CLART
PAPILOMAVIRUS HUMANO 2
GENOTIPAGEM DE PAPILOMAVIRUS HUMANO
POR IDENTIFICAÇÃO GENÓMICA
CLART® HPV2 está sob a proteção de 2 famílias de patentes que correspondem aos pedidos de Patentes Interncionais PCT WO2007017699 e WO2011116797, e que incluem membros regionais e nacionais em diferentes territórios, incluindo patentes concedidas em Espanha, Rússia, China e Israel, e aplicações de patente em utilização na Europa, Brasil, Canadá, India e México.
CLART® e CLART-Strip® são marcas registadas da GENOMICA.
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
www.genomica.es
ÍNDICE:
1. QUADRO DE SÍMBOLOS 2. DESCRIÇÃO
3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO
3.1. REAGENTES PARA EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO
3.2.REAGENTES DE VISUALIZAÇÃO
3.3.OUTROS COMPONENTES
4. MATERIAL ADICIONAL 4.1.REAGENTES E MATERIAL
4.2.EQUIPAMENTO
5. RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO 5.1.RECOMENDAÇÕES GERAIS
5.2.PRECAUÇÕES PARA A VISUALIZAÇÃO
6. RECOLHA DE AMOSTRAS 6.1.ESFREGAÇO
6.2.SUSPENSÕES CELULARES
6.3.TECIDO FIXADO EM FORMOL E INCLUÍDO EM PARAFINA
7. PROTOCOLO DE TRABALHO 7.1.EXTRACÇÃODOADNDOHPV 7.1.1. Extração manual 7.1.2. Extração automática
7.2.REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO
7.3.VISUALIZAÇÃO DO PRODUTO AMPLIFICADO PARA CLARTSTRIPS (CS) 8. LEITURA DE RESULTADOS
9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE TRABALHO 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. QUADRO DE SÍMBOLOS
Ler por favor as instruções de manipulação
Prazo de validade
Dispostivo para diagnóstico in vitro
Código de lote
Conservar à temperatura ambiente
2. DESCRIÇÃO
Baseado na amplificação de fragmentos específicos do genoma viral e sua hibridização com sondas específicas para cada tipo de HPV, o dispositivo CLART
PAPILLOMAVIRUS Humano 2 é
capaz de detetar infeções e co-infeções até 35 genótipos de HPV a partir de uma única amostra (num único tubo). Esta abordagem apresenta várias vantagens:
• A sua elevada sensibilidade permite a deteção de quantidades mínimas de ADN Viral.
• A sua elevada especificidade permite a deteção de genótipos de HPV específico, por reconhecimento de uma sequência altamente conservada do genoma viral.
• Este teste é facilmente executado num laboratório hospitalar.
• Deteta rapidamente a presença dos 35 tipos de HPV com maior relevância clínica em poucas horas.
O dispositivo CLART
PAPILOMAVIRUS Humano 2 deteta a presença de 35 tipos (6, 11, 16, 18,
26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 e 89) de HPV mais relevantes clinicamente (Figura 1) em diferentes tipos de amostras (esfregaços, suspenções celulares e tecidos fixados em formol ou parafina)
A deteção dos diferentes genótipos HPV é conseguida por amplificação por PCR de um fragmento de 450 pb região L1, altamente conservada do vírus. Esta sequência altamente conservada apresenta pequenas variações entre os diferentes tipos de HPV o que permite a sua identificação genómica por reconhecimento do ADN viral com sondas específicas. Desta forma assegura-se a especificidade da detecção.
A deteção do produto amplificado por PCR é efetuada através de uma nova plataforma tecnológica baseada em microarrays de baixa densidade: CLART® (Clinical Array Technology). A plataforma baseia-se num princípio muito simples, mas muito rentável. Consiste em incluir um microarray no fundo de um poço de placa microtitulada (CLART® Strip-CS) (Figura 1), este sistema simplifica consideravelmente o processo de hibridização e visualização quando comparado com os sistemas de microarrays clássicos.
Figura 1. CLART® Strip CS em formato de tiras de 8 poços
Durante o PCR os produtos amplificados são marcados com biotina. Estes produtos marcados, hibridizam com as respetivas sondas específicas que se encontram imobilizadas na superfície do microarray. Depois de incubar com o conjugado estreptavidina-peroxidase, este liga-se à biotina conferindo aos produtos amplificados e hibridizados, atividade de peroxidase. Na presença de o-Dianisidina, a atividade da peroxidase metaboliza este composto, formando um precipitado insolúvel nos locais onde ocorreu a hibridização (Figura 2)
3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DA EMBALAGEM O dispositivo CLART
PAPILOMAVIRUS Humano 2 contém reagentes suficientes para a extração e
análise do ADN de 48 ou 96 amostras clínicas. Os reagentes incluídos na embalagem estão agrupados em duas caixas, uma vez que devem ser armazenados a temperaturas diferentes. Todos os reagentes são estáveis nas condições indicadas de conservação até à data de validade indicada.
Figura 2: Esquema do método de visualização. As sondas, imobilizadas na superfície, hibridizam com os produtos de amplificação complementares marcados com biotina. O conjugado HRP (estreptavidina de rábano, HorseRadish Peroxidase) é adicionado à reação e a componente estreptavidina do conjugado liga-se à biotina, conferindo ao complexo hibridizado atividade de peroxidase. Finalmente o substrato o-Dianisidina é adicionado e é metabolizado pela ação da HRP, formando-se um precipitado insolúvel no local da hibridização.
3.1. Reagentes para extracção, purificação e amplificação
• O dispositivo CLART HPV2 de Extracção e Purificação é expedido a 4ºC ou à temperatura ambiente.
