Aplicação de um sistema de multi-sensores para a detecção de gliadinas: discriminação semi-quantitativa entre alimentos com glúten e sem glúten

Aplicação de um sistema de multi-sensores para a

detecção de gliadinas: discriminação semi-quantitativa

entre alimentos com glúten e sem glúten

Sofia Gabriel Meirinho

Dissertação apresentada à Escola Superior Agrária de Bragança para obtenção do Grau de Mestre em Qualidade e Segurança Alimentar

Orientado por

Doutor António Manuel Coelho Lino Peres Doutora Ana Cristina Araújo Veloso

Bragança

Trabalho realizado no Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada da Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Bragança, no âmbito dos projectos de investigação POCI/QUI/58706/2004 e PPCDT/QUI/58076/2004, financiados pela FCT.

Sob a orientação de:

Doutor António Manuel Coelho Lino Peres Doutora Ana Cristina Araújo Veloso

_____________________________________________________________________________________ iv

R

ESUMO

A doença celíaca caracteriza-se pela intolerância ou hipersensibilidade à ingestão de prolaminas existentes no trigo, centeio, cevada e aveia. As proteínas do glúten do trigo contêm aproximadamente 50% de prolaminas, denominadas por gliadinas. O tratamento para a doença celíaca consiste em fazer uma dieta livre de glúten. Assim sendo, torna-se imperativo dispor de metodologias analíticas capazes de detectar e quantificar o teor de glúten em alimentos, especialmente em alimentos rotulados “sem glúten”.

Neste trabalho, estudou-se a aplicabilidade de um sistema de multi-sensores (e-tongue), com 36 membranas poliméricas de sensibilidade cruzada como técnica analítica alternativa para análise qualitativa e semi-quantitativa de produtos alimentares. O objectivo foi estabelecer uma distinção, entre alimentos “com” e “sem glúten”. A discriminação entre os alimentos analisados baseou-se na capacidade do sistema multi-sensor fornecer diferentes perfis potenciométricos consoante diferentes conteúdos de gliadinas presentes nos alimentos, após extracção com uma solução aquosa de etanol a 70%. Os perfis de sinais do sistema de multi-sensores em conjunto com métodos estatísticos multivariados de reconhecimento de padrões, nomeadamente a análise discriminante, foram utilizados para diferenciar alimentos “com” e “sem glúten”. Foram analisados quinze alimentos comercializados em Portugal e, adquiridos em supermercados: 8 alimentos cujo rótulo indicava a presença de glúten e 7 alimentos, com indicação no rótulo de ausência de glúten. O teor de gliadinas nos alimentos estudados foi confirmado por cromatografia líquida de alta resolução, após a sua extracção. O sistema de multi-sensores utilizado, apresentou um desempenho satisfatório na diferenciação de extractos com diferentes teores de gliadinas, permitindo discriminar alimentos “com” e “sem glúten” com sensibilidade e especificidades globais superiores a 95% nos dados originais e de 75% no processo de validação cruzada. Além disso permitiu classificar de forma semi-quantitativa um alimento em 3 grupos: alimento sem glúten (<10 ppm), alimento com teor de glúten (20-40 ppm) e alimento com teor de glúten (100-400 ppm). Nesta discriminação obteve-se sensibilidades e especificidades globais de 100% e superiores a 79% para os dados originais e procedimento de validação cruzada (predição), respectivamente.

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Os resultados satisfatórios obtidos mostraram que o sistema potenciomérico de multi-sensores desenvolvido com base em membranas lipo-poliméricas pode ser utilizado como uma ferramenta na detecção preliminar de glúten em alimentos.

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A

BSTRACT

Celiac disease is characterized by intolerance or hypersensitivity to ingested prolamins, which are composites of wheat, rye, barley and oats. Gluten proteins of wheat are constituted of approximately 50% of prolamins named gliadins. The treatment for celiac disease is gluten - free diet.

