feitos para reduzir os efeitos desses fatores de risco através de intervenções preventivas durante os cuidados pré-natais. Entretanto, a freqüência de PP não foi reduzida, particularmente porque estes fatores não estão presentes em aproximadamente 50% dos casos (Agueda et al., 2008). A periodontite é uma doença infecciosa crônica cujas manifestações clínicas resultam de uma infecção polimicrobiana do sulco gengival e da resposta imunoinflamatória crônica do hospedeiro (Ebersole et al., 2009). Em 1996, Offenbacher et al. publicaram o primeiro estudo que associou positivamente a doença periodontal à prematuridade e baixo peso ao nascer. Desde então, vários estudos têm sugerido a possível associação entre a doença periodontal e os resultados adversos da gestação, tais como a prematuridade, o baixo peso ao nascer e a préeclâmpsia. Entretanto, um consenso a respeito desta problemática ainda não existe, uma vez que a doença periodontal ora é apontada como um fator de risco potencial em alguns estudos (Offenbacher et al., 2001; Siqueira et al., 2007; Pitiphat et al., 2008; Nabet et al., 2010; Souccar et al., 2010) e ora tal relação não é demonstrada (Lunardelli e Peres, 2005; Mumghamba e Manji, 2007; Novak et al., 2008). Além disso, o verdadeiro mecanismo pelo qual esta relação seria possível não foi evidenciado de maneira conclusiva. Uma possível explicação da associação entre a doença.

(26) 13. periodontal materna e o nascimento de bebês prematuros é que as bactérias do biofilme subgengival e os mediadores pró-inflamatórios, especialmente a prostaglandina E2, IL-1, e FNT alfa, provenientes do tecido periodontal inflamado podem atingir a circulação sistêmica, alcançar os tecidos materno-fetais e iniciar ou exacerbar a resposta inflamatória materna (Lopez et al., 2002; Guimarães et al., 2010). As pesquisas que abordam a condição periodontal clínica e microbiológica em mães de prematuros na população brasileira são escassas. Uma vez que há indícios do papel de patógenos periodontais na patogênese dos resultados adversos da gravidez, o objetivo deste trabalho foi realizar um estudo caso-controle em mulheres na região Nordeste do Brasil para determinar a frequência de bactérias periodontopatogênicas no biofilme subgengival e avaliar os parâmetros clínicos periodontais de mães de prematuros comparativamente às mães de bebês a termo.. MATERIAIS E MÉTODOS Localização do estudo. Este estudo caso-controle foi realizado na maternidade do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), situado na cidade do Recife, Nordeste brasileiro. O projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética e Pesquisa da Instituição Executora (UFPE), sendo aprovado sob o número 0319.0.172.000-09 (Anexo B).. Seleção da amostra. O universo do estudo foi composto por todas as puérperas internadas no referido Hospital. A seleção da amostra foi realizada inicialmente através da análise dos prontuários das pacientes. No total, foram avaliados 174 prontuários, dos quais foram selecionadas 40 mulheres que se enquadraram nos critérios da pesquisa, sendo excluídas as demais. Foi utilizada neste estudo uma amostra de conveniência. Foram incluídas no estudo as mulheres com faixa etária de 18 a 34 anos, que foram submetidas ao parto cesariana ou normal e que aceitaram participar da pesquisa. Adotou-se como critérios de exclusão para a alocação nos grupos os seguintes parâmetros: as mulheres com doenças sistêmicas como diabetes, hipertensão, cardiopatia, febre reumática, ou alguma.

(27) 14. alteração sistêmica que necessitasse de profilaxia antibiótica antes da sondagem periodontal; presença de anormalidades uterinas e fetais; gestação múltipla; mulheres que foram submetidas a tratamento periodontal durante a gestação; as mães de recém-nascidos com infecções congênitas como sífilis, AIDS, toxoplasmose, citomegalovírus, rubéola; mulheres que estavam fazendo uso de antibióticos no momento do exame periodontal ou aquelas que fizeram uso crônico (por mais de três meses) de bloqueadores de canais de cálcio, fenitoína e ciclosporina A; as mulheres fumantes, usuárias de drogas e aquelas que apresentassem menos de 20 dentes naturais presentes na cavidade bucal. As informações sobre a gestação das pacientes (pressão arterial, medicamentos prescritos, consultas ao pré-natal, doenças sistêmicas e complicações associadas à gestação) foram coletadas do prontuário das mesmas. No grupo caso foram incluídas 20 mulheres que tiveram trabalho de parto prematuro ou ruptura prematura das membranas ovulares. Neste grupo foram incluídas as mães de prematuros com peso normal e os de baixo peso ao nascer (grupo PP). A prematuridade foi considerada quando a idade gestacional era < 37 semanas; o baixo peso ao nascer, quando o recém-nascido apresentava peso < 2500g. Para o diagnóstico da prematuridade foi utilizada primariamente a data da última menstruação e corrigida pelo exame ultrassonográfico que tenha sido realizado até a 28ª semana de gestação. O grupo controle foi composto por 20 mulheres que tiveram bebês a termo (≥37 semanas) de peso normal (≥2500g) (grupo PT). Os grupos não foram pareados.. Entrevista e exame clínico periodontal. Após o parto e no máximo em 48 horas, todas as participantes do estudo foram submetidas a uma entrevista e um exame periodontal na mesma maternidade. A entrevista era composta das seguintes seções: dados de identificação, dados sociodemográficos, história gestacional atual e pregressa, hábitos de vida e aspectos relacionados à saúde bucal. Durante toda a pesquisa, apenas um especialista em Periodontia e um anotador realizaram o exame clínico periodontal. O processo de calibração intra-examinador foi realizado antes do início da coleta de dados, onde oito puérperas, que não faziam parte da amostra, foram selecionadas para participar. Foram realizados dois exames periodontais em um intervalo de 48 horas, na própria maternidade, a fim de se obter a confiabilidade diagnóstica. A concordância intra-examinador foi aferida pela medida da profundidade de sondagem através do coeficiente de correlação de concordância. Foi obtido um valor de 0,937 (0,922 a 0,947), indicando concordância elevada..