Componentes:
• Colunas de purificação adaptadas a tubos de 2 ml
• Tubos de 2 ml • Tampão T1 • Tampão B1 • Tampão B2 • Tampão B5 • Tampão BW • Tampão BE
• Etiqueta para Tampão B3
• Proteinase K, liofilizada (conservar a 4ºC após ressuspensão)
• Os tubos de amplificação são transportados a –20º C.
Os Tubos de Amplificação contêm 45 µl de mistura de reacção. São enviados prontos a usar e devem ser conservados a –20º C. Só deverá descongelar, em gelo, o número de tubos necessários, deixando os restantes a -20º C.
Nota: na caixa do dispositivo está incluído um indicador autocolante irreversível de temperatura. O aparecimento de uma cor rosa na janela de visualização indica que os produtos ultrapassaram a temperatura de conservação de -20ºC e o dispositivo não deve ser utilizado.
3.2. Reagentes de Visualização
O dispositivo de visualização é expedido e conservado a 4ºC.
AVISO: Após receber os CLART® strips (CS) estes devem ser conservados à temperatura ambiente.
• CLART® strips (CS) (incluem as sondas específicas). São enviados num envelope selado. Depois de aberto, o envelope deve ser fechado e conservado à temperatura ambiente (25oC máx.), protegido da luz.
• SH (Solução de Hibridização). Conservar a 4ºC .
• DC (Diluente do Conjugado). Conservar a 4ºC.
• CJ (Conjugado). Conservar a 4ºC. Centrifugar brevemente antes de utilizar.
• RE (Solução de Revelação). Conservar a 4º C, protegido da luz..
• TL (Tampão de lavagem). Conservar a 4ºC.
Para a captura e posterior processamento da imagem são necessários os seguintes componentes:
•CAR (Clinical Array Reader) (figura 3): que permite a leitura e interpretação automática até 12 CS, o que significa, um total de 96 amostras. Esta plataforma é fabricada exclusivamente para os dispositivos da GENOMICA.
•O adaptador de suporte a colocar na parte superior do tabuleiro do CAR de modo a ajustar as placas de microtitulação antes da leitura.
•SAICLART®: software desenvolvido e validado pela GENOMICA para processamento de imagens.
• Software específico do dispositivo CLART® PAPILOMAVIRUS Humano 2 concebido e validado pela GENOMICA
CAR
(Clinical Array Reader)
4. MATERIAL ADICIONAL 4.1. Reagente e material
• Água Destilada.
• Etanol a 96%
• Luvas descartáveis.
• Pontas de pipetas com filtro ou com êmbolo.
• Recipiente com gelo picado.
• Tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
• Suportes para Tubos de 1.5 ml.
• Suportes para tubos de 0.5 ml/0.2 ml.
• Solução salina a 0,9% NaCl 4.2. Equipamento
• Microcentrífuga.
• Termociclador.
• Câmara de fluxo laminar para o laboratório de extração.
• Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, 20-200 µl e 200-1000 µl) para uso no laboratório de extração.
• Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, 20-200 µl e 200-1000 µl) para uso no laboratório de visualização.
• Termomixer (a 25°C, 30°C e 65º C) com agitação ajustável, compatível com tubos tipo
Eppendorf.
• Vortex.
• Sistema de Vácuo (opcional).
5. RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO
Muito Importante: Ler cuidadosamente esta secção antes de iniciar a técnica.
5.1. Recomendações Gerais
1. A técnica deve realizar-se em duas áreas separadas fisicamente, para evitar a contaminação das amostras com produtos amplificados anteriormente.
Cada uma das áreas deve ter o seu próprio material de trabalho identificado (pipetas, pontas, tubos, suportes, luvas, etc.) que nunca deve sair das respetivas áreas.
• Área Pós-PCR: Nesta área efectua-se a amplificação e visualização da amostra. O material que se encontra nesta área nunca deve entrar em contacto com a área de Pré-PCR. Depois de trabalhar na área de pós-PCR não volte à área pré-PCR.
2. Utilizar sempre luvas. É recomendável substituir de luvas com alguma frequência.
3. Limpar as áreas de trabalho (bancada do laboratório, câmaras, suportes, pipetas, termociclador) minuciosamente, com lixívia diluída a 10%, após cada processamento de amostras; é obrigatório desinfetar todas a áreas de trabalho em caso de contaminação. No caso de termocicladores e termomixers, é aconselhado limpá-los antes e depois da sua utilização, nestas mesmas condições.
4. Utilizar sempre pontas com filtro ou pipetas com escoamento parcial para evitar contaminações. Devem ser utilizadas pipetas distintas em cada área.
5. Utilizar sempre material descartável ou autoclavado.
6. Nunca misturar reagentes de dois tubos diferentes, mesmo que sejam do mesmo lote.
7. Fechar os tubos dos reagentes imediatamente após utilização para evitar contaminações.
8. Eliminar as pontas da micropipeta após utilização.
9. A GENOMICA não assume qualquer responsabilidade pelos resultados obtidos com o dispositivo, se forem utilizadas amostras diferentes das recomendadas.
5.2. Precauções para a extração e adição de material extraído para o tubo de amplificação
• Usar sempre luvas
• Limpar as superfícies de trabalho das câmaras com solução de lixívia diluída a 10%.
• Ligar o fluxo laminar e a luz UV, pelo menos, 20 minutos antes da extração. Desligar a luz UV quando estiver a trabalhar dentro da câmara.
• A preparação das amostras antes da extração deve ser efetuada dentro da câmara. 5.3. Precauções para a visualização
1. Evitar que a ponta da pipeta ou o sistema de vácuo toquem no fundo do tubo onde se encontra o microarray, para não o danificar.
2. Adicionar todas as soluções às paredes da tira. Evitar pipetar diretamente para o fundo onde se encontra o microarray.
