Mecânica e Reologia de Células

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Mecˆ anica e Reologia de C´ elulas

Yareni Aguilar Ayala

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós- Gradua¸cão em F´ısica do Instituto de F´ısica da Univer- sidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obten¸cão do t´ıtulo de Doutor em Ciências (F´ısica).

Orientador: Prof. Nathan Bessa Viana

Rio de Janeiro Dezembro de 2013

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A283 Aguilar Ayala, Yareni Mecânica e Reologia de Células^/Yareni Aguilar Ayala^._—

Rio de Janeiro, 2013.

xxvii,129 f.: il. ; 30 cm^.

Tese (Doutorado em Física) – Programa de Pós-graduação em Física, Instituto de Física, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Orientador: Dr. Nathan Bessa Viana Bibliografia: f. 114-129

1. Reologia. 2. Pinças óticas. 3. Mecânica celular. 4. Rigidez de flexão. 5. Materiais Moles. I. Viana, Nathan Bessa. II.

Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Física. III.

Título.

CDD 531.1134

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Nome do Aluno: Yareni Aguilar Ayala

Orientador: Nathan Bessa Viana

Resumo da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Gradua¸cão em F´ısica do Instituto de F´ısica da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obten¸cão do t´ıtulo de Doutor em Ciências (F´ısica).

A célula é a unidade estrutural básica do ser vivo. Ela está constantemente sujeita a est´ımulos mecânicos provenientes do meio externo ou de condi¸cões fisiológicas internas que influenciam suas fun¸cões biológicas. Uma abordagem interdisciplinar é necessária para entender os princ´ıpios de sua organiza¸cão, as rela¸cões entre sua fun¸cão e estrutura e os mecanismos celulares usados para levar a cabo suas fun¸cões vitais. Neste trabalho são estudadas as propriedades mecânicas da membrana e do citoesqueleto de fibroblastos NIH3T3 utilizando a pin¸ca ótica.

As pin¸cas óticas são ferramentas de micromanipula¸cão utilizadas para medir for¸cas na escala de picoNewton (1pN = 10⁻¹²N). Essa é a escala de for¸ca na qual acontecem importantes processos celulares tais como locomo¸cão, divisão, contra¸cão, adesão e remodelamento celular. Por essa razão as pin¸cas óticas se tornaram nos últimos anos ferramentas muito utilizadas e aplicadas a problemas de interesse biológico. Neste trabalho são utilizadas duas técnicas baseadas no uso de pin¸cas óticas para estudar o complexo membrana-citoesqueleto. A primeira delas é a técnica de extra¸cão de amarras que permite caracterizar as propriedades da membrana celular. A outra técnica é a técnica de reologia,

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esta técnica foi implementada durante o desenvolvimento deste trabalho e é utilizada para medir as propriedades viscoelásticas do citoesqueleto. Para estudar a dependência que as propriedades mecânicas possuem com a integridade do complexo membrana-citoesqueleto foram utilizadas drogas que desestabilizam a estrutura do citoesqueleto.

As células NIH3T3 foram tratadas com três drogas que agem de forma molecularmente diferente afetando a dinâmica e a estrutura do citoesqueleto: citocalasina D, blebistatina e jasplakinolida. O efeito das drogas foi verificado para várias concentra¸cões através de imagens de microscopia confocal. A microscopia confocal permite avaliar a integridade do citoesqueleto ao marcar as células com faloidina-FITC, um marcador fluorescente para actina polimerizada, principal componente do citoesqueleto.

Nas membranas biológicas frequentemente são formadas estruturas cil´ındricas longas e finas (com comprimento da ordem de µm), conhecidas como nanotubos ou amarras de membrana. O estudo da forma¸cão destas estruturas é uma parte importante na com- preensão de vários processos biológicos. Artificialmente as amarras de membrana celular podem ser geradas usando a pin¸ca ótica. A descri¸cão mecânica das amarras é dada por um modelo baseado na energia livre de Helfrich para descrever a elasticidade de bicamadas lip´ıdicas. A partir da abordagem da energia de Helfrich é poss´ıvel obter expressões para a tensão superficial efetivaσef =σef(F, R) e para a rigidez de flexão efetivaκef =κef(F, R) em fun¸cão da for¸ca necessária para formar a amarra F e do raio da amarra formada R.

O raio da amarra R foi medido usando a técnica de microscopia eletrônica de varredura para cada uma das condi¸cões estudadas.

O complexo membrana-citoesqueleto é o principal responsável pelas propriedades estruturais das células, relacionando-se diretamente com processos de importância vital. De- vido às suas caracter´ısticas estruturais, o complexo membrana-citoesqueleto tem um comportamento similar ao de materiais conhecidos como materiais moles (colóides, pol´ımeros, espumas, géis, etc). Dependendo das carater´ısticas do est´ımulo externo o citoesqueleto pode se comportar como um l´ıquido ou como um sólido. A dinâmica do acoplamento

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Nos nossos resultados observamos uma diminui¸cão dos valores de for¸caF para formar a amarra de membrana em fun¸cão da concentra¸cão da droga usada, quanto maior concentra¸cão menor a for¸ca. Um efeito contrário é observado para o raio da amarra R. Os valores deF eRmedidos levam a uma diminui¸cão da tensão efetiva da membranaσef para todos os tratamentos de drogas, especialmente no tratamento com citocalisina D. Esta diminui¸cão é um indicativo da desestrutura¸cão do citoesqueleto que se traduz em uma perda da capacidade da célula em suportar grandes valores de tensão na sua membrana.

Por outro lado, os experimentos de reologia que acessam diretamente às propriedades do citoesqueleto dos fibroblastos NIH3T3 mostram que o módulo viscoelástico deste tipo de célula é descrito por uma lei de potência com expoente β = 0.22± 0.03 que descreve o estado inalterado do citoesqueleto. A desestrutura¸cão do citoesqueleto, observada nos experimentos de amarras com a diminui¸cão da tensão da membrana plasmática, é tradu- zida nos resultados de reologia em uma diminui¸cão direta dos módulos elástico e viscoso para todas as condi¸cões estudadas. A diminui¸cão do módulo viscoelástico caracterizada por um aumento do expoente da lei de potência β descreve um estado mais flex´ıvel do citoesqueleto. Os fibroblastos tratados com citocalasina D apresentam um citoesqueleto em estado mais l´ıquido quando comparado com as demais condi¸cões estudadas. A rigidez de flexão efetiva κef, associada com o acoplamento membrana-citoesqueleto, apresenta um inesperado aumento em resposta ao tratamento com drogas quando comparada com a situa¸cão controle. No entanto, este aumento se mostra insens´ıvel à concentra¸cão usada para o caso de blebistatina e jasplakinolida. Já para o tratamento com citocalasina D o aumento de κef é considerável, atingindo valores encontrados para o caso de membrana

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plasmática desacoplada do citoesqueleto. A poss´ıvel rela¸cão destes parâmetros mecânicos com as fun¸cões do citoesqueleto são discutidas neste trabalho. Para explicar os resultados encontrados para os valores deκef é proposto um modelo baseado na extensão da energia livre de Helfrich-Canham com a introdu¸cão fenomenológica de parâmetros relacionados com a curvatura da membrana plasmática e sua energia de adesão ao córtex.

Palavras-chave: Pin¸ca Ótica, Mecânica Celular, Extra¸cão de Amarras, Membrana Plasmática, Citoesqueleto, Energia Livre de Helfrich-Canham, Reologia, Materiais Moles, Módulo Viscoelástico, Curvatura Espontânea.

Rio de Janeiro

Dezembro de 2013

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Orientador: Prof. Nathan Bessa Viana

Abstract da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Gradua¸cão em F´ısica do Instituto de F´ısica da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obten¸cão do t´ıtulo de Doutor em Ciências (F´ısica).

