UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
MÍRIAM DOS SANTOS MUNIZ
Uso de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados como Plataformas de Liberação
para 5-Fluorouracil e RNA de Interferência no Tratamento do Câncer de Bexiga
Urinária Não-Músculo Invasivo
CAMPINAS 2018
MÍRIAM DOS SANTOS MUNIZ
Uso de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados como Plataformas de
Liberação para 5-Fluorouracil e RNA de Interferência no Tratamento do
Câncer de Bexiga Urinária Não-Músculo Invasivo
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA MÍRIAM DOS SANTOS MUNIZ, E ORIENTADA PELO
PROF. DR. WAGNER JOSÉ FÁVARO.
ORIENTADOR: WAGNER JOSÉ FÁVARO
CAMPINAS 2018
Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Muniz, Míriam dos Santos,
M925u MunUso de carreadores lipídicos nanoestruturados como plataformas de liberação para 5-fluorouracil e RNA de interferência no tratamento de câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo / Míriam dos Santos Muniz. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
MunOrientador: Wagner José Fávaro.
MunDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Mun1. Neoplasias da bexiga. 2. Nanotecnologia. 3. Carregadores lipídicos nanoestruturados. I. Fávaro, Wagner José, 1980-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Use of nanostructured lipid carriers as release platforms for
5-fluorouracil and interference RNA in the treatment of non-muscle invasive bladder cancer
Palavras-chave em inglês:
Bladder neoplasms Nanotechnology
Nanostructured lipidic carriers
Área de concentração: Biologia Celular
Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora:
Wagner José Fávaro [Orientador] Wagner Eduardo Matheus
Juliana Cancino Bernardi
Data de defesa: 25-01-2018
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
Campinas, 25/01/2018
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Wagner José Fávaro
Prof. Dr. Wagner Eduardo Matheus
Dra. Juliana Cancino Bernardi
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que
se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King)
Gostaria de dedicar meu trabalho a todos aqueles que sofreram e/ou sofrem com o câncer, sofrem com a possibilidade de não se verem livres dessa doença e se apoiam na esperança de que algum dia a cura seja descoberta e acessível a todos.
Dedico meu trabalho a todos os pesquisadores e cientistas que trocam as noites de sono pelo trabalho árduo, acreditando que fazemos parte de um todo, que cada história contada através de dissertações, teses e artigos, se somam para fazer a ciência mudar nossa realidade.
AGRADECIMENTO
A realização desta dissertação de mestrado contou com importantes apoios e incentivos sem os quais não se teria tornado uma realidade e aos quais serei muito grata.
Ao Professor Doutor Wagner José Fávaro, pela sua orientação, paciência, ensinamentos, colaboração ao solucionar problemas que foram surgindo ao longo da realização deste trabalho e por todas as palavras de incentivo.
Agradeço aos meus amigos e amigas que estiveram sempre ao meu lado durante toda esta fase de aprendizados. Aos meus colegas de trabalho, que me incentivaram, me ensinaram e estiveram sempre a postos para ajudar; em especial agradeço ao Joel Gonçalves de Souza, que tanto fez parte deste projeto comigo, sendo meu coorientador, quanto me ajudou em muitos aspectos desta caminhada.
Agradeço ao Instituto de Biologia da Unicamp, bem como ao Programa de Biologia Celular e Estrutural e a todos os Professores e funcionários que tornaram toda minha trajetória possível. Agradeço à CAPES por ter financiado este projeto e tornado possível sua execução.
Por último, e não menos importante, agradeço muito aos meus pais, Ronaldo e Cristina, e a toda minha família que tanto me deram suporte e me ajudaram a enfrentar todas as dificuldades que tive ao longe dessa caminhada. Agradeço também ao meu namorado, Ricardo, que esteve sempre por perto me amparando, me incentivando e acreditando em mim, mesmo quando eu não acreditava.
RESUMO
Atualmente, a modalidade de tratamento mais aceita para o tratamento do câncer de bexiga (CB) consiste na administração intravesical de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) associada à ressecção transuretral. Por outro lado, os efeitos antitumorais do BCG consistem no desencadeamento de uma resposta imunológica sistêmica, sendo que uma parcela significativa dos pacientes submetidos a esse tratamento apresenta intolerância, além de complicações potencialmente fatais, como sepse. Além disso, 50% dos tumores não-músculo invasivos (CBNMI) apresentam reincidência dentro de quatro anos após o tratamento com BCG e 11% dos casos passam a apresentar fenótipo invasivo. O 5-Fluorouracil (5-FU) é um antimetabólito que age através do bloqueio da incorporação das bases nitrogenadas purina e pirimidina na fita de DNA durante a fase ‘S’ do ciclo celular, interferindo no desenvolvimento e divisão celular. O 5-FU tem sido muito utilizado para o tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço e câncer colorretal. Além do 5-FU, a recente descoberta do RNA de interferência (siRNA) fez com que essas substâncias passassem a ser estudadas pré-clinicamente quanto à aplicação no silenciamento de genes associados ao câncer. Nesse projeto, foi desenvolvido um sistema de liberação controlada de fármacos à base de carreador lipídico nanoestruturado (CLN) para administração do 5-FU e siRNA para VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular). Foi apresentado um sistema de CLN complexado com 5-FU (CLN/5-FU) com tamanho de 217,2 ± 4,2, valor de PDI de 0,32 ± 0,03 e potencial Zeta de 74,4 ± 2,7; apontando estabilidade coloidal num período de 23 dias. A eficiência de encapsulação foi de aproximadamente 8,27%. Foi analisado também a concentração das partículas em solução, onde foi encontrado 1,58x1013 partículas/mL. As
análises histopatológicas dos animais do Grupo câncer + CLN/5-FU apresentaram 60% de regressão tumoral, a qual foi caracterizada pela presença de lesões benignas como a hiperplasia papilífera. Os outros 40% dos animais apresentaram lesões neoplásicas como o carcinoma pT1 (20%) e carcinoma pTa alto grau (20%). O tratamento intravesical com CLN/siRNA promoveu a regressão tumoral em 40% dos animais, sendo que esses apresentaram hiperplasia papilífera. Ainda, esse tratamento promoveu a redução da agressividade tumoral, sendo as lesões neoplásicas mais frequentes foram o carcinoma pTa de baixo grau e o carcinoma pTis em 40% e 20% dos animais, respectivamente.