3. É conveniente não adicionar a solução SH (solução de hibridização) até se adicionarem os produtos desnaturados de PCR.
5. Após a incubação com a solução CJ, é muito importante lavar bem a microarray para evitar que fiquem resíduos que possam reagir com a solução RE, resultando num precipitado inespecífico que pode dar lugar a falsas interpretações do resultado.
6. Evitar a formação de bolhas na superfície do microarray ao adicionar as diferentes soluções.
7. Quando estiver a visualizar a imagem no leitor, confirmar que os marcadores de posição aparecem e que não há bolhas ou pontos a interferir com a leitura. Caso contrário, limpar o fundo do tubo com papel de celulose ou toque suavemente o tubo com o dedo.
6. COLHEITA DE AMOSTRAS 6.1. Esfregaço
As amostras devem ser colhidas com uma zaragatoa seca e estéril de algodão ou alginato, suficientemente grande para obter uma boa quantidade de amostra.
Não utilizar dispositivos que provoquem sangramento, já que o sangue pode interferir com o ensaio. Coloque a zaragatoa no tubo respectivo, que não deve conter qualquer tipo de meio de conservação. Conservar a zaragatoa a 4ºC, no caso de ser processada até 7 dias ou a -20ºC se for processada depois.
6.2. Suspensões Celulares
Estas suspensões celulares são do tipo das utilizadas para realizar citologias cervicovaginais de capa fina por filtração através de membranas (ThinPrep®, Cytyc). Colher a amostra com uma escova ou espátula. Suspender novamente a amostra agitando o dispositivo utilizado num frasco com meio de transporte. Eliminar o dispositivo utilizado e conservar a amostra a 4ºC até ao seu processamento.
6.3. Tecidos fixados em formol, etanol e parafina
Fixar as amostras em formol tamponado durante o menor tempo possível (nunca mais de 24 horas). A utilização de formol não tamponado ou a fixação durante mais de 24 horas pode degradar o ADN da amostra. É importante limpar cuidadosamente a espátula com xileno, antes e depois de cortar a amostra, para evitar arrastar restos de outra amostra cortada anteriormente. Retirar com uma faca a parafina que sobra em redor da peça. Fazer com o micrótomo quatro ou cinco cortes de 5 µm e colocá-los num tubo de 1,5 ml estéril.
7. PROTOCOLO DE TRABALHO
7.1.1. Extração Manual do ADN DO HPV
PROCEDIMENTOS DE PREPARAÇÃO
• Dissolver a proteinase K em água desionizada estéril antes de usar (a quantidade está indicada na embalagem da proteinase K), para alcançar uma concentração de 20 mg/ml. A proteinase K deve ser armazenada a 4°C.
• Preparação do Tampão B5: Adicionar 28 ml de etanol (96% - 100%) antes de usar.
• Aquecer a Solução BE a 70°C antes de usar.
• Todas as centrifugações do processo deverão ser efetuadas a temperatura ambiente, a não ser que outra temperatura seja especificada.
Atenção: As Soluções B3 e BW contêm hidrocloreto de guanidina. Recomenda-se a utilização de
luvas, óculos e bata de laboratório para as manipular.
EXTRAÇÃO DE ADN DE HPV 1. Preparação da Amostra
Suspensões Celulares:
• Agitar a amostra invertendo várias vezes o frasco onde está contida e passar 1 ml para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml.
• Centrifugar as amostras durante 10 minutos numa microcentrífuga a 12.000 rpm e retirar, com uma micropipeta, o sobrenadante, tendo cuidado para não arrastar o precipitado.
• Suspender de novo o precipitado com 1 ml de água destilada estéril.
• Centrifugar as amostras durante 10 minutos numa microcentrífuga a 12.000 rpm e retirar, com uma micropipeta, o sobrenadante, tendo cuidado para não arrastar o precipitado.
• Suspender novamente em 180 µl de Solução T1.
• Transferir para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml e prosseguir para a etapa 2.
Esfregaço:
• Adicionar 1,5 ml de soro fisiológico (cloreto de sódio 0,9%) ao tubo que contém a zaragatoa e agitar vigorosamente num Vortex durante 1 minuto.
• Decantar o sobrenadante num tubo de 1,5 ml estéril.
• Ressuspender em 180 µl de Solução T1 e prosseguir para a etapa 2.
Tecido fixado em formol ou parafina:
• Introduzir as amostras para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar-lhes 180 µl de Solução T1.
A PARTIR DESTA ETAPA AS AMOSTRAS SÃO TRATADAS DA MESMA FORMA
2. Adicionar 25 µl de solução de Proteinase K e incubar as amostras a 56°C durante 1-3 h (toda a noite no caso de tecidos em parafina) num banho ou num Termomixer com agitação, até que a amostra esteja completamente lisada. Para acelerar a lise recomenda-se agitar as amostras num Vortex cada 15 minutos.
3. Uma vez decorrido o tempo de lise, juntar 200 µl de Solução
B3 a cada amostra. Misturar em Vortex e incubar a 70°C durante 10 min.
4. Juntar 210 µl de etanol 96% a cada amostra e agitar de imediato num Vortex
Nota: Não eliminar nenhum precipitado branco que se possa ter formado após a adição do etanol;
este precipitado deve adicionar-se com o resto da solução à coluna de purificação na etapa seguinte.
5. Preparar uma coluna de purificação por amostra e colocá-la num tubo de recolha de 2 ml. Juntar a amostra e centrifugar durante 1 minuto a 12.000 r.p.m. Se o líquido não atravessou completamente a membrana, repetir a centrifugação. Eliminar o fluido filtrado.
6 Adicionar 500 µl da Solução BW à coluna. Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min. Eliminar o fluido filtrado.