The cell is the basic unit of life; it is constantly subjected to mechanic stimulus from the external environment and from its internal physiological condition that influence its biological functions. An interdisciplinary approach is necessary to understand the princi- ples of its organization, its function-structure relations and the cellular mechanisms that are used to perform its biological functions. In this thesis the membrane and cytoskeleton mechanical properties of NIH3T3 fibroblast are studied by using an optical tweezers system. Optical tweezers are micro-manipulation tools used to measure forces in the pi- coNewton (1pN = 10⁻¹²N) scale. On this scale important cellular process occurs such as locomotion, division, contraction, adhesion and cellular remodelling. For these reason the optical tweezers are used extensively in biological applications. In this work, two te- chniques based on optical tweezers systems are used to study the membrane-cytoskeleton complex. The first one is the tether extraction technique that allows cellular membrane properties to be characterized. The other one is the rheology technique that was imple- mented during the development of this work. The rheology technique is used to measure the viscoelastic properties of the cytoskeleton. In order to study the relation between the mechanical properties of the cell and the membrane-cytoskeleton complex integrity drugs

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that crash the cytoskeleton structure were used.

The NIH3T3 cells were treated with three different drugs: cytochalasin D, blebistatin and jasplakinolide. Each drug acts on the cytoskeleton in a different molecular way, interfering with its dynamics and structure. The drug effects were verified for all concentrations by using confocal microscopy. The confocal microscopy allows a verification of the cytoskeleton integrity by the fluorescent effect of phalloidin-labeled cells.

Frequently, biological membranes form long thin cylindrical structures (with micro- metric length) known as nanotubes or membrane tethers. The study of tether formation mechanisms is an important tool used to investigate several biological processes. Ar- tificially, the cellular membrane tethers can be generated by using an optical tweezers system. The mechanical description of tether formation is given by a model based on Helfrich-Canham free energy that describes the phospholipidic bilayers elasticity. From Helfrich-Canham energy approach it is possible to obtain expressions for the effective membrane surface tension σef(F, R) and bending energy κef(F, R) as a function of the force (F) needed to form a tether with radius (R) . The tether radius is measured by using the scanning electronic microscopy technique.

The membrane-cytoskeleton complex is the principal responsible for the structural properties of the cells. Due to its structural characteristics, the membrane-cytoskeleton complex has a behavior similar to other materials called soft glassy materials (colloids, slurries, etc). Depending on the characteristics of the external stimulus, the cytoskeleton behaves as a solid or as a liquid material. The dynamics of its solid-liquid nature coupling can be characterized by means or power laws that describe the complex viscoelastic modulus dependence on the external stimulus frequency that acts on the cell. The optical tweezers can induce a sinusoidal mechanical perturbation on the cell with controlled amplitude and frequency that enable the study of the cytoskeleton rheological behavior.

In our results we observe a decrease in the tether formation force values (F) as a function of drug concentration, as higher is the concentration the less is the observed force. An

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law with an exponent of β = 0.22±0.03. The cytoskeleton disruption, observed by the tether extraction experiments through the effective membrane tension, is also detected in the rheological experiments by a direct complex viscoelastic modulus decrease for all tested conditions. The fibroblasts treated with Cytochalasin D exhibit a more liquid-like cytoskeleton behavior than the others tested conditions. The effective bending rigidity κef, associated with the membrane-cytoskeleton coupling, exhibits an unexpected increase in response to the drugs treatment.

However, for blebistatin and jasplakinolide this increase appears to be insensitive to the drug concentrations used. For citochalasin D there is a considerable increase of κef, reaching values found for the plasma membrane vesicles case.

A possible correlation of these mechanical parameters with the cytoskeletal functions is discussed. In order to explain the results found for the bending rigidity a model is proposed. This model is based on the Helfrich-Canham free energy extension with two phenomenological parameters added related to the plasma membrane curvature and membrane-cortex adhesion energy.

Keywords: Optical Tweezers, Cell Mechanics, Tether Extraction, Cell Membrane, Cytoskeleton, Helfrich-Canham Free Energy, Rheology, Soft Glass Materials, Viscoelastic Modulus, Spontaneous Curvature.

Rio de Janeiro

Dezembro de 2013

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Agradecimentos.

Gostaria de agradecer em primeiro lugar ao meu orientador, o professor Nathan Bessa Viana por me ter dado a oportunidade de trabalhar no Laboratório de Pin¸cas Óticas da UFRJ, pela paciente condu¸cão deste trabalho de tese e pela sua grande contribui¸cão

às idéias que deram forma a este trabalho. Aos meus colegas de laboratório, Bruno Pontes pela sua valiosa ajuda na parte de biologia através da troca de experiências e discussões. Ao meu colega Rafael Dutra pelas discussões da parte teórica da pin¸ca ótica.

Aos professores Moyses Nussenzveig, Vivaldo Moura, Marcos Farina e Paulo Américo por participarem das reuniões do laboratório acrescentando idéias e discutindo resultados.

Ao Laboratório de Morfogênese Celular, do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ por disponibilizar a sua estrutura para a obten¸cão das amostras biológicas usadas neste trabalho, assim como a todas as pessoas pertencentes a esse laboratório. A todos os professores da UFRJ que contribu´ıram na minha forma¸cão durante estes anos. Às agências CAPES pela concessão da bolsa de doutorado e CNPq pela bolsa DTI-1 para financiar os últimos três meses do desenvolvimento deste trabalho. Finalmente quero agradecer a minha fam´ılia pelo apoio que sempre me deu para continuar estudando.

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Sum´ario xii

Lista de S´ımbolos e Abreviaturas xv

Lista de Figuras xix

Lista de Tabelas xxvii

1 Introdu¸c˜ao 1

2 Membrana celular e citoesqueleto 4

2.1 Estrutura celular . . . 4

2.2 Membrana celular . . . 6

2.2.1 Lip´ıdios da membrana . . . 10

2.2.2 Prote´ınas da membrana . . . 11

2.2.3 Dom´ınios da membrana: Rafts de lip´ıdios . . . 12

2.2.4 Tens˜ao da membrana . . . 14

2.2.5 Rigidez de flex˜ao e curvatura de membrana . . . 15

2.3 Citoesqueleto . . . 20

2.3.1 Estrutura do citoesqueleto . . . 20

2.3.2 Complexo membrana-citoesqueleto . . . 25

2.3.3 Polimeriza¸cão de actina: forma¸cão e dinâmica dos microfilamentos . 27 2.3.4 Prote´ınas motoras do citoesqueleto . . . 28

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2.4 Amarras de membrana em c´elulas . . . 32

2.4.1 Modelo da forma¸c˜ao de amarras de membrana . . . 34

2.5 Reologia do citoesqueleto . . . 37

2.5.1 Modelos da dinˆamica do citoesqueleto . . . 39

2.5.2 A c´elula como material mole . . . 42

3 Materiais e m´etodos 46 3.1 Pin¸cas ´oticas . . . 46

3.1.1 Pin¸cas ´oticas: Montagem experimental . . . 50

3.1.2 Calibra¸c˜ao da pin¸ca ´otica . . . 54

3.2 Cultura celular . . . 58

3.2.1 Tratamento com drogas . . . 60

3.3 Experimento de extra¸c˜ao de amarras . . . 62

3.3.1 Microscopia eletrˆonica de varredura: Medida do raio da amarra . . 63

3.3.2 Imunocitoqu´ımica e microscopia confocal . . . 64

3.4 Medidas do módulo viscoelástico da célula . . . 65

3.4.1 Fun¸c˜ao geom´etrica . . . 69

4 Resultados 75 4.1 Calibra¸c˜ao da pin¸ca ´otica . . . 75

4.2 Extra¸c˜ao de amarras de Fibroblasto NIH3T3 . . . 77

4.3 Medida do m´odulo viscoel´astico do Fibroblasto NIH3T3 . . . 79

4.4 Fibroblasto NIH3T3 sob a¸cão de drogas: Extra¸cão de amarras e reologia . 84 4.4.1 Propriedades mecânicas do Fibroblasto NIH3T3 sob a¸cão de drogas 88 4.4.2 Propriedades viscoelásticas do Fibroblasto NIH3T3 sob a¸cão de drogas 89 5 Discussão 93 5.1 Fibroblasto NIH3T3 controle . . . 93

