TÍTULO: AVALIAÇÃO DA PLURIPOTENCIA DAS CÉLULAS PLURIPOTENTES-SIMILES ISOLADAS A PARTIR DE TECIDOS FETAIS
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): DAMIANA PEDRO DE OLIVEIRA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): CRISTIANE VALVERDE WENCELAU ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): INSTITUTO BUTANTAN, IRINA KERKIS COLABORADOR(ES):
RESUMO
As células tronco pluripotentes (CTP) podem ser isoladas in vitro a partir das fases iniciais do desenvolvimento embrionário (massa celular interna do blastocisto e epiblasto do embrião pré-implantado). Nesta fase do desenvolvimento várias moléculas sinalizadoras controlam a expressão de genes como oct/4 e nanog, que são responsáveis pelas características de pluripotência e auto-renovação celular das células tronco embrionárias (CTE) e células tronco do epiblasto. Resultados obtidos pelo nosso grupo demonstrou que a expressão destes marcadores de pluripotência se mantêm em fases posteriores do desenvolvimento embrionário, no encéfalo fetal de camundongos. No encéfalo fetal com idades de desenvolvimento 12, 15 e 18 dias, células imunopositivas para oct/4, nanog, sox2 e Fragilis foram identificadas. Com base nestes resultados, o projeto objetivou isolar células tronco embrionárias-símiles in vitro e avaliar a expressão das células isoladas para marcadores de pluripotência (oct/4 e nanog. Estes resultados parciais demonstram que é possível isolar colônias que apresentam similaridades com as CTE quanto a morfologia e expressão de marcadores de pluripotência, quando cultivadas sob as mesmas condições das CTE de camundongo de fetos com 12 dias de desenvovimento. INTRODUÇÃO
Células-tronco (CT) com diferentes graus de plasticidade residem em todos os tipos de tecidos do organismo. Estas células surgem a partir da fertilização do óvulo pelo espermatozoide, os quais derivam o zigoto. O zigoto inicia o processo divisão celular resultando na mórula, blastocisto e consequentemente todo o feto. O zigoto é considerado fonte de CT primordiais , e suas células são capazes de originar todo um organismo e os anexos embrionários, sendo classificadas como células tronco totipotentes . A mórula é composta por 16 blastômeros, consiste de uma massa embrionária esférica rodeada por uma zona pelúcida, que posteriormente se torna o blastocisto. O blastocisto é uma estrutura esférica rodeada por uma camada de células trofoblásticas que contém uma massa celular interna, que consequentemente origina o embrião. Ambas células isoladas a partir desta fase do embrião são classificadas como células tronco embrionárias e são pluripotentes (AVILON et al., 2003; NICHOLS et al., 1998). Durante o desenvolvimento embrionário inicial, o período entre a implantação e a gastrulação é marcado por
intensa proliferação e migração celular, resultando na determinação e posicionamento do endoderma, ectoderma e mesoderma para que ocorraa organogênese. A execução coordenada destes processos depende de uma cascata gênica complexa no embrião, cuja hierarquia ainda é pouco conhecida (GILBERT, 2010). Até o presente sabe-se que é controlado por várias moléculas sinalizadoras que as mantém pluripotentes e regula todo o mecanismo de comprometimento e diferenciação celular embrião-feto durante a ontogênese. As moléculas mais conhecidas são as citocinas, como por exemplo: “leucemia inhibitory fator” (LIF), “bone morphogenic protein” (BMP), “fibroblast growth fator” (FGF) e Wnt. Embora os fatores de transcrição reguladores, incluindo Sox2, Oct4, Nanog, e FoxD3 são expressos durante as fases iniciais de desenvolvimento do embrião , estudos têm demonstrado que muitos genes tornam-se ativos em diversos tecidos em fases posteriores do desenvolvimento (BOYER et al 2005). Um exemplo é a crista neural de camundongos que expressa níveis de Oct/4 e Nanog (LE DOUARIN et al., 2008). A expressão de fatores de transcrição e consequentemente a manutenção da pluripotência in vitro é mantida por diversas células como: células tronco embrionárias, células germinativas, células tronco pluripotentes induzidas e até mesmo por alguns tipos de células fetais de diversos tecidos (BELTRÃO BRAGA et al., 2011; WENCESLAU et al., 2011, TESAR et al., 2005; KUCIA et al., 2007; LAWSON et al., 1991). Porém, há muitas moléculas específicas que podem afetar a pluripotência e auto-renovação das células tronco pluripotentes. Neste sentido, a identificação, caracterização e classificação destas moléculas proporcionará ferramentas úteis para a identificação e isolamento de CTP. Além disso, a compreensão dos mecanismos que regulam a pluripotência das CTP continua a ser um grande desafio para os pesquisadores desta área. Mais conhecimento destes marcadores é criticamente necessário para os usos adequado das CTP e elucidação dos mecanismos que regem a pluripotência e auto-renovação destas células.
