CULTURA DE OSTEOBLASTOS SOBRE BLENDAS DE PLDLA / PCL-TRIOL
L. P. Coppini; M. A.T. Duarte; C. Lucchesi; E.A.R. Duek Pontifícia Universidade Católica de São Paulo
Centro de Ciências Medicas e Biológicas - Laboratório de Biomateriais Praça Dr. José Ermírio de Moraes, 290 – Sorocaba/ SP
lalacoppini@gmail.com
RESUMO
Dentre os polímeros bioreabsorvíveis, o PLLA, PLGA e a PCL são os mais estudados para aplicações como biomateriais. Neste trabalho foram cultivadas células osteoblásticas sobre membranas da blenda de poli(L-co-D, L ácido láctico)(PLDLA) com poli(caprolactona-triol)(PCL-T), PLDLA/PCL-triol, nas composições 90/10 e 70/30 utilizando como controle a blenda 100/0. Foram avaliadas a adesão célula-célula e célula-membrana, através da microscopia eletrônica de varredura e testes de citoquímica. Na microscopia eletrônica de varredura notou-se a variação morfológica das células osteoblásticas de acordo com a composição das blendas. Os resultados parciais indicaram que as blendas PLDLA/PCL-triol não permitiram uma boa adesão celular comparado à blenda 100/0.
Palavras-chave: Poli(L-ácido láctico-co-D,L ácido láctico) PLDLA, osteoblastos, cultura de células, Poli(ε-caprolactona) PCL.
INTRODUÇÃO
A busca por polímeros bioreabsorvíveis como suporte para cultura de células tem recebido atenção especial como possível alternativa para o tratamento de lesões e perdas teciduais [1].
Esses materiais bioreabsorvíveis têm sido utilizados na forma de parafusos, pinos e placas nas aplicações ortopédicas em humanos e animais. Suas propriedades mecânicas podem ser alteradas para prover rigidez suficiente para a
cura do osso, degradando uma certa velocidade que permita uma transferência gradual da tensão do implante do osso que está sendo regenerado, prevenindo assim o acúmulo de tensão no tecido[2].
Dentre os polímeros sintéticos bioreabsorvíveis e biodegradáveis encontram-se os poli (α-hidroxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, os quais fazem parte o poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ácido lático) (PLA), poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli (ε−caprolactona) (PCL), seus copolímeros e outros. Originalmente usados como fios de sutura, atualmente os poli (α- hidroxi ácidos) podem ser encontrados em diversos produtos comerciais de fixação óssea[3]. O PLA e o PCL têm sido amplamente utilizados em trabalhos com polímeros bioreabsorvíveis com intenção de auxiliar a regeneração óssea [4,5].
A biocompatibilidade destes materiais está diretamente associada ao comportamento das células em contato com o material e particularmente pela adesão à sua superfície. As características da superfície do material, são essenciais à adesão de osteoblastos aos biomateriais. A adesão e proliferação, que correspondem a primeira fase na interação célula/material, que irá influenciar na capacidade das células de se diferenciarem em contato com o implante, promovem a reconstituição inicial do tecido original [6,7].
O estudo dos polímeros bioreabsorvíveis in vitro tem como intenção medir respostas celulares após interações com materiais, visando avaliar o nível de segurança do material cultivado para emprego do biomaterial em humanos e correlacionar o desempenho nas reações provocadas pelo implante do material em situações clínicas reais [8].
Os experimentos envolvendo cultura de células têm várias vantagens em comparação com aqueles implantados diretamente no organismo. No caso da cultura de células, as condições experimentais podem ser controladas de forma mais rigorosa, mediante a manipulação das condições de crescimento, do meio utilizado no cultivo de um tipo celular específico, entre outras. Estas células quando isoladas podem formar rapidamente uma colônia, num processo de clonagem celular, o que garante a linhagem em cultivo ser geneticamente homogênea [9].