ABSTRACT
Currently, the most accepted treatment of bladder cancer (BC) is the intravesical administration of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) associated with transurethral resection. On the other hand, the antitumor effects of BCG consist of triggering a systemic immune response, and a significant portion of patients undergoing this treatment are intolerant, in addition to potentially fatal complications such as sepsis. In addition, 50% of non-muscle invasive tumors (CBNMI) present recurrence within four years after treatment with BCG and 11% of cases present an invasive phenotype. 5-Fluorouracil (5-FU) is an antimetabolite that acts by blocking the incorporation of the purine and pyrimidine nitrogen bases in the DNA strand during the 'S' phase of the cell cycle, interfering in the development and cell division. 5-FU has been widely used in the treatment of various types of cancer, including breast cancer, head and neck cancer, and colorectal cancer. In addition to 5-FU, the recent discovery of interfering RNA (siRNA) has made these substances pre-clinically studied for application in gene silencing associated with cancer. In this project, a controlled drug release system based on nanostructured lipid carrier (CLN) was developed for the administration of 5-FU and siRNA for VEGF (vascular endothelial growth factor). A CLN system complexed with FU (CLN / 5-FU) with a size of 217.2 ± 4.2, a PDI value of 0.32 ± 0.03 and a Zeta potential of 74.4 ± 2, 7; indicating colloidal stability in a period of 23 days. The encapsulation efficiency was approximately 8.27%. The concentration of the particles in solution was also analyzed, where 1,58x1013 particles/mL were found. Histopathological analyzes of the animals of the cancer +
CLN / 5-FU group presented 60% of tumor regression, which was characterized by the presence of benign lesions such as papillary hyperplasia. The other 40% of the animals had neoplastic lesions such as pT1 carcinoma (20%) and high grade carcinoma (20%). Intravesical treatment with CLN / siRNA promoted tumor regression in 40% of the animals, and these presented papillary hyperplasia. Moreover, this treatment promoted the reduction of tumor aggressiveness, with the most frequent neoplastic lesions being the low grade pTa carcinoma and the pTis carcinoma in 40% and 20% of the animals, respectively.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo esquemático de NLS e CLN. 188
Figura 2 Mecanismo de ação do siRNA na célula. 20
Figura 3 Ultrassonografia dos animais dos Grupos Controle e induzidos com MNU. 30
Figura 4 Planejamento experimental da indução e tratamento do CBNMI nos
diferentes grupos experimentais. 31
Figura 5 Gel de agarose mostrando a complexação de siRNA ao CLN. 49
Figura 6 Fotomicrografias representativas das bexigas urinárias dos grupos Controle e
MNU. 54
Figura 7 Fotomicrografias representativas das bexigas urinárias dos grupos MNU + 5-FU,
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Valores das médias dos tamanhos, PDI e potencial Zeta dos CLN; análise
realizada em triplicata. 33
Tabela 2 Valores das médias dos tamanhos, PDI e potencial Zeta dos CLN/5-FU;
análise realizada em triplicata. 36
Tabela 3 Quadro comparativo com os trabalhos descritos na literatura sobre a
síntese de diferentes tipos de CLN. 44
Tabela 4 Porcentagem de alterações histopatológicas na bexiga urinária de ratos dos
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Medida do potencial Zeta das partículas CLN ao longo do tempo. 344
Gráfico 2 Medida do tamanho das partículas CLN ao longo do tempo. 355
Gráfico 3 Medida do índice de polidispersividade das partículas CLN ao longo do
tempo. 355
Gráfico 4 Medida do potencial Zeta das partículas CLN/5-FU ao longo do tempo. 377
Gráfico 5 Medida do tamanho das partículas CLN/5-FU ao longo do tempo. 388
Gráfico 6 Medida do índice de polidispersividade das partículas CLN/5-FU ao longo do
tempo 399
Gráfico 7 Gráfico representando a análise do complexo CLN/5-FU por CLAE. 40
Gráfico 8 Representação da distribuição de tamanho e da concentração de partícula
sem solução da amostra de CLN, através da técnica de NTA. 466
Gráfico 9 Representação da distribuição de tamanho e da concentração de partícula
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-FU 5-Fluouracil
BCG Bacillus Calmette-Guerin
BDP Bis-2-Digliceril Poliaciladipato
CBNMI Câncer de Bexiga Urinária Não-Músuclo Invasivo
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLN Carreador Lipídico Nanoestruturado
DLS Dynamic light scattering - Espalhamento de Luz
DNA Ácido desoxirribonucleico
MNU N-metil-N-nitrosouréia
NLS Nanopartículas Lipídicas Sólidas
NTA Nanoparticle Tracking Analysis - Análise De Rastreamento De Partículas
PDI Índice de Polidispersividade
PEG Polietilenoglicol
RNA Ácido ribonucleico
RTU Ressecção Transuretral
siRNA RNA De Interferência
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 14
1.1. Câncer de Bexiga Urinária Não-Músuclo Invasivo (CBNMI)... 14
1.2. Alternativas possíveis: uso do antitumoral 5-Fluorouracil (5-FU) ... 15
1.3. Nanocarreadores lipídicos como sistema de liberação... 16
1.4. CLN à base de lipídios naturais conjugado com 5-FU... 18
1.5. Inibição da angiogênese com RNA de interferência (siRNA)... 19
2. JUSTIFICATIVA 22 3. OBJETIVOS 25 4. MATERIAIS E MÉTODOS 26 4.1. Obtenção dos materiais ... 26
4.2. Síntese de CLN... 26
4.2.1. Síntese de CLN/5-FU ... 27
4.3. Caracterização físico-química dos CLN sem e com incorporação de 5-FU e de siRNA... 27
4.3.1. Determinação de tamanho de partícula e do Potencial Zeta... 27
4.3.2. Análise de Rastreamento de partículas - NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) ... 27
4.3.3. Determinação da estabilidade da partícula... 28
4.3.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 28
4.3.5. Avaliação da complexação de siRNA empregando eletroforese... 29
4.4. Avaliação da Atividade Antitumoral in vivo dos fármacos... 29
4.4.1. Protocolo de Indução do CBNMI e Tratamentos dos animais... 29
4.4.2. Análises Histopatológicas... 31
4.5. Análises Estatísticas... 32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 5.1. Estudo das Características Físico-Químicas do Sistema CLN Apresentou Boa Estabilidade Coloidal e Homogeneidade de Partículas... 33
5.2. Caracterização Físico-Química do Sistema CLN/5-FU Indicou Resultados Coerentes Quando Comparadas as Análises de Tamanho, PDI, Zeta e Taxa de Encapsulação com Dados da Literatura... 36
5.3. Análise de Rastreamento de partículas, NTA (Nanoparticle Tracking Analisys), Determinou a Média no Tamanho e o Perfil de Concentração das Partículas e Confirmou Coerência no Sistema Particulado... 45
5.4. Técnica Eletroforética Demonstra Possível Complexação de siRNA ao Sistema de CLN... 48
5.5 Tratamento Intravesical com Carreador Lipídico Nanoestruturado Complexado com 5-FU ou siRNA Reverteu as Alterações Neoplásicas Quimicamente Induzidas na Bexiga Urinária, Reduzindo a Agressividade Tumoral... 50
6. CONCLUSÕES 56
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 57
ANEXO I – PROTOCOLO COMITÊ DE ÉTICA 64
ANEXO II – PROTOCOLO COMITÊ DE ÉTICA ANEXO III – DECLARAÇÃO DIREITOS AUTORAIS
65 66
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer de Bexiga Urinária Não-Músuclo Invasivo (CBNMI)
O câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo é caracterizado pela formação do tumor na camada mucosa mais interna da bexiga, o urotélio, e pela não invasão para as outras camadas do tecido. Ou seja, seu crescimento não penetra nas camadas adjacentes, como a camada muscular da bexiga. Esse é o tipo mais comum de câncer de bexiga, sendo que sete em cada 10 são do tipo não-músculo invasivo. Vale destacar que o câncer de bexiga é o quarto tipo de câncer mais comum em homens (Siegel et al., 2017; American Cancer Society, 2017). Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2016) a estimativa para o Brasil em 2016 foi de 9.670 novos casos de CB, sendo 7.200 homens e 2.470 mulheres. Em 2013 foram notificadas 3.642 mortes por CB, sendo 2.542 homens e 1.099 mulheres, o que demonstra o drástico aumento na prevalência desse tipo de tumor.
Mais de 70% da incidência de CB é superficial (pTis, pTa e pT1), tumor não-invasivo (CBNMI), e a ocorrência de uma doença invasiva é ocasional. Contudo, 50% dos tumores não-músculo invasivos recorrem em 4 anos após o tratamento e 11% evoluem para o fenótipo invasivo (Askeland et al., 2012)
As modalidades de tratamentos mais comuns para o CBNMI compreendem a ressecção transuretral (RTU), a qual envolve a retirada do tumor através de cirurgia, e a quimioterapia sistêmica (com administração de fármacos via oral ou injeção intravenosa) ou intravesical, que consiste na aplicação do fármaco diretamente na bexiga através da uretra. Por fim, tem-se a terapia adjuvante com Bacillus Calmette-Guerin (BCG) (Askeland et al., 2012).
Entretanto, o tratamento por RTU apresenta uma alta taxa de reincidência do tumor, chegando a mais de 70% dos casos. Além disso, outro ponto importante reside no fato de que mais de 30% dos casos progride para um tumor músculo invasivo, resultando na necessidade da realização do procedimento de cistectomia. Diante dessa circunstância, a retirada completa do órgão implica em severas consequências para o organismo (Kemp et al., 2005; Askeland et al., 2012).
O tratamento do CBNMI através de imunoterapia com adjuvante do BCG tem sido o mais utilizado atualmente, devido à grande diminuição de casos de reincidência e progressão do tumor. A terapia consiste na ativação de resposta imune sistêmica,
caracterizada pela expressão de citocinas no tecido da bexiga, a qual é responsável pelo recrutamento de neutrófilos, monócitos/macrófagos e células T para o local da lesão (Mehnert e Mäder, 2001; Kemp et al., 2005).