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Referˆencias Bibliogr´aficas 114

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Lista de S´ımbolos e Abreviaturas.

a - Raio da microesfera de poliestireno

Aα - Fun¸cão polinomial que define a fun¸cão geométrica α ADP - Difosfato de adenosina

AF M - Microsc´opia de for¸ca atˆomica

Arp2/3 - Complexo de prote´ınas relacionado `a actina AT P - Trifosfato de adenosina

Bα - Fun¸cão polinomial que define a fun¸cão geométrica α BBI - Blebistatina

BLEB - Bolhas de membrana plasm´atica BSA - Albumina do soro bovino

C - Cuvatura espontˆanea ativa da membrana plasm´atica C¹, C² - Curvaturas principais da membrana

C0 - Curvatura espontˆanea da membrana CitoD - Citocalasina D

CW - Modo Cont´ınuo do laser DN A - ´Acido desoxirribonucleico

DM SO - Crioprotetor (Dimetilsulf´oxido)

DM EM −F12 - Meio espec´ıfico utilizado para cultura de c´elulas (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)

E - M´odulo de Young

E0 - Módulo elástico da célula no modelo Kelvin-Voigt

Ei - Energia dos po¸cos de potencial no modelo de materiais moles E↔ - Polariza¸cão linear do laser horizontal à mesa de trabalho El - Polariza¸cão linear do laser perpendicular à mesa de trabalho

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g - M´odulo viscoel´astico no dom´ınio temporal G - Curvatura Gaussiana da membrana

G(f) - Módulo viscoelástico no dom´ınio de frequências G^′(f) - Módulo elástico no dom´ınio de frequências G^′′(f) - Módulo viscoso no dom´ınio de frequências

G⁰ - Rigidez da célula como parâmetro de escala da equa¸cão de amortecimento estrutural GKV - Módulo viscoelástico do modelo Kelvin-Voigt

GU V - Ves´ıculas unilamelares gigantes h - Altura

H - Energia de Helfrich-Canham hu - Altura da c´elula sob a microesfera JP K - Jasplakinolida

Kc - Constante elástica aparente da célula K_c^∗ - Rigidez complexa da célula

L - Comprimento da amarra

LP O - Laboratório de Pin¸cas Óticas M T C - Citometria de tor¸cão magnética N A - Abertura Numérica da objetiva nar - Índice de refra¸cão do ar

nesf - ´Indice de refra¸c˜ao da microesfera

nmeio - Índice de refra¸cão do meio em que está imersa a microesfera

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N IH3T3 - Linhagem de c´elulas de fibroblastos p - Press˜ao dentro da ves´ıcula

P AK/LIM - Quinase que se liga a actina no processo de polimeriza¸c˜ao

P BS−EDT A - Tampão fosfato salino com ácido etilenodiamino tetra-acético P IP2 - Fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato

P M V - Ves´ıculas de membrana plasm´atica R - Raio da amarra

R⁰ - Raio da amarra referente a ves´ıcula Raf t - Balsa lip´ıdica

RAs - Prote´ına RAt Sarcoma v´ırus RN A - ´Acido ribonucleico

Rp - Raio que define a área de adesão entre a microesfera e a célula SBF - Soro bovino fetal

SGR - Soft Glass Rheology - Reologia de materias moles Src - Prote´ına tirosina quinase

V - Volume da ves´ıcula

W asp/Sar - Prote´ınas que promovem a polimeriza¸cão de actina W - Energia de adesão da membrana plasmática com o citoesqueleto α(θ, hu, a) - Fun¸cão geométrica que relaciona Kc com G

β - Expoente da lei de potˆencia βS - Coeficiente de Stokes Γ - Fun¸c˜ao Gamma

∆A - Diferen¸ca de ´area entre as camadas da membrana

∆ρ(t) - Deslocamento da microesfera de sua posi¸c˜ao de equil´ıbrio η - Viscosidade do meio

θ - Ângulo que define a área de contato entre a microesfera e a célula κ - Rigidez de flexão da membrana

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σef - Tens˜ao superficial efetiva da membrana plasm´atica

˜

σ - Tensão mecânica na membrana σ - Tensão superficial da membrana τi - Tempo caracter´ıstico

φ - Ângulo de fase entre a componente elástica e a componente viscosa da célula

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Lista de Figuras

2.1 Partes principais da estrutura de uma célula eucariótica. . . . 6 2.2 Diagrama simplificado da estrutura qu´ımica de um fosfolip´ıdio, unidade básica da mem-

brana plasmática caracterizado por sua cabe¸ca hidrof´ılica e sua cauda hidrofóbica. . . . 8 2.3 Diagrama simplificado da membrana plasmática segundo a descri¸cão do modelo de mo-

saico fluido definida por um arranjo de mol´eculas de l´ıpidios e prote´ınas. . . . 9 2.4 Figura representativa dos Rafts e da Caveola. a) Actina em forma de filamentos e

monômeros e tubulina em forma de d´ımeros estão associadas com o raft e com a caveola. b) A desestrutura¸cão dos filamentos de actina e dos microtúbulos causa uma reorganiza¸cão das prote´ınas que fazem parte doraft [27]. . . . 13 2.5 (a) Para descrever a flexão da membrana usa-se o conceito geométrico de circunferência

osculatriz. Circunferência cujo centro se encontra sobre a normal à curva e tem a mesma curvatura que a curva dada nesse ponto. O raio desta circunferência (r1,r2) é chamado raio de curvatura, é o inverso da magnitude da curvatura. (b) Cria¸cão dos momentos de flexão intr´ınsicos causados por um gradiente na pressão lateral π(z) ao longo da espessura da bicamada. A curvatura espontânea é determinada pela a¸cão rec´ıproca do gradiente de pressão entre a região da cauda e a região da cabe¸ca dos fosfolip´ıdios. (c) Para dobrar ou flexionar uma membrana uma tensão positivaT+ tem que ser aplicada numa das camadas, e uma tensão negativa T₋ na outra, resultando num momento de flexãoM =D(T+−T₋), onde D é espessura da membrana. Figura (a) modificada de [38] e figuras (b) e (c) de [39]. . . . 15

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ser¸cão assimétrica de prote´ınas [48]. . . . 19 2.7 Imagem da estrutura do microtúbulo: o microtúbulo possui uma estrutura cil´ındrica

constru´ıda a partir de 13 protofilamentos paralelos, cada um composto de mol´eculas alternadas deαeβ-tubulina, imagem modificada de [57].. . . 21 2.8 a) Actina globular ligada a ATP (azul) associa-se espontaneamente para formar fila-

mentos definidos por um extremo de crescimento rápido + (actina ligada a ATP - azul) e um extremo lento - (actina ligada a ADP - vermelho). Toxinas como a citocalasina D (isoladas de esponjas marinhas) possuem afinidade para se ligar a actina no extremo +, evitando assim a adi¸cão de mais monômeros e induzindo despolimeriza¸cão. Existe uma variedade de prote´ınas que ligam-se a actina influenciando a organiza¸cão e estrutura do citoesqueleto, por exemplo b) α-actinina promove o arranjo em feixes de actina e c) filamina promove estruturas em rede. a) Outras como a profilina promove polimeriza¸cão, a cofilina favorece a despolimeriza¸cão e a gelsolina o encurtamento do filamento [59]. d) Imagem da rede de filamentos que formam o citoesqueleto de actina de queratinócitos [52]. . . . 24 2.9 a) Imagem da arquitetura do córtex de células da artéria pulmonar bovina (BPAECs)

mapeada por AFM em [62]. b) Organiza¸cão molecular de adesões entre o citoesqueleto e a membrana em células de músculo liso. Os filamentos de actina ligam-se a diversas prote´ınas via liga¸cões cruzadas através de integrinas. HSP (heat shock protein), ILK (in- tegrin linked kinase), FAK (focal adhesion kinase), N-WASp (neuronal Wiskott-Aldrich syndrome protein) [61]. . . . 26

