Influência da Má-Nutrição sobre as Respostas Inflamatória Aguda e Subcrônica e na Eficácia Farmacológica da Indometacina em Ratos

Texto

(1)RAFAELLA RODRIGUES BARRETO. INFLUÊNCIA DA MÁ-NUTRIÇÃO SOBRE AS RESPOSTAS INFLAMATÓRIA AGUDA E SUBCRÔNICA E NA EFICÁCIA FARMACOLÓGICA DA INDOMETACINA EM RATOS. RECIFE 2011.

(2) RAFAELLA RODRIGUES BARRETO. Influência da Má-Nutrição sobre as Respostas Inflamatória Aguda e Subcrônica e na Eficácia Farmacológica da Indometacina em Ratos. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Mestre em Patologia. Orientador (a ): Profa. Dra. Maria Bernadete de Sousa Maia Co-orientador (a): Profa. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva. RECIFE 2011.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. R E I T O R Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado VICE- REITOR Prof. Sílvio Romero Marques PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Francisco de Sousa Ramos D I R E T O R DO CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE Prof. José Thadeu Pinheiro CHEFE DO DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA Profª. Catarina de Oliveira Neves COORDENADOR DO MESTRADO EM PATOLOGIA Prof. Nicodemos Teles de Pontes Filho VICE-COORDENADOR DO MESTRADO EM PATOLOGIA Prof. Hilton Justino da Silva. R E C I F E 2011 .

(6) Agradecimentos. Agradeço a Deus, orientador da minha vida, por ter me dado persistência e sabedoria para concluir essa etapa da minha vida. Aos meus pais e minhas irmãs pelo amor incondicional e por me apoiarem em todas as minhas decisões. Ao meu namorado Juliano Cazuzú pelo amor, pela paciência, pela injeção diária de bons pensamentos e por ter possibilitado a realização de parte desse trabalho. A Professora Dra. Maria Bernadete de Sousa Maia por todos os ensinamentos, pela credibilidade e por ter sido tão importante para conclusão deste ciclo . A professora Dra. Teresinha Gonçalves da Silva do Departamento de Antibióticos pela paciência ímpar e pela disposição em me auxiliar na realização deste trabalho. A Técnica Rejane Souza e Silva por ter me auxiliado em todos os experimentos e pela doçura com que sempre me tratou. Aos amigos Carlos Fernando Brasileiro e Gustavo Dimech pela grande ajuda na realização de parte deste trabalho. Aos amigos Anacássia Fonseca, Ricardo Martins, Eryvelton Franco, Raphael Dutra e Thiago Oliveira pelo compartilhamento de conhecimentos, pela amizade e por terem tornado a convivência diária muito agradável. As minhas amigas Francine Iane e Diana Malta pelo auxílio em alguns experimentos, pela amizade e por todo incentivo; As minhas amigas Liliane Lima e América Palmeira pela amizade verdadeira, pelo compartilhamento de sorrisos e tristezas e pelo companheirismo constante..

(7) Onde não há obediência, não há virtude. Onde não há virtude, não há bem, não há amor; e onde não há amor, não há Deus, e sem Deus não se chega ao paraíso. Tudo isso é como uma escada: se faltar um degrau, caímos.” “. Santa Teresa D’Ávila.

(8) Resumo Objetivo: Avaliar o impacto da desnutrição intrauterina na intensidade das respostas inflamatórias aguda e subcrônica e suas implicações sobre o efeito anti-inflamatório da indometacina na prole adulta de ratas da linhagem Wistar. Material e Métodos: Ratos machos Wistar divididos em 2 grupos experimentais de acordo com a dieta fornecida às mães: Nutridos (Controle-N; Labina, n=36) e desnutridos durante a gestação (DBR-g, n=36). Aos 60 dias de idade, os grupos foram subdivididos (n=6 animais/grupo) e os animais foram submetidos aos modelos de inflamação aguda e subcrônica. Carragenina ou zymosan (0,1 mL) foi injetado na região subplantar (0 minuto) da pata de cada animal dos grupos ControleN e DBR-g. Os grupos Controle-N e DBR-g receberam salina 0,9% v.o. Outros grupos foram submetidos ao mesmo procedimento acima, mas receberam indometacina (10 mg/Kg, v.o) 45 minutos antes da injeção do agente e foram divididos em dois grupos: Controle-NI (Normonutridos tratados com indometacina) e DBRI-g (DBR-g tratados com indometacina). O volume do edema inflamatório das patas foi calculado nos tempos 0, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos. No modelo de inflamação subcrônica, dois “pellets” de algodão de 50 ± 1 mg foram assepticamente implantados na região dorsal dos animais dos grupos Controle-N e DBR-g e esses receberam 0,9% de salina v.o durante sete dias consecutivos. Outros grupos de animais (Controle-NI e DBRI-g) foram submetidos ao mesmo procedimento acima, porém foram tratados diariamente com indometacina (2mg/Kg; v.o) em uma única dose diária. Posteriormente, os animais foram dissecados e os “pellets” foram submetidos ao processo de desidratação para obtenção do peso médio. Ao final dos experimentos, amostras de sangue foram retiradas de todos animais para avaliação de parâmetros hematológicos e bioquímicos e do homogenato da pele da região suplantar dos animais para dosagem de citocinas. Resultados: A desnutrição durante a gestação promoveu retardo do crescimento fetal refletido no baixo peso ao nascimento (5,38 ± 0,28) quando comparado ao grupo Controle-N (7,26 ± 0,64). O volume do edema das patas, os níveis séricos de PCR e albumina e os níveis de citocinas foram inferiores nos animais dos grupos DBR-g quando comparados aos grupos Controle-N nos modelos de inflamação aguda; o peso médio dos granulomas e os níveis séricos de PCR e albumina foram inferiores nos animais dos grupos DBR-g quando comparados aos grupos Controle-N no modelo de inflamação subcrônica. Entretanto, nenhuma diferença foi encontrada na contagem total de leucócitos. Quando comparados aos respectivos grupos tratados com salina (Controle-N e DBR-g), o efeito anti-inflamatório da indometacina foi menor nos animais dos grupos DBRI-g do que nos grupos Controle-NI no modelo de inflamação aguda; no modelo de inflamação subcrônica, o efeito anti-inflamatório da indometacina foi reduzido nos animais desnutridos. Conclusão: A desnutrição precoce atenuou a severidade da resposta inflamatória aguda, mas não foi verificada alteração estatisticamente significante na inflamação subcrônica induzida por lesão granulomatosa. PALAVRAS-CHAVE: Desnutrição precoce; inflamação; indometacina.

