Propagação e tipagem molecular de estirpes de Chlamydia trachomatis

DEPARTAMENTO DE BIOL

Propagação e tipagem molecular de estirpes de

Mestrado

Nádia Carina de Albuquerque

Professora Doutora Maria Teresa Rebelo

2015

UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ANIMAL

Propagação e tipagem molecular de estirpes de Chlamydia

trachomatis

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

Nádia Carina de Albuquerque

Dissertação orientada por:

Doutora Maria José Borrego

Professora Doutora Maria Teresa Rebelo

Propagação e tipagem molecular de estirpes de

Mestrado

Nádia Carina de Albuquerque

Dissertação orientada por:

Doutora Maria José Borrego

Laboratório Nacional de Referência das Infecções Sexualmente Transmissíveis Saúde Dr. Ricardo Jorge

Professora Doutora Maria Teresa Rebelo

Departamento de Biologia Animal

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ANIMAL

2015

Propagação e tipagem molecular de estirpes de Chlamydia

trachomatis

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

Nádia Carina de Albuquerque

Laboratório Nacional de Referência das Infecções Sexualmente Transmissíveis - Instituto Nacional de

Doutora Maria Teresa Rebelo

Departamento de Biologia Animal – Faculdade de Ciências - Universidade de Lisboa

UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ANIMAL

Chlamydia

2015

Propagação e tipagem molecular de estirpes de Chlamydia

trachomatis

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

Nádia Carina de Albuquerque

Dissertação

Trabalho realizado no Departamento de Doenças Infecciosas, Laboratório Nacional de Referência das Infecções Sexualmente Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge.

O texto da presente dissertação não segue o novo acordo ortográfico da língua portuguesa.

As referências bibliográficas estão de acordo com as normas da revista Journal of Microbiological Methods.

i

Agradecimentos

E assim completo mais uma fase importante na minha vida, mais um objectivo cumprido para o que desejo alcançar no meu futuro… Mas não cheguei aqui sozinha e como tal gostaria de prestar a minha gratidão:

À Doutora Maria José Borrego, minha orientadora e mentora durante a realização deste trabalho. Obrigada pelo apoio, atenção e disponibilidade que demonstrou para comigo mas agradeço-lhe, principalmente, por toda a paciência e dedicação em transmitir-me os seus conhecimentos, sinto que “cresci” durante este ano e que a concretização deste trabalho foi possível também devido a si.

À minha orientadora interna, Professora Doutora Maria Teresa Rebelo, pelos seus ensinamentos e esclarecimentos.

Ao Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, em particular, aos membros do Departamento de Doenças Infecciosas por me terem acolhido nos seus laboratórios com simpatia e disponibilidade para me prestarem apoio sempre que preciso.

Aos meus colegas de laboratório, Rita, Miguel, Vítor, Xana e Margarida pela companhia, troca de conhecimentos e entreajuda. Um especial agradecimento à Dora Cordeiro por toda a disponibilidade, apoio e cooperação na realização das técnicas de tipagem onde transmitiu-me o seu conhecimento permitindo-me ganhar autonomia nessa área.

Aos meus colegas de faculdade e mestrado, Daniel, Ana, Pedro, Joana e Beatriz por passarem pelo mesmo que eu, pelas conversas, apoio e principalmente amizade.

Aos meus amigos, vocês sabem quem são, por todo o apoio, incentivo e momentos de distracção que me proporcionaram. Obrigada pela amizade!

À minha família, pelo apoio, incentivo, carinho, amizade, amor e por estarem sempre presentes mesmo quando eu me encontrava ausente. Um

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obrigada especial às companhias da minha vida, Tânia, Jeca e Ian! Por serem minhas irmãs, pelas conversas infinitas ao telemóvel nas horas vagas, pelas brincadeiras, risadas, apoio e por me aturarem e amarem exactamente como eu sou…

À minha mãe! Obrigada por seres o meu alicerce, por nunca duvidares das minhas capacidades e por me impulsionares a ir mais longe! Sem ti nada disto seria possível, portanto para ti ficam todos os agradecimentos.

“A verdadeira medida de um homem não é como ele se comporta em momentos de conforto e conveniência,

mas como ele se mantém em tempos de controvérsia e desafio.”

iii

Resumo

Chlamydia trachomatis, uma bactéria intracelular da família Chlamydiaceae, infecta exclusivamente a espécie humana. As clamídias são bactérias gram-negativas incapazes de sintetizar adenosina trifosfato, uma restrição metabólica que justifica a sua total dependência da célula hospedeira para obter energia. C. trachomatis constitui a principal causa bacteriana de infecções sexualmente transmissíveis em todo o mundo. Na ausência de tratamento, as infecções por C. trachomatis podem causar cervicite, doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e infertilidade tubária, na mulher, e no homem, epididimite.

No presente estudo foi feita uma análise ao gene ompA de 297 espécimes de C. trachomatis. Os genótipos E, D e F (32,7%, 21,4% e 18,0%, respectivamente) predominaram relativamente aos restantes genótipos ompA de C. trachomatis (A, B, Ba, C, G, H, I, J, K e L1-3), representando cerca de três quartos das estirpes tipadas. Foram identificados dois casos de infecção pelo genótipo L2, indicando que estas estirpes causadoras de linfogranuloma venéreo circulam em Portugal. Em 40,5% das estirpes clínicas tipadas foram encontradas mutações pontuais no gene ompA, sendo os genótipos D (41,2%), G (21,0%) e I (19,3%) aqueles em que foi observado maior número de variantes.

No decurso do presente estudo foi ainda possível propagar 25 estirpes em cultura celular e implementar uma técnica de isolamento de clones de C. trachomatis.

O presente estudo constituiu um contributo para a vigilância epidemiológica que beneficiará da contínua monitorização da distribuição genotípica de C. trachomatis em diversas regiões geográficas com vista a uma melhor compreensão da infecção.

Palavras-chave: Chlamydia trachomatis; genotipagem ompA; cultura celular; epidemiologia molecular; variabilidade genética.

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Abstract

Chlamydia trachomatis belongs to the family Chlamydiaceae and is an intracellular bacterium that only infects humans. Chlamydiae are gram-negative bacteria that are incapable of adenosine triphosphate synthesis, a metabolic constraint that justifies their absolute energy dependence from the host cell. C. trachomatis is worldwide leading cause of sexually transmitted bacterial infections. Without treatment, C. trachomatis infections can cause cervicitis, pelvic inflammatory disease, ectopic pregnancy and tubal infertility in women, and epididymitis in men.

In the present study the ompA gene of 297 C. trachomatis specimens was determined and analyzed. Genotypes E, D and F (32.7%, 21.4% and 18.0%, respectively) prevailed over the remainder C. trachomatis ompA genotypes (A, B, Ba, C, G, H, I, J, K e L1-3), accounting for about three-quarters of all typed strains. Two cases of infection with genotype L2 were identified, indicating that these strains, which cause lymphogranuloma venereum, are currently circulating in Portugal. Point mutations in the ompA gene were found in 40.5% of the typed specimens, among which genotypes D (41.2%) G (21.0%) and I (19.3%) provided most of the variants.

Along the study 25 C. trachomatis clinical strains were propagated in cell culture and the plaque assay technique for isolating chlamydial clones was implemented in the host laboratory.

The present study is a contribution to the molecular epidemiological surveillance which would strongly benefit from a continuous monitoring of C. trachomatis genotypic distribution within different geographical regions in order to better understand the chlamydial infection.