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2.10 Modelo de nuclea¸cão dendr´ıtica: esquema do modelo que descreve o mecanismo molecular que controla a dinâmica dos filamentos de actina [69]. . . . 29 2.11 a) Estrutura da molécula de miosina II. b) Mecanismos de contra¸cão muscular. c) Ciclo

contr´atil da actomiosina. Figura modificada de [70]. . . . 32 2.12 Forma¸c˜ao inicial de uma amarra a partir de uma membrana considerada localmente

plana. A curva da for¸ca requerida para formar o tubo em fun¸c˜ao do comprimentoLe o raio do tuboR0[85]. . . . 36 2.13 a) A rede de citoesqueleto modelada como um arranjo infinito de elementos unit´arios

representados pelo ´ındicei. b) cada elemento se comporta como um circuito de Kelvin- Voigt com um tempo de resposta caracter´ısticoτi, figura modificada de [98] . . . . 40 2.14 Esquema representativo dos po¸cos de potencial que definem a matriz de elementos do

modelo de materiais moles. Os elementos presos nos po¸cos de energiaEipodem escapar causando um rearranjo da rede. Se o elemento entra dentro de um outro po¸co fora da posi¸cão de equilibrio, uma for¸ca é gerada permitindo um deslizamento do elemento que eventualmente se direciona à posi¸cão de equilibro do po¸co [102]. . . . 43

3.1 For¸cas óticas sobre uma microesfera na aproxima¸cão da ótica geométrica. A luz do laser incide na objetiva de grande aumento com abertura numérica definida porN A= nsinθmax, ondené o ´ındice de refra¸cão do meio que está em contato com a objetiva.

A lente da objetiva focaliza a luz sobre uma microesfera. A microesfera com ´ındice de refra¸cão nesf está imersa num meio com ´ındice nmeio, de forma que nesf > nmeio. A intera¸cão dos raios de luz focalizados na microesfera gera uma for¸caFref lexão resultado da reflexão dos raios sobre a superf´ıcie, esta for¸ca afasta a microesfera da região do foco.

Uma outra for¸ca Fref racão é originada da refra¸cão dos raios de luz ao se propagarem dentro da microesfera gerando uma for¸ca restauradora que puxa a microesfera para a região do foco luminoso. . . . 49

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3.3 a) Esquema do microscópio invertido usado na montagem experimental: 1) ocular, 2) condensador que ilumina a amostra, 3) câmara com controle de temperatura e CO2, 4) estágio móvel, 5) espelho dicróico para direcionar o laser na entrada da objetiva, 6) laser colimado. b) A câmara 3) está montada sobre o estágio móvel 4), o qual é controlado por um sistema de posicionamento piezoelétrico nas dire¸cões x,y e z. Dentro da câmara

é colocada a placa de cultura celular contendo microesferas de poliestireno, de tal forma que o fundo de vidro da placa de cultura fica em contato com a objetiva através do óleo de imersão. A pin¸ca ótica formada pelo laser ao ser focalizado pela objetiva sobre uma microesfera interage com as células que estão aderidas no fundo da placa de cultura. . . 53 3.4 Laboratório de Pin¸cas Óticas da COPEA/UFRJ. . . . 54 3.5 Figura representativa da amostra usada para calibrar a pin¸ca ótica. A luz do laser

representada pelo perfil do feixe em vermelho, entra pela parte inferior da amostra para aprisionar uma microesfera de poliestireno. A pin¸ca é mantida fixa enquanto o meio l´ıquido de viscosidadeηpassa pela microesfera. A for¸ca de arrastoFaé equilibrada pela for¸ca da pin¸ca óticaFp. . . . 56 3.6 A linhagem NIH3T3 foi descongelada e mantida em cultura celular dentro de uma estufa

com temperatura e concentra¸c˜ao deCO2controladas. A partir da passagenP4 at´eP15

as células podem ser usadas para os experimentos. 24 horas antes de cada experimento, as células são contadas usando uma câmara de Neubauer e plaquedas em placas petri especialmente adaptadas para seu uso nas pin¸cas do LPO. As placas petri foram furadas na sua base onde foi grudada uma lam´ınula de vidro devidamente limpa. A lam´ınula de vidro define a região de uso da pin¸ca ótica. . . . 60

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3.7 Representa¸cão esquemática do processo de extra¸cão de amarra. (a) Condi¸cão inicial de equil´ıbrio. (b) Mudan¸ca da posi¸cão de equilibrio devido ao deslocamento da platina e

`

a adesão da microesfera na membrana celular. (c) Imagem fluorescência das amarras extra´ıdas com a pin¸ca, indicando a presen¸ca de actina nas mesmas. Imagens extra´ıdas de [83]. . . . 64 3.8 Esquema representativo do experimento de reologia. Uma microesfera é colocada em

contato com a superf´ıcie da célula e mantida na pin¸ca ótica. Um movimento oscilante de amplitude ξ0 é induzido no estágio do microscópio. O parâmetro x quantifica a deforma¸cão sofrida pela célula eρa posi¸cão da microesfera na pin¸ca ótica. . . . 68 3.9 a) Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando a adesão da microesfera

de poliestireno com a superf´ıcie de um fibroblasto NIH3T3 tomada da referência [83]. b) Imagem de [117] para determinar α(θ, a, hu). A geometria da célula é modelada como um paralelep´ıpedo de dimensõeslxlxhem contato com uma microesfera. Os parâmetros que influenciam fortemente a resposta celular são a alturahu, o raio da microesferaae o grau de imersão dela dentro da célula definido pelo ângulo 2θ. c) Mapa da distribui¸cão da deforma¸cão efetiva da célula na vizinhan¸ca da área de contato entre a microesfera e a célula para um dos casos particulares estudados em [117], ondeθ = 65ô,a= 2.5µm, l = 20a, for¸ca aplicada de 50pN em células de alturas diferentes, 6.5µm e h = 2µm mostradas em a) e b), respectivamente. . . . 71 3.10 Esquema do método utilizado para medir a altura do fibroblasto NIH3T3. . . . 74 4.1 Posi¸cão do centro de massa da microesfera presa na pin¸ca quando são aplicados três

conjuntos de deslocamentos diferentes. O primeiro deles representa a resposta da microesfera aprisionada na pin¸ca quando são aplicados deslocamentos laterais com diferentes velocidades. O segundo representa a posi¸cão da microesfera quando são aplicados deslocamentos senoidais de frequências diferentes e o último quando são aplicados deslocamentos com onda triangular de frequências diferentes. . . . 75

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fibroblasto NIH3T3 em condi¸c˜ao controle. . . . 77

4.4 Medida do módulo viscoelástico da célula. Exemplo das oscila¸cões induzidas na célula para caracterizar suas propriedades viscoelásticas. Um movimento senoidal formado por um conjunto de oscila¸cões de amplitude constante para cada uma das frequências

é aplicado na célula. Uma microesfera de poliestireno, previamente aderida sobre a lam´ınula em uma região fora da célula mas próxima dela, é usada como referência do movimento real da amostra. Um outra microesfera presa na pin¸ca ótica é aderida sobre a célula. Antes de terminar a medida, o laser é desligado para verificar que a aderência das microesferas foi mantida durante todo o experimento. O movimento simultâneo de ambas as microesferas é gravado e comparado para obter o valor dos módulosG^′ eG^′′

do fibroblasto estudado. . . . 80

4.5 Módulo viscoelásticoG=G^′+iG^′′ em fun¸cão da amplitude de oscila¸cão de uma onda senoidal de frequência 1Hz. No intervalo de amplitudes de oscila¸cão correspondente a [0.5,1.5], o valor deGnão varia significativamente. . . . 80

4.6 Medida da altura dos fibroblastos NIH3T3. O estágio do microscópio é deslocado com velocidade conhecida vz na dire¸cão z para fazer uma varredura das imagens das microesferas utilizadas para realizar o experimento de reologia. A microesfera aderida na lam´ınula (direita) funciona como referência para comparar o n´ıvel de cinza central da outra microesfera aderida sobre a superf´ıcie da célula (esquerda). . . . 81

(25)