(9) Abstract Aim: To assess the impact of intrauterine malnutrition on the severity of acute and subchronic inflammatory responses and their implications for the pharmacological effect of indomethacin in the adult offspring of Wistar rats. Methods and Materials: Male Wistar rats were divided into two groups according to the diet fed to mothers: normal nourished rats (Control-N, Labina, n = 36) and undernourished during pregnancy ones (BRD-g, n = 36). At 60 days of age, the groups were subdivided and the animals were subjected to models of acute and subchronic inflammation. Carrageenan or zymosan (0.1 mL) was injected into the sub plantar region (0 min) of the hind paw of each animal in both Control-N and BRD-g groups. All animals received 0.9% v.o. saline .Other groups of animals underwent the same procedure as above but were given indomethacin (10 mg / kg, po) 45 min before the injection of the agent and then divided into two groups: Control-NI (normal nourished rats treated with indomethacin) and BRDI-g (BRD-g rats treated with indomethacin). The paw edema volume was calculated at 0, 30, 60, 120, 180 and 240 minutes. In the subchronic model of inflammation, two cotton pellets of 50 ± 1 mg were aseptically implanted in the dorsum of the animals in the Control-N and DBR-g groups and they received 0.9% v. o. saline for seven consecutive days. Other groups of animals (Control-NI and BRDI-g) underwent the same procedure as above but were treated daily with indomethacin (2 mg/kg; v.o.) in a single daily dose. Subsequently, the pellets were subjected to dissection to obtain the average weight. At the end of the experiments, blood samples were taken from all animals for evaluation of hematological and biochemical parameters and a homogenate of the skin of the subplantar zones of the animals was made, in order to measure the cytokine levels. Results: Malnutrition during pregnancy caused fetal growth retardation shown by the low birth weight (5.38 ± 0.28), when compared to the Control-N (7.26 ± 0.64) group. The volume of paw edema, the serum levels of CRP and albumin, the average weight of the granulomas and the cytokine levels were lower than those in the BRD-g groups when compared to the ones in the ControlN groups in both models of inflammation that were studied. However, no difference was found in the total leukocyte count. When compared to the respective groups treated with saline (Control-N and BRD-g), the antiinflammatory effect of indomethacin in the model of acute innflamation, in the animals of BRDI-g groups was lower than in the Control-NI groups ; in the model of subchronic inflammation, the pharmacological effect of indomethacin was effective only in normal nourished animals Conclusion: The malnutrition in the early stages of development attenuated the severity of the acute inflammatory response, but there was no statistically significant change in subchronic inflammation induced by granulomatous lesion. KEYWORDS: Early undernutrition; inflammation; indomethacin..

(10) LISTA DE ILUSTRAÇÕES ARTIGO ORIGINAL. Figura 1. Time course of hind paw swelling in time zero, 30, 60, 120, 180 and 240 after carrageenan (figure 1A) or zymosan injection (figure B) on control-N and undernourished adult male rat offspring………………………... 63 Figura 2. Effect of treatment with indomethacin (10 mg/Kg) on hind paws edema on control-N (figure 2A) and undernourished (figure 2B) adult male Wistar rat offspring after carrageenan injection………………………………... 63. Figura 3. Effect of treatment with indomethacin (10 mg/Kg) on hind paws edema on control-N (figure 3A) and undernourished (figure 3B) adult male Wistar rat offspring after zymosan injection………………………………….... 64. Figura 4. Effect of treatment with Indomethacin (2mg/Kg) on the average weight of the granulomas of a adult male wistar rats in BRD-g and in ControlN groups………………………………………………………………………... 64 Figura 5. Levels of TNF-α in control and undernourished adult male Wistar rat offspring after carrageenan (figure 5A) and zymosan (figure 5B) injection.. 65 Figura 6. Levels of IL-6 in control and undernourished adult male Wistar rat offspring after carrageenan (figure 6A) and zymosan (figure 6B) injection….... 65.

(11) LISTA DE TABELAS ARTIGO ORIGINAL. Tabela 1. Data on Wistar Rat offspring of dams nourished (Control-N) and that received a Basic Regional Diet (BRD) during gestation (BRD-g)…………………. 61 Tabela 2. Avarege weight of the cotton pellets of male Wistar rats of Control-N and BRD-g groups…………………………………………………………………... 61. Tabela 3. Biochemical and hematological parameters of Control-N and Undernourished adult male Wistar rat offspring……………………………………. . 62.

(12) SUMÁRIO 1. APRESENTAÇÃO.................................................................................................. 11. 2. Objetivos.................................................................................................................. 13. 3. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 3.1. Aspectos gerais do estado nutricional................................................................... 14. 3.2. O processo inflamatório.......................................................................................... 3.3. Mediadores químicos envolvidos na resposta inflamatória................................ 19. 3.4. Eventos vasculares da resposta inflamatória e formação do edema.................. 3.5. Moléculas de adesão de membrana envolvidas na migração leucocitária.............................................................................................................. 28. 3.6. Marcadores da resposta de fase aguda................................................................. 3.7. Fase Subcrônica da Resposta Inflamatória.......................................................... 29. 3.8. Indometacina........................................................................................................... 30. 3.9. Nutrição, sistema imune e inflamação................................................................... 4. MÉTODOS.............................................................................................................. 34. 4.1. Animais..................................................................................................................... 34. 4.2. Manipulação Nutricional........................................................................................ 34. 4.3. Delineamento metodológico.................................................................................... 35. 4.3.1. Fase aguda da resposta inflamatória – Edema de pata induzido por carragenina.............................................................................................................. 35. 4.3.2. Fase aguda da resposta inflamatória – Edema de pata induzido por zimosan..... 4.3.3. Fase subcrônica da resposta inflamatória – Lesão granulomatosa induzida por pellets de algodão..................................................................................................... 36. 4.3.4. Determinação dos parâmetros bioquímicos e hematológicos................................. 37. 4.3.5. Dosagem de citocinas............................................................................................... 37. 4.4. Analíse estatística.................................................................................................... 38. 4.5. Considerações bioéticas.......................................................................................... 38. 5. RESULTADOS....................................................................................................... 39. 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................. 62. REFERÊNCIAS................................................................................................................... 63. ANEXOS............................................................................................................................... 77. ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE.................................... 77. 14 17 27. 29. 31. 36. ANEXO B – Normas e Instruções aos Autores do European Journal of Pharmaceutical Sciences..................................................................................................... 78 ANEXO C- Encaminhamento do Artigo Original........................................................... . 93.

(13) 11. APRESENTAÇÃO 1 APRESENTAÇÃO Estudos indicam que a desnutrição é um dos fatores não genéticos que mais interferem no desenvolvimento normal dos órgãos e participam de doenças crônico-degenerativas. O mecanismo subjacente ao desenvolvimento dessas afecções parece estar associado aos efeitos deletérios das deficiências nutricionais no período crítico de desenvolvimento. Evidências epidemiológicas têm demonstrado que a carência de nutrientes na infância eleva o risco de obesidade e doenças correlatas (hipertensão, diabetes tipo II, dislipidemia, hiperinsulinemia e doenças cardíacas) na vida adulta. Por outro lado, a reação inflamatória representa um conjunto de reações locais e gerais do organismo contra uma agressão. Ela é composta por uma série de fenômenos complexos que se associam e se complementam uns aos outros em uma reação em cascata. A resposta inflamatória visa, em última instância, combater o agente agressor e eliminar produtos resultante da destruição celular, promovendo condições ideais para o reparo do tecido lesado. A inflamação pode ser de origem aguda ou crônica. O processo inflamatório agudo pode durar minutos, horas ou dias, independe da natureza do agente agressor e apresenta respostas semelhantes a estímulos distintos. O processo inflamatório crônico tem duração prolongada que pode variar de semanas a meses, no qual há tentativas de reparo através da proliferação de fibroblastos e formação de granuloma. Estudos experimentais realizados com animais na fase adulta têm demonstrado que a deficiência nutricional predispõe a um baixo grau de resposta inflamatória local e sistêmica, e dessa forma, a resposta do hospedeiro a estímulos encontra-se prejudicada, o que o torna mais susceptível ao desenvolvimento de infecções e danos teciduais. No sistema imune, a desnutrição perinatal altera os mecanismos de defesa, com prejuízos da função fagocitária de macrófagos, na ação do sistema complemento e na produção de citocinas. Tanto a imunidade humoral como a celular encontram-se comprometidas na presença de desnutrição perinatatal. O uso de fármacos anti-inflamatórios não-esteróides costuma ser indicado nos casos em que a morbidade da reação inflamatória supera os benefícios de regeneração tecidual proporcionados pela inflamação. Esses fármacos constituem um grupo heterogêneo de moléculas com propriedades anti-inflamatórias, analgésicas e antipiréticas eficazes, embora a incidência de seus efeitos adversos em decorrência do uso continuado seja alta..

