ORIGINAL ARTICLE P P P P Pububububub... 943 943 943 943 943 ISSN 1679-9216 (Online)
Received: July 2010 www.ufrgs.br/actavet Accepted: October 2010
1Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária (FAMEV), Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa, nº 2367, Bairro Boa Esperança, CEP 78060-900 Cuiabá, MT, Brasil. 2Laboratório de
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Prevalence of Porcine Proliferative Enteropathy Associated to Lawsonia intracellularis in Pigs Slaughtered in Mato Grosso State, Brazil
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ABSTRACT
Background: Porcine proliferative enteropathy (PPE) is an infectious enteric disease that often affects pigs during the growing
and finishing stages. Its etiological agent is the obligate intracellular bacterium Lawsonia intracellularis. This study evaluates PPE frequency and geographic distribution in Mato Grosso state, Brazil, based on PPE diagnosis and epidemiology data from pig herds.
Materials, Methods & Results: An amount of 735 small intestine samples were collected from the ileum of finishing pigs and
culling sows in three slaughterhouses that received animals from 14 breeding farms adopting very similar husbandry systems located in 11 municipalities in Mato Grosso state, Brazil, between August 2006 and July 2007. All samples were processed in the Laboratory of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso, according to standard laboratory routines for histological analyses. These samples were stained using the hematoxilin-eosin (HE) procedures. Those sections that presented at least one of the characteristic histopathological lesions of EPS were evaluated by HE, Alcian blue and Warthin-Starry combined stain (CST) to detect Lawsonia intracellularis-like structures, inside enterocytes and also by immunohistochemistry (IHC) based on a polyclonal antibody. Upon initial histological examination, 124 samples (16.87%) presented histopathological lesions that met the L. intracellularis infection criteria. These 124 samples were analyzed using the CST and IHC protocols, which revealed 2 and 3 positive results, respectively. PPE prevalence in Mato Grosso state was 0.41% in slaughtered pigs, based on the original number of 735 samples analyzed.
Discussion: In Mato Grosso state, the geographic distance between farms does not favor the epidemiological conditions
required for the dissemination of L. intracellularis. Another important epidemiological aspect is the low number of new acquisitions and turnover rates of animals in farms. The influence of these biosecurity variables may therefore explain the low PPE prevalence observed in the present study. The PPE prevalence measured using the IHC protocol in the present sample was similar to that observed in other studies with the same technique. On the other hand, PPE prevalence measured by IHC in this study differs significantly from that found by PCR in previous research, which have shown that, due to its high specificity, PCR is one of the most accurate methods to detect symptomatic as well as asymptomatic animals carrying L. intracellularis. IHC is not as sensitive as PCR, though it is the technique of choice in PPE diagnosis because it allows the identification of the pathogen in the lesion site, which increases reliability of results, instead of merely identifying the agent. The relevance of the results found in this epidemiologic study lies in the representative number of farms and municipalities listed for sample collection, which affords an insight on the number of pigs with L. intracellularis. Also, a geographic panorama of L. intracellularis prevalence is presented, providing elementary data on the animals’ health condition and a useful tool for monitoring the spread of the disease in pig herds in Mato Grosso state, Brazil.
Keywords: ileitis, histopathology, immunohistochemistry, Lawsonia intracellularis, proliferative enteropathy. Descritores: íleite, histopatologia, imuno-histoquímica, Lawsonia. intracellularis, enteropatia proliferativa.
INTRODUÇÃO
Enteropatia proliferativa suína (EPS) é uma do-ença entérica infecciosa de suínos em crescimento/ter-minação [7,10,17] causada pela bactéria intracelular obrigatória Lawsonia intracellularis [19]. A EPS é ca-racterizada por dois quadros clínico-patológicos, uma forma subaguda/crônica de caráter proliferativo e outra aguda de caráter necro-hemorrágico [20,21].
Estudos sobre a epidemiologia demonstram que a grande prevalência desta doença está relacionada aos casos subclínicos, parecendo ser esse o principal fator que contribui para disseminação do agente [7,21]. O di-agnóstico de rebanho da infecção por L. intracellularis pode ser feito por sorologia, imunoperoxidase e/ou PCR de amostras de fezes [7-10,12,16].
O diagnóstico post mortem é baseado na obser-vação de lesões histológicas, sendo uma ferramenta im-portante para o diagnóstico de EPS em granjas e para o monitoramento de abate [8]. A combinação das técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE), Alcian Blue e Warthin-Starry facilitam a evidenciação de alterações compatí-veis com EPS e a observação de bacilos intracelulares morfologicamente compatíveis com L. intracellularis numa mesma secção histológica [4]. A técnica de imuno-histoquímica, apresenta sensibilidade superior, sendo de maior eficiência diagnóstica quando em amostras con-servadas em formol [13].