7. Adicionar 600 µl de Solução B5 à coluna. Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min. Eliminar o fluido filtrado.
8. Reinserir a coluna no tubo de recolha. Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min. para eliminar qualquer resto da Solução B5.
Nota: O etanol residual que possa ficar da Solução B5 inibe reacções enzimáticas, pelo que se deve
eliminar completamente mediante esta centrifugação.
9. Colocar a coluna num tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir o ADN com 100 µl da Solução BE (previamente aquecida a 70°C). Incubar esta Solução quente na coluna à temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 12000 rpm durante 1 min.
10. Recuperar o filtrado (aproximadamente 100µl) no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilizar 5
µl para a reação de amplificação e guardar o resto a – 20°C. 7.1.2. Extração automática de ADN de HPV
7.1.2.1. Aparelho NucliSENSTM bioMérieux easyMAG É aconselhado o seguinte protocolo:
1. Preparação das amostras para a lise a bordo (efectuada dentro do aparelho).
Esfregaços:
• Adicionar 1,5 ml de solução fisiológica (cloreto de sódio a 0.9%) ao tubo que contém a zaragatoa e agitar vigorosamente num Vortex durante 1 min.
• Decantar o sobrenadante para o tubo de 1,5 ml estéril.
• Transferir 1 ml para o poço da barrete (cada barrete tem oito poços).
Meio para Transporte (volumes inferiores a 3 ml):
Suspensões celulares (volumes inferiores a 3 ml):
• Agitar a solução invertendo várias vezes o frasco e transferir 1 ml para um poço da barrete. 2. Lise celular e extração do ADN: Seguir o protocolo do utilizador. É necessário definir o volume de eluição no programa para 110 µl.
3. Uma vez terminada a extração, transferir 110 µl do ADN eluído para um tubo tipo Eppendorf de 1,5 ml. Utilizar 5 µl para a reação de amplificação e conservar a -20 ºC.
7.1.2.2. Aparelho Qiagen BioSprint 96. É aconselhado o seguinte protocolo.
PREPARAÇÃO DOS TAMPÕES
Certificar-se que os tampões são preparados antes do processo de extração.
1. Antes de utilizar, reconstituir a protease liofilizada adicionando 4,4 ml do tampão indicado no rótulo. Uma vez reconstituída, conservar a 4ºC até dois meses.
2. Preparação do Tampão AW1 Volume concentrado AW1
(ml)
Volume de Etanol a 96% a ser adicionado
Volume final (ml)
19 25 44
27 35 62
98 130 228
Nota: Conservar à temperatura ambiente. Antes de utilizar agitar o frasco cinco vezes. 3. Preparação do Tampão AW2
Volume concentrado AW2 (ml)
Volume de Etanol a 96% a ser adicionado
Volume Final (ml)
17 40 57
68 160 228
Nota: Conservar à temperatura ambiente. Antes de utilizar agitar o frasco cinco vezes. 4. Preparação de 0.0002% Tween 20
H2O livre de RNase 30 ml 250 ml
Tween 20 6µl 50 µl
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
1. Atenção! Programar o Termomixer com agitação a 70ºC para estar pronto para a lise com a protease.
Esfregaço:
• Cortar a zaragatoa e introduzir num tubo de 1,5 ml. Adicionar: - 400 µl de tampão ATL
- 20 µl de Protease
Suspensões celulares (volumes inferiores a 3 ml):
• Líquido Citológico: agitar no vortex e adicionar à placa (S-Block): -200 µl de amostra
-20 µl de Protease
2. Incubar num Termomixer com agitação a 70ºC durante 10 min. Se a incubação for efetuada numa placa, cobrir com uma película transparente e uma tampa pré-aquecida a 70ºC, de forma a evitar a condensação da amostra que poderia levar à contaminação da mesma.
3. Preparação do Master-mix. Erros de pipetagem podem ser reduzidos preparando um tubo extra por cada grupo de 10.
Adicionar os seguintes volumes:
Componentes Volume por amostra (µl)
Tampão AL 200
Isopropanol 200
MagAttract Suspension G 20
4. Distribuir soluções pelo prato. Dispensar as soluções para as placas.
É necessário utilizar 6 Microplacas S-Block e 2 Microplacas MP.
Na tabela 1 apresenta-se o slot de cada placa no aparelho e os volumes que têm de ser adicionados às placas:
Slot no
aparelho
Placa A Adicionar Volume por
Poço (µl) 8 Micro-placa MP Colocar o suporte com a placa
protectora
---
6 S-Block H2O livre de RNase + Tween 20 500
5 S-Block Tampão AW2(2) 500
4 S-Block Tampão AW2(1) 500
3 S-Block Tampão AW1(2) 500
2 S-Block Tampão AW1(1) 500
1 S-Block Amostras Lisadas + Master-mix (*) 200 + 420
(*) Quando utilizar esfregaços, centrifugue as amostras de uma forma rápida (spin) antes de adicionar os lisados.
Adicionar primeiro 200 µl da amostra lisada e depois 420 µl da solução master-mix no poço. Se a lise for levada a cabo em Placas, adicionar 420 µl da solução master-mix diretamente no poço que contém a amostra lisada.
Agitar sempre as amostras e a master-mix, pipetando várias vezes para cima e para baixo.
5. Extração.
• Uma vez as placas preparadas, ligar o BioSprint 96.
• Abrir a porta da frente do sistema de proteção.