(14) 12. Alguns estudos têm investigado o impacto da desnutrição intrauterina sobre as respostas inflamatórias aguda e subcrônica, bem como suas repercussões sobre a eficácia farmacológica de alguns fármacos não-esteroidais, sobreduto a indometacina. No entanto, é preciso aprimorar a abordagem da influência da programação fetal resultante da desnutrição perinatal sobre as respostas inflamatórias local e sistêmica. O presente trabalho teve como objetivo geral investigar o perfil da reposta inflamatória da prole adulta de ratas da linhagem Wistar submetidas à desnutrição durante a gestação, utilizando-se um modelo nutricional denominado Dieta Básica Regional (DBR), bem como avaliar as implicações da desnutrição precoce sofre o efeito anti-inflamatório da indometacina. Os objetivos específicos deste trabalho consistiram em avaliar: 1) o perfil da resposta inflamatória aguda e o da subcrônica de ratos machos Wistar adultos provenientes de matrizes submetidas à desnutrição durante a gestação, 2) a influência da desnutrição intrauterina sobre o efeito anti-inflamatório da indometacina e sobre alguns marcadores da resposta inflamatória (Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e Interleucina -6 (IL-6)). Esse estudo foi realizado no Laboratório de Farmacologia e de Produtos Bioativos do Departamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de Ciências Biológicas (CCB) da Universidade Federal de Pernambuco, tendo como orientadora Profª Drª Maria Bernadete de Sousa Maia e como co-orientadora Profª Drª Teresinha Gonçalves da Silva. O estudo originou o artigo científico intitulado: Impact of early malnourishment on the acute and subchronic inflammatory responses and its implications in the effect of indomethacin in Wistar rats, que foi submetido para publicação na revista “European Journal of Pharmaceutical Sciences”..

(15) 13. OBJETIVOS 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral: - Investigar o perfil da resposta inflamatória de ratos machos Wistar adultos provenientes de matrizes submetidas à desnutrição durante a gestação e suas implicações sobre o efeito antiinflamatório da indometacina. 2.2 Objetivos específicos: - Avaliar os perfis das respostas inflamatória aguda (volume do edema de pata induzido por carragenina ou zymosan) e da subcrônica (reação granulomatosa induzida por “pellets” de algodão) na prole de ratas Wistar submetidas à desnutrição durante a gestação; - Determinar o número total e diferencial de leucócitos nos animais desnutridos e normonutridos; - Determinar a concentração plasmática de alguns marcadores da resposta inflamatória (PCR e albumina) - Determinar os níveis das citocinas (TNF-α e IL-6) no homogenato de pata de animais desnutridos e normonutridos submetidos aos modelos experimentais de inflamação aguda..

(16) 14. REVISÃO DA LITERATURA 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Aspectos gerais do estado nutricional A desnutrição é uma condição patológica que resulta da privação nutricional adequada e freqüentemente acontece devido à pobreza (OMS, 1999). Além dos fatores fisiológicos, elementos políticos, sociais, econômicos e culturais estão envolvidos. Segundo a Organização das Nações Unidas (ONU), a má nutrição engloba um grupo de distúrbios nutricionais que resulta da falta concomitante de calorias e de proteínas. A má nutrição calórico-protéica pode alterar uma série de órgãos e tecidos, tendo em vista que as proteínas são componentes importantes para a estrutura e função específicas das células do organismo (CICOGNA et al., 2001). O estado nutricional é definido por indicadores antropométricos que verificam o crescimento e, indiretamente, pela alimentação insuficiente (HOFFMAN, 1995). O desenvolvimento e a manutenção das dimensões corporais apropriados necessitam de condições viáveis, principalmente em relação à ingestão e utilização biológica de calorias e proteínas pelo corpo. Geralmente a má nutrição está associada a outras condições nocivas à saúde, como infecções, pobreza e doenças crônicas, como as doenças cardíacas de origem congênita, fibrose cística, falência renal crônica e doenças neuromuscular (GROVER e LOOI, 2009). No Brasil, inquéritos epidemiológicos recentes revelaram uma elevada freqüência de baixa estatura e reduzido peso corporal, características antropométricas indicativas da ocorrência da desnutrição em estágios diferenciados dos períodos iniciais do ciclo vital (MONTE, 2000; ACUNÃ e CRUZ, 2004). A má nutrição calórico-protéica é reconhecida como uma das principais causas de mortalidade infantil e agravo à saúde de indivíduos senis (BERGSTROM E LINDHOLM, 1998) e portadores de doenças debilitantes (BRUNN et al., 1999). A desnutrição por carência de energia (calorias) e proteínas é a forma mais letal de má nutrição e tem um papel significativo em pelo menos metade das 10,4 milhões de mortes anuais de crianças nos países em desenvolvimento e lesa uma em cada quatro crianças em todo o mundo. Destas, 150 milhões (26,7%) possuem baixo peso e 182 milhões (32,5%) possuem atraso do.

(17) 15. desenvolvimento físico e mental. Geograficamente, mais de 70% das crianças com carências energetico-protéicas vivem na Ásia (principalmente no oeste asiático), 26% na África e 4% na América Latina e Caribe (UNICEF, 1998; OPAS/OMS, 2000). No Brasil, um estudo feito no semi-árido mostrou que crianças com menos de 2 anos de idade estavam muito susceptíveis à desnutrição em 484 municípios (34,3% do total de 1.444), e mais de 10% das crianças nessa faixa etária encontravam-se com quadro de desnutrição instalado (UNICEF, 2005). Uma alimentação adequada é imprescindível para que os seres vivos atinjam seu pleno potencial de crescimento, saúde, reprodução e longevidade (GIANINI; VIEIRA; MOREIRA, 2005). A má nutrição é um dos fatores não genéticos que mais interferem no desenvolvimento normal dos órgãos (MORGANE et al., 1993; BATISTA FILHO; RISSIN, 2003 ). Esse fenômeno pelo qual um estímulo ou insulto, quando aplicado em fases críticas do desenvolvimento, pode conduzir a alterações permanentes na estrutura e função dos tecidos é conhecido como programação (LUCAS, 1991; LUCAS; FEWTRELL; COLE, 1999). Indivíduos mal nutridos no início da vida, onde o período de crescimento ocorre de forma acelerada, apresentam importantes mudanças nas quais o organismo deverá ajustar-se para sobreviver (ENGELBREGT et al, 2000). Um dos mecanismos usados é a diminuição na taxa de divisão celular, com possibilidade de alterar a “programação” da estrutura e função do sistema (LUCAS, 1991; BARKER e CLARK, 1997; DENNISON et al, 1997). Na vida fetal, os órgãos e tecidos do corpo passam pelo chamado período crítico de desenvolvimento que coincide com períodos de rápida divisão celular. Embora o crescimento do feto seja influenciado por seus genes, alguns autores sugerem que pode ser limitado pelo meio ambiente (BARKER, 1998; OSMOND e BARKER, 2000; GODFREY e BARKER, 2001). Quando um indivíduo recebe uma alimentação insuficiente quantitativamente ou inadequada do ponto de vista qualitativo, sobretudo no início da vida, o sistema nervoso, órgão controlador de toda a atividade metabólica, programa-se permanentemente para economizar energia em forma de gordura e reduzir o crescimento para garantir a sobrevivência em condições adversas (SAWAYA, 2006). Em humanos e animais, estudos evidenciaram que a dieta hipoprotéica durante a gestação e lactação gera alterações fisiológicas e morfológicas que se traduzem em danos funcionais podendo repercutir por toda a vida (OZANNE; HALES, 2002; GIANINI; VIEIRA; MOREIRA, 2005). Estudos realizados em humanos demonstraram a existência de uma relação entre a má nutrição fetal e doenças crônicas na vida adulta (SCRIMSHAW, 1997; SLOAN et al, 2001), pontuando uma associação entre retardo do crescimento fetal,.