OBJETIVOS
Avaliar a expressão de marcadores de pluripotência nas CTPS isoladas in vitro a partir de encéfalos de fetos de camundongos em cultura com ou sem monocamada de fibroblastos murinos. Avaliar a imunoreatividade de oct3/4 e nanog através da técnica de imunocitofluorescência e a expressão através da técnica de PCR.
Comparar as imunopositividade e expressão do oct3/4 e nanog nas células isoladas entre as diferentes idades fetais.
METODOLOGIA
As células isoladas in vitro neste trabalho foram provenientes de fetos de camundongos em diferentes idades de desenvolvimento (10, 12 e 15 e 18 dias), (Figura 1). Os animais adultos utilizados na pesquisa pertenciam à linhagem balb C proveniente do biotério do Setor de Reprodução animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zoocténica do Estado de São Paulo- FMVZ-USP, com idades variando entre dois e seis meses de vida. Após, confirmado o coito, as fêmeas de camundongo foram divididas em três grupos, sendo eutanasiadas nas seguintes idades gestacionais: 10, 12 e 15 dias. A eutanásia ocorreu em câmara de CO2 de
acordo com as práticas laboratoriais da COBEA/CEUIAB (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal/ Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan), que autorizou os procedimentos de coleta dos tecidos encefálicos, os quais foram utilizados para o isolamento das células in vitro.
Figura 1: Embriões e fetos utilizados na pesquisa para a coleta e isolamento das células tronco do tecido neuronal. A – saco gestacional com embriões de 10 dias de gestação; B – feto com dias de gestação; C - feto com 15 dias de gestação.
Para demonstrar a presença de células imunopositivas para marcadores de pluripotência foram utilizados métodos de imunohistoquímica e citometria de fluorescência, eletroforese de amostras de RNA, RT-PCR relativa quantitativa e o cultivo das CTP em monocamada de matrigel.
Após a coleta dos encéfalos fetais os mesmos foram lavados três vezes em solução de PBS com 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina –LGC) para a retirada dos possíveis contaminantes. Em seguida do tecido foi fragmentado em uma placa de petri de 33mm de diâmetro com auxilio de uma lamina de bisturi. Os fragmentos então foram transferidos para placas de petri de 33mm de diâmetro com meio de cultivo composto por: DMEM-F12, 10% soro fetal bovino -HYCLONE, 2% de glutamina, 1% amninoácidos não essenciais, 200ul Beta-mercaptoetanol , 1% LIF (recombinant murine leukemia inhibitory factor) e 1% de estreptomicina/penicilina. Após 4 dias as colônias com morfologia de CTE foram transferidas para placas de cultivo de 33mm de diâmetro como monocamada de matrigel. A coleta deu-se mecanicamente com auxilio de pipetas de vidros e microscópio invertido de luz. As culturas celulares foram mantidas em estufa de CO2 com 5% de oxigênio e umidade.
DESENVOLVIMENTO
As CTP são naturalmente derivadas in vitro do embrião em sua fase precoce do desenvolvimento, como o estágio de mórula e blastocisto pré-implantado e até mesmo da crista gonadal de fetos. Outra fonte de obtenção de CTP é a partir dos métodos de de-diferenciação celular utilizando uma célula adulta. Os métodos de diferenciação incluem: transferência nuclear de célula somática, fusão celular e produção de células tronco pluripotentes induzidas através da ativação de genes de manutenção de pluripotência em células adultas. (EVANS and KAUFMAN 1981; ANDREWS et al 2005; BELTRAO BRAGA et al 2011). A auto-renovação, diferenciação e a pluripotência das de CTE é regulada por vários sinais durante o desenvolvimento embrionário. Estas moléculas sinalizadoras através ligações extracelulares específicas desencadeia uma sequência de eventos de fosforilação envolvendo diversas outras proteínas, resultando finalmente na ativação ou inibição de fatores de transcrição. Dentre os fatores de transcrição comumente expressos em células tronco pluripotentes destacam-se o Oct/4, nanog e Sox2, os quais desempenham papeis cruciais na manutenção da pluripotência auto-renovação, sendo expressos nas fases inicias do desenvolvimento embrionário (MARUYAMA et al., 2005).