(28) 15. Para realização do exame periodontal foi utilizada a sonda do tipo Carolina do Norte, sendo avaliados 6 sítios em cada dente. Foram examinados todos os elementos dentários das pacientes sendo excluídos do exame apenas aqueles onde a junção cemento-esmalte não pode ser determinada corretamente e os terceiros molares. Durante o exame foi verificada a profundidade de sondagem (PS), sangramento à sondagem (SS), índice de placa (IP) e perda de inserção clínica (PIC). Para definição da periodontite foi utilizado o critério de Lopéz et al. (2002) que tem como parâmetro a presença de quatro ou mais dentes com um ou mais sítios apresentando profundidade de sondagem ≥ 4mm e perda de inserção clínica ≥ 3mm no mesmo sítio.. Exame microbiológico. Para a coleta microbiológica do biofilme subgengival foram considerados os três sítios com maior profundidade de sondagem na boca do paciente. A área foi isolada relativamente com gaze estéril e a placa supragengival removida com bolinhas de algodão estéril. Cones de papel estéreis nº 30 (Dentsply, Brasil) foram inseridos no interior da bolsa e permaneceram no local por 20 segundos. Após esse procedimento, cada cone foi transportado para um tubo tipo Eppendorf distinto e armazenados a -20ºC para posterior extração de DNA e análise em PCR convencional. Foram avaliadas a presença de quatro tipos de bactérias envolvidas no desenvolvimento das doenças periodontais: Tannerella forsythia (Tf), Treponema denticola (Td), Porphyromonas gingivalis (Pg) e Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa).. Polymerase chain reaction. Para a extração do DNA foi utilizado o kit de purificação QIAamp DNA Investigator (Qiagen, Alemanha), seguindo os procedimentos indicados pelo fabricante. Os primers utilizados neste estudo foram espécie-específicos para a porção 16S rDNA e a seqüência foi utilizada de acordo com Ashimoto et al. (1996). As amplificações do DNA bacteriano das amostras foram processadas com um volume final de 25 µl, de uma mistura contendo 3 µl de DNA, 12,5 µl da Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen, Alemanha), 1,0 µl de cada primer e 7,5 µl de água destilada (Taq PCR Master Mix Kit – Qiagen, Alemanha). As amplificações foram realizadas no termociclador.

(29) 16. Biocycler (Biosystems®, Brasil), o qual foi programado como segue: 1ª fase - “hot start” (94° C por 5 minutos); 2ª fase – dividida em três etapas e realizada por 30 ciclos – 1) desnaturação do DNA alvo por aquecimento (94°C por 30 segundos), 2) anelamento dos primers (temperatura de anelamento de acordo com cada primer utilizado por 30 segundos), 3) extensão (72° C por 30 segundos); e 3ª fase - extensão final (72° C por 5 minutos). A temperatura de anelamento foi a mesma adotada por Ávila-Campos e Velásques (2002). Após esta etapa, 5,0 µl dos produtos da PCR foram adicionados a 0,25 µl do corante fluorescente Blue green (LGC Biotecnologia®, Brasil) e submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,0%. Posteriormente, as corridas de eletroforese foram visualizadas em luz ultravioleta (Eletroforese Vilber Lourmat, França) e fotografadas para posterior análise. A massa molecular padrão 100 pb ladder (LGC Biotecnologia®, Brasil) foi utilizada.. Análise estatística. Os resultados foram submetidos à análise estatística descritiva obtendo-se distribuições absolutas, percentuais uni e bivariadas, e as medidas estatísticas: média e desvio padrão. As técnicas de estatística inferencial utilizaram os testes: t-Student com variâncias, tStudent com variâncias desiguais, Qui-quadrado de Pearson ou o teste Exato de Fisher quando as condições para utilização do teste Qui-quadrado não foram verificadas. A verificação da hipótese de igualdade de variâncias foi realizada através do teste F de Levene. Valores do Odds ratio (OR) e intervalos de confiança para a referida medida foram obtidos na análise da associação entre as variáveis no estudo bivariado considerando-se sempre a primeira ou a última categoria como valor de referência. Adotou-se um nível de significância de 5% e intervalo de confiança de 95% para as tomadas das decisões estatísticas. O software utilizado para digitação dos dados e obtenção dos cálculos estatísticos foi o SPSS 15.0 (Statistical Package for the Social Sciences).. RESULTADOS Um total de 40 mulheres participaram deste estudo, sendo 20 incluídas no grupo caso e 20 no grupo controle. As variáveis sócio-econômicas analisadas (renda familiar, ocupação, escolaridade, estado civil) não apresentaram diferenças entre os grupos, ambos considerados de baixo nível sócio-ecomômico. A média da idade dos grupos PP e PT também se mostra semelhante (25,25  5,10 e 22,20  4,85, respectivamente)..