Entretanto, o uso do BCG é limitado devido aos diferentes efeitos colaterais que acarreta em mais de dois terços dos pacientes submetidos a esta modalidade de tratamento, destacando-se inflamações do tipo cistite, hematúria, disúria e urgência miccional, além de sintomas da gripe, como febres altas e inflamações severas. Destaca-se o fato de que 20 a 50% dos pacientes apresentam falhas com este tratamento, ocorrendo, assim, a progressão do tumor com invasão na camada muscular e até morte (Mehnert e Mäder, 2001; Koya et al., 2006).
1.2. Alternativas possíveis: uso do antitumoral 5-Fluorouracil (5-FU)
O 5-Fluorouracil (5-FU) é um antimetabólito que age bloqueando a incorporação das bases nitrogenadas purina e pirimidina na fita de DNA durante a fase ‘S’ do ciclo celular, interferindo no desenvolvimento e divisão celular. Isso acontece devido à similaridade estrutural com a purina, apresentando facilidade de incorporação às fitas de DNA e RNA das células. Sendo assim, o 5-FU age tanto inibindo o mecanismo, como sendo incorporado às rotas biossintéticas (National Center for Biotechnology Information - NCBI, 2005).
O 5-FU tem sido muito utilizado para o tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer de mama, câncer no trato aerodigestivo, câncer de cabeça e pescoço, e câncer de colorretal, sendo que este último apresenta melhor resposta ao uso deste fármaco. Porém, a quimioterapia empregando apenas o 5-FU como tratamento principal apresenta uma baixa taxa de resposta de 10% a 15% no tratamento do câncer de colorretal (Longley et al., 2003; Rogez et al., 2004). É importante salientar que o 5-FU apresenta um baixo tempo de meia-vida, entre 10-20 minutos, e uma grande toxicidade, levando à redução da dose em 30% a 40% dos pacientes tratados quando administrado via intravenosa (Rogez et al., 2004).
Por outro lado, o uso do 5-FU ainda é muito limitado pelo fato de sua administração intravenosa resultar em uma alta toxicidade. Além disso, tem-se uma acentuada resistência do organismo frente a este fármaco (Rogez et al., 2004). Em contrapartida, o 5-FU ainda é um dos principais fármacos utilizados no tratamento de câncer, sendo na maioria das vezes administrado juntamente com outros quimioterápicos para aumentar taxas de resposta. Nesse sentido, tem-se como exemplo a utilização do 5-FU em
associação com o adenovírus expressando o ligante CD40 para o tratamento do câncer de bexiga (Liljenfeldt et al., 2014).
Algumas estratégias estão sendo desenvolvidas a fim de modular a ação anticancerígena do 5-FU, como diminuição da degradação do fármaco em função do baixo tempo de meia vida, modificações nas rotas metabólicas do 5-FU nas células e estratégias para redução de sua toxicidade (Longley et al., 2003).
1.3. Nanocarreadores lipídicos como sistema de liberação
Desde meados de 1990 nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) tem sido um atrativo para o desenvolvimento de carreadores de fármacos e de sistemas de liberação controlada de fármacos. NLS são feitas a partir da mistura de lipídios sólidos, o que confere diversas características favoráveis ao sistema como possibilidade de liberação controlada e direcionamento de fármaco, aumento da estabilidade do fármaco, alta concentração de fármaco no sistema, favorável à incorporação de fármacos lipofílicos e hidrofílicos, não apresenta toxicidade, sem necessidade de uso de solventes orgânicos na síntese e não apresenta problemas para escalonar e esterilizar o sistema (Mehnert e Mäder, 2001; Yuan et al., 2007). NLS combinam as vantagens de nanopartículas poliméricas, como liberação controlada de fármaco e o impedimento de agregação do fármaco, com as vantagens da emulsão e dos lipossomas (outros sistemas carreadores coloidais) como baixa toxicidade, boa biocompatibilidade e alta viabilidade. Comparando com nanopartículas poliméricas tradicionais, as NLS apresentam a matriz lipídica composta por lipídicos fisiologicamente compatíveis, o que reduz o potencial de toxicidade aguda e crônica. Entretanto, existem algumas desvantagens nos sistemas que utilizam as NLS como limitação na capacidade de incorporação do fármaco, expulsão do fármaco durante tempo de estocagem e alto teor de água nas dispersões aquosas de NLS (70-95%) (Müller et al., 2000; Yuan et al., 2007).
A fim de sanar as dificuldades encontradas nos sistemas de NLS, foi desenvolvida a segunda geração da tecnologia de partículas lipídicas, chamados carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN). Neste sistema as partículas são produzidas usando misturas controladas de lipídios sólidos e líquidos (óleos), onde pode-se obter diferentes nanoestruturas dependendo da característica da matriz desejada. Isso consequentemente
levou a uma nova e aprimorada geração de nanopartículas lipídicas (Müller et al., 2002; Pardeike et al., 2009).
As grandes vantagens encontradas em sistemas de NCL, comparando com sistemas de NLS, são uma menor quantidade de água na suspensão da partícula, evita/minimiza o potencial de eliminação do fármaco da partícula enquanto armazenada e uma maior capacidade de incorporação de fármacos (Pardeike et al., 2009). Um pré-requisito para uma boa acomodação do fármaco na nanopartícula é a presença de grandes distâncias entre as cadeias de ácidos graxos dos glicerídeos e as imperfeições gerais dos cristais dos fármacos. Assim, para alcançar o máximo de “imperfeição”, ou seja, obter a maior quantidade de espaços livres na matriz lipídica, ao invés de utilizar lipídios sólidos com diferentes características em suas cadeias, como feito em sistemas de NLS, a nova partícula lipídica foi produzida pela mistura controlada de lipídios sólidos com lipídios líquidos quimicamente muito diferentes (óleos). Isso leva a uma maior imperfeição no cristal, levando a formação de uma nanoestrutura especial, aumentando a capacidade de incorporação de fármacos e modulando o perfil de liberação de fármacos (Müller et al., 2002).
Dependendo do método de produção e da composição dos ligantes de lipídios, tipos diferentes de CLN podem ser obtidos, como o imperfeito, amorfo e múltiplo componente. A Figura 1 representada abaixo mostra dois tipos de estrutura, à esquerda tem-se uma NLS, mostrando a organização espacial com poucos espaços livres para o acomodamento do fármaco; e à direita tem-se o CLN na forma imperfeita, onde o fármaco encontra uma quantidade maior de espaços livres para se acomodar, dificultando a expulsão destes quando o sistema estiver armazenado (Yuan et al., 2007).
Figura 1: Modelo esquemático de NLS e CLN. Formação de uma estrutura cristalina quase perfeita em NLS, com moléculas em forma idênticas, semelhantes a uma parede de tijolos, com capacidade de carga limitada (esquerda). Formação de uma matriz de partículas sólidas em CLN, com muitas imperfeições, comparável com a construção de um muro composto por inúmeros blocos com formatos diferentes; um aumento no número de imperfeições leva a um aumento da capacidade de incorporação de compostos ativos (Pardeike et al., 2009). (Modificado de (Müller et al., 2002).
1.4. CLN à base de lipídios naturais conjugado com 5-FU
A busca pelo uso de produtos naturais no desenvolvimento de novas tecnologias farmacêuticas tem aumentado significativamente nos últimos anos, tanto pela biodiversidade brasileira, pelo maior conhecimento dos benefícios à saúde humana ou até mesmo pelo incentivo à economia local. Neste trabalho foi utilizado como fonte lipídica sólida para a preparação do carreador lipídico nanoestruturado a manteiga de Cupuaçu, um lipídio biodegradável e biocompatível. Esta manteiga é obtida através da semente do Cupuaçu, Theobroma grandiflorum, por pressão a frio (Colomé et al., 2010). Cupuaçu é nativo dos estados do Pará e Maranhão, sendo considerada uma das frutas mais populares do mercado Amazônico (Rogez et al., 2004). A extração da manteiga da semente é baseada no uso sustentável da biodiversidade por pequenas comunidades Amazônicas. O Cupuaçu apresenta diversos componentes importantes como ácidos graxos insaturados, aminoácidos e vitaminas, apresentando um potencial valor nutricional. Uma importante classe de produtos naturais são os flavonoides, que são componentes polifenólicos encontrados em frutas, vegetais e alguns tipos de bebidas que possuem efeitos bioquímicos e antioxidantes benéficos. O Cupuaçu apresenta dois glicosídeos flavonoides sulfatados específicos (teograndina I e II), os quais podem aumentar a biodisponibilidade dos compostos por serem facilmente dissolvidos em água e hidrolisarem seus glicosídeos flavonoides e flavonoides correspondentes, favorecendo
atividade antioxidante. Além disso, podem ser encontrados flavonoides antioxidantes como catequina, epicatequina, quercetina e kampeferol no extrato da fruta (Yang et al., 2003).