(18) 16. conseqüente à má nutrição no útero, com o desenvolvimento de Hipertensão Arterial Sistêmica (ERIKSSON et al., 2000) e doenças coronarianas na vida adulta (LEISTIKOW, 1998). Lucas (1998) sugeriu a hipótese da existência de uma programação nutricional de doenças tardias causadas por manipulações nutricionais nos períodos pré e pós-natal. Vários protocolos utilizando dietas de composições diferentes foram propostos para o estudo dos efeitos da má nutrição ou da deficiência de determinados nutrientes na formação, desenvolvimento e manutenção das funções orgânicas (HU et al., 2000). Passos et al. 2000 demonstraram que a restrição protéica (8% de proteína) durante a lactação provoca alterações no volume e na composição do leite das ratas lactantes com repercussões no ganho de peso da prole. Estudo realizado por HU et al. (2000), utilizando uma dieta com restrição protéicocalórica, durante o período intrauterino em ratos, apontou para a deficiência de proteínas maternas, como sendo a maior causa de má nutrição. Essa deficiência resultou em efeitos deletérios, tanto no crescimento corpóreo demonstrado por baixo peso e baixa estatura (TEODÓSIO et al., 1990; MARÍN et al., 1995; PASSOS et al., 2001; EL-SAYED et al., 2006; SAWAYA, 2006; GAMA, LIBERTI e SOUZA, 2007), quanto no desenvolvimento de órgãos e sistemas, tais como intestino, rins, fígado, pâncreas, coração, sistema imunológico dentre outros (DESAI et al., 1996; DESAI et al., 2005; GURMINI et al., 2005; EL-SAYED et al., 2006; PORTO et al., 2006). Além da importância da presença dos componentes protéicos e calóricos na dieta (JEOR et al., 2001), dependendo da fase de desenvolvimento a que o indivíduo é submetido, a má nutrição pode também interferir na estrutura e função normal dos órgãos e tecidos (CICOGNA et al., 2001). Em ratos, quando a restrição calórico-protéica ocorre entre as 1ª e 3ª semanas do período pré-natal, induz repercussões significativas no ganho ponderal, no desenvolvimento do sistema nervoso e na morfologia renal (MCCANCE, 1962). Nesses animais, a fase de maior divisão celular acontece no período de aleitamento, a partir do qual ocorre maior desenvolvimento dos órgãos e maturação do SNC, portanto, diferindo do homem, no qual essa fase tem início no terceiro trimestre da gestação, estendendo-se até o segundo ou terceiro ano após o nascimento (GUEDES, 1985). Estudos nutricionais realizados por TEODÓSIO et al. (1990), a partir de uma enquête alimentar com a população da Zona da Mata do estado de Pernambuco, permitiram a formulação de um modelo nutricional chamado Dieta Básica Regional (DBR). A DBR é deficiente em proteínas, lipídios, vitaminas, minerais, e tem sido considerada por muitos pesquisadores como dieta modelo para estudos experimentais de má nutrição em animais,.

(19) 17. visto que seus efeitos assemelham-se aos estados nutricionais observados em comunidades carentes do Nordeste brasileiro (TEODÓSIO et al., 1990; PAIXAO et al., 2001; MONTEIRO et al., 2001). 3.2 O processo inflamatório A reação inflamatória é um mecanismo fisiopatológico em resposta à invasão por um agente infeccioso ou apenas uma reação a uma lesão de natureza variada (térmica, química e/ou mecânica), sendo representada por um conjunto de reações locais e sistêmicas do organismo. Esse mecanismo é composto por vários fenômenos que se associam e se complementam uns aos outros formando uma reação em cascata, que envolve uma complexa interação de células inflamatórias (neutrófilos, linfócitos, monócitos/macrófagos), das células vasculares da muculatura lisa e de células endoteliais (TEDGUI e MALLAT, 2001). A resposta infamatória visa destruir ou neutralizar o agente agressivo sendo portanto, uma reação de defesa e reparo do dano tecidual (CHANDRASSOMA e TAYLOR, 1993). A inflamação é caracterizada, em sua forma aguda, pelos sinais cardinais de dor, calor, rubor, edema e perda de função, envolvendo uma série de eventos como: aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular, exsudação de fluídos, migração de leucócitos, liberação de agentes algésicos e dos efeitos induzidos por mediadores químicos no foco inflamatório (KUMAR, ABBAS e FAUSTO, 2005). O resultado principal do processo inflamatório agudo é a bem sucedida resolução e reparo do dano tecidual, mais do que a persistência da inflamação, que normalmente pode levar à formação de quelóides, tecido de granulação e perda de função (SERHAN e SAVILL, 2005). A inflamação aguda se caracteriza pelo predomínio de fenômenos exsudativos conseqüentes das alterações na permeabilidade vascular, levando ao acúmulo de líquido na região inflamada, fibrina, leucócitos, especialmente neutrófilos e hemácias. Evidências demonstram que vários fatores desempenham importantes papéis na modulação de cada uma das fases da resposta inflamatória aguda. Na fase preococe, mediadores como a histamina e a bradicinina modulam a resposta inflamatória aumentando o calibre e o fluxo vascular, responsável pelo calor e rubor presente no foco da inflamação (KUMAR, ABBAS E FAUSTO, 2005; ALBERTINI et al., 2004). A inflamação aguda tem duração relativamente curta, durando alguns minutos, horas ou dias e é independente da natureza do agente agressor, sendo a resposta muito similar aos.

(20) 18. diferentes estímulos. A resposta fisiológica que ocorre imediatamente após um estímulo agressivo é referida como uma fase precoce (0-1 hora), ao contrário do que ocorre na fase tardia da inflamação aguda (5-6 horas após a lesão), onde as células inflamatórias se acumulam no local lesado (ALBERTINI et al., 2004). Durante a fase tardia da inflamação aguda, há predominância de eventos celulares que se caracterizam pela marginação, aderência endotelial, diapedese e migração dos leucócitos para o foco da lesão decorrentes de estímulos quimiotáticos. Todos os granulócitos, monócitos, e em menor grau, linfócitos respondem aos estímulos quimiotáticos com taxas variáveis de velocidade (KUMAR, ABBAS E FAUSTO, 2005). Diversas substâncias endógenas e exógenas podem atuar como agentes quimiotáticos. Os agentes quimiotáticos exógenos são principalmente produtos bacterianos. Dentre as substâncias endógenas que podem atuar como agentes quimiotáticos, podem ser citados: componentes do sistema complemento- C5a (KILGORE et al., 1994), fator de atvação plaquetária (PAF) (KIM et al., 1995),. vários. produtos. da. lipooxigenase-. Leucotrieno. B4. (LTB4). ou. ácidos. hidroxieicosatetraenóicos (HETEs) (FREED et al., 1999) e alguns produtos da ciclooxigenase como as prostaglandinas (ISSEKUTZ et al., 1982). Os leucócitos penetram nos tecidos através da passagem pelas paredes dos vasos sanguíneos, após a ligação por intermédio de moléculas de adesão aos respectivos receptores no endotélio e subsequente processo de transmigração pelo endotélio. A migração leucocitária para dentro dos tecidos é essencial para defesa contra patógenos e antígenos estranhos ao organismo. No entanto, este mesmo fenômeno pode produzir inflamação inapropriada e destruição tecidual em vários tipos de doenças inflamatórias crônicas, agudas e auto-imunes (JAAKKOLA et al., 2000). A ativação leucocitária, liberação de radicais livres, proteases, metabólitos do ácido araquidônico, citocinas inflamatórias e antiinflamatórias liberadas no local inflamado podem induzir a secreção de quimiocinas e substâncias imunomoduladoras pelas células endoteliais, epiteliais e células intersticiais, criando uma reposta inflamatória local exacerbada (RINALDO et al., 1990; AGOURIDAKIS et al., 2002). Os eventos seguintes dessas interações humorais/celulares são importantes para iniciação e propagação da resposta inflamatória responsável por injúrias teciduais (STRIETER et al., 1994). A inflamação crônica tem duração prolongada (semanas a meses), na qual há inflamação ativa, destruição tecidual e as tentativas de reparo estão ocorrendo simultaneamente. Embora possa suceder a inflamação aguda, a inflamação crônica começa, com freqüência, de maneira insidiosa, como uma resposta de baixo grau, latente e muitas.