Keywords: Chlamydia trachomatis; ompA genotyping; cell culture; molecular epidemiology; genetic variability.

v

Índice Geral

Índice de Figuras ... vii

Índice de Tabelas ... vii

Lista de Abreviaturas ... iix

1. Introdução ... 1

1.1. Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) ... 2

1.2. Biologia ... 3

1.3. Classificação taxonómica e manifestações clínicas ... 5

1.4. Ciclo de desenvolvimento ... 8

1.5. Diagnóstico ... 10

1.5.1. Propagação de C.trachomatis em cultura celular ... 11

1.5.2. Testes serológicos ... 11

1.5.3. Detecção de Antigénio ... 12

1.5.4. Testes de amplificação de ácidos nucleicos (“Nucleic acids amplification tests”, NAATs) ... 13

1.6. Epidemiologia ... 14

2. Objectivos ... 17

3. Materiais e Métodos... 19

3.1. Propagação de estirpes de Chlamydia trachomatis ... 20

3.1.1. Cultura celular... 20

3.1.2. Inoculação de estirpes em células Hela 229 ... 20

3.1.3. Confirmação de cultura de Chlamydia trachomatis ... 22

3.1.4. Recuperação de culturas de C. trachomatis ... 22

3.2. Isolamento de Clones de estirpes de C. trachomatis (Plaque Assay) . 23 3.2.1. Propagação de clones de C. trachomatis ... 24

3.3. Tipagem ompA ... 26

3.3.1. Extracção de DNA ... 26

vi

3.3.3. Purificação dos produtos de PCR ... 28

3.3.4. Sequenciação dos produtos de PCR purificados... 28

3.3.5. Análise das sequências do gene ompA ... 29

4. Resultados ... 31 5. Discussão ... 41 6. Conclusão ... 47 7. Referências Bibliográficas ... 49 8. Anexos ... 59 Anexo I ... 60 Anexo II ... 61

vii

Índice de Figuras

Figura 1- Representação esquemática de uma bactéria de C. trachomatis …..4 Figura 2- Representação esquemática do ciclo de vida de C.trachomatis……10 Figura 3- Esquema de inoculação de amostras biológicas infectadas por

C.trachomatis em placa de 24 poços...21

Figura 4- Placa de 6 poços revelada pela adição de 0,03% Neutral Red

Agarose media. É possível visualizar placas de citotoxicidade promovidas pela estirpe de referência C-TW3 de C. trachomatis………..24

Figura 5- Electroforese em gel de agarose após nested-PCR do gene ompA de

C. trachomatis………...28

Figura 6- Alinhamento do gene ompA de um clone do isolado clínico CS76/14

utilizando as sequências dadas pelos primers ompA-1 e Sero2A pelo software MegAlign (DNASTAR)………...………..30

Figura 7- Frequência dos genótipos ompA em 294 amostras positivas por

nested-PCR………...32

Figura 8- Distribuição dos genótipos ompA de C. trachomatis por grupo etário

(<25 anos e ≥25 anos)……….33

Figura 9- Distribuição dos genótipos ompA de C. trachomatis nos casos

positivos identificados a partir da amostra biológica ‘urina’…………..…………34

Figura 10- Distribuição dos genótipos ompA de C. trachomatis em 74 casos

positivos identificados a partir de exsudados do endocolo………...………34

Figura 11- Distribuição dos genótipos ompA de C. trachomatis em 10 casos

positivos identificados a partir de exsudados anorretais………...…35

Figura 12- Representação do número de variantes do gene ompA por genótipo

de C. trachomatis (4 casos de infecção mista e 3 casos em que não foi possível confirmar a variabilidade do genótipo não foram incluídos) …..……….….37

Figura 13- Placas de citotoxicidade (clones) originadas pelas estirpes de

referência E-Bour e K-UW31, respectivamente, de C. trachomatis 10 dias pós-inoculação……….39

Figura 14- Árvore filogenética das estirpes de referência/protótipo de C.

trachomatis incluindo os clones da estirpe clínica ‘CS76/14’ e da estirpe de referência K-UW31……….….40

viii

Índice de Tabelas

Tabela 1- Relação entre serótipo, biovariedade, sexo acometido e doenças

causadas pela infecção por C. trachomatis ………..………7

Tabela 2- Primers utilizados na amplificação do gene ompA por

nested-PCR………....27

Tabela 3- Primers utilizados na sequenciação de produtos purificados do PCR

ompA de C.trachomatis………...………29

Tabela 4- Programa de sequenciação de produtos de PCR………....29 Tabela 5- Distribuição dos genótipos ompA em 95 amostras biológicas

inoculadas em cultura celular………...36

Tabela 6- Variantes ompA de C. trachomatis relativamente à respectiva estirpe

ix

Lista de Abreviaturas

CDC – Centers for Disease Control

CDs – Domínios Conservados (do inglês conserved domains) CE – Corpo Elementar

cm – centímetros

CO2 – dióxido de carbono

CR – Corpo Reticulado

DIP – Doença Inflamatória Pélvica

DNA – Ácido Desoxirribonucleico (do inglês desoxyribonucleic acid) ECDC – European Centre for Disease Prevention and Control EIA – Ensaios imunoenzimáticos

ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay (sem tradução usual em português)

EUA – Estados Unidos da América h – horas

HSP – proteínas de choque térmico (do inglês Heat Shock Proteins) IFD – Imunofluorescência directa

IFI – Imunofluorescência indirecta

IST – Infecção Sexualmente Transmissível LGV – Linfogranuloma Venéreo

LPS – Lipopolissacárido m – minutos

x

mL – mililitros mm – milímetros mM – miliMolar

MOMP – Principal protein da membrane externa (do inglês Major outer membrane protein)

MSM – Homens que têm sexo com homens (do ingles Men who have Sex with Men)

NAATs –Testes de amplificação de ácidos nucleicos ( do inglês Nucleic Acids AmplificationTests)

OmcA – Proteína rica em cisteína da membrana externa (do inglês Small cysteine-rich outer membrane protein)

OmcB – Proteína do complexo B da membrana externa (do inglês Outer membrane complex protein B)

OMS – Organização Mundial de Saúde

PCR – Reacção em Cadeia da Polimerase (do inglês Polymerase Chain reaction)

PDI – Proteína Bissulfito Isomerase (do inglês Protein Disulfide Isomerase) Pmp – Proteínas polimórficas da membrana externa (do inglês Polimorphic membrane proteins)

RNA – Ácido Ribonucleico (do inglês ribonucleic acid) rpm – rotações por minuto

s – segundos

SPG – tampão de Sacarose-Fosfato-Glutamato

T3SS – Sistema de secreção de tipo III (do inglês type III secretion system) Tarp –Translocated actin recruiting protein (sem tradução usual em português) UFI – Unidades Formadoras de Inclusões

VDs – Domínios Variáveis (do inglês variable domains) VIH – Vírus da Imunodeficiência Humana

1

1. Introdução

2

1.1.

Chlamydia trachomatis (C.trachomatis)

Em 1907, Halberstaedter e von Prowazek (1907, 1909) identificaram e descreveram pela primeira vez vacúolos intracitoplasmáticos em células de exsudados conjuntivais corados pelo Giemsa, de indivíduos com tracoma. Os dois cientistas consideraram que tais vacúolos seriam causados por um protozoário, ao qual chamaram “chlamydozoon”; esta designação tinha origem no termo grego “chlamys”, que significa “casaco”, em alusão ao halo não corado que envolvia os elementos da inclusão. Inclusões semelhantes foram posteriormente descritas em amostras biológicas colhidas em indivíduos com uretrite e cervicite e em recém-nascidos com conjuntivite, tendo sido por isso proposto que o microrganismo fosse o mesmo (Lindner, 1910). Durante os anos seguintes, foram identificadas inclusões similares em amostras ganglionares de pacientes com linfogranuloma venéreo (LGV), patologia que já tinha sido reconhecida como sexualmente transmissível e diferente da sífilis (Durand et al., 1913). Por volta de 1930, durante uma pandemia mundial de psitacose, uma pneumonia atípica e aguda cujo agente etiológico é transmitido por contacto com aves, em particular com psitacídeos, foram identificados “corpos basófilos” semelhantes aos descobertos por Halberstaedter e von Prowazek (1907, 1909) em amostras biológicas colhidas em aves e seres humanos infectados (Bedson et al., 1930; Coles, 1930). Durante esta década, ambos os organismos foram considerados potencialmente como vírus do grupo psitacose-LGV, dada a sua capacidade de atravessar filtros que retinham bactérias e a sua incapacidade de propagação em meios artificiais (Miyagawa et al., 1935). Em 1966, as clamídias foram classificadas como bactérias, dado possuírem ambos os tipos de ácido nucleico, DNA (Ácido Desoxirribonucleico) e RNA (Ácido Ribonucleico); por outro lado, a microscopia electrónica permitiu identificar estruturas celulares como ribossomas e uma parede celular semelhante à das bactérias Gram-negativas (Moulder, 1966).