Até o presente momento não há registros de trabalhos que utilizem carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN), à base de extrato de Cupuaçu e incorporados com 5-Fluoururacil. Assim sendo, este trabalho apresenta relevância significativa por utilizar produtos naturais brasileiros para propor o desenvolvimento de um sistema de liberação controlada de fármacos para o tratamento de câncer de bexiga não-músculo invasivo.
1.5. Inibição da angiogênese com RNA de interferência (siRNA)
Assim como tecidos normais, tumores também necessitam de sistemas de vascularização, por onde ocorre a distribuição de nutrientes para as células e a eliminação de resíduos metabólicos e dióxido de carbono. O desenvolvimento de novos vasos no tecido tumoral a partir de vasos existentes é conhecido como angiogênese, o qual é extremamente importante para o crescimento, desenvolvimento e invasão das células tumorais, contribuindo para o processo metastático. A angiogênese é controlada por reguladores que se ligam a receptores presentes nas membranas de células endoteliais vasculares, destacando os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Longley et al., 2003), que são considerados importantes alvos para a terapia antitumoral.
Sendo a angiogênese um dos processos mais importantes para sustentar o crescimento e invasão do tumor, novas estratégias terapêuticas estão surgindo com o objetivo de impedir a progressão tumoral, atuando de forma pontual sobre a expressão e bloqueio do VEGF. Um dos métodos que têm sido utilizados é o uso de RNAs de interferência, que agem na clivagem no RNA mensageiro que expressam o VEGF (Oh e Park, 2009; Colomé et al., 2010).
RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo natural da célula para regulação da expressão gênica que age no silenciamento de genes. Em células de mamíferos, a formação de pequenas moléculas de RNA de interferência (siRNA) se dá pela quebra de uma molécula dupla fita de RNA, através da ação da enzima DICER. Os siRNAs então se ligam a complexos de silenciamento induzido por RNA (RISCs), os quais serão responsáveis pela ligação desse RNAi à uma molécula de mRNA complementar, ocorrendo assim a degradação do mRNA, bloqueando sua tradução (Oh e Park, 2009). Entendendo que esse seria um bom alvo para o desenvolvimento de novas drogas, pequenas moléculas de RNA de interferência (siRNA)
foram sintetizadas a fim de maximizar o efeito dos RNAi, tornando esse processo mais previsível no que diz respeito à especificidade e duração da ação (Bumcrot et al., 2006). A
Figura 2 exemplifica o mecanismo de silenciamento promovido por uma molécula de siRNA.
Figura 2: Mecanismo de ação do siRNA na célula. Após a captação celular, o siRNA é incorporado ao complexo indutor de silenciamento de RNA (RISC), resultando na clivagem da fita “sense” pela enzima argonauta 2 (AGO2). Assim, o c omplexo ativado liga-se ao RNA complementar, promovendo sua degradação e co nsequente silenciamento do gene de interesse (Yang et al., 2003).
É importante ressaltar que esse material genético, ao entrar em contato com o organismo, encontra inúmeras barreiras extras e intracelulares que afetam os resultados da terapia gênica. Quando em estado livre no citosol, as moléculas de siRNA não são captadas eficientemente pelas células, pois as cargas negativas presentem nas membranas celulares dificultam a permeação do material genético, que também apresentam carga negativa e um elevado peso molecular (aproximadamente 13 kDa). RNAs livres são instáveis sob condições fisiológicas, resultando na degradação enzimática pela ação de endonucleases (REFS) e eliminação pelo sistema reticuloendotelial (SRE). Além disso, o efeito que esse material genético pode causar fora da célula-alvo é desconhecido, o que pode levar a toxicidades não
desejadas no tecido celular (Zhao e Huang, 2014). Dessa maneira, o uso de sistemas de liberação que aumentem a taxa de captação das moléculas de siRNA e ao mesmo tempo proporcione proteção contra a ação de endonucleases, representam uma estratégia promissora para a terapia gênica visando o tratamento do câncer de bexiga. Como exemplo de um sistema de liberação para siRNA tem-se os sistemas lipídicos, com a formação de partículas lipídicas responsáveis pela encapsulação e proteção do material genético até serem destinadas às células-alvo.
Şalva et al. (2015) descreveram o desenvolvimento de uma plataforma de lipossomas revestidos com quitosana para aumentar o efeito de silenciamento dos genes VEGF e HIF-1α em células provenientes de câncer de mama, importantes genes no processo de angiogênese. Foi mostrado que houve uma significativa diminuição da expressão de RNA mensageiro (RNAm) correspondentes aos dois genes, ocorrendo mais de 90% de supressão da expressão, o que torna esse sistema bastante promissor para a terapia do câncer (Yuan et al., 2007; Şalva et al., 2015).
Cao et al. (2013) desenvolveu um trabalho onde propôs um tratamento para o câncer com base em RNA de interferência. O siRNA utilizado foi escolhido com a intenção de bloquear a expressão de proteínas responsáveis por conferir resistência a fármacos pelas células, e assim, melhorar a resposta ao tratamento com doxorrubicina. O trabalho apontou bons resultados, mostrando que a toxicidade do fármaco foi aumentada com o uso desta plataforma. Além disso, foi constatado que houve uma diminuição do nível de RNAm do gene em questão, representando assim um modelo promissor para o uso em sistemas de direcionamento e liberação de fármacos para o tratamento de câncer (Hanahan e Weinberg, 2011).
2. JUSTIFICATIVA
A necessidade do desenvolvimento de novos fármacos e/ou combinações terapêuticas se relaciona com a alta frequência de recorrência do CBNMI. Neste tipo de tumor, a imunoterapia com BCG ainda representa a forma mais eficaz de terapia intravesical para a profilaxia da recorrência e progressão tumoral. Contudo, a imunoterapia com BCG está frequentemente associada com efeitos adversos locais e/ou sistêmicos, incluindo sepse, além de recorrência tumoral em até 31% dos casos. Apesar disso, não há no mercado nenhum outro medicamento mais eficaz que BCG. Outros tipos de terapias, como quimioterapias e imunoterapias, apresentam limitações devido ao baixo tempo de residência das formulações no sítio de administração, levando à necessidade de utilização de altas doses no tratamento, o que aumenta a toxicidade no organismo, os efeitos colaterais dos fármacos e as reações adversas.
O 5-FU é um antitumoral muito utilizado atualmente para o tratamento de diversos tipos de tumor, devido à sua eficácia terapêutica reconhecida. Porém, este fármaco apresenta tempo de meia-vida curto, o que leva à administração de altas doses do medicamento, tornando-o tóxico ao organismo quando comparado, por exemplo, a fármacos que apresentam tempo de meia-vida elevado. O que se tem feito para contornar este problema é a utilização de outros fármacos em associação com o 5-FU, a fim de administrar a dose efetiva para o tratamento. A criação de sistemas de liberação de fármacos como plataforma para o direcionamento do 5-FU no organismo se faz necessária com intuito de se obter uma proteção contra degradação, visando um aumento no tempo de meia vida do 5-FU. Além disso, o uso de sistemas de liberação pode promover sustentação da liberação e o aumento no tempo de retenção do fármaco no tecido tumoral. Como resultado, tem-se uma diminuição da concentração das doses administradas e da toxicidade do 5-FU.
Além da utilização de quimioterápicos para o tratamento do CBNMI, tem-se como tratamento adjuvante a terapia gênica, a qual age diretamente no bloqueio da expressão gênica. Nesse sentido, o desenvolvimento de plataformas de liberação de fármacos que atuem sobre diferentes mecanismos de ação, como a síntese de DNA por meio da ação de quimioterápicos e a expressão de proteínas fundamentais para o crescimento tumoral devido à ação de RNAs de silenciamento (siRNA), representa uma alternativa com grande potencial para o tratamento do CBNMI. Com o objetivo de bloquear a expressão de genes responsáveis
pelo processo de angiogênese tumoral, a utilização de siRNA para VEGF foi apresentada, afim de reduzir o crescimento e a invasividade do tumor, dificultando sua progressão.