Por serem osteogênicos, os osteoblastos são amplamente utilizados nas pesquisas com polímeros bioreabsorvíveis visando à regeneração do tecido ósseo danificado; demostrando em alguns estudos a formação de um tecido semelhante a
matriz óssea [5,10,11,12,13,14]. Os osteoblastos diferenciam-se dos fibroblastos, um outro tipo celular também utilizado em culturas para testes de materiais [4], pela grande concentração de fosfatase alcalina na superfície de suas membranas; esta que serve de parâmetro na avaliação do efeito do biomaterial sobre a atividade do tecido ósseo [8].
Assim, uma compreensão completa de adesão de célula e particularmente adesão de osteoblastos em materiais é agora essencial para aperfeiçoar os biomateriais [6].
Buscando acelerar o tempo de degradação do PLLA poli (L-ácido lático), uma combinação dos monômeros L-ácido láctico e D, L ácido láctico resultam no copolímero poli(L-ácido láctico-co-D, L ácido láctico) (PLDLA), sendo que esse tem como característica ser rapidamente degradado e não gerar fragmentos cristalinos, aliando as particularidades mecânicas do Poli (L-ácido láctico) sem o inconveniente do elevado tempo de degradação requerido por esse homopolímero decorrente de sua alta cristalinidade. Apesar da copolimerização resultar em um material com menor tempo de degradação, a flexibilidade desse material pode ser conseguida com a adição de PCL-triol. Assim, aliam-se as propriedades do copolímero PLDLA, que tem como característica ser rígido, rapidamente degradado e não gerar fragmentos cristalinos, com PCL-triol que melhorará a processabilidade e aumentar a flexibilidade. O PCL é biocompatível, não tóxico nas aplicações biomédicas e completamente biodegradável no interior de um organismo após sua interação com as células, o fluido corpóreo e enzimas [15]. Por ser um excelente plastificante, reduz a viscosidade do fundido, abaixa a temperatura de transição vítrea e diminuir seu módulo de elasticidade [16].
Resumindo, o interesse na obtenção da blenda PLDLA/PCL-triol é somar as características de rigidez e rápida degradação do PLDLA com o PCL-triol, buscando assim, uma blenda flexível, ideal para utilização em estudos em culturas celulares de osteoblastos.
OBJETIVO
O objetivo deste trabalho será explorar as influências mútuas entre células osteoblásticas e membranas de diferentes proporções de PLDLA/PCL-Triol para obtenção de organóides que se assemelhem ao tecido ósseo neoformado. Para isso, serão realizadas análises de adesão célula-célula e célula-membrana de
PLDLA/PCL-Triol, através da microscopia eletrônica de varredura e testes de citotoxicidade, adesão celular e citoquímica.
METODOLOGIA
1-Preparação das amostras
Obtenção da blenda PLDLA/PCL-triol
O PLDLA e o PCL-triol foram dissolvidos separadamente em clorofórmio para formar soluções 10% (m/v), onde foram mantidas em agitador magnético por 12 horas, até completa homogeneização. As soluções foram misturadas e a solução vertida em um molde de vidro (50x50x5mm) e colocada em uma câmera para evaporação do solvente por 24 horas. As amostras foram secas em uma estufa á vácuo durante 24 horas e armazenados em um dessecador. Foram obtidas blendas nas composições: 100/0, 90/10 e 70/30.
2- Estudo in vitro - Estudo da cultura de células
O trabalho foi realizado no Laboratório de Biomateriais, do Centro de Ciências Médicas e Biológicas da PUC-SP.
Este estudo nos trouxe as informações sobre a adesão celular e sobre a atividade metabólica dos osteoblastos cultivados, sendo de suma importância para a engenharia de tecidos, pois somente células aderidas na superfície do substrato podem migrar e/ou proliferar sobre o mesmo, ou mesmo exercer uma atividade fisiológica especial.