• Selecionar o protocolo “DNA Swab” usando as setas para cima e para baixo. Carregar em “Start” para iniciar o protocolo. O mostrador LCD mostra uma mensagem pedindo para carregar a slot 8 da worktable com a tampa de 96-rod. Depois de carregar a slot 8, carregue em “Start”. A base de trabalho roda e surge uma nova mensagem que pede para carregar a
slot 7 com a placa de eluição. Carregue a placa 7 e carregue em “Start” de novo. Continue este
processo de carregar em “start” e carregar uma determinada slot até que todas as slots tenham sido carregadas.
A Tabela 1 mostra em quais slots as placas devem ser carregadas. Carregue cada placa de
forma a que o poço A1 esteja alinhado com a etiqueta da slot .
• Verificar se a tampa protetora está corretamente instalada. Esta deve encaixar exatamente no corpo do BioSprint 96. Fechar a porta de correr para proteger as amostras de possíveis contaminações.
7.2. Reação de amplificação
Recomendações específicas para a amplificação:
• Trabalhar na área pre-PCR, numa câmara de fluxo laminar e seguindo as recomendações indicadas no ponto 5.1.
• Adicionar o ADN numa câmara de fluxo laminar e seguir as recomendações indicadas no ponto 5.1. Durante o processo, manter os tubos separados e em gelo.
1. Descongelar um Tubo de Reação por cada amostra e manter em gelo. Não usar temperaturas superiores a 37ºC para a descongelação.
2. Centrifugar uns segundos os Tubos de Reação na microcentrífuga para que fique todo o líquido no fundo do tubo (se não se dispõe de adaptadores de microcentrífuga para os Tubos de Reação, poderão utilizar-se em seu lugar tubos de um tamanho maior aos quais se tenha retirado a tampa).
3. Se a amostra de ADN tiver sido obtida de tecido em parafina, adicionar 1.5 µl de Cloreto de Magnésio 25mM aos Tubos de reação.
4. Adicionar 5 µl do ADN extraído das amostras aos Tubos de Reação, e ressuspender várias vezes com a micropipeta. Deixar os tubos em gelo.
5. Programar no Termociclador os seguintes ciclos de temperaturas:
6. Iniciar o programa e colocar os Tubos de Reacção no Termociclador quando o bloco tiver ultrapassado os 90 ºC. Deste modo minimizam-se as possíveis amplificações inespecíficas devidas a hibridização ocorrida abaixo da temperatura de reação. A duração da amplificação é de cerca de 4 horas, ainda que possa variar ligeiramente dependendo do Termociclador.
7.3. Visualização do produto amplificado para as CLART Strips(CS):
Recomendações específicas antes de iniciar o processo de visualização:
1 Ciclo 95ºC 5 min 40 Ciclos 94ºC 30 seg
55ºC 60 seg 72ºC 90 seg 1 Ciclo 72ºC 8 min
O PROTOCOLO DESCRITO A SEGUIR DEVE REALIZAR-SE SEMPRE NUMA ÁREA PÓS-PCR. NUNCA TRANSPORTAR O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ÁREA DE PRÉ-PCR.
1. Ligar o CAR (Clinical Array Reader) antes de iniciar o procedimento. A auto-calibração do equipamento leva uns minutos, e é necessário introduzir o nome das amostras no programa antes da leitura.
2. Assegurar-se de que, antes de iniciar a hibridização, a temperatura do termomixer atingiu os 65º C durante, pelo menos, 1 hora.
3. Aquecer a SH (solução de hibridização) no termomixer.
4. Preparar a solução de lavagem antes de cada análise, não utilizar soluções anteriores ou quaisquer soluções remanescentes de análises anteriores.
5. Utilizar uma ponta com filtro diferente para cada poço e substituí-la de cada vez que se adicionar um reagente.
6. O pente de 8 pontas utilizado na bomba de aspiração deve ser descartado após utilização ou descontaminado com uma solução de lixívia a 10% após cada análise. Certificar-se de que o sistema de vácuo funciona corretamente e não deixar restos de líquido nos poços.
7. Todos os tampões devem ser completamente aspirados dos poços sem tocar no fundo.
VISUALIZAÇÃO:
1. Desnaturação: Colocar os tubos de amplificação no termociclador quando tiver atingido 95ºC e incubar os tubos durante 10 min. Não exceder 10 min. de tempo de desnaturação para prevenir que os tubos sejam abertos e que possa ocorrer a contaminação.
Retirar os tubos da incubação aos 95º C e colocá-los imediatamente no gelo.
2. Preparação da Solução TL diluída:
Para 8 Poços (uma Strip) adicionar:
• 1 ml de Solução TL + 9 ml de água destilada. Resultam 10 ml de solução TL diluída necessárias para uma Tira.
4. Hibridização: A Solução de Hibridização (SH) deve ser aquecida a 50º C de modo a dissolver os sais cristalizados.
Adicionar 100 µl de tampão SH a cada poço (evitando a formação de espuma), + 5 µl de produto desnaturado em cada poço. Homogeneizar com a ajuda da pipeta evitando tocar no array e incubar a strip, coberta com a tampa de plástico transparente no Termociclador durante 1 hora a 65ºC com agitação a 550 rpm.
Após uma hora, retirar o CS do Termociclador e aspirar o tampão SH com o sistema de vácuo.
(Configurar o Termociclador para 30º C com agitação para posterior utilização na etapa 6. Retirar a tampa para acelerar o processo de arrefecimento).
5. Dupla Lavagem: Usar pontas diferentes para cada poço em ambas as lavagens. Adicionar 200 µl de tampão TL diluído e homogeneizar 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta. Eliminar a solução TL diluída com o sistema de vácuo. Repetir esta lavagem uma vez e deixar a CS com 200 µl de tampão TL até que o Termomixer atinja os 30ºC.
6. Bloqueio e Conjugado: Preparar a solução CJ diluída 15 minutos antes de terminar a hibrização e mantê-la no gelo até à sua utilização. É aconselhado centrifugar o tampão CJ durante 10 segundos antes de utilizar.