3

1.2.

Biologia

As clamídias são bactérias gram-negativas, têm ribossomas e são capazes de síntese proteica; contudo, são incapazes de sintetizar adenosina trifosfato (ATP), uma restrição metabólica que justifica a sua total dependência da célula hospedeira para obter energia, e explica o seu ciclo de vida obrigatoriamente intracelular (Nunes e Gomes, 2014; Pereira, 2009). Tal ciclo, único em toda a natureza, envolve a conversão entre duas formas morfologicamente distintas: uma forma infecciosa não-replicativa, o corpo elementar (CE) e uma forma não-infecciosa replicativa, o corpo reticulado (CR) (Borges et al., 2013; Cunha et al., 2014). O CE tem uma forma esférica com cerca de 0,3µm de diâmetro, um nucleóide denso e central e é dotado de uma parede celular rígida que permite a sobrevivência extracelular da bactéria por alguns minutos (AbdelRahman e Belland, 2005; Liechti et al., 2013). O CR é maior que o CE (aproximadamente 1µm de diâmetro), tem uma estrutura esférica mais flexível e apenas sobrevive em ambiente intracelular, já que é osmoticamente frágil devido à falta de ligações cruzadas entre as proteínas da sua membrana externa (Nunes e Gomes, 2014; Pereira, 2009). A estabilidade e rigidez da parede das clamídias, composta por uma membrana externa e uma membrana interna, são asseguradas pelas pontes de cisteína que estabelecem-se entre as proteínas que compõem a membrana externa, das quais a major outer membrane protein (MOMP) é a principal, já que compõe cerca de 60% da membrana externa e possui determinantes antigénicos de género, espécie e tipo (Nunes et al., 2010). A MOMP tem uma estrutura composta por cinco domínios conservados (CDI, CDII, CDIII, CDIV e CDV) e quatro domínios variáveis (VDI, VDII, VDIII e VDIV) expostos na face externa da membrana bacteriana. A definição dos serótipos baseia-se na heterogeneidade da sequência da MOMP, mais precisamente das VDs (Lister et al., 2004; Nunes et al., 2010; Twin et al., 2011). Outras proteínas, como a Small cysteine-rich outer membrane protein (OmcA) e a Outer membrane complex protein B (OmcB), constituem uma camada proteica estruturada hexagonalmente na face interna da membrana externa que inclui ainda outras proteínas como as Polimorphic membrane proteins (Pmp), as proteínas de choque térmico (“heat shock proteins”, HSP) e o lipopolissacárido (LPS), entre

4

outros (Cevenini et al., 2002; Nunes e Gomes, 2014; Solomon et al., 2004). Entre as duas membranas que compõem a parede existe uma camada de peptidoglicano com importância para o processo de divisão celular (Egan e Vollmer, 2013; Liechti et al., 2013). Por microscopia electrónica foram observadas projecções à superfície dos CR´s e CE´s, eventualmenteproteínas relacionadas com o sistema de secreção tipo III (T3SS), e que são codificadas por genes existentes em todas as espécies de Chlamydia (Chang et al., 1997; Valdivia, 2008). O T3SS é um mecanismo de virulência utilizado por várias bactérias patogénicas gram-negativas para translocar proteínas efectoras directamente no citoplasma da célula hospedeira, de forma a manipular funções celulares específicas em fases distintas da infecção (Hueck, 1998). A figura 1 representa esquematicamente uma bactéria de Chlamydia.

Figura 1- Representação esquemática de uma bactéria de C. trachomatis (Land et al., 2010).

Relativamente ao genoma das clamídias, a primeira sequência de um genoma completo foi publicada em 1998 (Stephens et al., 1998). Chlamydia sp terá sofrido evolutivamente uma redução de genoma, processo que justifica-se pelo seu ciclo de vida intracelular, e possui por isso um dos cromossomas mais pequenos entre as bactérias, com cerca de 1 milhão de pares de bases (Kingsbury, 1969; Stephens et al., 1998). O genoma inclui também plasmídeos, cujo número se estima actualmente ser entre 8 a 10, cada um com cerca de

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7500 pares de bases codificando apenas oito proteínas (Comanducci et al., 1988; Nunes e Gomes, 2014; Østergaard, 2002). No conjunto, o genoma será constituído por cerca de 900 genes, sendo que um terço codifica proteínas exclusivas de Chlamydia. O ciclo biológico intracelular obrigatório das clamídias e a estrutura “tipo esporo” da sua forma extracelular dificultou durante muitos anos estudos que envolvessem manipulação genética, com vista ao esclarecimento das funções de genes exclusivos das clamídias (Stephens et al., 1998). Contudo, em 2011 foi publicado o primeiro estudo envolvendo estirpes de Chlamydia geneticamente modificadas, tecnologia que tem vindo a permitir aprofundar a investigação sobre as funções e sobretudo o potencial patogénico dos genes exclusivos de Chlamydia (Wang et al., 2011).

1.3.

Classificação taxonómica e manifestações clínicas

C. trachomatis é uma bactéria intracelular que infecta exclusivamente a espécie humana, e que pertence à família Chlamydiaceae. Os géneros incluídos nesta família têm sido objecto de discussão entre os clamidiologistas, sendo que têm sido admitidos dois géneros Chlamydia e Chlamydophila (Everett et al., 1999) ou um único género, Chlamydia (Stephens et al., 2009). No presente trabalho e na ausência de um consenso da comunidade científica em termos taxonómicos, assumimos apenas o género Chlamydia, no qual foram incluídas as espécies C. muridarum, C. avium, C.gallinacea, C. suis, C. psittaci, C. abortus, C. caviae, C. felis, C. pecorum e C. pneumoniae, responsáveis por uma grande variedade de doenças em diversas espécies animais e também no Homem (apenas C. psittaci e C. pneumoniae) (Kari et al., 2011; Liechti et al., 2013; Sachse et al., 2015).

As estirpes de C. trachomatis foram classificadas em duas biovariedades, cada uma compreendendo vários serótipos (ou serovariedades) /genótipos; estes termos são utilizados consoante a identificação dos tipos e é feito com recurso a anti-soros específicos ou a análise genética. Cada biovariedade agrupa estirpes com tropismo para o mesmo tipo de tecidos eucariotas e que causam o mesmo tipo de infecção (WHO, 2013).

6

Os diferentes serótipos foram definidos com base no reconhecimento por anticorpos monoclonais que puderam ser especificamente produzidos com base nas propriedades antigénicas da MOMP de C. trachomatis. Foram definidos 15 serótipos (A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L1, L2, L3). Posteriormente, a análise do gene ompA, que codifica a MOMP, permitiu fazer corresponder genótipos ompA aos serótipos inicialmente determinados e ainda identificar variantes genotípicas de cada genótipo ompA que os estudos serológicos não podiam distinguir (Bom et al., 2011; Nunes e Gomes, 2014; Nunes et al., 2013).

Os genótipos A, B e C infectam preferencialmente a mucosa ocular e causam o tracoma, uma patologia que inicia-se por uma conjuntivite que, quando não tratada e sobretudo se ocorrerem repetidos episódios de infecção, evolui para triquíase, úlcera da córnea e finalmente cegueira. O tracoma, uma das sete principais doenças negligenciadas no presente século XXI, é a principal causa infecciosa de cegueira susceptível de prevenção a nível mundial (Mariotti et al., 2009; Nunes e Gomes, 2014; Wright et al., 2008). Os genótipos D a K estão normalmente associados a infecções ano-urogenitais sexualmente transmissíveis, podendo também causar conjuntivite, artrite, peri-hepatite; no caso da mulher grávida, pode ocorrer transmissão ao recém-nascido no momento do parto, causando conjuntivite, rinite e pneumonia neonatais (Mylonas, 2012; WHO, 2013). Entre estes, os genótipos E e F são os mais frequentemente identificados em indivíduos heterossexuais; o genótipo G foi associado a infecções anorretais de homens que fazem sexo com homens (“men who have sex with men”, MSM) (Nunes et al., 2013). Finalmente, os genótipos L1, L2 e L3 são responsáveis por uma infecção invasiva, o linfogranuloma venéreo que caracteriza-se pela formação de uma úlcera genital (uretra, endocolo ou ânus), enquanto ascende para os gânglios linfáticos inguinais, nos quais causa supuração; no caso da infecção anorretal, as estirpes LGV causam proctite (Carlson et al., 2008; WHO, 2013).