O objetivo deste estudo foi obter dados de prevalência sobre Enteropatia Proliferativa Suína em animais abatidos em frigoríficos oriundos de diferentes Sistemas Intensivos de Produção de Suínos no Estado de Mato Grosso.
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi realizado entre os meses de Agosto de 2006 a Julho de 2007, as amostras foram obtidas de suínos abatidos em três frigoríficos sob inspeção Esta-dual e Federal, no Estado de Mato Grosso. Foram coletadas 735 amostras de intestino delgado (íleo), de forma aleatória, independente de sexo, idade, raça, his-tórico das propriedades e lesões macroscópicas.
As amostras foram obtidas seccionando-se o íleo a 20 cm da válvula ileocecal. Cada amostra media entre 5 a 8 cm de comprimento. Essas amostras foram acondi-cionadas individualmente em sacos plásticos, identifi-cados e conservados com formol a 10%. No Laborató-rio de Patologia Veterinária da Universidade Federal do
Mato Grosso (LPV-UFMT), estas amostras foram pro-cessadas rotineiramente para cortes histológicos de 5 µm e corados pelas técnica de Hematoxilina e Eosina (HE). Em amostras em que se observou pelo menos uma das seguintes lesões: proliferação de enterócitos, desaparecimento de células caliciformes, dilatação lacteal central, acúmulo de células inflamatórias e debris celu-lares na luz de glândulas intestinais, as mesmas foram submetidas à técnica de coloração combinando HE, azul de alcian1 e Warthin-Starry2 (TC) [4]. Nessas amostras
empregou-se a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) com a utilização de um anticorpo policlonal anti-Lawsonia3 [11,13] com diluição 1:1500 pelo método
Streptavidina-biotina-peroxidase (ABC)4 revelada com
cromógeno 3´3-diaminobenzidina4 (DAB).
O protocolo utilizado para realização da imuno-histoquímica foi: (1) bloqueio da atividade da peroxidase endógena pela incubação das lâminas em metanol com 3% de H2O2 por 15 min, (2) digestão prévia das lâminas em tripsina 0,1% por 15 min a 37°C, (3) irradiação em forno de microondas com as lâminas imersas em 100 mL de tampão citrato pH 6, por 2 min, à potência máxi-ma, atingindo 60°C, (4) redução de marcações inespecíficas pela incubação das lâminas em leite em pó desnatado 5% por 20 min, (5) aplicação do anticorpo primário policlonal anti-L. intracellularis durante 45 min a 37°C, (6) lavagem em solução PBS e (7) incubação com complexo ABC por 40 min, em temperatura ambi-ente. A revelação da reação foi obtida DAB como cromógeno.
Para o cálculo do número de amostras foi utili-zado o programa EpInfo 6.0 [5], baseado no número de suínos abatidos no ano de 2005, aproximadamente 800.000 cabeças [1]. Para efeito desse cálculo estatísti-co foi estatísti-considerada uma prevalência estimada em 12,5% [2], com intervalo de confiança de 95%, e precisão ab-soluta de 5%. A Análise estatística consistiu de uma ava-liação subjetiva sendo empregada uma estatística des-critiva, e uso de porcentagem para apresentação de re-sultados.
RESULTADOS
As amostras foram obtidas em três frigoríficos no Estado de Mato Grosso e eram provenientes de 11 municípios, compreendendo 14 granjas. Essas granjas eram caracterizadas como: 07 Unidades de Terminação, 06 Unidades de Ciclo Completo e de 01 Unidade de
Pro-dução de Leitões, sendo que nesta houve um descarte de matrizes. A Tabela 1 apresenta os municípios de origem e caracterização das granjas.
No exame histológico, dentre 735 amostras, 124 (16,87%) tinham lesões de acordo com os critérios esta-belecidos por conter pelo menos uma das alterações. A maioria das amostras caracterizou-se por uma leve pro-liferação de enterócitos com desaparecimento de célu-las caliciformes e dilatação lacteal central. As 124 amos-tras foram submetidas à TC nas quais duas amosamos-tras apresentaram bacilos morfologicamente compatíveis com L. intracellularis no interior dos enterócitos.
Com o uso da técnica de IHQ, apenas três (3/ 124) apresentaram marcação positiva. Uma das
amos-tras foi positiva na IHQ e negativa na TC. As amosamos-tras positivas na IHQ eram provenientes de dois diferentes sistemas de criação: ciclo completo (duas amostras) e matrizes de descarte da unidade produtora de leitões (uma amostra).