Preparar o tampão CJ diluído: para uma strip (8 poços) adicionar como se segue: o 1 ml de Tampão DC
o 7,5 µl de Tampão CJ
Homogeneizar em vortex brevemente a solução CJ diluída antes da utilização.
Remover o tampão TL diluído sem deixar secar o array e adicionar 100 µl de tampão CJ diluído a cada poço. Incubar no Termociclador a 30º C a 550 rpm durante exatamente 15 minutos.
Após esta incubação, retirar a tira e eliminar imediatamente o tampão CJ diluído com o sistema de vácuo, (ver figura 4).
(Programar o Termomixer a 25ºC com agitação para a etapa 8. Retirar a tampa para acelerar o arrefecimento.)
7. Tripla lavagem: Adicionar imediatamente 200 µl de solução TL diluída por poço, homogeneizar 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta e retirar o tampão TL diluído com o sistema de vácuo sem deixar secar o array. Repetir esta lavagem duas vezes e deixar o CS com 200 µl do tampão TL à temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos ou até a temperatura do Termomixer atingir 25 ºC.
É muito importante que o tampão CJ diluído seja completamente removido dos poços, uma vez que este pode reagir com o tampão RE produzindo um sinal inespecífico.
8. Revelação com o Tampão RE: Retirar completamente o tampão TL diluído sem deixar o
Array secar e adicionar 100 µl de tampão RE por poço. Incubar no Termomixer a 25ºC
Atenção! É muito importante utilizar o Termociclador sem agitação nesta etapa. 9. Após 10 min., retirar o tampão RE com o sistema de vácuo. O Array deve secar nesta
altura.
10. CAR (Clinical Arrays Reader): Um adaptador metálico deverá ser colocado na bandeja
do CAR de forma a proceder à análise das amostras. Colocar a Strip no CAR, este irá analisar os Arrays automaticamente.
8. LEITURA DE RESULTADOS
O Processamento dos dados obtidos a partir de cada uma das análises é completamente automático. O equipamento de leitura/análise emitirá um relatório com os resultados.
No ecrã irá aparecer uma tabela com três colunas. Na coluna da esquerda aparecerão os tipos de HPV que podem ser detetados, a coluna central apresenta o resultado positivo ou negativo para cada tipo de HPV, resultante da análise, e a coluna da direita mostra a conformidade dos controlos de ADN e de amplificação.
9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Um dos principais inconvenientes da detecção por amplificação genómica é a possível ocorrência de resultados falsos negativos devido à qualidade inadequada de ADN na amostra (quantidade insuficiente na amostra, degradação de ADN ou perda de ADN durante a extração) ou a presença de inibidores de ADN Polimerase (hemoglobina, resíduos de parafina, sais, etc.) nas amostras a serem analisadas. Contudo o CLART Papilomavirus Humano 2 elimina falsos negativos, uma vez
que tem incluído controlos internos no tubo onde a amostra é analisada e que são amplificados ao mesmo tempo que o ADN viral.
Cada tubo de amplificação do dispositivo contém os seguintes primers:
• Um par de primers que amplifica o fragmento do gene humano CFTR (ADN genómico ou do paciente). Este é utilizado como controlo de ADN genómico.
• Um par de primers que amplifica um plasmídeo modificado que se encontra no tubo e que é utilizado como controlo da reacção de amplificação.
• Primers para o HPV.
Estas reações de amplificação foram desenhadas de forma a favorecer a reação de amplificação do HPV em relação aos outros dois controlos. Em relação a estes controlos, a amplificação do ADN genómico é favorecido em relação ao controlo interno da reacção de amplificação.
A explicação para este desenho é a seguinte:
O Controlo Interno de amplificação só é essencial quando não existe amplificação no tubo, uma vez que vai ajudar a distinguir entre um PCR inibido e uma amostra onde não se encontra ADN.
Contudo, quando o HPV está presente na amostra, irá sempre haver uma preferência para amplificar os genótipos em vez dos controlos de amplificação. Ou seja, sob determinadas condições (i.e. quando um elevado número de cópias de um tipo particular de HPV ou quando vários genótipos de HPV estão presentes na amostra) os controlos internos podem não surgir (sem sinal).
Tendo em conta estas observações, podemos considerar os seguintes resultados.
AMOSTRA POSITIVO para qualquer genótipo CONTROLO DE ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO √ √ √ POSITIVO
É considerado um RESULTADO VÁLIDO.
Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO, mesmo que a amplificação do controlo diga SEM SINAL. Isto deve-se à competição entre os três tipos de ADN durante a reacção de amplificação.
AMOSTRA POSITIVO para qualquer genótipo CONTROLO DE ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO
√ √ SEM SINAL POSITIVA
Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO, mesmo que o resultado para os dois controlos seja SEM SINAL. Isto deve-se ao elevado número de cópias de um genótipo de um HPV presente na amostra. AMOSTRA NEGATIVO para qualquer genótipo CONTROLO DE ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO √ √ √ NEGATIVO
Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO.
AMOSTRA NEGATIVO para qualquer genótipo CONTROLO ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO
√ √ SEM SINAL NEGATIVO
Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO, mesmo que não se obtenha o controlo PCR, devido a uma grande concentração de ADN genómico.
AMOSTRA POSITIVO para qualquer genótipo CONTROLO ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO
√ SEM SINAL SEM SINAL POSITIVO
GENÓTIPO DE HPV
CONTROLO PCR CONTROLO DE
BRANCO NEGATIVO para qualquer genótipo CONTROLO ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO
H2O √ SEM SINAL √ NEGATIVO
Este é considerado como um RESULTADO VÁLIDO, por se tratar de um BRANCO, só o controlo PCR deveria aparecer porque não há ADN na amostra para ser amplificado.