O amplo tropismo tecidual e o grande potencial para causar diversas patologias no Homem (Tabela 1), justificam que C. trachomatis seja considerada a principal causa bacteriana de infecções sexualmente transmissíveis (IST) nos países desenvolvidos (Mylonas, 2012; Nunes et al.,

7

2013); e, sendo de notificação obrigatória em diversos países, revelou-se como a infecção mais frequentemente notificada nalguns desses países (ECDC, 2014). Além disso e tal como todas as IST, C. trachomatis é um cofactor para a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH). Na ausência de tratamento, as infecções por C. trachomatis no tracto genital inferior podem propagar-se até ao tracto genital superior causando, na mulher, cervicite, doença inflamatória pélvica (DIP), gravidez ectópica, e infertilidade tubária e, no homem, epididimite (ECDC, 2014; Stephens et al., 2011; WHO, 2013). As patologias associadas à infecção por C. trachomatis podem resultar da resposta imunológica à própria infecção (Stephens, 2003). No entanto, em ambos os sexos e independentemente do genótipo envolvido, a maioria das infecções por C. trachomatis (cerca de 50% no homem e 70% na mulher) não causa qualquer sintoma (Seadi et al., 2002; Shaw et al., 2011). Esta situação favorece epidemiologicamente a propagação da infecção e assim, a sua elevada prevalência na população (Land et al., 2010).

Tabela 2- Relação entre genótipo, biovariedade, sexo acometido e doenças causadas pela infecção por C. trachomatis (Chernesky, 2005; Haggerty et al., 2010; Stephens et al., 2011; WHO, 2013).

Genótipo Biovariedade Sexo Doença

A – C Células

epiteliais Ambos Tracoma

D – K Células

epiteliais

Homem Uretrite, prostatite, epididimite, orquite Mulher Cervicite, uretrite, endometrite, salpingite, doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica L1 – L3 Células linfáticas Ambos Linfogranuloma venéreo

8

1.4.

Ciclo de desenvolvimento

O ciclo de vida das clamídias (Figura 2) inicia-se pela interacção do CE com a célula hospedeira, inicialmente de forma reversível, envolvendo interacções electrostáticas da bactéria com as microvilosidades da célula hospedeira e, posteriormente, por uma adesão irreversível a receptores da célula hospedeira (normalmente uma célula eucariota epitelial); tais receptores variarão consoante a estirpe de clamídia infectante e o tipo de célula hospedeira. Por outro lado, a capacidade de infectar eficientemente numerosos tipos de células não-fagocíticas de diversas espécies animais indica que as adesinas das clamídias, nomeadamente os glicosaminoglicanos, a MOMP, a OmcB e a PmpD devem reconhecer receptores específicos da célula hospedeira, como por exemplo o receptor da manose e o receptor de estrogénio (AbdelRahman e Belland, 2005; Carabeo e Hackstadt, 2001; Chen et al., 1996; Cocchiaro e Valdivia, 2009; Dautry-Varsat et al., 2005; Fadel e Eley, 2007; Menozzi et al., 2002; Moelleken e Hegemann, 2008; Su et al., 1996; Wehrl et al., 2004). O mecanismo exacto de internalização do CE é ainda pouco conhecido mas foi demonstrado que um factor multi-funcional do hospedeiro, a protein disulfide isomerase (PDI) está implicado nesse fenómeno. Após contacto com a membrana da célula hospedeira, o CE será capaz de libertar imediatamente efectores para o citosol da célula hospedeira através do T3SS e pensa-se que a PDI possa ser um dos activadores desses efectores, nomeadamente da Tarp (translocated actin recruiting protein) que seria essencial à internalização da bactéria pela capacidade de induzir a remodelação do citosesqueleto da célula hospedeira a partir dos locais de adesão (Abromaitis e Stephens, 2009; Beeckman e Vanrompay, 2010; Clifton et al., 2004; Jewett et al., 2006).

Forma-se então um endossoma/inclusão no citoplasma da célula hospedeira, cuja membrana é constituída pela própria membrana da célula hospedeira (Seadi et al., 2002). No interior da inclusão, o CE transforma-se em CR e este sofrerá diversos ciclos de replicação por fissão binária, sendo capaz de sintetizar o seu próprio DNA, RNA e proteínas mas obtendo energia, nutrientes e precursores biossintéticos da célula hospedeira (Liechti et al., 2013; Seadi et al., 2002). Durante este processo a inclusão aumenta de

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tamanho por albergar um número crescente de CR’s que, aproximadamente a meio do ciclo de infecção, diferenciam-se novamente em CE’s. No final do ciclo ocorre lise celular, com libertação de CE’s capazes de infectar de imediato novas células eucariotas e dar início a novos ciclos de replicação, ou extrusão da inclusão. A lise é um processo destrutivo que consiste na ruptura sequencial da inclusão e das membranas celulares levando à morte da célula hospedeira. A extrusão é um processo lento segundo o qual uma porção da inclusão é libertada deixando a inclusão e a célula hospedeira intactas (Hybiske e Stephens, 2007; Liechti et al., 2013; Valdivia, 2008).

Sob condições adversas de crescimento in vitro, o desenvolvimento normal do ciclo de C. trachomatis é interrompido e os organismos de Chlamydia podem entrar num estado de persistência. A infecção persistente foi definida como uma associação de longo prazo entre a clamídia e a sua célula hospedeira em que estes organismos permanecem em um estado de cultura viável porém negativa. Durante esta fase, ocorre o aparecimento de CR’s alargados e morfologicamente aberrantes que não se submetem à divisão celular bacteriana nem se diferenciam em CE’s, no entanto, continuam a replicação do seu DNA (Beatty et al., 1994b; Hogan et al., 2004). Esta infecção pode ser induzida por privação de nutrientes (tais como ferro, e aminoácidos), antibióticos, exposição interferão-gama, temperatura ou infecção de monócitos (Beatty et al., 1993; Clark et al., 1982; Coles et al., 1993; Kahane e Friedman, 1992; Koehler et al., 1997; Matsumoto e Manire, 1970; Raulston, 1997). A persistência in vitro é considerada reversível após a remoção do factor de stress, contudo, devido às respostas inflamatórias para infecções repetitivas e persistentes in vivo serem agressivas, existe a possibilidade de iniciarem-se eventos patogénicos irreversíveis que conduzem a sequelas crónicas de tracoma e infertilidade (Beatty et al., 1994a; Stephens, 2003).

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Figura 2- Representação esquemática do ciclo de vida de C.trachomatis. N- núcleo; G- Aparelho de Golgi; h- horas (Adaptado de Morais et al., 2013).

1.5.

Diagnóstico

A elevada prevalência das infecções por C. trachomatis e a ausência de sintomas claros e específicos na maioria dos infectados pela bactéria, tornam essencial o diagnóstico laboratorial precoce. A detecção precoce das infecções por C. trachomatis contribui para evitar as complicações clínicas a elas associadas, contribuindo para evitar os custos do respectivo tratamento (Manavi, 2006). As técnicas laboratoriais de diagnóstico de C. trachomatis evoluíram muito nas últimas décadas, desde a cultura celular, os testes serológicos ou os testes de detecção de antigénio, até aos mais recentes testes de amplificação génica (Chernesky, 2005; WHO, 2013).

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1.5.1. Propagação de C. trachomatis em cultura celular

A propagação de C. trachomatis em cultura celular foi padronizada na década de 1970, tornando-se numa ferramenta útil para o isolamento de microrganismos que não cresciam em meios de cultura artificiais; entre esses microrganismos encontram-se as clamídias (WHO, 2013). As linhagens celulares mais utilizadas para a cultura de C. trachomatis são as células McCoy e as HeLa229, nas quais se podem identificar as inclusões intracelulares características ao fim de 48 horas pós inoculação, preferencialmente por imunofluorescência com recurso a anticorpos monoclonais específicos (Chernesky, 2005; Manavi, 2006).