Considerando aspectos relacionados à aplicação clínica de siRNA, torna-se necessário o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos eficientes. Assim sendo, vários sistemas não virais têm sido desenvolvidos para o carreamento de siRNA, como lipídios catiônicos (Ko et al., 2009), polímeros (Feng et al., 2013) e dendrímeros (Richards Grayson et al., 2006). Para que ocorra o silenciamento de genes em diversos tecidos biológicos, tem-se a necessidade do carreamento do siRNA em um sistema de liberação que proteja o siRNA contra degradação e ao mesmo tempo facilite a transfecção celular (Whitehead et al., 2009).
O desenvolvimento de nanossistemas para liberação controlada de fármacos se faz necessário para o aprimoramento dos tratamentos disponibilizados atualmente para o câncer de bexiga, visando a uma ação localizada, a redução da dose administrada e a diminuição dos efeitos adversos inerentes ao tratamento. Como exemplo de plataformas de liberação de fármacos tem-se o carreador lipídico nanoestruturado, o qual é biocompatível e possui uma estrutura bastante favorável para a encapsulação de fármacos e adsorção de compostos em sua superfície.
Por outro lado, como o nanossistema contendo o siRNA para VEGF e o 5-FU será administrado por meio da aplicação intravesical, acredita-se que o fluxo urinário possa reduzir o tempo de retenção do sistema de liberação na bexiga urinária, tornando necessário o aumento na frequência de administração e na dose dos fármacos. Levando em consideração que o potencial elétrico positivo induz a uma característica catiônica das partículas, espera-se que ocorra um aumento na adesividade do sistema na superfície do urotélio, já que ocorre uma interação das cargas positivas com as cargas negativas presentes nas membranas celulares. Portanto, a formulação lipídica das partículas pode proporcionar um aumento no tempo de residência do 5-FU e do siRNA-VEGF e promover uma sustentação na liberação destes.
Para se ter uma comparação detalhada sobre os carreadores lipídicos nanoestruturados sintetizados neste trabalho, foi necessário fazer a busca pela literatura de trabalhos que utilizassem a mesma base tecnológica para a encapsulação de 5-FU, independente do objetivo final de cada trabalho. Foi constatado então, que não existemna literatura até o momento registros de trabalhos que descrevem carreadores lipídicos
nanoestruturados a base de lipídios naturais (manteiga de cupuaçu e óleo de semente de buriti) contendo 5-FU e siRNA para VEGF visando o tratamento do CBNMI. Por conseguinte, os CLN podem ser considerados como alternativas promissoras para o tratamento do CBNMI.
3. OBJETIVOS
Os objetivos gerais deste projeto foram investigar os efeitos histopatológicos dos CLN contendo 5-FU e siRNA para VEGF no tratamento do CBNMI induzido quimicamente em ratos. Os objetivos gerais foram alcançados através dos seguintes objetivos específicos:
a) Síntese e caracterização do CLN;
b) Incorporação do 5-FU ao sistema particulado, síntese e caracterização do CLN/5-FU; c) Incorporação de siRNA ao sistema, síntese e caracterização do CLN/siRNA;
d) Teste de estabilidade da partícula nos sistemas sintetizados: CLN e CLN/5-FU; e) Determinação da porcentagem de encapsulação do 5-FU ao CLN;
f) Caracterização da histopatologia do CBNMI de ratos induzidos quimicamente e comparação da progressão tumoral frente aos sistemas CLN, CLN/5-FU, CLN/siRNA.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Obtenção dos materiais
Os óleos naturais, como a manteiga de Cupuaçu, o Bis-2-Digliceril Poliaciladipato (BDP) e óleo de Buriti foram doados pela empresa Amazon Oil (na espera de formulários para notificar esta pesquisa para PatGen). Todos os demais materiais utilizados no trabalho foram comprados da empresa Sigma Aldrich.
4.2. Síntese de CLN
Para a sínese de CLN, seguiu-se o seguinte protocolo. Foram pesadas porcentagem em massa para cada composto, sendo 4% (0,06 g) de cloreto de Behetrimônio, 30% (0,460 g) de manteiga virgem de Cupuaçu, 13% (0,20 g) de BDP, 8% (0,120 g) de óleo de Buriti e 4% (0,06 g) de Pluronic F-68. Os pesos foram obtidos para uma solução final de 15 mL. Para se chegar na formulação final, foram realizados diversas formulações a fim de padronizar e estabelecer a melhor.
Primeiramente, foi dissolvido o cloreto de Behetrimônio em 13 mL de água destilada, sob agitação magnética, com temperatura aproximada de 60°C a 70°C. Em outro recipiente, colocou-se o Cupuaçu e o BDP para fundir, em ‘banho maria’, à temperatura de 70°C, até que fique uma mistura homogênea. Em seguida, adicionou-se o óleo de Buriti e voltar ao ‘banho Maria’. Ao mesmo tempo, adiciona-se o pluronic F-68 em 2 mL de água destilada para dissolver à mesma temperatura de 70°C. Em seguida, coloca-se a solução com cloreto de Behetrimônio sob agitação ultrarrápida, utilizando o Turrax, a 10.000 rpm. Adiciona-se gotejando primeiramente a solução com Pluronic F-68 e logo em seguida a mistura oleosa na solução sob agitação. Deixa-se a mistura sob agitação no Turrax por 40 minutos a 9.500 rpm.
4.2.1. Síntese de CLN/5-FU
Para a preparação do sistema nanoparticulado com o fármaco, seguiu-se o protocolo descrito acima. O 5-FU foi incorporado em uma concentração de 5 mg/mL.
Pesou-se 0,075 g de 5-FU e adicionou-se à mistura oleosa, contento Cupuaçu, BDP e óleo de Buriti, antes da mistura ser adicionada à solução de Behetrimônio. A mistura foi bem homogeneizada em ‘banho Maria’, com o intuito de obter a melhor dispersão do fármaco na fase lipídica. Após essa etapa, protocolo seguiu-se normalmente.
4.3. Caracterização físico-química dos CLN sem e com incorporação de 5-FU e de siRNA
4.3.1. Determinação de tamanho de partícula e do Potencial Zeta
O tamanho da partícula do CLN foi determinado por técnica de espalhamento de luz, DLS (Dynamic light scattering), a qual determina o tamanho hidrodinâmico do diâmetro da partícula baseado na refração da luz através das partículas. O equipamento utilizado foi Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Malvern, U.K.).
A carga de superfície da mistura de CLN foi confirmada através de medidas do potencial zeta, determinando também a estabilidade do sistema. O equipamento utilizado também foi Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Malvern, U.K.). O potencial Zeta mede a distribuição de carga da superfície da partícula, o qual é determinado pela mobilidade eletroforética da partícula e sua interação com o dispersante utilizado. A interação das partículas se dá pela magnitude do potencial Zeta, sendo possível prever a estabilidade da suspensão coloidal, bem como a agregação das partículas. Ou seja, quanto maior o valor absoluto do potencial Zeta, maiores serão as forças de repulsão entre as partículas e assim menor possibilidade para a formação de agregados (Melo et al., 2010).
4.3.2. Análise de Rastreamento de partículas - NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) A análise de rastreamento de partículas por NTA foi empregada para avaliar a concentração das partículas em solução e obter o tamanho de diâmetro médio das partículas. Para isto, foi utilizado o equipamento NS300 (Nanosigth, Malvern), com câmera digital sCMOS e o software Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3. A técnica de NTA determina o
diâmetro hidrodinâmico de cada partícula individualmente, através do movimento Browniano, calculado pela equação de Stokes-Einstein (Filipe et al., 2010; Carr e Wright, 2012). O software do instrumento rastreia simultaneamente várias partículas enquanto elas entram e saem do plano de foco, identificando e monitorando o centro de cada partícula em cada frame captado durante 30 a 60 segundos (900 a 1800 frames por análise)(Anderson et al., 2013). Para cada amostra, os vídeos foram adquiridos em 32,5 imagens/segundo, com a câmera posicionada no nível 8 e foram obtidos um total de 1951 frames. As amostras foram diluídas 10000 vezes e injetadas no compartimento de análise com o auxílio de seringas. O tamanho médio e os valores de desvio padrão (DP) obtidos pelo software correspondem à média aritmética dos valores calculados através dos tamanhos de todas as partículas analisadas pelo software. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente e em triplicata.