AMOSTRA NEGATIVO para qualquer genótipo CONTROLO ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO
√ SEM SINAL √ SEM ADN
É considerado como um RESULTADO INVÁLIDO. Este resultado aparece por não haver ADN na amostra, o que pode acontecer por diversas razões:
1. Não existe ADN suficiente na amostra
2. Perda de ADN durante o processo de extração
A solução nestes casos é repetir a técnica desde a extração ou obter uma nova amostra do doente.
AMOSTRA NEGATIVO para qualquer amostra CONTROLO DE ADN GENÓMICO CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO INTERPRETAÇÃO
√ SEM SINAL SEM SINAL PCR INIBIDO
CONTROLO DE ADN GENÓMICO
Este é considerado um RESULTADO INVÁLIDO. Tal acontece porque há algumas substâncias que podem inibir a AND polimerase.
A solução é verificar que não tem nenhuma destas substâncias e em seguida é preferível repetir a extração, ou obter uma nova amostra.
Um resultado incerto pode surgir devido a uma destas possibilidades:
• Quando três cópias da mesma sonda são muito diferentes entre si.
• Quando há uma co-infecção e um dos vírus detectados está no limiar entre o positivo e o negativo.
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE TRABALHO
FONTES DE INTERFERÊNCIA CONHECIDAS
Certas substâncias podem interferir com o dispositivo CLART Human Papillomavirus 2. Estas são
principalmente substâncias que inibem a ADN polimerase e por conseguinte a reação de amplificação. As interferências mais conhecidas são:
• Hemoglobina ou Parafina. O ADN extraído de esfregaços cervicovaginais pode conter pequenas quantidades de hemoglobina, enquanto o ADN extraído a partir de amostras de tecidos incluídos em parafina, pode estar contaminado com pequenas quantidades deste meio. Não obstante o nosso dispositivo de Extracção-Purificação minimizar estes efeitos, ainda existe a possibilidade de interferência.
• Ácido acético ou Iodo. Se a recolha da amostra a analisar se realizar depois de uma colposcopia, a contaminação do ácido acético ou iodo pode ocorrer. Pelo facto de ambos os compostos poderem inibir reacções de PCR, recomendamos que se faça a recolha da amostra antes da colposcopia.
• Uso das amostras não adequadas. A análise de qualquer outro tipo de amostra que não as indicadas no manual do dispositivo CLART Human Papillomavirus 2, assim com a recolha
incorreta das amostras, pode levar a que o resultado da análise não seja conclusivo. Por exemplo, se a zaragatoa for colocada num meio alternativo, a PCR pode ser inibida ou se o tempo de fixação de um tecido em formol for excessivo, o ADN pode degradar-se.
• Atividade residual da Proteinase K. Durante a extração do ADN, a proteinase K tem de ser inibida por incubação a 70ºC durante 10 minutos. Este passo leva à sua total inatividade. Se omitir esta etapa, ou as condições se suavizarem significativamente, a proteinase poderá permanecer com alguma atividade, o que resultaria na degradação da ADN polimerase, ou seja na inibição do PCR.
• Conservação inadequada das amostras. Se submeter as amostras a condições que podem resultar na degradação do ADN, os resultados podem ser incertos.
ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS
1. Parâmetros analíticos:
• Sensibilidade analítica. A sensibilidade analítica foi determinada por amplificação específica de diferentes genótipos de HPV clonados em plasmídeos recombinantes. A sensibilidade dos tipos 16 e 18 de HPV também foram determinados de amostras do WHO HPV LabNet Proficiency Study of HPV DNA Typing de 2010.
GENÓTIPO HPV 102 cópias 50 cópias* 10 cópias
6 100% 40% 11 100% 60% 16 100% 100% 80% 18 100% 26 100% 80% 31 100% 80% 33 100% 80% 35 100% 39 100% 45 100% 60% 51 100% 80% 52 100% 80% 53 100% 80% 56 100% 58 100% 59 100% 80% 66 100% 68 100% 80% 82 100%
N=95 * Dados expressos em equivalentes genómicos. Tabela 1. Sensibilidade analítica do dispositivo CLART® HPV 2.
tipo 18, este conjunto de dados é considerado proficiente, facto esse ocorrido com o CLART HPV 2.
Especificidade Analítica. A especificidade analítica conseguida foi de 100%. O dispositivo CLART
Papilomavirus Humano 2 não deteta outros vírus patogénicos que possam ser encontrados nas
amostras cervicovaginais, tal como os vírus Herpes.
2. Parâmetros de utilidade diagnóstica.
Para determinar diversos parâmetros de diagnóstico do dispositivo CLART® Human Papillomavirus 2, foram feitos estudos comparativos com a versão anterior do dispositivo.
Esta comparação foi efetuada em colaboração com dois hospitais espanhóis e um português.
• Serviço de Microbiologia do Hospital Universitário Germans Trías i Pujol de Badalona.
• Unidade de Virologia do Hospital Virgen de la Arrixaca, Múrcia.
• Departamento de Doenças Infecciosas do Instituto Nacional de Saúde Ricardo Jorge, I.P. Lisboa (Portugal).
Foram analisadas 386 amostras, incluindo 9 zaragatoas, 25 tecidos embebidos em parafina e 364 LBC.