Sendo que, este estudo envolveu cinco etapas:
2.a-Obtenção das culturas primárias de osteoblastos de calota craniana de ratos
Para este procedimento, foram utilizados 2 ratos Wistar machos com idade aproximada de 20 dias sacrificados por deslocamento cervical seguido de decapitação. As calotas cranianas foram retiradas através de uma abertura na região cranial expondo-se a calota craniana, sendo estas retiradas e mantidas em meio de cultura DMEM (Meio Eagle Modificado por Dulbecco - Nutricell) e 0,2M de L-glutamina (Sigma), adicionado de gentamicina (40 mg/ml - Sigma). Em ambiente estéril, os tecidos moles adjacentes às calotas foram cuidadosamente retirados,
sendo posteriormente fragmentadas e submetidas à digestão enzimática para extração celular em meio DMEM e 1mg/mL de colagenase tipo IA (Sigma) e tripsina durante 2 horas a 37°C sob agitação. Seguindo-se a centrifugação em três etapas de 10 minutos a 1200 rpm, com subseqüente ressuspensão em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e gentamicina. Após a centrifugação foi realizada a quantificação da viabilidade celular com emprego do corante vital azul de Tripan em câmara hemocitométrica (Neubauer) e depois os osteoblastos foram mantidos em frasco para cultivo celular de 25 cm2 (TPP). As trocas de meio de cultura foram realizadas a cada 48 horas com monitoramento diário dos cultivos celulares em microscópio invertido Eclipse TS 100 (Nikon).
2b-Análise Citoquímica
A análise citoquímica nos mostrou a atividade metabólica das células cultivadas nos polímeros. Para obtenção do material que foi utilizado para as
colorações, células osteoblásticas blendas de PLDLA/PCL-triol nas concentrações (100/0), (90/10), (70/30) (m/m)%; permanecendo em cultura até os tempos desejados, sendo estas mantidas em meio de cultura DMEN com 10% de soro fetal
bovino. As placas foram incubadas em estufa de CO2 a 37°C, sendo o meio de
cultura trocado sempre que houve acidificação do mesmo. Após 24, 72 e 168h de cultura, as amostras foram fixadas, desidratadas e seguidas de uma série crescente de etanol, coradas com azul de toluidina (AT), um corante básico que pode ser corado com grupos aniônicos, e com xylidine ponceau (XP), um corante aniônico que cora grupos catiônicos. As amostras para AT foram fixadas durante 1 min com Metanol/ácido acético 3:1 e as amostras para XP foram fixadas com Formol 10%. Posteriormente as amostras foram lavadas uma vez com Metanol e cobertas com seus respectivos corantes, agindo por 15 min, lavadas com água ultra pura utilizando-se três banhos de 5 min cada, preenchendo o volume total dos poços. As amostras foram retiradas da placa e colocadas, sobre papel filtro, para secar. Após secas, as membranas foram montadas com Entelan para observação ao microscópio óptico com luz polarizada (Eclipse E800 – Nikon). Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
2c- Microscopia eletrônica de varredura
As células osteoblásticas foram cultivadas por um período de 6, 24, 72 e 168 horas sobre as membranas, sendo o número de células e condições de cultivo os mesmo que serão empregados nos testes de adesão e citotoxicidade. Após estes
períodos, as amostras foram fixadas durante 1 hora a temperatura ambiente em solução fixadora contendo paraformaldeído 2,5%, glutaraldeído 2,5% (Sigma), ácido pícrico 0,06%, ácido tânico 1% dissolvidos em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Posteriormente as amostras foram pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1% (Sigma) e desidratadas em etanol em concentrações crescentes. As amostras forma levadas para o Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto Biológica da UNICAMP e secas em Ponto Crítico (Balzers CTD 030), recobertas por ouro (Balzers SCD 050) e observadas em microscópio eletrônico de varredura (JEOL JSM-5800 LV).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Microscopia eletrônica de varredura
Os resultados obtidos ao microscópio eletrônico de varredura evidenciam que as membranas de PLDLA/PCL-triol, independentemente da composição da blenda, permitiram que os osteoblastos se estabelecessem nas superfícies e iniciassem a polarização celular seguida pela extensão de projeções citoplasmáticas (Fig.1A)
As imagens observadas através da MEV após 6, 24 72 e 168 horas de cultivo de osteoblastos sobre as blendas PLDLA/PCL-triol, mostraram diferenças significativas entre as composições das blendas (Fig.1), com relação à quantidade de células aderidas e ao tempo de adesão celular, sendo que as blendas 100/0 e 90/10 apresentaram um número evidentemente maior de células aderidas com morfologia semelhante a células osteoblásticas, quando comparadas à blenda 70/30, que apesar de ter uma superfície bastante irregular, as células tiveram uma adesão mais lenta e diferenciada das demais.