4.7 Módulo elásticoG^′(P a)(•) e módulo viscosoG^′′(P a)() do fibroblasto NIH3T3 controle.

O comportamento deG^′ eG^′′em fun¸cão da frequênciaf(Hz) segue uma lei de potência que cresce com expoenteβ= 0.22±0.03. A lei de potência está representada pelas linhas sólidas que ajustam o módulo viscoelástico da célula. O ajuste dos dados experimentais com a lei de potência para esta situa¸cão é dado usando como parâmetros de ajuste G0= (53±4)P a,µ= (1.1±0.4)P a·sef0= 1Hz. . . . 83

4.8 Fibroblastos controle NIH3T3 e fibroblastos tratados com diferentes concentra¸cões de citocalasina D. a) Imagens de imunocitoqu´ımica mostram as células NIH3T3 com marca¸cão para faloidina-FITC em microscopia confocal para cada uma das concentra¸cões usadas para esta droga [120]. b) Valores médios da for¸ca para forma¸cão da amarraF0 ±erro padrão obtidas de pelo menos 20 células diferentes para cada concentra¸cão de citocalasina D usada. c) Resposta viscoelástica do fibroblasto para várias frequências, descrita por uma lei de potência com expoenteβ: Fibroblasto controle (), 2.5µM(◦) e 5µM(•) de Citocalasina D. . . . 85

4.9 Fibroblastos NIH3T3 controle e tratados com diferentes concentra¸cões de blebistatina. a) Imagens de imunocitoqu´ımica mostram as células NIH3T3 com marca¸cão para faloidina-FITC em microscopia confocal para cada uma das concentra¸cões usadas para blebistatina [120]. b) Valores médios da for¸ca para forma¸cão da amarraF ±erro padrão obtidos de pelo menos 20 células diferentes para cada concentra¸cão de blebistatina usada.

c) Resposta viscoelástica do fibroblasto para várias frequências, descrita por uma lei de potência com expoenteβ: Fibroblasto controle (), 5µM() e 10µM() de blebistatina. 86

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por uma lei de potência com expoenteβ: Fibroblasto controle (), 25nM(△) e 50nM(N) de jasplakinolida. . . . 87 4.11 Modelo viscoelástico de Kelvin-Voigt para caracterizar o comportamento viscoelástico

do Fibroblasto NIH3T3 para frequência 1Hz. . . . 91 4.12 Parâmetros obtidos da representa¸cão do comportamento viscoelástico da célula usando

o modelo de Kelvin-Voigt. Este modelo permite caracterizar a resposta da c´elula para frequˆencias baixas, neste caso paraf = 1Hz. . . . 92

(27)

Lista de Tabelas

4.1 Cálculo da fun¸cão geométricaα(θ, a, hu). Da combina¸cão dos valores obtidos de extra¸cão de amarras para a for¸ca máxima Fmax e da medida da altura das célulashu, define-se o fator geométrico que relaciona a resposta aparente da célula, medida diretamente do experimento de reologia, com seu módulo viscoelástico. . . . 82 4.2 Tabela com resultados da extra¸cão de amarras para fibroblasto NIH3T3. . . . 89 4.3 Tabela com resultados de reologia. . . . 90 5.1 Tabela com valores de curvatura espontânea C e de energia de liga¸cão membrana-

citoesqueleto W e para a tensão mecânica ˜σ do fibroblasto NIH3T3, determinados a partir da energia livre de Helfrich-Canham com a adi¸cão de parâmetros fenomenológicos paraC eW. . . . 110

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Introdu¸c˜ ao

As células representam sistemas altamente complexos e dinâmicos. O interesse em estudar suas propriedades mecânicas tem por objetivo poder relacioná-las com suas fun¸cões biológicas, pois diferentemente dos materias inertes, na célula a aplica¸cão de um est´ımulo mecânico se traduz em uma resposta biológica.

A célula possui a capacidade de interpretar est´ımulos mecânicos do exterior e trans- formá-los em sinaliza¸cões bioqu´ımicas, como a ativa¸cão de canais iônicos na membrana que se abrem em resposta a uma tensão permitindo a entrada de cálcio e outros ´ıons [1].

As fun¸cões biológicas que as células individuais desempenham por sua vez são traduzidas na capacidade de tecidos como a pele de sentir mudan¸cas de temperatura, a capacidade do sistema vascular de regular o fluxo sangu´ıneo ou a do sistema muscular de responder a tensões mecânicas [2].

As propriedades mecânicas da célula são reguladas principalmente pela sua estrutura interna, em especial, pela rede de actina que forma o citoesqueleto acoplada à membrana plasmástica. Ambas estruturas são altamente heterogêneas e dinâmicas e as propriedades mecânicas da célula dependem fortemente de seu acoplamento.

Diversas técnicas de micromanipula¸cão tem sido utilizadas para explorar a resposta mecânica de células a tensões aplicadas sobre elas [3]. A extra¸cão de amarras de membrana é uma técnica que possibilita a forma¸cão de um fino tubo a partir da membrana plasmática. Através do estudo da forma¸cão deste tubo é poss´ıvel caracterizar propriedades

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mecânicas como a tensão superficial e rigidez de flexão da membrana plasmática acoplada ao citoesqueleto. Por outro lado, a técnica de reologia revela a resistência dinâmica da célula a ser deformada por um est´ımulo externo de frequência dada. Esta técnica permite a medida do módulo elástico e do módulo viscoso da célula. O acoplamento destas duas propriedades descreve a natureza viscoelástica do citoesqueleto.

Como objetivo geral desta tese propomos:

Estudar as propriedades mecânicas de fibroblastos NIH3T3, através do uso de duas técnicas: a extra¸cão de amarras de membrana e a reologia, que permitem caracterizar a resposta mecânica e viscoelástica da célula a diferentes est´ımulos externos.

Como objetivos espec´ıficos destacamos:

- Utilizar a técnica experimental de extra¸cão de amarras e microscopia eletrônica de varredura para medir as propriedades mecânicas de fibroblastos NIH3T3 em condi¸cões de cultura.

- Estabelecer no Laboratório de Pin¸cas Óticas LPO da UFRJ a técnica experimental de reologia para medir as propriedades viscoelásticas de fibroblastos NIH3T3 em condi¸cões de cultura.

- Usar a t´ecnica de microscopia confocal para descrever qualitativamente o efeito em fibroblastos NIH3T3 de drogas que interferem na dinˆamica do citoesqueleto.

- Com a finalidade de entender a participa¸cão mecânica do citoesqueleto na defini¸cão destas propriedades, utilizar a técnica de extra¸cão de amarras para investigar as propriedades mecânicas dos fibroblastos NIH3T3 quando são submetidos a tratamentos com essas drogas.

- Uma vez estabelecida a técnica de reologia, investigar as propriedades viscoelásticas dos fibroblastos NIH3T3 quando são submetidos a tratamentos com as mesmas drogas.

- A partir dos resultados obtidos por ambas as técnicas, identificar as propriedades mecânicas associadas à membrana plasmática quando a mesma está desacoplada do citoesqueleto. Da mesma forma, identificar a mudan¸ca dessas propriedades mecânicas em

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plasmática e o citoesqueleto. Neste cap´ıtulo também é apresentada a descri¸cão f´ısica do modelo que explica a forma¸cão de amarras de membrana, abordada pela energia livre de Helfrich-Canham. No final do cap´ıtulo são discutidos os conceitos f´ısicos da teoria de materiais moles e sua rela¸cão com as propriedades viscoelásticas das células.

No cap´ıtulo 3 apresentamos os materiais e métodos utilizados. Detalhes das metodo- logias usadas na aplica¸cão da técnica de extra¸cão de amarras e de reologia são discutidos.

No cap´ıtulo 4 são apresentados os resultados obtidos da aplica¸cão de ambas as técnicas ao fibroblasto NIH3T3. Primeiramente são apresentados os valores medidos das propriedades mecânicas e viscoelásticas para a condi¸cão controle, quando o fibroblasto encontra-se em um estado inalterado e em seguida são apresentados os resultados para cada uma das condi¸cões de tratamento com as drogas utilizadas.