4.3.3. Determinação da estabilidade da partícula
Para se ter o estudo de estabilidade da partícula ao longo do tempo, análises do potencial Zeta e do tamanho da partícula foram feitas compreendendo os dias 1, 2, 3, 4, 11, 18 e 23 a partir da síntese da partícula. Essas análises foram feitas a fim de identificar alterações no tamanho e no potencial Zeta que poderiam indicar a desestabilidade da partícula sintetizada. Todas as medidas foram feitas em triplicata.
4.3.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
As amostras de CLN foram submetidas à técnica de CLAE para identificar quanti e qualitativamente a incorporação de 5-FU na partícula. Foi utilizado o equipamento Shimadzu – Prominence, com detector de arranjo de diodos (SPD20MA) e bomba LC-20AT. A coluna utilizada foi Agilent Microsorb-MV 100-5, C18, tamanho 250 mm X 4,6 mm. Para a realização da análise foram retiradas duas alíquotas, a primeira pegou-se 400 µL de CLN e colocou-se no filtro para microtubos, centrifugada à 14.000 rpm, 10°C por 30 min, o sobrenadante obtido foi reservado para utilização; a segunda foi uma alíquota da solução de CLN total, onde 100 µL de amostra foi adicionado à 900 µL de metanol, centrifugado à 14.000 rpm, 10°C por 30 min e filtrado. A eficiência de encapsulação se deu pela diferença de concentração de 5-FU
encontrada no sobrenadante e na solução total. Foi utilizado solução de 90/10, v/v de metanol em água, como solvente. Os parâmetros do método utilizados para análise foram fluxo de 0,1 mL/min, água ácida com pH=3,4.
4.3.5. Avaliação da complexação de siRNA empregando eletroforese
A preparação do complexo de CLN com siRNA se deu pela adição de 5,14 µL de siRNA em 200 µL de CLN, para chegar a uma dose de siRNA de 140 µg/Kg por animal. A solução foi misturada por 30 s e incubada à temperatura ambiente por 30 min. A fim de avaliar a complexação, 20 µL desta solução adicionada à 10 µL de tampão de amostra (tampão contendo 0,25% de Azul de Bromofenol, 0,25% de Orange G e 40% de glucose) foi submetida à eletroforese com gel de Agarose a 2% em tampão TAE 1X (tampão TAE 50X: 242 g de Tris Base; 57,1 mL de ácido acético glacial; 100 ml de EDTA 0,5M pH 8,0; água para volume final de 100 mL) com Brometo de Etídio. A concentração de Brometo de Etídio utilizada foi de 0,5 µg/mL e as condições para a eletroforese foram 100 V por 20 minutos, seguido por visualização sob luz ultravioleta, no transiluminador UV para gel (transiluminador uv 302nm Kasvi).
4.4. Avaliação da Atividade Antitumoral in vivo dos fármacos 4.4.1. Protocolo de Indução do CBNMI e Tratamentos dos animais
No presente estudo foram utilizadas 30 ratas da variedade Fischer 344, na faixa etária de 7 semanas, pesando em média 190 gramas, obtidos no Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP). Para a indução do CBNMI, 25 animais foram anestesiados com Cloridrato de Xilazina 2% (5 mg/Kg i.m.; König, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Ketamina 10% (60 mg/Kg, i.m.; Fort Dodge, Iowa, EUA), mantidos nesse estado por 45 minutos para evitar micção espontânea e instilada uma dose de 1,5 mg/kg de N-metil-N-nitrosouréia (MNU - Sigma, St. Louis, MO, EUA) dissolvida em 0,3 mL de citrato de sódio (1M pH 6,0) a cada 15 dias (semana 0, 2, 4, 6), totalizando 4 doses (Garcia et al., 2016). Os outros 5 animais que não receberam MNU foram considerados como Grupo Controle. Duas semanas após a última dose de MNU, os animais foram submetidos ao exame de ultrassonografia para avaliar a ocorrência de tumor. Os ultrassons foram avaliados utilizando
um sistema portátil de ultrassonografia (Z6 Vet, Mindray) controlado por software com um transdutor microconvexo (6C2P). A ultrassonografia das bexigas urinária dos animais induzidos com MNU mostrou massa tumoral infiltrando as paredes cranial e ventral da bexiga (Figura 3). A média do tamanho tumoral na parede ventral da bexiga foi de 0,44 cm X 0,19 cm longitudinalmente (medida 1) e 0,28 cm X 0,28 cm transversalmente (medida 2) (Figura 3B). Ainda, a média do tamanho tumoral na parede crânio-ventral foi de 0,14 cm X 0,15 cm longitudinalmente (medida 1) e 0,31 cm X 0,26 cm transversalmente (medida 2) (Figura 3C).
Figura 3: Ultrassonografia dos animais dos Grupos Controle (A) e induzidos com MNU (B, C).
(a) Morfologia da bexiga urinária com aspectos normais. (B) Lesão tumoral na parede ventral da bexiga medindo 0,44 cm X 0,19 cm longitudinalmente (medida 1) e 0,28 cm X 0,28 cm transversalmente (medida 2). (C) Lesão na parede crânio-ventral foi de 0,14 cm X 0,15 cm longitudinalmente (medida 1) e 0,31 cm X 0,26 cm transversalmente (medida 2).
Após a indução do CBNMI com MNU, os animais foram divididos em 6 grupos (n=5 animais por grupo) (Figura 4): Grupo Controle (CT): recebeu uma dose intravesical de 0,3 mL de solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas (Garcia et al., 2016); Grupo MNU
(Câncer): recebeu o mesmo tratamento que o Grupo 1; Grupo MNU + 5-FU: recebeu uma
dose intravesical de 10 mg/Kg de 5-Fluorouracil por 6 semanas consecutivas; Grupo MNU +
CLN/B: recebeu uma dose intravesical de 1 mg/Kg da partícula branca do carreador lipídico
nanoestruturado (CLN) por 6 semanas consecutivas; Grupo MNU + CLN/5-FU: recebeu uma dose intravesical de 1 mg/Kg do CLN, complexado com 5 mg/Kg de 5-FU por 6 semanas
consecutivas; Grupo MNU + CLN/siRNA: recebeu uma dose intravesical de 1 mg/Kg do CLN, complexado com 140 µg/Kg de siRNA por 6 semanas consecutivas (Fávaro et al., 2017).
As doses intravesicais nos diferentes grupos experimentais foram instiladas via cateter flexível 20 gauge (Abocath, São Paulo, Brasil). Os animais de todos os grupos experimentais receberam água e a mesma dieta sólida ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Após o período de tratamento, os animais foram eutanasiados e as bexigas urinárias coletadas e submetidas às análises histopatológicas. Os protocolos experimentais seguiram os princípios éticos em pesquisa animal foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)/ UNICAMP (protocolos: 3873-1 e 4368-1, Anexos I e II).
Figura 4: Planejamento experimental da indução e tratamento do CBNMI nos diferentes
grupos experimentais.
4.4.2. Análises Histopatológicas
Para as análises histopatológicas, amostras da bexiga urinária de todos os animais de cada grupo experimental (n= 5 animais por grupo) foram coletadas e fixadas em solução fixadora de Bouin por doze horas. Após a fixação, os tecidos foram lavados em álcool etílico a 70%, com posterior desidratação em uma série crescente de álcoois. Posteriormente, os fragmentos foram diafanizados com xilol por 2 h e inclusos em polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EUA). Em seguida, os materiais foram seccionados no micrótomo Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemanha) com espessura de 5 micrômetros, corados com Hematoxilina-Eosina e fotografados no fotomicroscópio DM2500 (Leica, Munique, Alemanha). O diagnóstico das lesões uroteliais foram classificadas conforme o estadiamento proposto pelo consenso da Organização Mundial da Saúde/Sociedade Internacional de Patologia Urológica (Epstein et al., 1998).