A cultura de C. trachomatis ainda é o método de escolha quando existe suspeita de abuso sexual e a pesquisa é requerida por questões médico-legais, devido ao facto de ser o único método em que se confirma a presença de organismos infecciosos viáveis (Chernesky, 2005; Mylonas, 2012; Papp et al., 2014).

A vantagem do isolamento de C. trachomatis por cultura celular é a preservação do microorganismo para estudos adicionais, de investigação ou terapêuticos, como por exemplo a avaliação da resistência aos antimicrobianos. Contudo, não existem evidências de fenómenos de aquisição estável de mecanismos de resistência em Chlamydia e como tal não existe necessidade de efectuar este método por rotina (WHO, 2013). Por outro lado, o sucesso deste método depende das condições de colheita, transporte e conservação que permitam a viabilidade do microrganismo. Assim, actualmente, a cultura apenas é efectuada em laboratórios de referência e de investigação fundamental (Seadi et al., 2002; WHO, 2013).

1.5.2. Testes serológicos

As técnicas serológicas mais comuns, como a fixação de complemento, a imunofluorescência indirecta (IFI) e ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), podem detectar anticorpos anti-clamídia. No caso da infecção humana por C. trachomatis, são produzidos anticorpos para diferentes determinantes

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antigénicos das clamídias, nomeadamente para o LPS e para a MOMP (Papp et al., 2014; WHO, 2013).

A maior desvantagem dos testes serológicos é a possibilidade de ocorrerem reacções cruzadas. Ou seja, uma pessoa pode ser infectada por diferentes espécies de clamídia ao longo da vida e quando lhe são detectados anticorpos anti-clamídia, estes podem dever-se a uma infecção anterior por qualquer espécie de clamídia, já que muitos dos determinantes antigénicos são comuns às várias espécies de clamídia; assim, é difícil distinguir uma infecção presente de uma infecção passada. Por outro lado, muitas infecções por clamídia, nomeadamente por C. trachomatis, são meramente locais e como tal podem não promover uma resposta imunitária com produção de anticorpos detectável pelos testes laboratoriais, favorecendo o risco de obtenção de resultados falso-negativos (Papp et al., 2014; Persson, 2002; Proto et al., 2013).

O serodiagnóstico pode ser efectuado no caso dos recém-nascidos, sendo considerados positivos se ocorrer subida do título de IgG em duas titulações com duas semanas de intervalo e quando são detectadas IgM. No caso de infecções sistémicas, como o LGV, ou no caso de mulheres inférteis, a serologia pode ser um indicador de infecção. Contudo, os testes serológicos não são recomendados para o diagnóstico de infecções urogenitais, sobretudo quando assintomáticas (Mylonas, 2012; Papp et al., 2014; Proto et al., 2013; WHO, 2013).

1.5.3. Detecção de Antigénio

Os métodos de detecção de antigénio de C. trachomatis, como a imunofluorescência directa (IFD) e os ensaios imunoenzimáticos (EIA) baseiam-se na utilização de anticorpos monoclonais anti-LPS ou anti-MOMP de C. trachomatis marcados (por exemplo pela fluoresceína no caso da IFD) que se ligam aos CE’s que existam em esfregaços da uretra, do endocolo ou da conjuntiva (Black, 1997; Mylonas, 2012; WHO, 2013). Os testes IFD baseados em anticorpos monoclonais anti-LPS podem ser de difícil leitura, devido à distribuição desigual do LPS na membrana externa. Os anticorpos monoclonais

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anti-MOMP de C. trachomatis promovem uma fluorescência de melhor qualidade porque a MOMP está distribuída uniformemente na membrana dos CE’s e CR’s. As desvantagens do método em termos de diagnóstico são a dificuldade em processar um elevado número de amostras, a necessidade de um técnico experiente em microscopia de fluorescência, e as baixas sensibilidades (o número de CE que é necessário observar para que um teste seja considerado positivo implica uma infecção aguda; podem ocorrer falso-negativos) e especificidade (podem ocorrer ligações inespecíficas do anticorpo a outros microrganismos; podem ocorrer falso-positivos) (Chernesky, 2005; Østergaard, 2002; WHO, 2013).

Os testes EIA têm a vantagem de poderem ser automatizados, facilitando o processamento de elevados números de amostras. Estes testes podem basear-se na detecção de LPS, com risco de ligações cruzadas com o LPS de outras bactérias e, por isso promover resultados falso-positivos; ou podem basear-se na MOMP, com menor risco de reacção cruzada. Contudo, a performance dos testes EIA em termos de especificidade e sensibilidade faz com que a sua utilização não seja recomendada (Manavi, 2006; Papp et al., 2014; Seadi et al., 2002).

1.5.4. Testes de amplificação de ácidos nucleicos (“Nucleic Acids Amplification Tests”, NAATs)

A partir da década de 1990, os testes de amplificação e detecção de ácidos nucleicos encontraram ampla aplicação ao diagnóstico da infecção por C. trachomatis. Devido à sua alta sensibilidade e especificidade, e à capacidade de analisar uma grande variedade e número de amostras, os testes de amplificação de ácidos nucleicos, NAATs, tornaram-se os testes de primeira escolha para o diagnóstico da infecção genital por C. trachomatis (WHO, 2013).

Os NAATs detectam rápida e especificamente pequenas quantidades de C. trachomatis presente em amostras biológicas, pela amplificação do respectivo DNA ou RNA, com obtenção de milhares de cópias de um segmento de DNA específico da bactéria, pela utilização de iniciadores (primers) de uma

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sequência de DNA alvo exclusiva de C. trachomatis (Chernesky, 2005; Papp et al., 2014).

Estão disponíveis vários NAATs, nomeadamente baseados na reacção em cadeia da polimerase (PCR) e em particular na PCR em tempo real. A PCR dirigida ao plasmídeo de C. trachomatis é considerada a mais sensível porque existem várias cópias do DNA em contraponto com a PCR dirigida ao gene ompA, do qual existe uma única cópia em cada genoma (Black, 1997; Østergaard, 2002).

Os NAATs têm variadas vantagens em termos de diagnóstico laboratorial, nomeadamente não dependerem da viabilidade dos microrganismos para o sucesso da detecção dos mesmos e o reduzido número de microrganismos necessário para detectar uma infecção (em teoria basta um). Assim, os NAATS caracterizam-se pelo seu elevado desempenho em termos de sensibilidade e especificidade (por utilização de sondas específicas que hibridam exclusivamente com o DNA alvo) e pela sua adequação ao diagnóstico laboratorial em amostras biológicas não invasivas, como a urina. O risco de obtenção de resultados falso-negativos devido à presença de inibidores foi minimizado, nos testes comerciais que encontram-se disponíveis, pela inclusão de controlos internos que distinguem os resultados verdadeiro-negativos dos falso-verdadeiro-negativos por inibição da reacção de PCR e que obrigam a tratamentos especiais das amostras para eliminar os inibidores. Igualmente o risco de falso-positivos foi minimizado pela utilização da base uracilo (em substituição da timina) e pelo desenvolvimento de equipamentos automatizados em ambiente fechado. Actualmente, pode considerar-se que a maior desvantagem dos NAATs para C. trachomatis seja o seu custo (Manavi, 2006; Papp et al., 2014; WHO, 2013).

1.6.

Epidemiologia

As infecções urogenitais por C.trachomatis são a IST bacteriana mais frequente no mundo, sendo que a prevalência pode variar entre 1 e 40%, consoante a população em estudo. Tal como acontece com todas as IST, os

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jovens e as pessoas com maior número de parceiros sexuais são os principais grupos de risco, pelo que é sobretudo diagnosticada em mulheres jovens nos grupos etários dos 15 aos 19 anos (2.619 / 100.000 indivíduos) e dos 20 aos 24 anos (2.570 casos / 100.000 indivíduos) (CDC, 2003; Mylonas, 2012).