A multisensor potentiometric (e-tongue) with 36 cross-sensibility polymeric membranes was applied for qualitative foodstuffs analysis. The objective was to distinguish gluten-containing from gluten-free foods. The discrimination was based on the capability of the e-tongue device to detect different gliadins contents. The e-tongue signal profiles were used together with supervised multivariate statistical methods for pattern recognition. A set of 15 Portuguese foods (7 foods samples with gluten-free indicating and 8, indicating gluten-containing), purchased in commercial supermarkets were analyzed. The multisensor systems used, showed satisfactory performance in the differentiation of extracts with different levels of gliadins, allowing discriminating food "with gluten" and "gluten free" with an overall sensitivity and specificity higher than 95% in the original data and 75% for the cross-validation procedure. Moreover it allowed to semi-quantitatively classify food samples into 3 groups: gluten-free food (<10 ppm), gluten-containing foods (20-40 ppm) and gluten-containing food (100-400 ppm). This discrimination was achieved with an overall sensitivity and specificity of 100% and greater than 79% for the original data and cross-validation (prediction) procedure, respectively. The satisfactory results obtained showed that the multisensor potentiometric device developed based on lipo-polymeric membranes can be used as an effective tool in the preliminary detection of gluten in foods.

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A

GRADECIMENTOS

Ao Doutor António Peres, meu orientador, por todo o empenhamento, atenção dispensada, disponibilidade, apoio e compreensão a todos os níveis, e também pelos conhecimentos transmitidos.

Ao Doutor Luís Dias por todo o empenhamento, atenção dispensada, disponibilidade, apoio e compreensão a todos os níveis, e também pelos conhecimentos transmitidos.

Á Doutora Ana Cristina Veloso, minha orientadora, por todo o empenhamento, atenção dispensada, disponibilidade, apoio e compreensão a todos os níveis, e também pelos conhecimentos transmitidos.

Ao Eng. Jorge Sá Morais por estar sempre disponível para ajudar quando surgiam os problemas cromatográficos e por todos os conhecimentos transmitidos.

A todos os meus amigos, especialmente, Daniela, Ana Paula, Anabela, Soraia, Ivo e Hugo por toda a amizade e incentivo, por estarem sempre presentes e disponíveis para ouvirem as minhas reinvocações, nos bons e maus momentos.

A todo o pessoal do laboratório pelo apoio e carinho, em especial à Soraia e a Lilian, pela ajuda no HPLC e paciência.

À minha família, em especial a minha mãe, pelo incondicional apoio, compreensão e paciência que sempre me dedicaram.

A todas as pessoas que de uma forma ou de outra me ajudaram a tornar este momento possível.

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Í

NDICE

G

ERAL

ÍNDICE GERAL... VIII

ÍNDICE DE TABELAS ...X ÍNDICE DE FIGURAS ... XI ABREVIATURAS ... XII CAPÍTULO 1 ... 1 INTRODUÇÃO ... 1 1.1. IMPORTÂNCIA DO GLÚTEN... 2 1.2. PROTEÍNAS DO GLÚTEN ... 3 1.3. DOENÇA CELÍACA ... 6