(30) 17. Em relação às características obstétricas das puérperas, observou-se que as mães de bebês prematuros apresentaram um percentual significativamente maior de prematuridade prévia (95%) em relação às mães de bebês de peso normal e a termo (10%) (p<0,001). O tipo de parto, sexo do recém-nascido, número de consultas de pré-natal, gravidez prévia, aborto prévio, corrimento vaginal e a infecção urinária não mostraram diferenças significantes entre os grupos. A avaliação dos parâmetros clínicos periodontais está demonstrada na Tabela 1. O grupo PP obteve médias de PS e IP maiores em relação ao grupo PT, entretanto estas diferenças não foram significantes. A média da PIC e do SS do grupo PP se apresentaram significativamente superiores ao grupo PT. Na amostra estudada, 30% das mulheres apresentavam periodontite. Apesar da maior frequência desta doença no grupo PP (40%) em relação ao grupo PT (20%), não foi encontrada diferença estatística entre os grupos. A freqüência de cada um dos periopatógenos está disposta na Tabela 2. Na análise microbiológica do biofilme subgengival, observou-se que a bactéria mais frequente em ambos os grupos foi a Aggregatibacter actinomycetemcomitans, presente em 57,5% dos sítios avaliados, não sendo encontrada diferença estatística entre os mesmos. Os periopatógenos Treponema denticola e Tannerella forsythia não apresentaram diferenças em relação à freqüência entre os grupos PP e PT, entretanto, o mesmo não ocorreu com a Porphyromonas gingivalis. Esta última mostrou-se mais frequente no grupo PP (35% vs 5%), obtendo-se uma diferença significante (OR 10,22; 95% IC: 1,21 a 93,34; p= 0,044).. DISCUSSÃO Neste estudo foram analisados os parâmetros clínicos periodontais e a freqüência dos periopatógenos do biofilme subgengival de brasileiras não fumantes, mães de bebês prematuros, comparativamente às mães de bebês a termo. Neste estudo, foi observada uma associação entre a média do SS e da PIC, parâmetros clínicos importantes da doença periodontal, e a prematuridade. Além disso, a presença da Porphyromonas gingivalis no biofilme subgengival das puérperas apresentou-se positivamente associada ao parto prematuro. A amostra estudada foi homogênea em relação aos fatores sócio-econômicos, entretanto, a raça não foi avaliada. Apesar de alguns estudos apontarem a etnia negra como um fator de risco para a prematuridade (Skuldbol et al., 2006; Farrel et al., 2006; Santos Pereira et al., 2007), esta variável não foi incluída nesta pesquisa em virtude da grande.

(31) 18. heterogeneidade étnica existente na amostra analisada, difícil, portanto, de se caracterizar. Dentre as características obstétricas, foi observada uma associação entre o grupo PP e a prematuridade prévia. Esta última já tem sido apontada como um importante fator de risco por outros autores (Offenbacher et al., 2001; Farrel et al., 2006; Siqueira et al., 2007; Agueda; Ramon et al., 2008; Khader et al., 2009) Várias pesquisas têm mostrado evidências de que a periodontite aumenta o risco de partos prematuros, muito embora outros estudos não tenham demonstrado uma associação positiva. Uma revisão sistemática realizada por Xiong et al. (2006) reuniu 13 estudos casocontrole, 9 estudos de coorte e 3 ensaios clínicos controlados que avaliaram a associação entre a doença periodontal e os resultados adversos da gestação (prematuridade, baixo peso ao nascer, pré-eclâmpsia, aborto espontâneo). Dezoito estudos sugeriram que a doença periodontal representou um fator de risco para os resultados adversos da gravidez, enquanto outros sete não demonstraram tal relação. Sete estudos observacionais sugeriram que a doença periodontal atua como fator de risco para a prematuridade (com OR e RR variando de 2.12 a 20.0). Um ensaio clínico controlado também indicou que o tratamento periodontal em gestantes pode reduzir o risco de nascimento de prematuros (RR 0.5, 95% CI 0.2-1.3) Entretanto, 2 estudos de coorte e 2 estudos caso-controle não encontraram associação positiva. Neste estudo foi observada uma alta frequência de periodontite na amostra avaliada (30%), principalmente por se tratarem de mulheres jovens (23,73  5,15 anos), onde a prevalência de doença periodontal normalmente é baixa. O baixo nível sócio-econômico das pacientes de ambos os grupos poderia explicar esta elevada frequência encontrada. Apesar de não ter sido observada associação entre a periodontite e o PP, importantes parâmetros clínicos periodontais, como a média do SS e a PIC apresentaram associação com a prematuridade. A associação entre estes parâmetros clínicos e o PP corroboram com outros trabalhos já citados na literatura (Hasegawa et al., 2003; Khader et al., 2009; Rakoto et al., 2010 Uma das possíveis causas para os resultados contraditórios existentes em relação à associação entre periodontite e os resultados indesejáveis da gravidez é a falta de um consenso na definição de periodontite nos estudos que abordam este tema. A prevalência da periodontite entre as gestantes assim como a magnitude das associações entre esta doença e os resultados adversos da gravidez poderão ser influenciadas pela definição da doença periodontal (Manau et al., 2008; Vettore et al., 2008; Gomes Filho et al., 2010). Nesta pesquisa foi adotada a definição de Lopéz et al. (2002), também utilizada em outros estudos.