Em 2008, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou a incidência das infecções por C. trachomatis em 105,7 milhões de novos casos por ano e alertou para o facto da taxa de infecção ter vindo a aumentar ao longo dos anos; de facto, em 2005 a incidência era de 101,5 milhões (WHO, 2012, 2013). Nos Estados Unidos da América (EUA), a prevalência de infecção por C. trachomatis em adultos jovens com idade de 18 a 26 anos é de 4,19%, com as mulheres a terem um risco de adquirir a infecção 3,5 vezes superior aos homens (Mylonas, 2012). O “Centers for Disease Control” (CDC) dos EUA reportou, em 2002, mais de 800.000 novos casos de infecção por C. trachomatis; em 2006, mais de 1 milhões de novos casos, com uma taxa de incidência de 347.8 casos por 100.000 habitantes e em 2010, registou-se um novo aumento dos novos casos reportados, para 1.307.893 (426.0 casos por 100.000 habitantes) (CDC, 2003, 2007; Mylonas, 2012).

Na Europa, a prevalência estimada de infecção por C. trachomatis varia de acordo com a população e com o país, nomeadamente devido às diferenças de recursos que são alocados à vigilância e à prevenção em cada país, assim como à diversidade de sistemas de vigilância e notificação nos diferentes países da Comunidade Europeia (ECDC, 2014; Marconi et al., 2012). O “European Centre for Disease Prevention and Control” (ECDC) reportou para a Europa 385.307 novos casos de infecção por Chlamydia em 2012, sendo mais frequente (40%) na faixa etária dos 20 aos 24 anos. É de realçar que apesar de 26 países europeus notificarem anualmente os casos de infecção por C. trachomatis, 84% dos casos foram notificados por apenas quatro países (Dinamarca, Noruega, Suécia e Reino Unido), o que reflecte as diferenças dos sistemas de vigilância entre os diferentes países Europeus. A tendência geral na Europa de 1990 a 2009 (para o conjunto de países que notificaram casos neste período de tempo) foi de subida; contudo, entre 2008 e 2012 a incidência manteve-se globalmente estável (ECDC, 2014).

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A real tendência epidemiológica do número de casos de infecção por C. trachomatis é de difícil interpretação dado que na última década o rastreio e o diagnóstico passaram a ser efectuados sobretudo (ou exclusivamente, dependendo dos países) por NAATs, cuja sensibilidade e especificidade são muito elevadas. Assim, a comparação com os dados relativos a períodos de tempo anteriores, nos quais se usavam métodos menos sensíveis e específicos, é difícil (ECDC, 2014; Land et al., 2010).

Em Portugal a vigilância só foi instituída em 2014 através do despacho n.º 5681-A/2014, de 21 de Abril, publicado em suplemento ao Diário da República, 2.ª série, parte C, n.º 82, de 29 de Abril de 2014 e posterior Declaração de rectificação do Ministério da Saúde, Direção-Geral da Saúde: n.º 609-A/2014 publicado no suplemento ao Diário da República, 2.ª série, parte C, n.º 113 de 16 de Junho de 2014; como tal ainda não existem dados sobre a prevalência ou incidência das infecções por C. trachomatis em Portugal.

Relativamente à epidemiologia molecular, e com base na variabilidade genética do gene ompA (descrita na secção 1.2. Biologia) os genótipos A e B são os mais frequentemente identificados nas regiões em que o tracoma é endémico, (países em vias de desenvolvimento da América Latina, África Subsariana e Ásia), enquanto o genótipo C é raramente identificado, tendo sido descrito em comunidades remotas da Austrália do Norte (Nunes e Gomes, 2014). Os genótipos E e F (e, em menor extensão, o D) predominam nas IST por C. trachomatis detectadas em populações heterossexuais, nas quais causam cerca de 50% dos casos (Nunes et al., 2010). Por outro lado, no caso da infecção anorrectal em MSM, os genótipos D, G e J parecem mais frequentes e foi mesmo estabelecida uma associação estatisticamente significativa entre um determinado polimorfismo genómico do genótipo G e o tropismo rectal (Christerson et al., 2012). Finalmente, os genótipos L1 a L3, responsáveis por LGV, patologia endémica em África, Sudeste asiático, América do Sul e Caraíbas, têm vindo a ser identificados, desde 2003, nos países mais desenvolvidos, nomeadamente na Europa e nos Estados Unidos (Mabey e Peeling, 2002). De facto, desde há cerca de dez anos que tem sido publicada a ocorrência de surtos nestes países relacionados com uma variante em particular, o genótipo L2b (de Vrieze e de Vries, 2014).

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2. Objectivos

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Os objectivos desta dissertação são:

Propagação de estirpes de C. trachomatis em cultura celular a partir de amostras biológicas previamente identificadas como infectadas por um método comercial de diagnóstico.

Identificação de genótipos ompA de estirpes de C. trachomatis responsáveis por diferentes situações clínicas em pessoas infectadas da região de Lisboa.

Avaliação da similaridade das sequências génicas que codificam o principal antigénio de C. trachomatis em diversos isolados clínicos pertencentes ao mesmo genótipo ompA.

Estudo de identificação de isolados de clones em estirpes de referência e em isolados clínicos de C. trachomatis.

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3. Materiais e Métodos

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3.1. Propagação de estirpes de Chlamydia trachomatis

Estirpes de referência de Chlamydia trachomatis e amostras biológicas (n=95) (exsudados uretrais, endocervicais, orofaríngeos, conjuntivais, anorretais ou de lesão urogenital) conservadas em 2mL de 2SP (tampão sucrose-fosfato) a –80ºC e previamente identificadas no laboratório de acolhimento como infectadas por C. trachomatis pelo método comercial Cobas Amplicor PCR 4800 (Roche Molecular Systems, Branchburg, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, foram inoculadas em cultura celular.

3.1.1. Cultura celular

Foram utilizadas duas linhas celulares aderentes e contínuas, Hela 229 e McCoy, para a propagação de estirpes de C. trachomatis; as primeiras para a propagação de estirpes clínicas e as segundas para a obtenção de clones. Estas linhas celulares foram mantidas em cultura em frascos T175 centímetros2

(cm)com 50 mililitros (mL) de meio de cultura completo (Anexo I). As culturas celulares foram passadas para novos frascos por um processo que envolve a rejeição do meio de cultura, duas lavagens com 10mL de DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, gibco®, Invitrogen 14190), dissociação pela acção da tripsina (gibco®, Invitrogen 15090) (5mL) durante breves minutos (m), suspensão em 10mL de meio de cultura completo e sua transferência parcial para um novo frasco de cultura celular. As culturas celulares foram mantidas numa estufa a 36,5 graus (°C) numa atmosfera com 5% dióxido de carbono (CO2).

3.1.2. Inoculação de estirpes em células Hela 229

A inoculação de estirpes foi realizada utilizando técnicas anteriormente descritas (Borges et al., 2010, 2013). De forma sucinta, 24 horas previamente à inoculação foram preparadas culturas celulares Hela 229 em placas de 24 poços onde foram colocadas lamelas de vidro com 12 milímetros (mm) antes da distribuição duma suspensão celular com 2x105 _{células /mL. Para preparar}

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esta suspensão foi necessário efectuar uma contagem de células de um ou mais frascos (50 microlitros (µL)) de suspensão celular em 200µL de HBSS (1X) (Hanks’ Balanced Salt Solution, gibco®, Invitrogen 14185), diluída por sua vez a 1:2 numa solução Trypan Blue 0,4% (Sigma, Steinheim, Alemanha), sendo usados 2 x 10µL desta diluição para contagem numa câmara Neubauer (Buffalo, EUA) com recurso a um microscópio óptico (Zeiss Axioskop 40)). No dia seguinte, a cultura celular em placa foi observada num microscópio óptico invertido Leica DMIL Led (objectiva 10x) para confirmação da obtenção de um tapete celular confluente, antes de aspirar o meio de cultura celular e de inocular a amostra biológica em quatro poços (250µL/poço) (Figura 3). As placas inoculadas foram centrifugadas (Eppendorf Centrifuge 5810R, Hamburgo, Alemanha) durante 1hora (h) a 32°C e a 3200 rotações por minuto (rpm). As placas foram incubadas na estufa a 36,5°C, 5% CO2 durante 1h,

sendo então aspirado o inóculo de cada conjunto de quatro poços e distribuído meio enriquecido (Anexo I). O desenvolvimento das inclusões foi regularmente monitorizado (observação do tamanho das inclusões) em microscópio óptico invertido e, finalmente, o sucesso da cultura de C. trachomatis foi efectuado por coloração de uma das lamelas com recurso a um anticorpo monoclonal marcado pela fluoresceína.