DISCUSSÃO
A prevalência de EPS em suínos abatidos no Estado de Mato Grosso foi de 0,41%, considerando a IHQ como principal técnica de diagnóstico neste estu-do. No trabalho realizado no Rio Grande do Sul, utili-zando a mesma técnica, a prevalência foi de 3% [6], re-sultado similar foi descrito Estados Unidos [18].
No Estado de Mato Grosso as condições epidemiológicas para a disseminação da L. intracellularis são dificultadas pela distância geográfica entre os muni-cípios, e a consequente distância entre os sistemas de produção, outro fator importante é a menor taxa de re-posição e/ou introdução de animais nas granjas. Prova-velmente essas características de biossegurança justifi-cam os baixos índices da EPS encontrados nesse estudo. A prevalência de EPS em diversos países utili-zando-se a PCR em amostras de fezes é superior ao des-te levantamento. Na província do Yucatán no México relatou-se prevalência de 40% das granjas [3]; em um estudo em frigoríficos na Colômbia verificou-se uma prevalência de 87,22% [23]; na Dinamarca relatou-se prevalência de 75% [24]. No Brasil, nos Estados de São Paulo e Santa Catarina constatou-se uma prevalência de 13,8% [2]; em outro estudo contendo amostras de diver-sos Estados detectou-se uma prevalência de 15% em suínos sem sintomatologia clínica [22].
Estudos já indicam que a PCR em virtude de sua alta especificidade é um dos métodos de maior pre-cisão para a detecção de animais infectados e portadores [14-16]. A IHQ utilizada neste estudo tem uma sensibi-lidade menor que a PCR [14], mas é a técnica de escolha no diagnóstico da EPS, pois permite a identificação do agente no local da lesão associando também o padrão lesional com o quadro clínico, aumentando a confiabilidade do resultado, ao invés de apenas identifi-car o agente [15].
CONCLUSÃO
Este trabalho demonstra uma baixa prevalência de L. intracellularis em suínos em idade de abate no Estado de Mato Grosso, situação que pode ser atribuída Tabela 1. Descrição do município, número de granjas,
núme-ro de amostras e tipo de sistema de pnúme-rodução onde foram coletadas as amostras para estudo da Prevalência da enteropatia proliferativa suína causada por Lawsonia intracellularis em suínos no Estado de Mato Grosso, Brasil, durante o período de Agosto de 2006 a Julho de 2007.
Município Nº Granjas Nº amostras Sistema deProdução
Nova Mutum 01 126 Ciclo Completo
Diamantino 01 143 Ciclo Completo
Lucas do Rio
Verde 01 86 Terminação
Sinop 02 41 Terminação
Itiquira 01 29 Ciclo Completo
Campo Verde 01 34 Ciclo Completo
Poxoréo 01 92 Ciclo Completo
Primavera do Leste 01 24 Unidade Produtora de leitões Tapurah 02 78 Terminação Sorriso 02 54 Terminação
Vera 01 28 Ciclo Completo
às características do Sistema de Produção, pois há pou-co pou-contato entre as granjas, o que resulta numa baixa circulação do agente entre os rebanhos e conferindo uma melhor condição sanitária.
Nesse estudo avaliou-se a EPS no Estado de Mato Grosso, verificando-se que o nível de saúde dos rebanhos suínos é alto. Esses resultados comprovam a importância do monitoramento via frigorífico, como for-ma de diagnóstico e avaliação da dinâmica da EPS em estudos epidemiológicos em rebanhos.
NOTAS INFORMATIVAS
1Alcian Blue 8GX, Cat. No. A5268, Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA.
2AgNO
3, Cat. No.1015100250, Merck KGaA, Darmstadt,
Germany.
3Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal
Medicine, Iowa State University, USA.
4DakoCytomation- Carpinteria, CA, USA.
REFERÊNCIAS
1 ABIPECS. Associação Brasileira da Indústria Produtora e Exportadora da Carne suína. 2006. [Fonte: <http://
www.abipecs.org.br>].
2 Bacarro M.R., Moreno A.M & Coutinho L.L. 1998. Porcine proliferative enteritis: histopatological aspects and diagnosis
using polymerase chain reaction. In: Proceedings of the 15th Congress of Internacional Pig Veterinary Society (Birmingham, England). p.108.
3 Buenfil J.R.C. 2000. Identificacíon de Lawsonia intracellularis em 20 granjas porcinas Del estado de Yucatán. Revista
Biomédica (11): 271-275.
4 Driemeier D., Faccini G.S., Oliveira R.T., Colodel E.M., Traverso S.D. & Cattani C. 2002. Silver staining combined with
alcian blue and hematoxylin-eosin detection of Lawsonia intracellularis in swine proliferative enteropathy. Acta histochemica. 104(3): 285-287.