(32) 19. (Siqueira et al., 2007; Agueda et al., 2008; Guimaraes et al., 2010). Gomes Filho et al. (2007) compararam o uso de diferentes definições da doença periodontal na associação entre esta e a prematuridade e ou o nascimento de bebês de baixo peso, e demonstraram que a frequência da doença periodontal variou de 33,1% a 94,7% de acordo com o critério utilizado. Talvez, uma explicação plausível para o fato de ter sido verificada associação entre alguns importantes parâmetros clínicos periodontais e o mesmo não ter ocorrido com o diagnóstico de periodontite, seja o critério de classificação utilizado nesta pesquisa. Além da falta de uniformização na definição da doença periodontal, outras causas podem sugerir a falta de concordância entre os resultados dos estudos tais como: falta de padronização das metodologias, diferentes tamanhos amostrais empregados, controle insuficiente das variáveis de confusão, métodos estatísticos inadequados. Dessa forma, a comparação entre os resultados obtidos pelas pesquisas é bastante dificultada. Não foram incluídas neste estudo as mulheres fumantes, as usuárias de drogas e bebidas alcoólicas, três importantes fatores de risco para as alterações da gravidez e, portanto, considerados fatores de confusão (Skuldbol et al., 2006; Toygar et al., 2007). Outros importantes fatores foram controlados através da exclusão da Diabetes, hipertensão, alta ou baixa idade materna (>34 anos e < 17 anos) e anormalidades intra-uterinas. O tamanho amostral utilizado nesta pesquisa pode se tornar uma limitação deste estudo, entretanto, outros trabalhos utilizando pequenas amostras têm sido publicados na literatura (Offenbacher et al., 2006; Bosnjak et al., 2006; Skuldbol et al. 2006; Lin et al., 2007 ) Adicionalmente, a localização geográfica onde são realizadas as pesquisas é um fator capaz de influenciar os resultados das mesmas. Dessa forma, o fato de estudos estarem sendo desenvolvidos em populações diferentes, as quais apresentam variações na prevalência da doença periodontal e da PP também poderiam explicar a falta de concordância nas conclusões apresentadas pelos diversos autores. A estimativa da prevalência da doença periodontal relatada em diversos estudos pode variar de 3,79% (Pitiphat et al., 2008) a 55,8% (Bassani et al., 2007), dependendo da população envolvida e dos critérios utilizados; enquanto a prevalência de PP pode variar de 5,3% (Marin et al., 2005) a 23,1% (Offenbacher et al., 2001). Marin et al. (2005) sugeriu que fatores sociais, demográficos e raciais juntamente com diferentes graus de exposição a outros fatores de risco resultam em diferentes distribuições da doença periodontal em diferentes populações, o que poderia indicar que a periodontite, um possível fator de risco para a PMBP, não se manifesta igualmente em todas as populações. Segundo Rajapakse et al. (2005), a associação entre doença periodontal e PP pode ser.

(33) 20. população-específica, muito embora não existam explicações biológicas para demonstrar esta hipótese. A associação entre patógenos periodontais e os resultados indesejáveis da gestação tem sido demonstrada em alguns estudos em animais e humanos (Collins et al., 1994; Griffen et al., 1998; Skuldbol et al., 2006; Lin et al., 2007). Já foi relatada a presença de alguns dos periodontopatógenos em tecidos materno-fetais tais como a placenta (Lin et al., 2003; Barak et al.,2007), em fluido amniótico de mães com diagnostico de ameaça de parto prematuro e trabalho de parto prematuro (Leon et al., 2007), assim como a resposta imune a estes microorganismos em amostras séricas de cordão fetal (Madianos et al., 2001). No presente estudo, diferentemente da Td, Aa e Tf, a Pg foi encontrada com uma freqüência significativamente maior no grupo PP comparativamente ao grupo PT (35% vs 5%). Outros autores também descreveram um aumento significativo destes patógenos associados ao PP (Urbán et al., 2006; Lin et al., 2007). A Porphyromonas gingivalis é um bastonete imóvel, anaeróbio gram-negativo. Dentre os seus fatores de virulência destacam-se a colegenase, queratinases, hemolisinas, fibrolisinas, fosfolipase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, (Doungudomdacha et. al., 2000), lipopolissacarídeos, fímbrias, efeitos destrutivos diretos como citotoxicidade e degradação da membrana celular (Holt et al., 1999). Estudos em hamsters prenhes demonstraram que a infecção localizada da Pg é capaz de produzir retardo no crescimento fetal, a morte do embrião e estimular o aumento dos níveis séricos de PGE2 e FNT-α derivados do hospedeiro (Collins et al., 1994). Além disso, a infecção materna pela Pg pode resultar na translocação deste microorganismo e seus fatores virulentos para o tecido placentário e induzir a restrição do crescimento fetal (Lin et al., 2003). Dessa forma, a freqüência mais elevada da Pg no biofilme subgengival do grupo PP, neste estudo, sugere que a presença deste patógeno, juntamente com suas endotoxinas e a conseqüente estimulação da resposta inflamatória do hospedeiro pode ter desempenhado um papel na etiopatogênia da prematuridade. Todavia, este resultado deve ser interpretado com cautela, em virtude do amplo intervalo de confiança identificado (95% IC: 1,21 a 93,34). A influência clínica dos periopatógenos originados de bolsas periodontais na prematuridade permanece questionável, uma vez que outros estudos têm falhado em mostrar tal associação (Jarjoura et al., 2005; Novak et al., 2008; Africa et al., 2010). A freqüência do Aa apresentou-se elevada na amostra analisada (57,5%), corroborando com os achados de Africa et al. (2010) que também relataram uma alta prevalência (45%) desta bactéria em um estudo envolvendo mães de bebês prematuros e ou.