4.5. Análises Estatísticas
Os parâmetros quantificados (análises histopatológicas) foram analisados estatisticamente para os diferentes grupos experimentais. Para as análises histopatológicas foram empregados o teste de proporção, sendo que para essas análises o erro tipo-I de 1% foi considerado estatisticamente significante. Foi realizado teste T pareado seguido de Fischer.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Estudo das Características Físico-Químicas do Sistema CLN Apresentou Boa Estabilidade Coloidal e Homogeneidade de Partículas
Os CLN foram sintetizados de acordo com o protocolo descrito anteriormente. Para avaliação físico-química das partículas, foram feitas medidas do potencial Zeta, do tamanho de partícula e do índice de polidispersividade (PDI),
Tabela 1:valores das médias dos tamanhos, PDI e potencial Zeta dos CLN; análise realizada em triplicata
Tamanho (nm) PDI Zeta (mV) Média das análises 218,8 ± 2 0,31 ± 0,02 68,1 ± 1
A Tabela 1 mostra os valores obtidos do potencial Zeta, do tamanho de partícula e do índice de polidispersividade. Sabendo-se que uma boa estabilidade coloidal por cargas é dada pelo valor do potencial Zeta igual ou maior a ±30 mV (Melo et al., 2010), o valor do potencial Zeta do sistema apresentado ser igual a 68,1 mV mostra que o sistema coloidal possui carga positiva e uma ótima estabilidade.
O índice de polidispersividade (PDI) indica a distribuição do tamanho das partículas, caracterizando a homogeneidade da solução (Melo et al., 2010). Quanto mais próximo a PDI = 1,0, mais polidispersa está a solução, ou seja, menos homogênea ela se encontra, apresentando populações de partículas com tamanhos variados. O valor de PDI igual a 0,309 mostra que a solução apresenta uma boa homogeneidade e estabilidade, com o tamanho das partículas de aproximadamente 220 nm.
Para mostrar a estabilidade do sistema ao longo do tempo, medidas do potencial Zeta, tamanho e do índice de polidispersividade (PDI) foram feitas a cada dia, no período de 1 a 23 dias. Todas as medidas foram feitas em triplicatas e suas médias foram representadas nos gráficos.
Gráfico 1: medida do potencial Zeta das partículas CLN ao longo do tempo.
Como pôde ser observado no Gráfico 1: medida do potencial Zeta das partículas CLN
ao longo do, a maior variação do potencial Zeta das partículas foi de 4,86 mV, do 18° ao 23° dia. Porém esse valor não altera a estabilidade do sistema, já que a variação é muito pequena por quase um mês de monitoramento. Sendo assim, o sistema apresenta uma ótima estabilidade ao longo de 23 dias. Porém, foi observado que há uma tendência do decaimento do valor do potencial Zeta ao passar dos dias, o que pode indicar a desestabilidade do sistema passados tempos maiores do que 30 dias.
Essa mesma estabilidade ao longo dos dias foi medida para tamanho de partícula e índice de polidispersividade (PDI). O Gráfico 2 abaixo mostra os valores de tamanho das partículas ao longo dos dias. É possível observar que os valores se mantiveram praticamente constante, onde pôde ser observado uma média de tamanho de aproximadamente 220 nm durantes os 23 dias de análise.
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 1 2 3 4 11 18 23 Pot en cail Z eta (m V) Dias
Gráfico 2: medida do tamanho das partículas CLN ao longo do tempo.
O PDI dessas partículas não apresentou o mesmo padrão de continuidade, como mostra o Gráfico 3. É possível observar um aumento considerável do PDI no 23° dia, que chegou próximo de 0,5. Esse aumento pode ser relacionado com aglomeração de partículas, levando a formação de diversas populações com tamanhos variados. Entre o primeiro e o 18° dias o PDI se manteve relativamente constante, apresentando uma média no valor de aproximadamente 0,35.
Gráfico 3: medida do índice de polidispersividade das partículas CLN ao longo do tempo.
Através das análises apresentadas entende-se que o sistema permaneceu estável até o 18° dia. A partir desse dia, o índice de polidispersividade se mostrou mais elevado, o que pode indicar alguma aglomeração de partículas que acarreta empopulações de partículas com
100 120 140 160 180 200 220 240 1 2 3 4 11 18 23 Taman h o (n m ) Dias
Estabilidade do Tamanho - CLN
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 1 2 3 4 11 18 23 PDI DiasEstabilidade do PDI - CLN
tamanhos variados, tornando o sistema menos homogêneo e o valor de tamanho de partícula menos confiável. Portanto, a variação do tamanho das partículas e do PDI caracterizou um sistema estável até o 18° dia, onde não houve mudanças significativas em seus valores.
5.2. Caracterização Físico-Química do Sistema CLN/5-FU Indicou Resultados Coerentes Quando Comparadas as Análises de Tamanho, PDI, Zeta e Taxa de Encapsulação com Dados da Literatura
Com o sistema de CLN estabelecido e analisado, foi feita então a incorporação do fármaco 5-FU, conforme protocolo estabelecido. Para sua caracterização, foram feitas medidas de potencial Zeta, tamanho e PDI, assim como a análise em CLAE, cromatografia líquida de alta eficiência.
Tabela 2:valores das médias dos tamanhos, PDI e potencial Zeta dos CLN/5-FU; análise
realizada em triplicata
Tamanho (nm) PDI Zeta (mV) Média das análises 217,2 ± 4 0,32 ± 0,03 74,4 ± 3
O valor do potencial Zeta de 74,4 mV, como mostrado na Tabela 2mostra que o sistema apresenta carga positiva e uma ótima estabilidade, sendo maior do que o sistema sem o fármaco incorporado. O PDI também se manteve em um valor bom, próximo a 0,3, o que determina boa homogeneidade das partículas no sistema. O tamanho das partículas, de aproximadamente 215 nm, mostrou que a partícula com o 5-FU não sofreu alteração de tamanho, o que pode indicar uma baixa incorporação de 5-FU ao sistema. Essas análises mostraram que o sistema permaneceu coerente quando comparado com CLN sem a incorporação do fármaco.
Após a incorporação do fármaco ao sistema, a análise de estabilidade ao longo do tempo também foi realizada, medindo-se o potencial Zeta, tamanho das partículas e índice de polidispersividade (PDI) no período de 1 a 23 dias. Todas as medidas foram feitas em triplicatas e suas médias foram representadas nos gráficos.
Gráfico 4: medida do potencial Zeta das partículas CLN/5-FU ao longo do tempo.
O Gráfico 44 representa as medidas de potencial Zeta do sistema particulado com
a presença de 5-FU, onde a média do valor do potencial é 67 mV durante todo o período. No 3° dia pôde-se observar uma pequena variação no valor, porém essa alteração não indicou uma desestabilidade do sistema, visto que todos os valores do potencial permaneceram acima de 30 mV. Sendo assim, o sistema com o fármaco incorporado também apresenta uma ótima estabilidade ao longo de 23 dias. Entretanto, assim como no sistema CLN sem o fármaco, o gráfico aponta que há uma tendência do decaimento do valor do potencial Zeta ao passar dos dias, o que não garante total estabilidade do sistema após esse período de 23 dias.
Os valores de tamanho de partícula e PDI também foram analisados para este sistema contendo 5-FU.
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 1 2 3 4 11 18 23 Pot en ci al Z eta (m V) Dias
Gráfico 5: medida do tamanho das partículas CLN /5-FU ao longo do tempo.
No Gráfico 5 é possível observar que o tamanho das partículas também se manteve constante, como observado no sistema CLN, apresentando uma média de tamanho também próximo de 220 nm, como era esperado. O que diferiu nesse sistema comparado com o CLN foi que o PDI se manteve bem constante ao longo dos dias, o que pode indicar que não houve aglomeração de partículas em solução, não apresentando populações de partículas com tamanhos muito diferentes. A média do valor de PDI foi aproximadamente 0,3 ao longo de todos os dias, como era esperado, mostrando uma baixa polidispersividade do sistema, como mostra o Gráfico 6. Portanto, é possível inferir, com base nos dados apresentados, que o sistema CLN/5FU possui uma ótima estabilidade e homogeneidade de partículas ao longo dos 23 dias analisados.
100 120 140 160 180 200 220 240 1 2 3 4 11 18 23 Taman h o (n m ) Dias
Gráfico 6: medida do índice de polidispersividade das partículas CLN/5-FU ao longo do tempo
Para uma análise quantitativa da incorporação de 5-FU ao sistema, foi realizado e ensaio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), de acordo com os parâmetros descritos anteriormente. Primeiramente as amostras de sobrenadante e solução total foram preparadas conforme protocolo. A presença de metanol no o preparo da solução total se deu para que ocorra a ruptura da partícula e assim todo o 5-FU seja liberado em solução. Em seguida, para que fosse calculado a concentração de 5-FU nas amostras, foi necessário construir uma curva padrão de calibração, com as concentrações de 5-FU estabelecidas em 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL e 100 µg/mL. Todas as diluições das concentrações foram feitas em soluções de metanol em água 4:6, respectivamente, em balão volumétrico.