(21) 19. vezes pela ausência dos sinais cardinais da inflamação. A inflamação crônica origina-se de infecções persistentes por certos microrganismos, por exposição prolongada a agentes parcialmente tóxicos (inalação de sílica) e de distúrbios de auto-imunidade (Artrite Rematóide, Lúpus Eritematoso Sistêmico) (COLLINS, 2000). Diferentemente da inflamação aguda que se manifesta por alterações vasculares, edema e infiltração, principalmente de neutrófilos, a inflamação crônica se caracteriza por: •. Infiltração de células mononucleares, que incluem macrófagos, linfócitos e plasmócitos;. •. Destruição tecidual induzida sobretudo pelas células inflamatórias;. •. Tentativas de cicatrização por substituição do tecido danificado por tecido conjuntivo, realizada por proliferação de pequenos vasos e em particular fibrose (COLLINS, 2000).. Durante a evolução do processo de reparo, os eventos que ocorrem são: infiltração de neutrófilos, infiltração de macrófagos, fibroplasia e deposição de matriz extracelular, angiogênese, cicatrização e reepitelização (GERSZTEN et al., 1999). 3.3 Mediadores químicos envolvidos na resposta inflamatória Os mediadores do processo inflamatório originam-se do plasma ou das células. Os mediadores oriundos do plasma estão presentes em formas precursoras que devem ser ativadas, em geral por uma série de clivagens proteolíticas, a fim de adquirir suas propriedades biológicas. Os mediadores oriundos de células estão contidos em grânulos intracelulares que precisam ser secretados (por exemplo histamina nos mastócitos) ou são sintetizados originalmente (p.ex. prostaglandinas, citocinas) em resposta a um estímulo. As principais fontes celulares são as plaquetas, os neutrófilos, os monócitos/macrófagos, mastócitos e as células mesenquimais (endotélio, músculo liso) e fibroblastos também podem ser induzidos a elaborar alguns mediadores) (COLLINS, 2000). A inflamação é desencadeada, conduzida, controlada e extinta pela presença de mediadores químicos, cada um com um papel específico, atuando em estágios definidos da resposta inflamatória. Dividem-se nos seguintes grupos: aminas vasoativas (histamina e serotonina), proteases plasmáticas (sistema de cinina- bradicinina, sistema complemento, sistema de coagulação-fibrinolítico); metabólitos do ácido araquidônico (via ciclooxigenase e via lipooxigenase), proteases lisossômicas, radicais livres derivados do oxigênio, fatores.

(22) 20. ativadores das plaquetas (PAF), quimiocinas, citocinas e óxido nítrico (KUMAR, ABBAS E FAUSTO, 2005; ALBERTINI et al., 2004). AMINAS VASOATIVAS A histamina encontra-se distribuída nos tecidos, sendo os mastócitos, normalmente presentes no tecido conjuntivo adjacente, a fonte mais rica. Também é encontrada nos basófilos e plaquetas. Em humanos, a histamina causa dilatação das arteríolas e aumento da permeabilidade vascular. É considerada o principal mediador na fase imediata de aumento da permeabilidade vascular e exerce seus efeitos pela ocupação principalmente de receptores H1 localizados nas células endoteliais (COLLINS, 2000). A serotonina possui ações semelhantes às da histamina e foi originalmente isolada do sistema das células enterocromafins na mucosa gastrointestinal, mas também está presente no sistema nervoso central e nas plaquetas (BARMAN, 1997). MICHEL e KENDALL (1997) demonstraram que os efeitos da serotonina e da histamina eram temporários, com picos de aumento da permeabilidade dentro de 3 minutos após microperfusão com a serotonina e entre 6 a 9 minutos com a histamina. A permeabilidade retornou aos níveis normais entre 12 e 30 minutos, a despeito da presença do mediador no perfusato. Portanto, a mudança de permeabilidade durante o tempo corresponde aproximadamente com a abertura e fechamento dos “gaps” no endotélio vascular. CININAS As cininas se interrelacionam com dois fatores derivados do plasma, o sistema complemento e da coagulação. A bradicinina e a lisil-bradicinina são peptídeos cujo precursor é o cininogênio de alto peso molecular, presente na fração globulínica do plasma. São hormônios ativos localmente e liberados principalmente pela calicreína plasmática (BHOOLA et al., 1992). Classificada como autacóide de ação local, a bradicinina produz dor, vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, síntese de prostaglandinas, liberação de histamina dos mastócitos, etc. Possui capacidade de contrair a musculatura lisa extra-vascular, especialmente útero de rato e íleo de cobaio. O mecanismo de ação das cininas envolve a ativação de 3 receptores, B1, B2 e B3, que por meio da ativação da fosolipase C, aumenta as concentrações de cálcio citosólico. Além disso, a bradicinina também é capaz de ativar a fosfolipase A2, resultando em síntese de eicosanóides (GARRISON, 1991)..

(23) 21. SISTEMA COMPLEMENTO Compreende 20 proteínas encontradas em maior concentração no plasma e funciona na imunidade inata e adaptativa, defendendo o organismo contra agentes microbianos através de lise pelo chamado Complexo de Ataque à Membrana (CAM) (REID et al., 1998). Na formação do CAM, uma série de componentes do complemento são produzidos, causando aumento da permeabilidade vascular, quimiotaxia e opsonização (MORGAN, 1995). Os fatores derivados do complemento executam uma série de fenômenos na inflamação aguda. C3a e o C5a podem aumentar a expressão do receptor para adesão celular endotelial neutrofílica, induzir extravasamento vascular, atrair leucócitos por quimiotaxia e estimular a liberação de histamina e enzimas líticas na área afetada (KAJITA et al., 1990; MEUER et al., 1981). SISTEMA DE COAGULAÇÃO A inflamação e a coagulação são dois processos intimamente relacionados que fazem parte de uma única resposta defensiva do organismo. Alguns estudos já referiram o envolvimento da formação de fibrina no edema de pata induzido por carragenina, estabelecendo uma ligação entre a inflamação e a coagulação (WISEMAN et al., 1968). De acordo com CICALA et al (1998), após dano ao endotélio vascular, uma proteína receptora de alta afinidade para trombina é liberada (trombomodulina). O complexo trombinatrombomodulina ativa a Proteína C que forma um complexo com um co-fator, a proteína S no endotélio. A proteína C ativada inibe a coagulação e ativa a via fibrinolítica. Por outro lado, a trombina ativa a via da proteína C, agindo como inibidor de sua própria produção por feedback negativo. Portanto, a presença de trombomodulina no endotélio e a integridade da via da proteína C são requisitos fundamentais para um correto balanço entre a coagulação e a fibrinólise (ESMON et al., 1991). A trombina tem se mostrado indutora de várias respostas celulares que estão envolvidas na inflamação, tais como: quimiotaxia para monócitos e neutrófilos, mitogênese para diferentes tipos celulares e estimulação das células endoteliais com liberação de prostaciclina (PGI2) (OHBA et al., 1996)..