(34) 21. baixo peso ao nascer. Entretanto, esta freqüência se mostrou mais alta que a demonstrada em outros estudos envolvendo gestantes (Mitchell-Lewis et al., 2001; Hasewaga et al., 2003; Skuldbol et al., 2006; Lin et al., 2007), sugerindo uma maior ocorrência destas bactérias na amostra estudada e levando a questionar que fatores poderiam estar relacionados à maior frequência destas bactérias em gestantes, uma vez que o Aa, em geral, não se apresenta com alta prevalência em populações com gengivite e periodontite leve a moderada. Este estudo mostra evidências de que as alterações na condição de saúde periodontal e a presença da Pg no biofilme subgengival estiveram associadas ao nascimento de bebês prematuros. A prematuridade continua sendo um importante problema de saúde pública, sendo necessária a adoção de políticas públicas que visem melhorar o estado de saúde materno e, consequentemente, do recém-nascido. Diante dos resultados demonstrados por este e por outros estudos, os cuidados com a saúde bucal devem estar presentes e serem incentivados antes e durante toda a gestação e, para isso, a consulta ao Cirurgião-Dentista deve ser considerada parte essencial de todo pré-natal.. REFERÊNCIAS 1- Africa CWJ, Kayitenkore J, Bayingana C (2010). Examination of maternal gingival crevicular fluid for the presence of selected periodontopathogens implicated in the preterm delivery of low birthweight infants. Virulence 1: 254-259. 2- Agueda A, Ramón JM, Manau C, Guerrero A, Echeverría JJ (2008). Periodontal disease as a risk factor for adverse pregnancy outcomes: a prospective cohort study. J Clin Periodontol 35: 16–22. 3- Ashimoto A, Chen C, Bakker I, Slots J (1996). Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions. Oral Microbiol. Immunol 11: 266-273. 4- Avila-campos MJ and Velásquez-Meléndez G (2002). Prevalence of putative periodontopathogens from periodontal patients and Healthy subjects in São paulo, SP, Brazil. Rev inst med trop S. Paulo 44: 1-5. 5- Barak S, Oettinger-Barak O, Machtei EE, Sprecher H, Ohel G (2007). Evidence of periodontopathogenic microorganisms in placentas of women with preeclampsia. J Periodontol 78: 670-676. 6- Bassani DG, Olinto MTA, Kreiger N (2007). Periodontal disease and perinatal outcomes: a casecontrol study. J Clin Periodontol 34: 31–39..

(35) 22. 7- Bosnjak A, Relja T, Vucicevic-Boras V, Plasaj H, Plancak D (2006). Pre-term delivery and periodontal disease: a case-control study from Croatia. J Clin Periodontol 33: 710– 716. 8- Collins JG, Smith MA, Arnold RR, Offenbacher S (1994). Effects of Escherichia coli and Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide on Pregnancy Outcome in the Golden Hamster. Infect Immun 62: 4652-4655. 9- Doungudomdacha S, Rawlinson A, Douglas CW (2000). Enumeration of Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Actinobacillus actinomycetemcomitans in subgingival plaque samples by a quantitative-competitive PCR method. J Med Microbiol 49: 861-874. 10- Ebersole JL, Novak MJ, Michalowicz BS, Hodges JS, Steffen MJ, Ferguson JE, DiAngelis A, Buchanan W, Mitchell DA, Papapanou PN (2009). Systemic Immune Responses in Pregnancy and Periodontitis: Relationship to Pregnancy Outcomes in the Obstetrics and Periodontal Therapy (OPT) Study. J Periodontol 80:953-960. 11- Farrell S, Ide M, Wilson RF (2006). The relationship between maternal periodontitis, adverse pregnancy outcome and miscarriage in never smokers. J Clin Periodontol 33: 115–120. 12- Gomes-Filho IS, Cruz SS, Rezende EJC, Santos CAST, Soledade KR, Magalhães MA, Azevedo ACO, Trindade SC, Vianna MIP, Passos JS, Cerqueira EMM (2007). Exposure measurement in the association between periodontal disease and prematurity/low birth weight. J Clin Periodontal 34: 957–963. 13- Griffen AL, Becker MR, Lyons SR, Moeschberger ML, Leys EJ (1998) Prevalence of Porphyromonas gingivalis and Periodontal Health Status. J Clin Microbiol 36: 3239– 3242. 14- Guimarães AN, Silva-Mato A, Cota LOM, Siqueira FM, Costa FO (2010). Maternal Periodontal Disease and Preterm or Extreme Preterm Birth: An Ordinal Logistic Regression Analysis. J Periodontol 81:350-358. 15- Hasegawa K, Furuichi Y, Shimotsu A, Nakamura M, Yoshinaga M, Kamitomo M, Hatae M, Maruyama I, Izumi Y (2003). Associations between systematic status, periodontal status, serum cytokine levels, and delivery outcomes in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol 74:1764-70. 16- Holt SC, Kesavalu L, Walker S, Genco CA (1999). Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontology 2000 20:168-238. 17- Jarjoura K, Devine PC, Delboy AP, Herrera-Abreu M, D’Alton M, Papapanou PN (2005). Markers of periodontal infection and preterm birth. Am J of Obstet Gynecol 192: 513-9..