5 Epi-Info 6.0. Center of Disease Control. [Fonte: <http:// www.cdc.gov/EpiInfo>].
6 Faccini G.S., Guedes R.M.C., Pescador C.A., Cruz C.E.F. & Driemeier D. 2005. Diagnóstico histoquímico e
imunoistoquímico de enteropatia proliferativa (Lawsonia intracellularis) em suínos. Arquivo Brasileiro Medicina
Veteri-nária Zootecnia (57): 569-575.
7 Guedes R.M.C. 2004. Update on epidemiology and diagnosis of porcine proliferative enteropathy. Jounal Swine Health
Production. 12(3): 134-138.
8 Guedes R.M.C & Gebhart C.J. 2001. Aspectos atuais sobre a detecção da infecção pela Lawsonia intracellularis em
suínos. In: 10º Congresso da ABRAVES. (Porto Alegre, Brasil).[Fonte:<http://www.cnpsa.embrapa.br/abravessc/].
9 Guedes R.M.C & Gebhart C.J. 2002. Deen. Validation of an immunoperoxidase monolayer assay as a serologic test for
porcine proliferative enteropathy. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (14): 528-530.
10 Guedes R.M & Gebhart C.J. 2003. Comparison of intestinal mucosa homogenate and pure culture of the homologous
Lawsonia intracellularis isolate in reproducing proliferative in swine. Veterinary Microbiology. 93(2): 159-166.
11 Guedes R.M.C & Gebhart C.J. 2003. Preparation and characterization of polyclonal and monoclonal antibodies against
Lawsonia intracellularis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. (15): 438-446.
12 Guedes R.M.C., Gebhart C.J. & Armbruster G.A. 2002. Serologic follow-up of a repopulated swine herd after an
outbreak of proliferative enteropathy. Canadian Journal Veterinary Research (66): 258-263.
13 Guedes R.M.C., Gebhart C.J., Winkelman N.L., Rebecca A.C., Nuss M., Marsteller T.A. & Deen J.N.L. 2002.
Comparison of different methods for diagnosis of porcine proliferative enteropathy. Canadian Journal of Veterinary Research
(66): 99-107.
14 Huerta B., Arenas A., Carrasco L., Maldonado A., Tarradas C., Carbonero A. & Perea A. 2003. Comparison of
diagnostic techniques for porcine proliferative enteropathy (Lawsonia intracellularis infection). Journal of Comparative
15 Jensen T.K., Vigre H., Sorensen V. & Moller K. 2005. Naturally acquired Lawsonia intracellularis infection in pigs
studied from weaning to slaughter by indirect immunofluorescence antibody test and polymerase chain reaction on faeces.
Research in Veterinary Science (79): 93-98.
16 Jordan D.M., Knittel J.P., Roof M.B., Schwartz K., Larson D. & Hoffman L. 1999. Detection of Lawsonia intracellularis
in swine using polymerase chain reaction methodology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (11): 45-49.
17 Lawson G.H.K & Gebhart C.J. 2000. Proliferative enteropathy. Journal Comparative Pathology (122): 77-100. 18 McOrist S. 1997. Enteric diseases: porcine proliferative enteropathies. Pig Journal. (39): 74-76.
19 McOrist S. & Gebhart C.J. 1999. Porcine proliferative enteropathies. In Diseases of Swine. 8th edn. Ames, Iowa: Iowa
State University Press, pp.521-534.
20 McOrist S., Gebhart C.J., Broid R. & Barns S.M. 1995. Characterization of Lawsonia intracellularis ge. Nov., sp. Nov.,
the obligatelly intracellular bacterium of porcine enteropathy. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology (45): 820-825.
21 McOrist S., Roberts L., Jasni S., Rowland A.C., Lawson G.H., Gebhart C.J. & Boswhort B. 1996. Developed and
resolving lesions in porcine proliferative enteropathy: possible pathogenetic mechanisms. Journal of Comparative Pathology (115): 35-45.
22 Moreno A.M., Baccaro M.R. & Coutinho L.L. 2002. Lawsonia intracellularis detection in swine feces from important
producing regions in Brazil. Arquivo Instituto Biológico. 69 (3): 5-8.
23 Rodrigues B.J., Aranzazu D., Giraldo G., Alvarez L.C., Cano E.M. & Isaza B. 2004. Prevalencia de enteropatía proliferativa
porcina y caracterización histopatológica de las lesiones asociadas en cerdos sacrificados em el matadero municipal de Medellín Colombia. Revista Colombiana Ciencias Pecuarias (17):1.
24 Stege H., Jensen T.K, Moller K., Vestgaard K., Baekbo P. & Jorsal S.E. 2004. Infection dynamics of Lawsonia