No cap´ıtulo 5 são discutidos os resultados apresentados no cap´ıtulo anterior. A dis- cussão dos valores obtidos para a rigidez de flexão em todas as condi¸cões estudadas leva

à apresenta¸cão de uma extensão do modelo de energia livre de Helfrich-Canham para descrever a mecânica do tubo extra´ıdo da membrana plasmática de células. Nesse modelo são adicionados dois termos fenomenológicos que representam parâmetros mecânicos associados ao acoplamento entre a membrana plasmática e o citoesqueleto.

Finalmente, no cap´ıtulo 6 apresentamos as conclus˜oes do trabalho.

(31)

Cap´ıtulo 2

Membrana celular e citoesqueleto

2.1 Estrutura celular

A célula é a unidade básica de todo ser vivo. De acordo com sua estrutura, as células animais podem ser classificadas em dois tipos: as eucarióticas e as procarióticas. As pro- carióticas são células estruturalmente mais simples, podem ser encontradas em bactérias e carecem de um núcleo verdadeiro. As células procarióticas vivas atualmente são similares às encontradas em fósseis que datam de mais de 3.5 bilhões de anos. Acredita-se que por mais de 2 bilhões de anos os procariontes eram os únicos seres vivos existentes, antes da apari¸cão das primeiras células eucarióticas [4], [5]. Atualmente todos os outros tipos de organismos que não são bactérias: protistas, fungos, plantas e animais são formados por células eucarióticas muito mais complexas internamente. Ambos tipos de células possuem uma região nuclear que contém o material genético rodeada por um meio fluido chamado citoplasma. No caso das procarióticas o material genético encontra-se no nucleóide, que é uma região que carece de membrana limitante para separá-la do citoplasma. A célula eucariótica possui um núcleo bem definido limitado por uma estrutura membranosa complexa denominada membrana nuclear. Esta diferen¸ca na estrutra é a origem dos nomes dados aos dois tipos fundamentais de células: procarióticas (pro, antes;

carion, núcleo) e eucariótica (eu, verdadeiro;carion, núcleo). Neste trabalho foram usadas células animais, portanto descreveremos apenas a estrutura das células eucarióticas. De

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citoplasma em compartimentos, dentro dos quais são realizadas atividades bioqu´ımicas altamente especializadas. Estas membranas também formam um sistema de condutos e ves´ıculas interligadas cuja fun¸cão é transportar substâncias para o interior e o exterior da célula. O citoplasma é o espa¸co no interior da célula entre a membrana plasmática e o envoltório nuclear formado por diversas estruturas. Estas estruturas, por sua vez, contêm organelas recobertas por membranas cuja natureza é a mesma da membrana plasmática exterior. Por exemplo: as mitocôndrias, onde encontra-se dispon´ıvel a energia qu´ımica que a célula precisa para realizar suas fun¸cões; o ret´ıculo endoplasmático, onde é gerada a maior parte dos lip´ıdios e prote´ınas; o complexo de Golgi, onde os materiais são clas- sificados, modificados e enviados a um destino espec´ıfico da célula. No interior da célula também são encontradas diversas estruturas que carecem de membrana. Neste grupo estão inclu´ıdos os microtúbulos e os diversos filamentos protéicos que formam uma rede dinâmica no interior da célula, o citoesqueleto. Esta estrutura filamentosa participa ativamente dos movimentos celulares, além de dar suporte estrutural à célula. Um outro elemento encontrado no citoplasma são os ribossomos: complexos macromoleculares que participam da montagem de prote´ınas. O núcleo celular é a estrutura que controla as atividades qu´ımicas da célula. Além de estar delimitado por uma membrana plasmática, o núcleo celular armazena a maior parte do material genético, o qual é responsável de prover à célula suas caracter´ısticas únicas. Este material é constitu´ıdo pelo DNA e os componentes necessários para a transcri¸cão e processamento do RNA.

Neste trabalho foram estudadas propriedades da c´elula relacionadas principalmente

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Figura 2.1: Partes principais da estrutura de uma c´elula eucari´otica.

com a membrana plasm´atica e o citoesqueleto. A seguir descrevemos com mais detalhes estas duas estruturas.

2.2 Membrana celular

As membranas são estruturas que estabelecem o limite espacial da célula, separando o conteúdo celular do ambiente externo. São estruturas complexas que funcionam como barreiras seletivas, permitindo a passagem de compostos moleculares para o interior da célula e deixando outros sa´ırem. Estas estruturas são suficientemente estáveis para suportar as hostilidades do meio externo. Mas, ao mesmo tempo apresentam carater´ısticas dinâmicas que permitem à célula levar a cabo processos como crescimento, divisão e mudan¸cas de morfologia. O interesse por esses tipos de estrutura data do século XIX, quando come¸cou-se a investigar a intera¸cão do óleo com água. Uma aten¸cão especial para o caso da membrana celular foi dada por volta de 1899 [6]. A partir de então, apareceram os primeiros modelos tentando explicar como e por que as moléculas de óleo podiam se orientar na água [7]. Nesta época também apareceram os primeiros experimentos que come¸caram a detectar caracter´ısticas estruturais como a fluidez da membrana celular [8].

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A principal unidade estrutural da membrana plasmática são os fosfoglicer´ıdeos, moléculas lip´ıdicas pertencentes ao grupo dos fosfolip´ıdios. São moléculas compostas por glicerol, um grupo fosfato e duas cadeias de ácidos graxos. Numa molécula individual podemos distinguir um extremo hidrofóbico, composto pelas cadeias de ácidos graxos e um extremo hidrof´ılico, constitu´ıdo pelo grupo fosfato, como ilustrado na figura 2.2. Esta caracter´ıstica peculiar da sua estrutura, permite aos fosfolip´ıdios num meio aquoso, organizarem-se lado a lado, expondo sua parte hidrof´ılica em contato com a água e escondendo seu lado hi- drofóbico, formando assim bicamadas estáveis de forma espontânea.

O fato de que a membrana celular tenha como unidade fundamental os fosfolip´ıdios possui vantagens energéticas e estruturais não somente do ponto de vista biológico, mas também f´ısico. Devido a sua natureza hidrofóbica, os fosfolip´ıdeos conseguem se associar em água a partir de concentra¸cões muito baixas, apresentando propriedades elásticas

´

unicas. Os fosfolip´ıdios formam estruturas que possuem uma baixa rigidez de flexão e uma tensão lateral interna muito alta. São capazes de criar momentos de flexão intr´ınsecos por meio da introdu¸cão de assimetrias. Devido a isto, as bicamadas exibem fortes efeitos de auto reestrutura¸cão quando sofrem uma desmontagem na sua estrutura. Elas apresentam uma alta estabilidade ao se associarem devido à for¸ca hidrofóbica [10], para minimizar seu contato com a água [11]. Estas propriedades f´ısicas intr´ınsecas da sua natureza serão tratadas com mais detalhes nos cap´ıtulos posteriores, pois estão relacionadas com um dos objetivos de estudo deste trabalho. A seguir descrevemos o modelo de mosaico fluido proposto por Singer e Nicolson.

(35)

Figura 2.2: Diagrama simplificado da estrutura qu´ımica de um fosfolip´ıdio, unidade básica da membrana plasmática caracterizado por sua cabe¸ca hidrof´ılica e sua cauda hidrofóbica.