(36) 23. 18- Khader Y, Al-shishani L, Obeidat B, Khassawneh M, Burgan S, Amarin ZO, Alomari M, Alkafajei A (2009). Maternal periodontal status and preterm low birth weight delivery: a case–control study. Arch Gynecol Obstet 279:165–169. 19- León R, Silva N, Ovalle A, Chaparro A, Ahumada A, Gajardo M, Martinez M, Gamonal J (2007). Detection of porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J periodontol 78:1249-55. 20- Lin D, Smith MA, Elter J, Champagne C, Downey CL, Beck J, Offenbacher S (2003). Porphyromonas gingivalis Infection in Pregnant Mice Is Associated with Placental Dissemination, an Increase in the Placental Th1/Th2 Cytokine Ratio, and Fetal Growth Restriction. Infect Immun 71: 5163–5168. 21- Lin D, Moss K, Beck JD, Hefti A, Offenbacher S (2007). Persistently high levels of periodontal pathogens associated with preterm pregnancy outcome. J Periodontol 78: 833-41. 22- Lopéz NJ, Smith PC, Gutierrez J (2002). Periodontal therapy may reduce the risk of preterm low birth weight in women with periodontal disease: a randomized controlled trial. J Periodontol 73: 911-924. 23- Lunardelli AN, Peres MA (2005). Is there an association between periodontal disease, prematurity and low birth weight? A population-based study. J Clin Periodontol 32: 938–946. 24- Madianos PN, Lieff S, Murtha AP, Boggess KA, Auten Rl, Beck JD Offenbacher S (2001). Matermal periodontitis and prematurity. Part II: Maternal infection and fetal exposure. Ann Periodontol 6: 175-82. 25- Manau C, Echeverria A, Agueda A, Guerrero A, Echeverria JJ (2008). Periodontal disease definition may determine the association between periodontitis and pregnancy outcomes. J Clin Periodontol 35: 385–397. 26- Marin C, Segura-Egea JJ, Martínez-Sahuquillo Á, Bullón P (2005). Correlation between infant birth weight and mother’s periodontal status. J Clin Periodontol 32: 299–304. 27- Michell-Lewis D, Engebretson SP, Chen J, Lamster IB, Papanou PN (2001). Periodontal infections and pre-term birth:early findings form a cohort of young minority women in New York. Eur J Oral Sci 109: 34-9. 28- Ministério da Saúde. DATASUS/SINASC – Informações em saúde. Disponível em:< http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?sinasc/cnv/nvuf.def> Acesso em: 20 Fev. 2011. 29- Mumghamba EGS and Manji KP (2007). Maternal oral health status and preterm low birth weight at Muhimbili National Hospital, Tanzania: a case-control study. BMC Oral Health 7: 1-12..

(37) 24. 30- Nabet C, Lelong N, Colombier ML, Sixou M, Musset AM, Goffinet F, Kaminski M (2010). Maternal periodontitis and the causes of preterm birth: the casecontrol Epipap study J Clin Periodontol 37: 37–45. 31- Novak MJ, Novak KF, Hodges JS, Kirakodu S, Govindaswami M, DiAngelis A, Buchanan W, Papapanou PN, Michalowicz BS (2008). Periodontal Bacterial Profiles in PregnantWomen: Response to Treatment andAssociations With Birth Outcomes in the Obstetrics and Periodontal Therapy (OPT) Study. J Periodontol 79:1870-1879. 32- Offenbacher S, Katz V, Fertik G, Collins J, Boyd D, Maynor G, McKaig R, Beck J (1996). Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol 67:1103-13. 33- Offenbacher S, Lieff S, Boggess KA, Murtha AP, Madianos PN, Champagne CME, McKaig RG, Jared HL, Mauriello SM, Auten Jr RL, Herbert WNP, Beck JD (2001). Maternal Periodontitis and Prematurity. Part I: Obstetric Outcome of Prematurity and Growth Restriction. Ann Periodontol 6: 164-174. 34- Pitiphat W, Joshipura KJ, Gillman MW, Williams PL, Douglass CW, Rich- Edwards JW (2008). Maternal periodontitis and adverse pregnancy outcomes. Community Dent Oral Epidemiol 36: 3–11. 35- Rajapakse PS, Nagarathne M, Chandrasekra KB, Dasanayake AP (2005). Periodontal Disease and Prematurity among Non-smoking Sri Lankan Women. J Dent Res 84: 274277. 36- Rakoto-Alson S, Tenenbaum H, Davideau JL (2010). Periodontal Diseases, Preterm Births, and Low Birth Weight: Findings From a Homogeneous Cohort of Women in Madagascar J Periodontol 81:205-213. 37- Santos-Pereira SA, Giraldo PC, Saba-Chujfi E, Amaral RLG, Morais SS, Fachini AM, Gonçalves AKS (2007). Chronic periodontitis and pre-term labour in Brazilian pregnant women: an association to be analysed. J Clin Periodontol 34: 208–213. 38- Siqueira FM, Cota LOM, Costa JE, Haddad JPA, Lana AMQ, Costa FO (2007). Intrauterine Growth Restriction, Low Birth Weight, and Preterm Birth: Adverse Pregnancy Outcomes and Their Association With Maternal Periodontitis. J Periodontol 78:2266-2276. 39- Skuldbol T, Johansen KH, Dahlén G, Stoltze K, Holmstrup P (2006). Is pre-term labour associated with periodontitis in a Danish maternity ward? J Clin Periodontol 33: 177– 183. 40- Souccar NM, Chakhtoura M, Ghafari JG, Abdelnoor AM (2010). Porphyromonas gingivalis in dental plaque and serum C-reactive protein levels in pregnancy. J Infect Dev Ctries 4:362-366..