(24) 22. METABÓLITOS DO ÁCIDO ARAQUIDÔNICO A principal fonte de eicosanóides é o ácido araquidônico (AA) (ácido 5,8,11,14eicosatetraenóico), um ácido graxo insaturado com 20 átomos de carbono contendo quatro ligações duplas. O ácido araquidônico é encontrado esterificado nos fosfolipídeos da membrana e vários estímulos, como a trombina das plaquetas, o fragmento do sistema complemento C5a nos neutrófilos, as reações antígeno-anticorpo nos mastócitos e lesões celulares são estímulos para liberação do ácido araquidônico. O AA livre, liberado a partir dos fosfolipídios de membrana pela enzima fosfolipase A2, é metabolizado por diversas vias: via das ciclooxigenases, que iniciam a biossíntese das prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXs), e por várias lipooxigenases que iniciam a síntese dos leucotrienos (LTs), as lipoxinas e outros compostos. (RANG et al, 2007). Em células de mamíferos as cicloxigenases (COXs) existem em pelo menos duas isoformas (COX-1 e COX-2). A COX-1 é uma enzima constitutiva, expressa em quase todo tipo de célula responsável pela produção de prostaglandinas (PGs), com função fisiológica, em diversos órgãos, e tromboxano A2 (TXA2) que é expresso nas plaquetas. A COX-2, por outro lado, geralmente está ausente na maioria dos tecidos (com exceção dos rins, partes do cérebro e útero gravídico, onde a COX-2 é constitutiva), mas sua expressão pode ser facilmente induzida por numerosos estímulos como fatores de crescimento, promotores de tumor ou citocinas produzindo grandes quantidades de PGs, em particular PGE2 e PGI2, que são mediadores pró-inflamatórios que atuam aumentando a permeabilidade vascular e promovendo edema nos locais inflamados. A COX-2 é expressa por células que estão envolvidas na inflamação (por exemplo, neutrófilos, macrófagos, monócitos, mastócitos, sinoviócitos), surgindo como a principal isoforma responsável pela síntese de prostanóides envolvidos nos processos patológicos, tanto manifestações agudas como em estados inflamatórios crônicos (GOMES et. al., 2009). As prostaglandinas, na maior parte PGE2 e prostaciclinas, são mediadores importantes em processos inflamatórios, de dor e de febre. Em áreas de inflamação aguda, a PGE2 e a PGI2 são produzidas pelos vasos sanguíneos locais. Na inflamação crônica, as células da série monócitos-macrófagos também liberam PGE2 e TXA2. A PGE2, PGI2 e PGD2 são poderosos vasodilatadores e atuam de modo sinérgico com outros vasodilatadores inflamatórios como a histamina e a bradicinina (RANG et al., 2007). O tromboxano A2 (TXA2) é outro metabólito do ácido araquidônico produzido durante a catálise do AA pela COX através da enzima tromboxano sintetase (TXS). É um dos.

(25) 23. mais potentes indutores da vasoconstricção e agregação plaquetária, acredita-se que desempenha um papel importante na patogênese dos distúrbios circulatórios, incluindo infarto do miocárdio, angina e acidente vascular cerebral (SATO, 1995; NAKAHATA, 2008). As lipooxigenases são encontradas nos pulmões, nas plaquetas, nos mastócitos e nos leucócitos. A principal enzima desse grupo é a 5-Lipooxigenase, a primeira enzima na biossíntese dos leucotrienos. O Leucotrieno B4 (LTB4) pode ser encontrado em exsudatos inflamatórios e ocorre nos tecidos em muitas condições inflamatórias, incluindo a artrite reumatóide. Há evidência de que estes contribuem para a hiperreatividade brônquica subjacente em asmáticos e acredita-se que estejam envolvidos entre os principais mediadores tanto na fase inicial quanto na tardia da asma (RANG et al., 2007). Ao atuar sobre os receptores, produz adesão, quimiotaxia de Polimorfonucleares (PMN) e macrófagos além de aumentar a produção de citocinas como a IL-6, relacionada com destruição tissular, por parte dos monócitos, e a IL-5, a partir dos linfócitos T (AMATLLER; ANTEZANA, 2007; BECA; HERNÁNDEZ; BASCONES, 2007), agindo também como agregante plaquetário (RIVERRAMÍREZ; MENDONZA-MAGAÑA; RACETTE, 2008). As lipoxinas possuem várias ações biológicas, sendo algumas pró-inflamatórias e outras antiinflamatórias. Causam vasodilatação em modelos in vivo e in vitro. Em certos tecidos, as lipoxinas podem estimular a formação de prostaciclinas pelas células endoteliais, o que pode contribuir para a vasodilatação (SERHAN, 2007). PROTEASES LISOSSÔMICAS Após a adesão ao endotélio vascular, os neutrófilos migram para o sítio infectado onde liberam radicais livres do oxigênio e seus constituintes internos, incluindo grânulos de proteínas azurófilos (BORREGAARD et al., 1997). Recentemente foram descobertos muitos mecanismos potencialmente patogênicos pelos quais proteinases e mieloperoxidases liberadas de grânulos neutrofílicos produzem efeitos deletérios nos tecidos e células em múltiplos modelos experimentais (JOHNSON et al., 1987). Estas proteases degradam moléculas da matriz extracelular como a elastina, fibronectina, laminina e colágeno tipo IV resultando na destruição tecidual típica de alguns processos inflamatórios purulentos (BORREGARD et al., 1997). RADICAIS LIVRES DO OXIGÊNIO.

(26) 24. O estresse oxidativo agudo e crônico ao endotélio vascular causa séria disfunção nas células endoteliais e desempenha um importante papel na fisiopatologia de várias doenças inflamatórias. Dois aspectos da disfunção endotelial podem ser particularmente importantes na determinação da doença inflamatória: o aumento da permeabilidade vascular e o aumento da adesão endotelial para os leucócitos, ambos fatores críticos para a formação do edema e extravasamento de leucócitos (LUM et al., 2001). Espécies reativas do oxigênio funcionam como moléculas sinalizadoras, estimulando atividades celulares que vão desde a secreção de citocinas e de quimiocinas até a proliferação celular e, em altas concentrações, elas podem produzir injúria e morte celular por modificação oxidativa de proteínas e carboidratos e peroxidação de lipídios. Estas respostas diversas estão relacionadas a vários fatores, tais como as espécies prevalentes no local da inflamação, concentração dos oxidantes e a capacidade antioxidante local assim como as células-alvo (LANDER, 1997). FATOR DE ATIVAÇÃO PLAQUETÁRIA O Fator de Ativação Plaquetária (PAF) é um fosfolipídio biologicamente ativo, inicialmente descrito por seus efeitos como agregante plaquetário e como um produto liberado pelos basófilos. Atualmente, sabe-se que o PAF pode ser produzido por muitas células inflamatórias, incluindo leucócitos, plaquetas, macrófagos e células endoteliais. O PAF tem sido considerado um mediador de processos inflamatórios agudos, de respostas sistêmicas ao choque e de reações alérgicas. Apresenta diversas ações pró-inflamatórias, entre elas a estimulação da formação de eicosanóides, produção de superanion e ativação da fosfolipase A2 (MYERS et al., 1995). CITOCINAS Independente de qualquer definição, o termo citocina compreende as monocinas (mediadores derivados dos monócitos/macrófagos) e linfocinas (mediadores derivados dos linfócitos) (TURNBULL et al., 1999). As quimiocinas e interleucinas fazem parte deste grupo, que se caracteriza por apresentar meia-vida curta, modulação da resposta imune, interação com outras citocinas, assim como reconhecimento por receptores específicos (ZHANG, 2008). As principais citocinas que medeiam a inflamação são a Interleucina-1β.