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 1 2 3 4 11 18 23 PDI Dias
Gráfico 7: gráfico representando a análise do complexo CLN/5-FU por CLAE. Os pontos em
azul representam a curva de calibração de 5-FU; a seta em laranja mostra a concentração de FU no sobrenadante, diluído 100X; e o quadrado em vermelho mostra a concentração de 5-FU na solução total, com o que foi incorporado nas partículas e o que está no sobrenadante.
Através da curva de calibração do 5-FU por CLAE, representada no Gráfico 7, foi possível calcular a concentração de 5-FU tanto no sobrenadante quanto na solução total da amostra. A seta em laranja na curva representa o valor de 102,53 µg/mL encontrado no sobrenadante; e o quadrado em vermelho representa o valor de 55,87 µg/mL de 5-FU encontrado na solução total. Após a multiplicação pelo fator de diluição de cada amostra, os valores reais de concentração encontrados para o sobrenadante foi 5,13mg/mL e para a solução total foi 5,59 mg/mL. A partir desses valores de concentração foi possível inferir uma eficiência de encapsulação do 5-FU no sistema particulado CLN, levando em consideração a subtração da concentração total pela concentração encontrada no sobrenadante. Assim, foi possível estabelecer uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 8,27%, ou seja, a concentração de 5-FU que se encontra encapsulada é de aproximadamente 0,46 mg/mL.
Como foi descrito anteriormente, para a síntese do complexo CLN/5-FU, foi necessário incorporar o fármaco na mistura oleosa fundida, antes mesmo da formação do sistema particulado. Porém, o 5-FU é um fármaco hidrofílico, o que dificultou a dispersão do mesmo na porção lipídica. A interação do fármaco com a partícula se deu predominantemente por adsorção, o que explica a baixa porcentagem de encapsulação do fármaco. Vale ressaltar ainda, que para a execução dos experimentos in vivo e para a análise destes resultados, foram considerados os valores de concentração do fármaco tanto em solução total como
y = 79853x - 22406 R² = 1 0 1500000 3000000 4500000 6000000 7500000 9000000 0 20 40 60 80 100 120 Áre a Concentração
Análise CLAE CLN/5-FU
Curva de calibração
Sobrenadante 1:100
Total 1:50
Linear (Curva de calibração)
encapsulado, pois a resposta biológica ao fármaco se difere dependendo da forma como é apresentado ao organismo.
O sistema de CLN apresentado neste trabalho foi comparado com outros estudos disponibilizados na literatura que foram realizados por diferentes autores, tendo como pontos principais a tecnologia utilizada e as análises físico-químicas empregadas na caracterização das partículas.
Mais recentemente, o trabalho de (Rajinikanth e Chellian, 2016) estudou o desenvolvimento de CLN à base de hidrogel com encapsulamento de 5-FU para o tratamento de doenças de pele. Para a construção da partícula foi utilizado Precirol ATO5 (palmitoestearato de glicerol) como lipídeo em fase sólida e Labrasol como lipídio em fase líquida. Como surfactante para a formação das partículas, foram escolhidos Poloxamer 188 e Solutol HS15. As partículas foram obtidas através do método de homogeneização com temperatura (70°C), utilizando o homogeneizador de alta pressão. Uma primeira emulsão foi obtida através da agitação magnética com alta velocidade (8000 rpm) durante 2 minutos, utilizando o Ultra Turrax. Em seguida, a mistura foi colocada no homogeneizador a alta pressão onde passou por 5 a 6 ciclos de repetição, com 1500 bar de pressão. As médias dos valores de tamanho, PDI e Zeta para as partículas foram de 208.32 ± 8.21 nm, 0.352 ± 0.060 e -21.82 ± 0.40 mV, respectivamente. A eficiência média obtida no encapsulamento do 5-Fu foi de 79,03% (Rajinikanth e Chellian, 2016).
Em 2015, Badea et al. desenvolveram um carreador lipídico nanoestruturado para o tratamento de câncer de pele, com liberação controlada de 5-FU. Os CLN foram preparados pelo método de homogeneização a alta pressão com temperatura. O óleo da semente de amaranto enriquecida com esqualeno foi utilizado na composição da fase lipídica; e a composição da fase aquosa se deu pela presença de colato de sódio, Tween 20 e Pluronic F-68, incorporados como surfactantes do sistema particulado. Uma primeira emulsão foi obtida através da mistura das fases lipídica e aquosa sob agitação magnética em 85°C, por 30 min. Depois a mistura foi colocada em agitação mecânica com velocidade de 12.000 rpm por 1 minuto. A emulsão resultante foi submetida ao homogeneizador de alta pressão por 6 ciclos de 600 bar de pressão. As médias dos valores de tamanho, PDI e Zeta para as partículas foram de 98 nm, 0,179 e -28,1 mV, respectivamente. A eficiência média obtida no encapsulamento do 5-Fu foi de 61,3% (Badea et al., 2015).
Ainda em 2015, Qu et al., descreveram um método para o desenvolvimento de carreador lipídico nanoestruturado para o tratamento de câncer de estomago, com liberação controlada de 5-FU conjugado com lipídeo de ácido esteárico. Os CLN foram preparados pelo método de emulsificação seguida por solidificação à baixa temperatura. A fase lipídica foi obtida através da incorporação do 5-FU modificado aos compostos monoesterato de glicerol, lecitina de soja e óleo de soja, com agitação a 70°C. Em seguida, a fase lipídica foi incorporada à fase aquosa, que continha Tween 80 e brometo de dimetildioctadecilamonio, à mesma temperatura e mantendo agitação em 800 rpm, por 3 horas. A emulsão foi colocada em banho de gelo (0°C- 2°C) e deixada sob agitação magnética por mais 1 hora. A média dos valores de tamanho, PDI e Zeta para as partículas foi de 101,4 ± 2,3 nm, 0,160 ± 0,02 e 37,3 ± 2,3 mV, respectivamente. A eficiência média obtida no encapsulamento do 5-Fu foi de 91,9 ± 1,9% (Qu et al., 2015). A alta taxa de encapsulamento se deu devido à modificação química do 5-FU, em que foi adicionado um lipídeo ao fármaco para facilitar sua dispersão na fase lipídica do sistema.
Anteriormente ao trabalho descrito acima, em 2012 Varshozas et al. desenvolveram dois trabalhos utilizando carreadores lipídicos nanoestruturados para o encapsulamento de 5-FU. Um deles foi destinado ao tratamento do câncer de fígado, onde os CLN foram preparados pelo método de difusão da emulsificação em solvente orgânico. O autor descreve diferente formulações testadas, tendo como fase lipídica a composição de lecitina de soja com ácido oleico ou Labrafac. Em todas as formulações é utilizado monoesterato de glicerol como surfactante na fase lipídica. A fase lipídica, juntamente com o 5-FU, é dissolvida em uma mistura de acetona/etanol (1:1), em seguida é adicionada à fase aquosa que contém Tween 80 ou Solutol e deixada sob agitação a 500 rpm por 1h30min em temperatura ambiente. A formulação que apresentou o melhor valor da taxa de encapsulação de 5-FU, de 44,6 ± 1,0 %, teve como resultado a média dos valores de tamanho, PDI e Zeta para as partículas de 154,0 ± 4,7 nm, 0,4 ± 0,1 e -21,6 ± 1,4 mV, respectivamente (Varshosaz, Hassanzadeh, Sadeghi e Khadem, 2012). O outro trabalho apresentado pelo autor e seus colaboradores foi destinado ao tratamento de câncer colorretal, ainda utilizando o 5-FU como objetivo de amenizar os efeitos de citotoxicidade e direcioná-lo ao alvo mais eficientemente. Os CLN foram preparados pelo método de agitação magnética em temperatura ambiente. A porção lipídica é composta por colesterol (ou estearato de coleseterol), lecitina, PEG-40 conjugado com estearato (lipídio conjugado com PEG), ácido retinoico-octadecilamina