Células tronco neuronais
Células tronco neuronais possuem as mesmas propriedades das células tronco isoladas dos tecidos convencionais como medula óssea e tecido adiposo. Os marcadores das células tronco neuronais são relativos e sua importância depende em particular, do ambiente celular e do estado. Foram primeiramente encontradas no sistema nervoso central de animais adultos e seres humanos, em regiões do cérebro reconhecidas por sua atividade neurogênica ao longo da vida a : zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e no giro dentado (DG) na formação do hipocampo. As atividades proliferativas das células tronco neurais nos nichos celulares foi relatado a muito tempo (ALTMAN, 1969). No entanto, a capacidade regenerativa desta região em derivar astrócitos e neurônios foi demonstrada posteriormente somente na década de 90 (LABOSKY et al., 1994; LUSKIN, 1993). As CT e os progenitores da ZSV são derivados durante o desenvolvimento embrionário, a partir das células neuroepiteliais que formam a parede do tubo neural.No cérebro adulto, as células tronco estão localizadas em nichos particulares, com elementos estruturais do microambiente o que permite que as células tronco mantenham a sua identidade, module sua proliferação e destino (WATT and HOGAN, 2000). Estas células liberam fatores mitogênicos e sinais de diferenciação neuronais como :o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), o fator de crescimento semelhante á insulina (IGF-1), o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) de plaquetas, o fator de crescimento de plaquetas (PDGF), interleucina-8 e fator neurotrófico derivado de cérebro (LEVENTHAL et al., 1999; GROTHE et al., 2001), o qual desempenham papel importante no destino das células neurais ( GRITTI et al., 1999). As CT neurais estão no topo da cadeia evolutiva da linhagem neuronal, e possuem um alto grau de multipotencialidade sendo comparadas com as CTH, devido sua capacidade de originar todas a diversidade celular do SNC. Além disso, as CT neuronais fetais possuem uma grande capacidade de enxertia no SNC após o transplante, contribuindo com a neurogênese em encéfalos de roedores adultos (TABAR et al., 2005).
RESULTADOS
Para o isolamento de células tronco embrionárias-símiles foram utilizados fragmentos de tecidos do sistema nervoso central do embrião com 10 dias de desenvolviemnto e de fetos com 12, 14, 15 e 18 dias de desenvolvimento foram utilizados dois métodos: “explante” e digestão enzimática. No método “explante” os tecidos foram fragmentados com auxílio de uma lâmina de bisturi e posteriormente transferidos para placas de cultivo com e sem monocamada de matrigel (este método foi realizado nas amostras de 10, 12 dias com matrigel e 15 e 18 dias sem monocamada de matrigel). Para realizar a digestão enzimática o tecidos após serem fragmentados com auxílio de lamina de bisturi foram submetidos a digestão enzimática com triple a 0,025% por 30 minutos a 37°C . Após este período a enzima foi inativada com meio de cultivo contendo SFB, seguido da centrifugação por 5 min a 1000rpm. As células derivadas da digestão enzimática foram transferidas para placas para o meio de cultivo 3 (este método foi utilizado para as amostras de 12 dias de desenvolvimento) (ver figura 1). Com base na análise de todas as metodologias que lançamos mão, podemos demonstrar que os tecidos fetais abrigam nichos de células tronco pluripotentes, multipotentes e progenitores no início do desenvolvimento embrionário/fetal (10-12 dias de desenvolvimento) com predominância de células imunopositivas para marcadores relacionados à pluripotência (oct/4, nanog, sox2 e Fragilis) (ver figura 2) e células tronco neuronais multipotente (nestina) (ver figura3). Nesta fase, as CTP e germinativa, mulitpotentes e progenitores foram encontradas em regiões adjacentes a zona subventricular, como por exemplo nas três vesículas cerebrais (mesencéfalo, rombencéfalo e prosencéfalo) em desenvolvimento. Com o avanço do desenvolvimento a presença de células pluripotentes e germinativas está preferencialmente localizada na zona subventricular, que é o nicho do encéfalo adulto.
Figura 1: Colônias isoladas a partir do encéfalo de feto com 12 dias de desenvolvimento em monocamada de matrigel com meio de cultivo 2.
Demonstramos as diferentes morfologias das colônias isoladas mecanicamente do encéfalo fetal: epitelial-símile (A), embrionária – símile, neuronal–símile
Figura 2: Imunocitofluorescência das colônias isoladas com
12 dias de desenvolvimento em meio de cultivo para o fator de transcrição Oct/4 (a) Sox2 (c) e nanog (b). Em C colônias de células fibroblastoídes com imunolocalização perinuclear (seta).
Figura 7: Imunocitofluorescência das colônias isoladas com 12 dias de desenvolvimento em
meio de cultivo para o fator de transcrição Oct/4 (a) Sox2 (c) e nanog (b). Em C colônias de células fibroblastoídes com imunolocalização perinuclear (seta).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base na análise de todas as metodologias que lançamos mão, podemos demonstrar que os tecidos fetais abrigam nichos de células tronco pluripotentes, multipotentes e progenitores no início do desenvolvimento embrionário/fetal (10-12 dias de desenvolvimento) com predominância de células imunopositivas para marcadores relacionados à pluripotência (oct/4, nanog, sox2 e Fragilis) e células tronco neuronais multipotente (nestina). Nesta fase, as CTP e germinativa, mulitpotentes e progenitores foram encontradas em regiões adjacentes a zona subventricular, como por exemplo nas três vesículas cerebrais (mesencéfalo, rombencéfalo e prosencéfalo) em desenvolvimento. Com o avanço do desenvolvimento a presença de células pluripotentes e germinativas está preferencialmente localizada na zona subventricular, que é o nicho do encéfalo adulto.
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