Figura 3- Esquema de inoculação de amostras biológicas (A) infectadas por

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3.1.3. Confirmação de cultura de Chlamydia trachomatis

O meio de cultura enriquecido do poço contendo a lamela de vidro foi aspirado e colocou-se aproximadamente 1mL de metanol para proceder à fixação da preparação. Após alguns segundos (s), as lamelas foram retiradas dos poços e colocadas, com a face das células viradas para cima, sobre gotas de cola de vidro previamente distribuídas em lâminas de vidro marcadas com a identificação das amostras em estudo. Uma vez coladas, foi colocada uma gota de anticorpo monoclonal marcado pela fluoresceína (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, França) sobre cada lamela e procedeu-se a uma incubação de 30m à temperatura ambiente numa caixa humidificada e ao abrigo da luz. Foi efectuada uma lavagem com água destilada e, após secagem, foi colocada uma gota de glicerol (Euroimmun, Seekamp, Alemanha) e uma lamela antes da observação em microscópio de fluorescência (Zeiss Axioskop 2 plus) com objectiva x40, tendo sido consideradas positivas todas as culturas em que foram observadas inclusões intracelulares. O número e tamanho das inclusões foram registados, tendo as culturas sido propagadas até atingiram o nível máximo de infecção (+++++, 100% de células infectadas) sendo sempre conservadas a –80°C alíquotas das passagens intermédias com menor número de inclusões.

3.1.4. Recuperação de culturas de C. trachomatis

As culturas de C. trachomatis foram raspadas para recuperação e conservação de estirpes. Neste procedimento aproximadamente 800µL de meio dos remanescentes três poços do conjunto de quatro foram rejeitados, tendo sido deixados ~200 µL, e tendo-se procedido à raspagem da cultura celular infectada com uma pipeta descartável de 2mL. Aspiraram-se os raspados de cada estirpe para um único tubo de centrífuga esterilizado para sonificação indireta (tubo mergulhado em água na qual se encontra a sonda de ultrassons) (Vibra-Cell B/4840, Bioblock Scientific, Dlkirch, França) durante 7m, 90% de ciclo activo, potência 8. Posteriormente, os tubos foram centrifugados durante 7m, a 700rpm, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi aspirado e homogeneizado com igual volume de 2SP para conservação a –80°C.

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3.2. Isolamento de Clones de estirpes de C. trachomatis

(Plaque Assay)

Para o isolamento de clones de estirpes de C. trachomatis foi utilizada uma técnica adaptada das descritas por vários autores (Carlson et al., 2008; Matsumoto et al., 1998) e que se baseia na formação de placas de destruição celular devido ao efeito citotóxico provocado por C. trachomatis.

Foram realizados 13 ensaios laboratoriais utilizando cinco estirpes de referência (B-Har 36; D-UW3; C-TW3; E-Bour e K-UW 31) e três estirpes clínicas da colecção do laboratório (CS76/14; CS72/14 e CS1314/13).

Foram preparadas placas de 6 poços com linhas celulares McCoy (2x105 células /mL) no dia anterior à inoculação de estirpes de C. trachomatis. No dia da inoculação foi confirmada, em todas as placas, a presença de uma monocamada celular confluente por observação ao microscópio óptico invertido Leica DMIL Led (objectiva 10x). As amostras foram diluídas em SPG (tampão de sacarose-fosfato-glutamato) de forma a obter placas / UFI (Unidades Formadoras de Inclusões) isoladas e promovidas pela propagação a partir de uma única inclusão. Antes da inoculação (com 2mL/poço das diluições em SPG das estirpes de C. trachomatis), as placas foram lavadas com 2mL/poço de HB Hanks (Hepes-buffered Hanks media, Anexo II). As placas foram ligeiramente agitadas manualmente para que a distribuição do inóculo fosse homogénea por toda a camada celular e centrifugadas durante 1h, a 1600rpm, à temperatura ambiente. Posteriormente foram incubadas durante 30m a 36,5°C, 5% CO2.

Durante a centrifugação e incubação foram preparados os meios Non-Agarose Overlay media e Non-Agarose Overlay media (Ver Anexo II), sendo o Agarose Overlay media mantido a 44°C num banho-maria com agitação. O inóculo das placas foi rejeitado e foi colocado 2mL/poço de Agarose Overlay media e 2mL/poço de Non-Agarose Overlay media, tendo as culturas sido incubadas a 36,5°C, 5% CO2 até serem observadas (objectiva x20, microscópio

óptico invertido Leica DMIL Led) placas de destruição celular causadas por C. trachomatis. Assim, o Non-Agarose Overlay media foi substituído a cada 3 dias para manter as culturas em condições óptimas de crescimento. Uma vez

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visualizadas placas de citotoxicidade ou atingidos os 15 dias após inoculação, procedeu-se à revelação das placas de citotoxicidade adicionando 2mL/poço de 0,03% Neutral Red Agarose Overlay media (Anexo II). As placas de citotoxicidade (pontos transparentes num fundo avermelhado de células vivas) foram contadas a olho nu (Figura 4) com o auxílio de uma mesa de luz, num máximo de 4h após adição de 0,03% Neutral Red Agarose Overlay media. As placas de citotoxicidade que se encontravam isoladas foram picadas, transferidas para tubos com 300µL de SPG e conservadas a –80°C.

Figura 4- Placa de 6 poços revelada pela adição de 0,03% Neutral Red Agarose media. É possível

visualizar placas de citotoxicidade promovidas pela estirpe de referência C-TW3 de C. trachomatis.

3.2.1. Propagação de clones de C. trachomatis

Foram propagados 10 clones do isolado clínico CS76/14. Sucintamente, foram preparadas placas de 96 poços com células McCoy (3,8x104 células/poço) no dia anterior à inoculação. Os clones conservados em SPG a – 80ºC foram homogeneizados com recurso ao Eppendorf Thermomixer® (Thermo Fisher Scientific) durante 2m a 1400rpm seguindo-se uma pequena centrifugação de 5m a 1900rpm à temperatura ambiente para eliminação dos detritos celulares. Após confirmação da confluência do tapete celular por observação ao microscópio óptico invertido, efectuou-se uma lavagem das células McCoy com 100µL/poço de HB Hanks sendo, posteriormente,

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inoculados quatro poços com o sobrenadante de cada clone (100µL/poço). As placas de 96 poços foram centrifugadas durante 1h, 1600rpm, à temperatura ambiente e incubadas a 36,5°C 5% CO2 durante 30m. Posteriormente, o

inóculo foi rejeitado e foram colocados 100µL/poço de meio DMEM (gibco®, Invitrogen 31966) com 1 micrograma (µg)/mL de cicloheximida (Sigma-Aldrich C7698). As culturas dos clones incubaram a 36,5°C 5% CO2 durante 48h, ao fim das quais, cada conjunto de poços / clone foram raspados com 100µL SPG/poço, tendo sido sonificados os 400µL para nova inoculação. Cada clone foi reinoculado pelo menos três vezes antes de serem inoculados em dois poços de uma placa de 24 poços onde foi efectuado o controlo do sucesso da propagação por observação de inclusões com a objectiva de x40 no microscópio invertido. As culturas foram raspadas em 400µL SPG, dos quais 200µL foram usados para extracção de DNA (ver secção 3.3.1. Extracção de DNA) e os restantes 200µL foram conservados a –80 °C.