O quadro seguinte apresenta os dados de sensibilidade e especificidade diagnósticas para os tipos de HPV detetados no CLART® HPV 2:
Tipo HPV Sensibilidade Especificidade Tipo HPV Sensibilidade Especificidade
6 97,37 100,00 56 100,00 100,00 11 100,00 100,00 58 97,44 100,00 16 100,00 99,69 59 100,00 99,73 18 100,00 100,00 61 100,00 100,00 26 100,00 100,00 62 100,00 99,46 31 100,00 100,00 66 100,00 100,00 33 97,14 99,72 68 97,44 98,33 35 100,00 99,74 70 94,44 100,00 39 88,89 100,00 71 100,00 100,00 42 100,00 99,46 72 100,00 100,00 43 100,00 99,50 73 100,00 99,74 44 100,00 100,00 81 100,00 100,00 45 92,86 99,74 82 94,74 99,47 51 100,00 100,00 83 100,00 100,00 52 96,15 100,00 84 100,00 100,00 53 95,83 100,00 85 100,00 100,00 54 100,00 100,00
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bosch, F.X., Lorincz, A., Muñoz, N., Maijer, C.J.L.M. and Shah K.V.: “The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer”. J. Clin. Pathl. 55, 244-265 (2002).
Calleja-Macías, I.E., Villa, L.L., Prado, J.C. et al. "Wordwide genomic diversity of the high-risk human papillomavirus types 31, 35, 52, 58, for close relatives of human papilloma virus type 16”. Journal of Virology. 79, 13630-13640 (2005).
Chranioti A., Spathis A., Aga E., Merustoudis C. Pappas A., Panayiotides I. and Karakitsos P. “Comparison of two commercially available methods for HPV Genotyping: CLART HPV2 and Linear Arrays HPV Genotyping Test”. Analytical and Quantitative Cytopathology and Histopathology. Volumen 34, number 5, October 2012.
De Villiers, E.M.: “Heterogeneity of the human papillomavirus group”. J. Virol. 63, 4898-4903 (1989).
Dunne, E.F., Unger E.R., Sternberg m., McQuillan G., Swan D.C., Patel S.S., Markowitz L.E.: “Prevalence of VPH infection among females in the United States”. JAMA, February 28, 2007-Vol 297, nº 8.
Flavio, L.: “VPH genotyping: are different hybridization methods comparable in detecting high risk infections?” 23rd International papillomavirus conference and clinical workshop. September 2006. Praga.
Garbugliaa A. R., Piselli P., Lapaa D., Sias C., Del Nonnoc F., Baiocchinic A., Cimagliab C., Agrestab A. and Capobianchia M. R. “Frequency and multiplicity of human papillomavirus infection in HIV-1 positive women in Italy”. Journal of Clinical Virology. JCV-2429 (2012).
Goldman B., Rebolj M., Rygaard C., Preisler S., Ejegod DM, Lyngea E., and Jesper Bonde. “Patterns of cervical coinfection with multiple human papilloma virus types in a screening population in Denmark”. Vaccine 2013 Mar 15;31 (12): 1604-9.
Kjær S.K., Frederiksen K., Munk C., Iftner T. Long-term Absolute Risk of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 3 or Worse Following Human Papillomavirus Infection: Role of Persistence. J Natl Cancer Inst. 2010 Sep 14.
Muñoz, N., Bosch, X., Sanjosé, S., Herrero, R., Castellsagué, X., Shah, K.V., Snijders, P.J.F. y Meijer, C.J.L.M. “Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer”. N. Engl. J. Med. 348, 518-527 (2003).
Ronco G., P. Giorgi-Rossi, F. Carozzi, M. Confortini, P. Palma, A. Mistro, B. Ghiringhello, S. Girlando, A. Gillio-Tos, L. Marco, C. Naldoni, P. Pierotti, R. Rizzolo, P. Schincaglia, M.Zorzi, M. Zappa, N.Segnan, J. Cuzick. “Efficacy of human papillomavirus testing for the detection of invasive cervical cancers and cervical intraepithelial neoplasia: a randomised controlled trial”. Lancet Oncol. 2010 Mar;1 1(3):249-57.
Suarez Moya, A., Esquivias Gómez, J.I., Vidart Aragón, J.A. Picazo de la Garza, J.J.: “Detección y tipificación mediante biología molecular del virus del Papilloma humano en muestras genitales”. Rev. Esp. Quimioterap., Junio 2006; Vol. 19 (Nº2); 161-166.
Verdasca, N.; A. Coelho; F. Ribeiro; A. Pista.: “Detection of VPH ADN from cervical samples in a group of portuguese women: comparison of two VPH genotyping assays”. 24th internacional papillomavirus conference and clinical workshop, Nov 3-9, 2007, Beijing, P.R.China."
12. TABELA
Riscos oncogénicos dos tipos de HPV detetáveis com o dispositivo CLART® HPV2.
TIPO RISCO
ONCOGÉNICO*
TIPO RISCO
ONCOGÉNICO*
HPV 6 Baixo Risco HPV 56 Alto Risco
HPV 11 Baixo Risco HPV 58 Alto Risco
HPV 16 Alto Risco HPV 59 Alto Risco
HPV 18 Alto Risco HPV 61 Baixo Risco
HPV 26 Alto Risco HPV 62 Baixo Risco
HPV 31 Alto Risco HPV 66 Alto Risco
HPV 33 Alto Risco HPV 68 Alto Risco
HPV 35 Alto Risco HPV 70 Alto Risco
HPV 39 Alto Risco HPV 71 Baixo Risco
HPV 40 Baixo Risco HPV 72 Baixo Risco
HPV 42 Baixo Risco HPV 73 Alto Risco
HPV 43 Baixo Risco HPV 81 Baixo Risco
HPV 44 Baixo Risco HPV 82 Alto Risco
HPV 45 Alto Risco HPV 83 Baixo Risco
HPV 51 Alto Risco HPV 84 Baixo Risco
HPV 52 Alto Risco HPV 85 Alto Risco
HPV 53 Alto Risco HPV 89 Baixo Risco
HPV 54 Baixo Risco