(38) 25. 41- Toygar HU, Seydaoglu G, Kurklu S, Guzeldemir E, Arpak N (2007). Periodontal Health and Adverse Pregnancy Outcome in 3,576 Turkish Women. J Periodontol 78 2081-2094. 42- Urbán E, Radnai M, Novák T, Gorzó I, Pál A, Nagy E (2006). Distribution of anaerobic bacteria among pregnant periodontitis patients who experience preterm delivery. Anaerobe 12: 52–57. 43- Vettore MV, Leal MC, Leão AT, Monteiro da Silva AM, Lamarca GA, Sheiham A (2008). The Relationship between Periodontitis and Preterm Low Birthweight. J Dent Res 87:73-78. 44- Wilder R, Robinson C, Jared HL, Lieff S, Boggess K (2007). Obstetricians' Knowledge and Practice Behaviors Concerning Periodontal Health and Preterm Delivery and Low Birth Weight. Journal of Dental Hygiene 81: 1-15. 45- Xiong X, Buekens P, Fraser WD, Beck J, Offenbacher S (2006). Periodontal disease and adverse pregnancy outcomes: a systematic review. BJOG 113:135–143. 46- Yeo BK, Lim LP, Paquette DW, Williams RC (2005). Periodontal disease – The emergence of a risk for systemic conditions: pre-term low birth weight. Ann Acad Med Singapore 34: 111-6..

(39) 26. TABELAS Tabela 1 – Avaliação dos parâmetros clínicos periodontais segundo o grupo Grupo Variável. PP. PT. Grupo Total. 20 (100,0). 20 (100,0). 40 (20,0).  Índice de placa: Média ± DP. 37,76 ± 29,91. 27,13 ± 24,90. 32,44 ± 27,69. p(1) = 0,229.  Índice de sangramento. 19,51 ± 29,90. 3,82 ± 4,27. 11,66 ± 22,53. p(3) = 0,031*.  Profundidade sondagem: Média ± DP. 2,06 ± 0,78. 1,70 ± 0,33. 1,88 ± 0,61. p(3) = 0,069.  PIC: Média ± DP. 2,13 ± 0,85. 1,71 ± 0,33. 1,92 ± 0,67. p(3) = 0,049*. 8 (40,0). 4 (20,0). 12 (30,0). p(2) = 0,168. TOTAL: n (%). Valor de p. OR (IC a 95%). gengival: Média ± DP.  Doença periodontal: n (%) Sim. 2,67 (0,65 a 10,97). (*): Diferença significativa ao nível de 5,0%. (1): Através do teste t-Student com variâncias iguais. (2): Através do teste Qui-quadrado de Pearson. (3): Através do teste t-Student com variâncias desiguais.. Tabela 2 – Avaliação da frequência dos periopatógenos segundo o grupo Grupo Bactérias. TOTAL. PP. PT. Grupo Total n %. Valor de p. OR (IC a 95%). n. %. n. %. 20. 50,0. 20. 50,0. 40. 100,0. 4. 20,0. 4. 20,0. 8. 20,0. p(1) = 1,000. 7. 35,0. 1. 5,0. 8. 20,0. p(1) = 0,044*. 5. 25,0. 3. 15,0. 8. 20,0. p(1) = 0,695. 1,89 (0,38 a 9,27). 10. 50,0. 13. 65,0. 23. 57,5. p(2) = 0,337. 1,86 (0,52 a 6,61).  Tf Presente. 1,00 (0,21 a 4,71).  Pg Presente. 10,22 (1,21 a 93,34).  Td Presente  Aa Presente. (*): Diferença significativa ao nível de 5,0%. (1): Através do teste Exato de Fisher. (2): Através do teste Qui-quadrado de Pearson..

(40) 27. ANEXOS.

(41) 28. ANEXO A - Normatização do Artigo Author Guidelines 5. MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE. 5.1. Page Charge Articles exceeding 7 published pages are subject to a charge of GBP70 per additional page. One published page amounts approximately to 5,500 characters (excluding figures and tables). 5.2. Format Language: Authors should write their manuscripts in British English using an easily readable style. Authors whose native language is not English should have a native English speaker read and correct their manuscript. Spelling and phraseology should conform to standard British usage and should be consistent throughout the paper. A list of independent suppliers of editing services can be found at http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp. All services are paid for and arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or preference for publication. Presentation: Authors should pay special attention to the presentation of their findings so that they may be communicated clearly. The background and hypotheses underlying the study as well as its main conclusions should be clearly explained. Titles and abstracts especially should be written in language that will be readily intelligible to any scientist. Technical jargon: should be avoided as much as possible and clearly explained where its use is unavoidable. Abbreviations: Oral Diseases adheres to the conventions outlined in Units, Symbols and Abbreviations: A Guide for Medical and Scientific Editors and Authors. Non-standard abbreviations must be used three or more times and written out completely in the text when first used. 5.3. Structure: All papers submitted to Oral Diseases should include:       . Title Page Structured Abstract (reviews need not include a structured abstract) Main text References (Figures) (Figure Legends) (Tables) Title Page: should be part of the manuscript uploaded for review and include:.    . A title of no more than 100 characters including spaces A running title of no more than 50 characters 3-6 keywords Complete names and institutions for each author.