• Modelo do mosaico fluido

A estrutura e disposi¸cão dos componentes da membrana no modelo de mosaico fluido são notavelmente diferentes das propostas por modelos anteriores. Segundo este modelo, a membrana é formada por uma bicamada de fosfolip´ıdios que possui várias moléculas pro- teicas dispersas aleatoriamente formando um mosaico de part´ıculas como o esquematizado na figura 2.3. Estas part´ıculas penetram profundamente no interior da bicamada, algumas delas atravessando-a completamente. A caracter´ıstica fluida deste modelo é assim chamada por considerar a membrana celular como uma estrutura dinâmica com componentes móveis e com capacidade de se agruparem e participarem ativamente dos processos biológicos. Dentre os componentes da membrana celular, os lip´ıdios formam quase a me- tade da massa da membrana. Também podemos encontrar os glicolip´ıdios, o colesterol e as prote´ınas. Os glicolip´ıdios são encontrados exclusivamente na camada externa da membrana, com seu grupo de carbohidrato exposto na superf´ıcie como mostrado na figura 2.3. Eles formam cerca de 2% dos lip´ıdios de membrana. O colesterol constitui a maior parte da membrana, estando presente nela quase na mesma quantidade que os fosfolip´ıdios. Hoje se sabe que o colesterol participa da regula¸cão da rigidez de membranas

(36)

Figura 2.3: Diagrama simplificado da membrana plasmática segundo a descri¸cão do modelo de mosaico fluido definida por um arranjo de moléculas de l´ıpidios e prote´ınas.

O modelo de Singer e Nicolson prevê uma liberdade rotacional e translacional, assim como uma distribui¸cão aleatória dos seus componentes moleculares. Porém, hoje é sabido que essa liberdade de mobilidade das prote´ınas e l´ıpidios está longe de ser considerada uma mobilidade sem restri¸cões. O descobrimento do co-nivelamento (co-capping) forneceu um dos primeiros ind´ıcios da distruibui¸cão das prote´ınas com caráter não aleatório [15].

A difusão das prote´ınas na membrana, como descrito no modelo de mosaico fluido perdeu for¸ca com o surgimento da evidência da constru¸cão hierárquica de complexos proteicos [16]. O descobrimento da existência de associa¸cões estáveis de l´ıpidios e colesterol, os chamadosrafts, cuja fluidez é muito menor que à da membrana, também veio a contradizer

(37)

o modelo de 1972 [17].

2.2.1 Lip´ıdios da membrana

Todos os tipos de l´ıpidios da membrana são de natureza anfipática, apresentam uma região hidrof´ılica e uma região hidrofóbica. A maioria deles possuem um grupo fosfato, algumas exe¸cões são os glicolip´ıdios e o colesterol. Quase todos os fosfolip´ıdios possuem um esqueleto glicerol, como o exemplo mostrado na figura 2.2 que representa a estrutura da colina. Dois dos grupos hidroxila do glicerol se esterificam para formar ácidos graxos (caudas hidrofóbicas); um terceiro grupo do glicerol se esterifica para formar um grupo fosfato. Um grupo adicional, a colina se une ao fosfato definindo a estrutura da fosfatidilcolina. Em geral, dependendo do grupo adicionado ao fosfato, podem se formar fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, esfingomielina, fosfatidilinositol, entre outros. Es- tes diversos grupos que se unem ao fosfato formam o dom´ınio identificado como cabe¸ca hidrof´ılica. Por outro lado, as cadeias de ácidos graxos, longas e não ramificadas, formadas por cadeias hidrocarbonadas que possuem natureza hidrofóbica, formam a região da cauda da estrutura. Outros compostos presentes na membrana, porém menos abundan- tes, são os esfingolip´ıdios: lip´ıdios derivados de esfingosina unida a um ácido graxo por meio de seu grupo amino, carentes de grupo fosfato. Dentre eles temos a esfingomielina e os glicolip´ıdios, ambos aparecem mais concentrados na camada externa, em localiza¸cões assimétricas. Os primeiros são assinalados como participantes na regula¸cão da distribui¸cão do colesterol, outra importante molécula da membrana [13]. Os glicol´ıpidios estão relacionados com mecanismos de reconhecimento celular [14].

Outro componente importante das membranas é o colesterol, que diferentemente dos demais lip´ıdios, é menos anfipático. Encontra-se inserido na bicamada com seus grupos hidroxilas alinhados próximos às cabe¸cas dos fosfolip´ıdeos. O colesterol está relacionado com a funcionalidade das prote´ınas, pois tem se mostrado que mudan¸cas nos n´ıveis de colesterol na membrana altera as fun¸cões das prote´ınas [18], [19]. Ele também é responsável

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Enquanto os lip´ıdios definem a estrutura da membrana, diversos tipos de prote´ınas estão inseridas assimetricamente nela, de modo que, de acordo com sua localiza¸cão, são agru- padas em prote´ınas integrais, periféricas e em um terceiro grupo formado por prote´ınas ancoradas nos lip´ıdios.

Prote´ınas integrais: São prote´ınas que penetram a bicamada por completo, mantendo contato com o meio extracelular e citoplasmático simultaneamente. Contêm res´ıduos não polares, em grande parte, oriundos da sua superf´ıcie exposta. Estas regiões não polares da prote´ına se integram ao interior da bicamada de lip´ıdios onde podem interagir com os ácidos graxos. O restante da prote´ına é composto principalmente por aminoácidos iônicos e polares não integrados na bicamada. Estes aminoácidos se sobressaem em um ou em ambos lados da bicamada, formando um canal aquoso. Estes dom´ınios hidrof´ılicos são as partes de uma prote´ına integral que podem interagir com sustâncias hidrosolúveis na superf´ıcie da membrana, ou bem dentro do canal. Devido a sua forte intera¸cão com a membrana é dificil separar este tipo de prote´ına sem causar um dano na membrana.

Geralmente consegue-se extra´ı-las usando detergentes.

Prote´ınas periféricas: São prote´ınas unidas à membrana mediante liga¸cões fracas não covalentes. Podem se unir temporariamente aos grupos hidrof´ılicos dos l´ıpidios ou a regiões hidrof´ılicas das prote´ınas integrais que sobressaem da bicamada.

Prote´ınas ancoradas em lip´ıdios: Podemos distingu´ı-las em dois grupos, a partir do tipo de liga¸cão que as une ao lip´ıdio e da sua localiza¸cão. As prote´ınas que se localizam na camada externa da membrana estão unidas a ela mediante um oligossacar´ıdeo. Este, por sua vez, está unido a uma molécula de glicofosfatidilinositol integrada à camada

(39)

externa. Outro grupo de prote´ınas presente na membrana é formado por prote´ınas que estão ancoradas na membrana mediante liga¸cões de cadeias de hidrocarbonetos integradas

à camada interna da membrana. Pelo menos duas destas prote´ınas (Src e Ras) foram relacionadas na transforma¸cão de células normais em células em estado maligno [23] .

2.2.3 Dom´ınios da membrana: Rafts de lip´ıdios

Osrafts foram propostos a partir de estudos da polaridade de células epiteliais [24]. Eles são definidos como microdom´ınios l´ıquidos ordenados e unidos mais fortemente que o resto das componentes que formam a membrana de fosfolip´ıdios. Os rafts são estruturas altamente dinâmicas que boiam em forma de balsas dentro da bicamada da membrana.

Uma das propriedades mais importantes dos rafts é que mesmo sendo menos fluidos do que seu entorno, eles permitem que tanto os lip´ıdios quanto as prote´ınas que os formam entrem e saiam dos seus dom´ınios. O tamanho dos rafts é var´ıavel, e assim como suas fun¸cões e sua dinâmica, o tamanho é ainda um tema em discussão. Dependendo da técnica e do tempo de resolu¸cão usados, diferentes propriedades têm sido reveladas. Apesar da falta de consenso no tamanho dosrafts, é aceito que eles contêm apenas poucas prote´ınas.

Há uma evidência, cada vez mais aceita, que sugere que os rafts se associam em clusters em ambas as camadas da membrana [25]. Estudos bioqu´ımicos sugerem que os rafts são formados por colesterol e esfingolip´ıdios na camada exoplasmática e por colesterol e fosfolip´ıdeos com ácidos graxos saturados na camada endoplasmática. Dentre as prote´ınas com afinidade para formarraftsestão as prote´ınas ligadas ao glicofosfatidilinositol, quinase da fam´ılia Src, prote´ınas unidas com colesterol como as caveolinas, e prote´ınas unidas a fosfolip´ıdeos como as anexinas [26].