(27) 25. (IL-1β) e o Fator de Necrose Tumoral (TNF-α). A IL-1β e o TNF compartilham muitas propriedades biológicas (DINARELLO, 1996; BEUTLER, 1995). A IL-1β e o TNF-α são reconhecidas como as iniciadoras dos processo inflamatório, pois ativam uma cascata complexa, envolvendo mais de 20 outras citocinas, além dos sistemas de coagulação e do complemento (SANTOS et al., 2004). A síntese e a liberação de proteínas de fase aguda de classe 1 é iniciada pelas citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α via um mecanismo que é mediado pela interleucina-6 (IL-6) (COUPADE et al., 2001). Promovem ainda a adesão de leucócitos às células endoteliais e acionam outros eventos inflamatórios (WAN et al., 1989). A IL-1 tem sido associada com a ativação de linfócitos T e de várias células nãolinfóides, incluindo as células endoteliais, nas quais a atividade pró-coagulante é induzida. É uma das responsáveis por induzir a expressão da molécula de adesão ICAM-1. Além de estar relacionada à pirogenicidade, é responsável pela síntese de outras citocinas como IL-6 pelos monócitos, atuando sinergicamente com o TNFα (WAN et al., 1989; LEMAY et al., 1990) O TNF-α aumenta a aderência de neutrófilos às superfícies endoteliais aumentando o número de sítio de ligações nos neutrófilos e nas células endoteliais. Trata-se ainda de um agente quimiotático para neutrófilos e monócitos, estimula a fagocitose e a produção de outras citocinas pró-inflamatórias como algumas quimiocinas, estando ainda relacionado com a produção de hipernocicepção inflamatória, juntamente com a IL-1 (WAN et al., 1989; CAMUSSI, 1991; ZHANG, 2001; CUNHA et al., 2007). A Interleucina-6 (IL-6) que é produzida em resposta à ação da IL-1β e/ou à ação do TNF- α, é uma citocina multifuncional que foi originalmente identificada como um fator de diferenciação de células B envolvidas na maturação de células produtoras de anticorpos. É uma proteína de cadeia simples produzida por células B, células T, monócitos, fibroblastos e certamente por outros tipos de células (SANTOS et al., 2004). É considerada como um mediador fundamental em diversas etapas da inflamação (GALLUCCI et al., 2000). Dente os vários efeitos pró-inflamatórios que lhe são atribuídos estão os seus efeitos quimioatraentes sobre os neutrófilos na fase mais precoce e os intimamente relacionados ao processo de reparo e a indução mitótica de queratinócitos na fase mais tardia (SATO et al., 1999). A família das quimiocinas é composta de aproximadamente 50 membros. São proteínas homólogas de 8 a 10KD que são subdivididas em quatro famílias (C, CC, CXC e CX3C) baseadas na posição relativa dos resíduos de cisteína na proteína madura (VOLIN et al., 2001). Apesar de a ação das quimiocinas ser mais evidente na quimiotaxia de macrófagos e linfócitos, alguns membros desta família de moléculas, como a proteína quimioatraente de.

(28) 26. macrófagos (MCP-1) exerce esta função também sobre neutrófilos (CHRISTOPHERSON e HROMAS, 2001). São secretadas em sítios de inflamação e infecção por células teciduais residentes, leucócitos residentes e recrutados e células endoteliais ativadas por citocinas. O aumento da secreção de quimiocinas durante a inflamação resulta no recrutamento seletivo de leucócitos para dentro do tecido inflamado. Os principais estímulos para a produção de quimiocinas são citocinas pró-inflamatórias como a IL-1 e TNF-α, produtos bacterianos e infecção viral. A capacidade de controlar precisamente o movimento de células inflamatórias sugere que as várias quimiocinas e seus receptores podem gerar novos alvos para intervenções terapêuticas (LUSTER, 1998). ÓXIDO NÍTRICO O óxido nítrico (NO) é uma pequena molécula lipofílica gasosa, capaz de difundir-se facilmente através das membranas biológicas. Trata-se, na verdade, de um radical livre, extremamente reativo dentre uma série de óxidos de nitrogênio, que pode reagir com outros radicais, formando espécies tão ou mais biologicamente ativas do que a molécula original (BRUCKDORFER, 2005). O NO é gerado via oxidação da L-arginina pela enzima chamada óxido nítrico sintase (NOS) (NATHAN, 1997). Existem três isoformas da NOS identificadas, duas são expressas constitutivamente, sendo dependentes de cálcio/calmodulina e classificadas como endotelial (eNOS) e neuronal (nNOS) e uma é induzível por citocinas e é independente de cálcio/calmodulina (iNOS) (MONCADA et al., 1995). O papel do NO na inflamação está relacionado a várias funções: relaxamento do músculo liso vascular, redução da agregação e aderência plaquetária, redução do recrutamento de leucócitos, ação citostática e citotóxica através de mecanismo mediados por radicais livres que são protetores contra agentes infecciosos e células tumorais, mas que também podem ser lesivos para o próprio organismo, contribuindo para o estabelecimento de doenças inflamatórias (RIBBONS et al., 1997)..

(29) 27. 3.4 Eventos vasculares da resposta inflamatória e formação do edema O endotélio controla o tônus vascular a partir de músculos lisos vasculares pela liberação de várias substâncias vasoativas, incluindo o NO, espécies reativas do oxigênio, íons potássio, metabólitos do ácido araquidônico, como algumas prostaglandinas (PGI2, PGD2, PGE2) e alguns leucotrienos (LTB4) (LAWRENCE et al., 2002). O endotélio se comporta como uma camada condutiva propagando sinais elétricos ao longo do vaso sanguíneo, através das “gaps junctions” percorrendo toda parede vascular. Essa condução elétrica ativa canais de Ca2+ voltagem dependentes, aumentando assim a concentração de Ca2+ e conseqüentemente abrindo canais de K+ dependentes de canais de Ca2+. Esses canais são os canais Ca2+ de pequena condutância, amplamente distribuídos pela membrana plasmática, e os canais de condutância intermediária, expressos potencialmente nas células endoteliais em direção às células do músculo liso (FÉLÉTOU e VANHOUTTE, 2009). A vasodilatação resulta em geração de calor e rubor local e tem como função aumentar o aporte de mediadores inflamatórios e de leucócitos circulantes no tecido inflamado, ocorrendo inicialmente nas arteríolas (LAWRENCE et al., 2002). Sob as condições fisiopatológicas da inflamação, a hiperpermeabilidade vascular é promovida por mediadores circulantes e fatores de crescimento que se ligam aos receptores endoteliais e desse modo disparam sinais nessa barreira, até então semipermeável, permitindo assim o extravasamento plasmático e de proteínas formando o edema inflamatório, também denominado de exsudato (KUMAR et al., 2009). Dentre estes mediadores, destacam-se a histamina, a bradicinina, os leucotrienos, os componentes do sistema complemento, o fator de ativação plaquetária e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (LAWRENCE et al., 2002; KUMAR et al., 2009). As células endoteliais são unidas por proteínas de adesão transmembranar que formam as regiões de junção. Existem as junções de oclusão (tight junctions) e as junções aderentes (adherens junctions), que impedem a passagem de proteínas do plasma (por exemplo, albumina e imunoglobulinas) para o espaço extravascular (DEJANA et al., 2009). O estímulo edematogênico é capaz de induzir a contração de células endoteliais, permitindo a formação de espaços entre as mesmas, e consequentemente o efluxo de líquidos e proteínas para o tecido. A passagem de líquidos e proteínas através do endotélio pode ainda ocorrer através da própria célula endotelial, mediado por poros chamados “fenestras” (estruturas dinâmicas capazes de contrair e dilatar) ou por transporte vascular através das.