(42) 29  . Corresponding author's name, address, email address and fax number Date of submission (and revision/resubmission) Abstract: is limited to 200 words in length and should contain no abbreviations. The abstract should be included in the manuscript document uploaded for review as well as separately where specified in the submission process. The abstract should convey the essential purpose and message of the paper in an abbreviated form set out under:.    . Objective(s), Subject(s) (or Materials) and Methods, Results, Conclusions(s). The Main Text of Original Research Articles should be organised as follows Introduction: should be focused, outlining the historical or logical origins of the study and not summarize the results; exhaustive literature reviews are inappropriate. It should close with the explicit statement of the specific aims of the investigation. Materials and Methods must contain sufficient detail such that, in combination with the references cited, all clinical trials and experiments reported can be fully reproduced. As a condition of publication, authors are required to make materials and methods used freely available to academic researchers for their own use. This includes antibodies and the constructs used to make transgenic animals, although not the animals themselves. Other supporting data sets must be made available on the publication date from the authors directly. (i) Clinical trials: As noted above, these should be reported using the CONSORT guidelines available at www.consort-statement.org. A CONSORT checklist should also be included in the submission material. Clinical trials can be registered in any of the following free, public clinical trials registries: www.clinicaltrials.gov, http://clinicaltrials.ifpma.org/clinicaltrials/, http://isrctn.org/.As stated in an editorial published in Oral Diseases (12:217-218), 2006), all manuscripts reporting results from a clinical trial must indicate that the trial was fully registered at a readily accessible website. The clinical trial registration number and name of the trial register will be published with the paper. (ii)Experimental subjects: As noted above, experimentation involving human subjects will only be published if such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including the World Medical Association Declaration of Helsinki (version 2002) and the additional requirements, if any, of the country where the research has been carried out. Manuscripts must be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the understanding and written consent of each subject and according to the above mentioned principles. A statement regarding the fact that the study has been independently reviewed and approved by an ethical board should also be included.Editors reserve the right to reject papers if there are doubts as to whether appropriate procedures have been used. When experimental animals are used the methods section must clearly indicate that adequate measures were taken to minimize pain or discomfort. Experiments should be carried out in accordance with the Guidelines laid down by the National Institute of Health (NIH) in the USA regarding the care.

(43) 30. and use of animals for experimental procedures or with the European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and in accordance with local laws and regulations. (iii) Suppliers: Suppliers of materials should be named and their location (town, state/county, country) included. Results: should present the observations with minimal reference to earlier literature or to possible interpretations. Discussion: may usually start with a brief summary of the major findings, but repetition of parts of the abstract or of the results sections should be avoided. The section should end with a brief conclusion and a comment on the potential clinical relevance of the findings. Statements and interpretation of the data should be appropriately supported by original references. Acknowledgements: Should be used to provide information on sources of funding for the research, any potential conflict of interest and to acknowledge contributors to the study that do not qualify as authors. All sources of institutional, private and corporate financial support for the work within the manuscript must be fully acknowledged, and any potential grant holders should be listed. Acknowledgements should be brief and should not include thanks to anonymous referees and editors. Where people are acknowledged, a covering letter demonstrating their consent must be provided. 5.4. References The journal policy is to encourage references to original papers, not to literature reviews. References in the text should quote the last name(s) of the author(s) and the year of publication (Brown and Smith, 2005). Three or more authors should always be referred to as, for example, Jones et al., 2005. We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference management and formatting. EndNote reference styles can be searched for here: www.endnote.com/support/enstyles.asp. Reference Manager reference styles can be searched for here: www.refman.com/support/rmstyles.asp A list of the references must be given at the end of the paper and should follow the recommendations in Units, Symbols and Abbreviations: A Guide for Medical and Scientific Editors and Authors, (1975), p.36. London: The Royal Society of Medicine. a) The arrangement of the references should be alphabetical by first author's surname. b) The order of the items in each reference should be: (i) for journal references: last name(s) of all the author(s) and their initials, year, title of paper, title of journal, volume number, first and last page numbers. (ii) for book references:.

(44) 31. Name(s) of author(s), year, chapter title, title of book, edition, volume, town of publication, publisher, page number(s). c) Authors' names should be arranged thus: Smith AB and Jones DE d) The year of publication should be surrounded by parentheses: (2005). e) The title of the paper should be included without quotation marks. f) The journal title should be abbreviated, should be italicised, and followed by the volume number in bold type and page numbers separated by a dash. Examples: Gupta PC, Murti PR, Bhonsle RB, Mehta FS, Pindborg JJ (1995). Effect of cessation of tobacco use on the incidence of oral mucosal lesions in a 10-year study of 12212 users. Oral Diseases 1: 54-58. Baum BJ, Voutetakis A, Wang J (2004). Salivary glands: novel target sites for gene therapeutics. Trends Mol Med. 10: 585-590. Shear M and Speight PM (2007). Cysts of the Oral and Maxillofacial Regions. Wiley-Blackwell: Oxford. Scully C (2004). The oral cavity and lips. In: Burns DA, Breathnach SM, Cox N, Griffiths C, eds., Rooks Textbook of Dermatology. 7th Edition. Blackwell Science: Oxford, pp.66.1.-66.121. 5.5. Tables, Figures and Figure Legends Figures: All figures and artwork must be provided in electronic format. Please save vector graphics (e.g. line artwork) in Encapsulated Postscript Format (EPS) and bitmap files (e.g. half-tones) or clinical or in vitro pictures in Tagged Image Format (TIFF). Detailed information on our digital illustration http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp.. standards. Check your electronic artwork http://authorservices.wiley.com/bauthor/eachecklist.asp.. before. can. be. found. submitting. at. it:. Unnecessary figures and parts (panels) of figures should be avoided: data presented in small tables or histograms, for instance, can generally be stated briefly in the text instead. Figures should not contain more than one panel unless the parts are logically connected. Figures divided into parts should be labelled with a lower-case, boldface, roman letter, a, b, and so on, in the same type size as used elsewhere in the figure. Lettering in figures should be in lower-case type, with the first letter capitalized. Units should have a single space between the number and unit, and.

(45) 32. follow SI nomenclature common to a particular field. Unusual units and abbreviations should be spelled out in full or defined in the legend. Scale bars should be used rather than magnification factors, with the length of the bar defined in the legend rather than on the bar itself. In general visual cues (on the figures themselves) are preferred to verbal explanations in the legend (e.g. broken line, open red triangles etc)..

(46) 33. ANEXO B - Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa.

(47)