Vários estudos divergem quanto ao comportamento celular frente à morfologia da superfície do material. Alguns autores demonstraram que o espalhamento de células ósseas sobre biomateriais de superfície lisa foi melhor do que o encontrado para biomateriais com a superfície rugosa [17,18]. Outros atestam exatamente o contrário [19].
Berry et al. [20], consideram que dentre as aplicações da engenharia de tecidos,
é necessária a utilização de um substrato poroso, para que haja crescimento e proliferação celular em três dimensões, embora tenham observado um maior crescimento de fibroblastos sobre a superfície de quartzo com menor diâmetro de poros (7µm). Entretanto, Wan et al. [5], (2005) não notaram diferenças entre a
proliferação de células osteoblásticas sobre superfície de PLLA com diferentes porosidades.
No PLDLA/PCL-triol 100/0, considerado como material controle, as células se apresentaram em grande número, crescendo sobre o substrato, quando comparado aos demais materiais. Após 6h de cultivo (Fig.1A) as células osteoblásticas dispunham-se isoladamente, apresentando morfologia característica, achatadas e com projeções citoplasmáticas, sendo observada a presença de material particulado. Essas mesmas características foram observadas após 24 horas de cultivo (Fig. 1D). Após 72h (Fig.2A) as células recobriram toda a superfície das blendas, formando um tapete celular.
Na blenda 90/10 aparentemente apresentaram em 6h (Fig.1B) e 24h (Fig.2E), uma menor quantidade de células quando comparada à blenda (100/0). As células apresentaram projeções citoplasmáticas e observou-se quantidade excessiva de material particulado. Após 72 horas de cultivo, houve a formação de um tapete celular
recobrindo a membrana, com algumas células com morfologia arredondada sobre o
tapete celular (Fig.2B e D).
Apesar da blenda 70/30 apresentar uma superfície bastante irregular, verificou-se uma menor quantidade de células aderidas comparado às demais composições. As células aderidas formaram após 168 horas (Fig. 2E), um tapete celular. Após 6 e 24 horas (Fig. 1C e F), as poucas células se mostraram alongadas e com projeções celulares, não observando material particulado sobre as superfícies celulares. Após 72 horas, não se observou células aderidas sobre a superfície da blenda, acreditando-se que estas foram colocadas sobre os suportes para microscopia eletrônica, do lado contrário ao lado onde se cultivou as células, observando-se apenas a morfologia porosa da membrana.
As características da superfície do material, assim como sua morfologia, química e energia da superfície são partes essenciais da adesão osteoblástica no biomaterial. Estes fatores, adesão e espraiamento, pertencem à primeira fase da interação da célula com o material; e a evolução desta fase irá interferir na capacidade da célula de se proliferar e diferenciar no contato com o material [6].
1A
1B
1C
1E
Figura 1 - Células osteoblásticas sobre as membranas após 6h. A) PLDLA, B) PLDLA/PCL-triol (90/10), C) PLDLA/PCL-triol (70/30). Células osteoblásticas sobre as membranas após 24h. D) PLDLA, E) PLDLA/PCL-triol (90/10), F) PLDLA/PCL-triol (70/30).
Figura 2 - Células osteoblásticas sobre as membranas após 72h. A) PLDLA, B) PLDLA/PCL-triol (90/10). Células osteoblásticas sobre as membranas após 168h. C) PLDLA, D) PLDLA/PCL-triol (90/10), E) PLDLA/PCL-triol (70/30).
3A 1B 1C 1C 1B 1C 1E 1F 2A 2B 2C 2D 2E
Citoquímica
A escolha da coloração é um importante recurso para se avaliar e qualificar células provenientes de culturas primárias ou de culturas permanentes em condições normais ou obtidas após um determinado tratamento experimental. Assim, para este estudo utilizaram-se de dois corantes: Xylidine Ponceau (XP) – pH 2,5 para evidenciação de proteínas totais, e Azul de Toluidina (AT) – 0,2%, pH 4,0 para moléculas específicas como DNA / RNA / Glicosaminoglicanos (Gag) [21].