O DNA extraído de cada clone do isolado clínico CS76/14 e nas estirpes de referência E-Bour e K-UW31foi usado para amplificação e sequenciação do gene CT135 como marcador da mistura de clones, já que dados da análise por sequenciação de nova geração das duas estirpes de referência no laboratório tinham revelado uma mistura clonal em que o gene estava completo, truncado ou mesmo ausente. A amplificação foi efectuada por PCR em que foram utilizados os primers CT135-1 (5’-CAGAAAGCCGTGCTGAATGGTTC-3’) e CT135-2 (5’-TCCGCCGCTATGAGCAGAAAAT-3’) e que compreendeu um ciclo inicial de desnaturação a 95ºC durante 5 minutos e uma hibridação a 57ºC durante 1 minuto às quais seguiram-se 35 ciclos de extensão (72ºC, 1 minuto e 45 segundos), desnaturação (94ºC, 30 segundos) e hibridação (57ºC, 30 segundos) e um ciclo final de extensão a 72ºC durante 10 minutos. A sequenciação foi executada como descrito na secção 3.3.4. Sequenciação dos produtos de PCR purificados utilizando os primers 1, 2 e CT135-3 (5’-CTATGTTTGTTGCCATTGTC-CT135-3’) e a sua análise foi efectuada por meio do software LaserGene 9 Core Suite (DNASTAR). O DNA extraído dos clones do isolado clinico CS76/14 e da estirpe de referência K-UW31 foram também utilizados para determinar o genótipo ompA como descrito na secção 3.3.

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3.3. Tipagem ompA

As amostras clínicas positivas para C. trachomatis usadas no presente estudo fazem parte da colecção do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Das 389 amostras analisadas, 164 (42,2%) foram identificadas em mulheres e 225 (57,8%) em homens. As mulheres infectadas tinham idades entre os 13 e os 58 anos, sendo que 97 (59,1%) eram menores de 25 anos e 67 (40,8%) tinham mais de 25 anos; uma estirpe foi identificada numa recém-nascida. Os homens apresentavam idades entre os 16 e os 67 anos, sendo que 58 (25,8%) tinham idades inferiores a 25 anos e 167 (74,2%) tinham mais de 25 anos; três estirpes foram identificadas em recém-nascidos. O tipo de amostra biológica predominante no estudo foi a urina 69,2% (269/389).

3.3.1. Extracção de DNA

O DNA das amostras clínicas positivas para C. trachomatis, dos raspados de culturas de amostras clínicas ou de estirpes de referência foi extraído com recurso ao método comercial NucliSENS® easyMAG® (BioMérieux, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Quando a amostra biológica foi a urina usaram-se 3mL, quando foram exsudados ou raspados de culturas em 2SP usaram-se 250µL.

3.3.2. Amplificação do gene ompA por nested-PCR

A amplificação foi efectuada com recurso a um termociclador Gene Amp® (Applied Biosystems) por uma técnica de nested-PCR em uso no laboratório, adaptada de Lan et al. (1994). No primeiro PCR foram utilizados os primers NLO e NRO (Tabela 2) que compreendeu um ciclo inicial de desnaturação a 95ºC durante 5 minutos e uma hibridação a 55ºC durante 1 minuto às quais se seguiram 35 ciclos de extensão (72ºC, 1 minuto e 25 segundos), desnaturação (94ºC, 30 segundos) e hibridação (55ºC, 30 segundos) e um ciclo final de extensão a 72ºC durante 10 minutos. No segundo PCR foram utilizados os primers PCTM3 e Sero2A (Tabela 2), sendo o

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programa de PCR idêntico ao primeiro, excepto na temperatura de hibridação que foi 50ºC. A mistura reaccional do primeiro PCR (15µL) continha 5µL de dNTPs (dATP, dTTP, dGTP e dCTP) a 1milimolar (mM) (Bioline), 2,5µL de OptiBuffer 10x (Bioline), 1,4µL de MgCl2 a 50mM (Bioline), 1µL de cada primer

a 25pmol/µL (Thermo Fisher Scientific), 0,37µL de Tag DNA polimerase Bio-x-act™ (Bioline) a 4U/µL e 3,73µL de água destilada (gibco®, Thermo Fisher Scientific 10977) aos quais adicionaram-se 10µL de DNA. A composição da mistura reaccional do segundo PCR (23µL) foi idêntica à do primeiro PCR excepto na quantidade de água (11,73µL) e na de produto amplificado no 1º PCR (2µL). Cada sessão de amplificação no termociclador incluiu um controlo positivo (uma amostra de DNA de uma estirpe L3 de C. trachomatis) e um controlo negativo (água).

Tabela 2- Primers utilizados na amplificação do gene ompA por nested-PCR.

Gene Primer Sequência (5’- 3’)

Tamanho do fragmento (pb) Referência Bibliográfica ompA NLO ATGAAAAAACTCTTGAAATCG 1114 Lan et al., 1994 NRO CTCAACTGTAACTGCGTATTT PCTM3 TCCTTGCAAGCTCTGCCTGTGGGGAATCCT 1014 Sero2A TTTCTAGATTTCATCTTGTT pb- par de bases

O sucesso da amplificação do gene ompA foi verificado por electroforese em gel de agarose a 1%, tendo sido usados 7µL de cada produto de PCR e 2µL de loading buffer. O SYBR®Safe (Invitrogen™) foi incorporado no gel para permitir a visualização de DNA quando o gel é observado num transiluminador com luz ultravioleta. Foi ainda colocado um marcador (Bioline, Hyper Ladder II H2) em que é conhecido o tamanho dos fragmentos que origina. A electroforese executou-se a uma voltagem constante de 90 volts durante 1 hora. A figura 5 ilustra uma electroforese em gel de agarose.

Sempre que não ocorreu amplificação do gene ompA numa amostra biológica positiva para C. trachomatis, procedeu-se à repetição do nested-PCR.

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Figura 5- Electroforese em gel de agarose após nested-PCR do gene ompA de C. trachomatis.

3.3.3. Purificação dos produtos de PCR

Os produtos de PCR positivos foram purificados com o ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Affymetrix); este processo visa remover nucleótidos e primers em excesso derivados do nested-PCR. Sumariamente, adicionaram-se 2µL de ExoSAP-IT a 5µL de produto de PCR e deixou-se a enzima degradar os nucleótidos e primers em excesso a 37°C durante 15m, inactivando-se seguidamente a enzima a 80°C durante 15m.

3.3.4. Sequenciação dos produtos de PCR purificados

A reacção de sequenciação foi executada numa mistura reaccional de 10µL contendo 2,5µL de Big Dye (Applied Biosystems), 0,75µL de tampão de sequenciação 5x (Applied Biosystems), 1µL de primer a 5pmol/µL (Thermo Fisher Scientific), 3,75µL de água destilada (gibco®, Thermo Fisher Scientific 10977-035) e 2µL de produto de PCR. A concentração de produto de PCR purificado a adicionar foi ajustada com água destilada de acordo com a intensidade da banda observada na electroforese em gel de agarose. Os

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primers utilizados para sequenciação foram o ompA-1 e o Sero2A (Tabela 3). A reacção de sequenciação decorreu num termociclador Gene Amp® (Applied Biosystems) de acordo com o programa descrito na tabela 4.

Tabela 3- Primers utilizados na sequenciação de produtos purificados do PCR ompA de

C. trachomatis.

Gene Primer Sequência (5’- 3’) Referência Bibliográfica

ompA

ompA-1 TTATGATCGACGGAATTCT Lan et al., 1994 Sero2A TTTCTAGATTTCATCTTGTT Nunes et al.,

2009

Tabela 4- Programa de sequenciação de produtos de PCR.

Fase Temperatura Tempo Ciclos

Desnaturação inicial 96 °C 30s 1x Desnaturação 96 °C 10s 25x Hibridação 50 °C 5s Extensão 60 °C 4m

Posteriormente, as amostras foram enviadas para a Unidade de Tecnologia e Inovação – Sequenciação (UTI – Seq) do Instituto Superior de Saúde Doutor Ricardo Jorge onde decorreu a sequenciação pelo método de Sanger (Sanger et al., 1977).

3.3.5. Análise das sequências do gene ompA

As sequências do gene ompA das estirpes em estudo vindas da UTI-Seq foram tratadas (análise manual das sequências no laboratório) com recurso ao programa SeqBuilder (DNASTAR) e posteriormente alinhadas com as