(30) 28. cavéolas (invaginações na membrana plasmática que funcionam como vesículas endocíticas) (RYAN e MAJNO, 1977; SERHAN et al., 2008). 3.5 Moléculas de adesão de membrana envolvidas na migração leucocitária Uma importante forma de ativação de células na microcirculação é a expressão de moléculas de adesão de membrana que facilitam a fixação de células circulantes ao endotélio e de estruturas teciduais sobre o qual migram. Duas classes gerais de moléculas de adesão são descritas nos leucócitos: as integrinas e selectinas e seus ligantes. Elas são pré-expressas na membrana plasmática e também em grânulos citoplasmáticos ou podem ser sintetizadas novamente após estimulação (SCHMID-SCHONBEIN, 2006). A fixação inicial de leucócitos às membranas endoteliais é facilitada por selectinas, um grupo de três lectinas de mamíferos (P, E e L-selectina). As L-selectinas localizam-se preferencialmente na região final das microvilosidades das membranas dos leucócitos que fazem ligação inicial com o endotélio. Já P-selectina é pré-expressa em vesículas de membranas das células endoteliais e podem também ser induzidas por síntese protéica. A Eselectina é encontrada predominantemente no endotélio e precisa ser induzida em condições inflamatórias (SCHMID-SCHONBEIN, 2006). Em contrapartida, a firme adesão à membrana e a disseminação de células no endotélio são facilitadas pelas integrinas, uma família de heterodímeros e receptores tirosina quinase que atribuem sítios de adesão à matriz extracelular para as proteínas estruturais na célula citoplasmática e são também sinalizadores moleculares. Uma das mais importantes integrinas na reação inflamatória é a CD11b/CD18 (também conhecido como receptor complemento 3 ou Mac-1) expressa nos neutrófilos, macrófagos, monócitos e em linfócitos natural killer. Mac-1 pode se ligar a uma variedade de ligantes, sendo a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) um dos mais importantes, expressa em células endoteliais específicas em vênulas da microcirculação e menos expressa em ateríolas e capilares. ICAM-1 é um membro da superfamília das imunoglobulinas e sua expressão é regulada através de mecanismos de transcrição na microcirculação que são largamente desconhecidos (SCHMIDSCHONBEIN, 2006)..

(31) 29. 3.6 Marcadores da resposta de fase aguda A resposta de fase aguda iniciada pela IL-1 ou TNF, ou ambas, inclui febre, catabolismo músculo-esquelético, aumento hepático de síntese de proteínas de fase aguda, alteração do sistema endócrino e neutrofilia (WAN et al., 1989). Em resposta à lesão tecidual ou à inflamação aguda, muitas proteínas plasmáticas sintetizadas pelo fígado exibem mudanças quantitativas que se manifestam em tempo variável após o início da resposta de fase aguda. Proteínas com um aumento transitório na síntese e na concentração plasmática são chamadas de proteínas positivas de fase aguda, enquanto que aquelas proteínas cuja síntese diminui são chamadas de proteínas negativas de fase aguda. Em muitas espécies de mamíferos, a regulação da expressão dos genes das proteínas de fase aguda é mediada por citocinas inflamatórias que incluem principalmente Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-1 (IL-1) e Fator de Necrose Tumoral (TNF) (LYOUMI et al., 1998). Os efeitos das citocinas sobre o padrão de expressão gênica hepática durante o processo inflamatório permite distinguir duas classes de proteínas de fase aguda: a classe 1 em humanos inclui a Hepatoglobina, Proteína C Reativa (PCR), Amilóide Sérica A (SSA), α1 glicoproteína ácida (AGP) e Hemopexina, reguladas principalmente por IL-1 ou combinações de IL-1, IL-6 e glicocorticóides. A classe 2 inclui o fibrinogênio, α-1 antiquimotripsina e a α-1 antitripsina e são reguladas exclusivamente pela IL-6 e glicocorticóides (LYOUMI et al., 1998). A IL-6 estimula, no fígado, a síntese de algumas proteínas como a α-1 glicoproteína ácida, a amilóide sérica A e a PCR e inibe a síntese de outras proteínas como a transferrina e a albumina. Os marcadores da resposta inflamatória mais sensíveis são elevado nível sérico de PCR e o reduzido nível sérico de albumina (SANTOS et al., 2004). 3.7 Fase Subcrônica da Resposta Inflamatória A lesão granulomatosa induzida por “pellets” de algodão é um modelo de inflamação subcrônica indicativo da fase proliferativa da inflamação. De acordo com COLLINS (2000), a inflamação granulomatosa é um tipo específico de inflamação desencadeada por uma variedade de agentes infecciosos e não infecciosos. Um granuloma é uma área focal de inflamação granulomatosa e consiste em uma agregação de macrófagos que estão transformados em células de aparência epitelial (epitelióide), circundadas por leucócitos mononucleares, principalmente linfócitos. De acordo com FREITAS (1997), vários.

(32) 30. mediadores estão envolvidos na fase subcrônica da inflamação. Fatores quimiotáticos como produtos do sistema complemento (C5a e C567), LTB4, linfocinas, histamina, bem como fator de necrose tumoral (TNF-α) e várias interleucinas, numa complexa organização funcional, seriam os responsáveis pelas etapas do processo. 3.8 Indometacina A indometacina é um fármaco derivado do ácido indolacético, pertencente à categoria dos antiinflamatórios não-esteróides (AINEs). Da mesma forma que os outros AINEs, a indometacina apresenta potente atividade antiinflamatória, além de ação analgésica e antipirética. É empregada em doenças inflamatórias reumáticas, sendo também indicada em situações não inflamatórias como doenças degenerativas das articulações (osteoartrite e espondilite anquilosante), cólicas, febre e dor de cabeça (ROBERTS II e MORROW, 2001). O efeito antiinflamatório da indometacina é mediado tanto pela inibição de ambas as isoformas da COX quanto pela redução da migração dos neutrófilos (JACOBS e BIJLSMA, 1997; PESKAR, 2001). Em função de seu efeito inibitório sobre a COX-1, a indometacina apresenta importantes efeitos adversos, que são dose-dependente e restringem sua utilização a doenças inflamatórias severas, nas quais outras alternativas terapêuticas não são efetivas (ROBERTS II e MORROW, 2001). Sua toxicidade está relacionada principalmente ao trato gastrintestinal, no qual pode provocar ulcerações, perfurações e hemorragias. Tem sido observado que um efeito citotóxico direto independente das COXs está envolvido com o desenvolvimento de lesões gastrintestinais (TOMISATO et al., 2004). A inibição de prostaglandinas renais protetoras dos efeitos vasoconstritores de angiotensina e catecolaminas pode agravar disfunções renais preexistentes e causar insuficiência renal, tornando necessária a interrupção do tratamento para a reversão do quadro clínico (ROBERTS II e MORROW, 2001; WANNMACHER e FERREIRA, 2004). Os efeitos dos AINEs em pacientes com artrite reumatóide são atribuídos à inibição da ativação leucocitária e adesão de leucócitos, função que parece ser independente da inibição da síntese de prostaglandinas. Entretanto, assim como outros AINEs, o uso da indometacina no tratamento de doenças reumáticas visa apenas o alívio dos sintomas, principalmente a dor e a inflamação, uma vez que inexistem tratamentos que possam ser considerados terapias definitivas, ou capazes de impedir as deformidades e a perda de função locomotora relacionadas com essas doenças (ROBERTS II e MORROW, 2001; WANNMACHER e FERREIRA, 2004)..