Umraft morfologicamente indentificado é a caveola (pequena cova), de tamanho apro- ximado de 50−100nm representado na parte a) da figura 2.4. A caveola é um tipo de invagina¸cão presente na membrana de células epiteliais e adiposas [28]. As caveolas são formadas a partir de um raft de l´ıpidios pela polimeriza¸cão de caveolinas, prote´ınas in-

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Figura 2.4: Figura representativa dos Rafts e da Caveola. a) Actina em forma de filamentos e monômeros e tubulina em forma de d´ımeros estão associadas com o raft e com a caveola. b) A desestrutura¸cão dos filamentos de actina e dos microtúbulos causa uma reorganiza¸cão das prote´ınas que fazem parte doraft [27].

tegrais da membrana que estão unidas fortemente ao colesterol. Apesar da fun¸cão da caveola não ser totalmente clara, ela tem sido relacionada aos processos mecânicos e de forma¸cão da curvatura da membrana, como a endocitose [29], e nas transdu¸cões de sinais mecânicos [30]. A célula investe grandes quantidades de energia para gerar e manter a caveola através do ATP e de mecanismos dependentes de actina, prote´ına que descreveremos na próxima se¸cão, provavelmente porque estas estruturas dinâmicas permitem à célula minimizar os danos que possa sofrer na sua membrana plasmática, por exemplo um aumento na tensão da membrana é rapidamente minimizado com um achatamento da caveola como mostrado na parte b) da figura 2.4 [31].

(41)

2.2.4 Tens˜ ao da membrana

Todas as fun¸cões celulares que envolvem deforma¸cões da membrana ou mudan¸cas mor- fológicas da célula estão vinculadas à tensão da membrana. A motilidade da célula é controlada pelo citoesqueleto de actina que constantemente empurra a membrana. Esta intera¸cão resulta em um esticamento da mesma e na gera¸cão de tensão superficial. A tensão na membrana funciona como um regulador mecânico que acopla diferentes processos bioqu´ımicos que acontecem em diversas regiões da célula [32]. Qualquer processo relacionado com a deforma¸cão ou flexão da membrana tem um custo energético para a célula que depende da tensão da mesma. Por exemplo, foi mostrado que a tensão está en- volvida na coordena¸cão da ativa¸cão e do balan¸co entre exocitose e endocitose, assim como das contra¸cões sofridas pela célula durante mudan¸cas morfológicas [33]. Também foi mostrado que a caveola, descrita brevemente na subse¸cão 2.2.3, funciona como reservatório de membrana, pois permite que as células endoteliais e musculares mudem rapidamente sua

área superficial em resposta a aumentos na tensão da membrana. A caveola rapidamente se achata, como esquematizado na parte b) da figura 2.4, permitindo às células aumentar sua área superficial e com isso evitar danos ou rompimentos na membrana causados por mudan¸cas na tensão [31]. Em células a tensão aparente da membrana tem a contribui¸cão de duas componentes. Uma delas é a tensão lateral da bicamada de lip´ıdios, devida principalmente à pressão hidrostática e à flexão da membrana [34]. A segunda contribui¸cão,

é a tensão cortical, referente à contratilidade do citoesqueleto aderido a ela. Esta última tensão é mediada por prote´ınas ligadas à fosfolip´ıdeos que podem estar ligadas ao citoesqueleto [35]. A magnitude da contribui¸cão de cada uma das componentes depende do estado de cada célula, das prote´ınas que ligam a membrana como citoesqulesto (filami- nas, α actinina, etc), e de processos que ainda não estão totalmente esclarecidos, pois as contribui¸cões são dependentes umas das outras. Quando por exemplo, a adesão da membrana com o citoesqueleto é reduzida, seja por despolimeriza¸cão, ou por diminui¸cão

(42)

Figura 2.5: (a) Para descrever a flexão da membrana usa-se o conceito geométrico de circunferência osculatriz. Circunferência cujo centro se encontra sobre a normal à curva e tem a mesma curvatura que a curva dada nesse ponto. O raio desta circunferência (r1,r2) é chamado raio de curvatura, é o inverso da magnitude da curvatura. (b) Cria¸cão dos momentos de flexão intr´ınsicos causados por um gradiente na pressão lateralπ(z) ao longo da espessura da bicamada. A curvatura espontânea é determinada pela a¸cão rec´ıproca do gradiente de pressão entre a região da cauda e a região da cabe¸ca dos fosfolip´ıdios. (c) Para dobrar ou flexionar uma membrana uma tensão positiva T+ tem que ser aplicada numa das camadas, e uma tensão negativa T₋ na outra, resultando num momento de flexão M = D(T+−T₋), onde D é espessura da membrana. Figura (a) modificada de [38] e figuras (b) e (c) de [39].

de certas prote´ınas como a miosina, são formadas bolhas de membrana chamadas blebs que crescem do lado externo da membrana. Nestas regiões separadas do citoesqueleto, a componente da tensão que age é a referente à pressão hidrostática. O valor da tensão do bleb é significativamente menor quando comparado com o valor da tensão em outra região da célula ligada ao citoesqueleto [36], [37]. Entre os mecanismos moleculares que as células utilizam para identificar e responder aos sinais mecânicos, foram identificados mecanismos relacionados com elementos que interagem com a membrana plasmática: os canais iônicos mecanosensitivos [40], as prote´ınas sens´ıveis e indutoras de curvatura de membrana (BAR ou ALPS) [41] e as prote´ınas que ligam a membrana plasmática com o citoesqueleto de actina (filamina e miosina I) [35].

2.2.5 Rigidez de flex˜ ao e curvatura de membrana

A descri¸cão da rigidez de flexão de membrana está intimamente ligada ao conceito de curvatura de membrana. A curvatura caracteriza o quanto uma membrana foi flexionada num ponto particular. Por sua vez, a curvatura é descrita pelo raio de um c´ırculo que caracteriza a deforma¸cão sofrida, como mostrado na figura 2.5.

(43)

A curvatura é definida como o inverso do raio, com sinal positivo ou negativo dependendo se o c´ırculo que a define está por cima ou por baixo da membrana respectivamente como ilustrado na parte a) da figura 2.5. Se R → ∞, a membrana descrita será plana na dire¸cão definida por R e viceversa. Por outro lado, os m´ınimos e máximos valores dos raios num ponto particular definem as curvaturas principais, C1 e C2 associadas a esse ponto. A curvatura média, H, e a curvatura gaussianaG, são definidas em fun¸cão de C1

e C2 como,

H = 1

2(C1+C2) , G=C1C2. (2.1) O modelo de energia de Helfrich-Canham possibilita a descri¸cão mais simples para a rigidez de flexão da membrana [42]. Helfrich percebeu que a natureza da bicamada de fosfolip´ıdios tinha carater´ısticas similares aos cristais l´ıquidos. Baseando-se na teoria que existia na época para cristais l´ıquidos [43], ele prôpos o funcional da energia de curvatura por unidade de área como,

E[C1, C2] = κ 2

I

dA[C1+C2−C0]², (2.2) na equa¸cão anterior C0 é a curvatura espontânea e κé a rigidez de flexão da membrana.

Para entender a origem do parâmetro C0, usamos a figura 2.5 (b). Vemos que para uma dada rigidez de flexão κ, o raio de uma ves´ıcula e sua estabilidade podem ser controlados pela tensão no plano da bicamada. Esta tensão aparece da deforma¸cão de fosfolip´ıdios nas bordas causada pela flexão da bicamada para evitar a exposi¸cão da sua região hidrofóbica

à água ou pela inser¸cão de outras moléculas presentes na membrana. São criadas for¸cas compressivas dentro da região hidrof´ılica, para apertar as moléculas de modo à minimizar a exposi¸cão da cadeia hidrofóbica à agua [44]. Estas for¸cas estão presentes nessa região mesmo sem a presen¸ca de uma for¸ca externa aplicada para flexionar a membrana, como no caso (c) da figura 2.5. Uma forma de caraterizar o efeito é introduzir o parâmetro de curvatura espontânea C0 reduzindo a energia de flexão. C0 pode ser ajustado por um gradiente de pressão lateral ^dπ_dz, na dire¸cãoz, normal à membrana, que causa um momento