Nas amostras da blenda 100/0, verificou-se a presença de poucas células, e a maior parte encontrava-se nas bordas do material, principalmente nas coradas com Xylidine Ponceau. Após 24 e 72 horas de cultura, as células apresentavam morfologia característica de osteoblastos, sendo alongadas, achatadas e com projeções citoplasmáticas (Fig.3A). Nas amostras coradas por XP, as células apresentaram-se bem espalhadas pelas bordas do material, com o citoplasma mais corado que os nucléolos, por ser mais basófilo. Os nucléolos estavam grandes e bem definidos, apresentando o material genético descondensado, podendo indicar que as células estavam em síntese.
Após 168horas, não foram encontradas células sobre o material, independente da coloração. Na amostras 100/0, coradas por AT, os nucléolos estavam mais corados que os citoplasmas; foram observadas poucas células, algumas em divisão (Fig. 3B) e outras, bem espalhadas com os nucléolos grandes (Fig. 3A), também podendo indicar uma possível síntese.
As blendas 90/10 e 70/30 apresentaram resultados semelhantes na análise citoquímica; com raras células em todos os tempos analisados e estas, com características apoptóticas (Fig.3C).
Os resultados obtidos na citoquímica não foram condizentes em relação aos dados obtidos na MEV, pois foram encontradas poucas células em todos os tempos analisados, em comparação aos mesmos tempos do MEV, sendo semeadas as mesmas quantidades iniciais de células de 1x105. Observou-se ainda, células com características apoptóticas, acreditando-se estarem estas em período de senescência.
Segundo Alberts et al. [22], as maiorias de células de vertebrados param de dividir após um número finito de divisões celulares em cultura, um processo chamado de senescência celular.
A morte celular programada acontece quando entra em ação um programa genético, que determine em que período de tempo a mesma irá acontecer. Este mesmo programa pode ser induzido ou antecipado por ação de estímulos fisiológicos, passando então a ser conhecido como apoptose. Morfologicamente, a apoptose é caracterizada pela perda da integridade celular, havendo condensação do citoplasma. Surgem, depois de uma série de processos, corpos, ou vesículas apoptóticas , contendo parte do citoplasma e do núcleo celular[23].
Figura 3 – Células osteoblásticas sobre as blendas em teste citoquímico.
A) PLDLA corado com XP 40x, após 24 horas, B) PLDLA corado com AT 20x, após 24 horas, C) PLDLA/PCL-triol (90/10) corados com XP 40x, após 72horas.
CONCLUSÃO
Baseada nas análises realizadas, as blendas de PLDLA/PCL-triol 100/0 demonstrou ter uma maior interação com as células osteoblásticas, quando comparada com as demais amostras.
O PLDLA/PCL-triol 90/10 interagiu melhor com as células em relação ao PLDLA/PCL-triol 70/30.
Portanto, o PCL-triol não permitiu uma boa interação entre células e material.
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CULTURE OF OSTEOBLAST ON PLDLA / PCL-TRIOL BLENDS
ABSTRACT
Among bioreabsorbable polymers, the PLLA, PLGA and PCL are the most studied
for biomaterials applications. In this work osteoblasts cells were cultivated on poly(L-co-D, L lactic acid)(PLDLA) with poly(caprolactone-triol)(PCL-T), PLDLA/PCL-triol ,in the 90/10 and 70/30 compositions, using as control the 100/0 blend. It was available the adhesion cell-cell and cell-membrane by the scan electron microscopy and cytochemical test. The SEM results showed a morphological variation of osteoblasts. The partial results indicated that PLDLA/PCL-triol blends did not allow a good cell adhesion comparing to 100/0 blend.
Key-words:Poly (L- co-D,L lactic acid) PLDLA, Poly caprolactone triol) PCL-triol, osteoblasts, cells culture.