1.4. LEGISLAÇÃO E LIMITES DE TOLERÂNCIA AO GLÚTEN ... 8

1.5. MÉTODOS DE DETECÇÃO E ANÁLISE DO GLÚTEN ... 9

1.6. SISTEMA DE MULTI-SENSORES ... 13

1.7. OBJECTIVOS ... 14

CAPÍTULO 2 ... 16

MATERIAIS E MÉTODOS ... 16

2.1.AMOSTRAGEM ... 17

2.2.MÉTODO DE ANÁLISE DE GLIADINAS EM ALIMENTOS POR HPLC ... 17

2.2.1. Equipamento ... 17

2.2.2. Reagentes e Padrões ... 18

2.2.3. Quantificação das soluções padrão de gliadina ... 18

2.2.4. Preparação de soluções e extractos ... 18

2.2.5. Condições cromatográficas para análise de gliadinas ... 20

2.2.6. Identificação dos picos referentes às gliadinas nos cromatogramas das amostras de alimentos ... 20

2.2.7. Parâmetros analíticos avaliados no método de HPLC ... 20

2.3.ANÁLISE DE GLIADINAS EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS POR SISTEMA MULTI-SENSORES ... 22

2.3.1. Equipamento ... 22

2.3.2. Reagentes e Solventes ... 22

2.3.3. Preparação de soluções e extractos ... 23

2.3.4. Análise com o sistema de multi-sensores ... 25

CAPÍTULO 3 ... 29

RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29

3.1.ANÁLISE DE GLIADINAS POR HPLC ... 30

3.1.1. Quantificação das soluções padrão por Kit “Coomassie Plus assay reagent”. ... 30

3.1.2. Linearidade e curva de calibração do sistema de HPLC ... 32

3.1.2.1. Limites detecção e quantificação ... 33

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3.1.3. Identificação dos picos de gliadinas nas amostras de alimentos estudadas ... 35

3.1.4. Quantificação de gliadinas nos alimentos por HPLC ... 40

3.2.ANÁLISE DOS ALIMENTOS COM O SISTEMA MULTI-SENSOR ... 41

CAPÍTULO 4 ... 49

CONCLUSÕES ... 49

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 52

ANEXOS ... 60

_____________________________________________________________________________________ x

Í

NDICE DE

T

ABELAS

Pág.

Tabela 1: Diferentes tipos de proteínas do glúten (adaptado de H.Wieser [5])... 4 Tabela 2. Aditivos e plastificantes usados na preparação das membranas poliméricas. 23 Tabela 3. Concentrações de gliadinas determinadas por HPLC nos extractos e a respectiva concentração de gliadinas por kg de alimento, nos diferentes alimentos analisados “com” e “sem glúten”. ... 41 Tabela 4. Matriz de contingência da análise discriminante de 3 grupos de concentrações de gliadinas extraídas dos 15 alimentos analisados pelo sistema de multi-sensores. ... 44 Tabela 5. Matriz de contingência da análise discriminante, para a validação cruzada, de 3 grupos com diferentes concentrações de gliadinas extraídas da Papa 4 (com e sem adição de padrão de gliadinas). ... 47

_____________________________________________________________________________________ xi

Í

NDICE DE

F

IGURAS

Pág.

Figura 1: Modelo estrutural sugerido para o glúten de trigo (retirado de P.R. Shewry

[10]). ... 6

Figura 2. Esquema da instalação experimental na análise recorrendo ao sistema de multi-sensores. ... 25

Figura 3. Sistema de multi-sensores e o eléctrodo de referência Ag/AgCl. ... 26

Figura 4. Recta de calibração do padrão albumina (BSA kit Pierce). ... 31

Figura 5. Perfis cromatográficos obtidos por HPLC (210 nm) das 6 soluções de padrão gliadinas utilizadas na elaboração da recta de calibração. ... 32

Figura 6. Recta de calibração das soluções padrão de gliadina medidas por HPLC. ... 33

Figura 7. Cromatograma típico das gliadinas ... 36

Figura 8. Espectro UV das gliadinas obtido por HPLC ... 36

Figura 9. Perfis cromatográficos das amostras alimentares “com glúten” obtidos por HPLC a 210 nm. ... 38

Figura 10. Perfis cromatográficos das amostras alimentares “sem glúten” obtidos por HPLC a 210 nm. ... 39

Figura 11. Representação gráfica das 2 primeiras funções discriminantes dos 45 extractos etanólicos... 44

Figura 12. Representação gráfica das 2 primeiras funções discriminantes das 35 misturas etanólicas. ... 47

_____________________________________________________________________________________ xii

A

BREVIATURAS

ADN – ácido desoxirribonucleico

AOAC – Associação de Químicos Analíticos Oficiais (abreviatura de “Association of Official Analytical Chemistry”)

CE – eletroforese capilar

CV% - coeficiente de correlação Da – Dalton

DC – Doença celíaca

ELISA – Ensaio por inmunoabsorção ligado a enzimas (abreviatura de “Enzyme linked immuno sorbent assay”

FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (abreviatura de “Food and Agriculture Organization)

GC – cromatografia gasosa (abreviatura de “Gas Chromatography”) HMW - subunidades de gluteninas de alto peso molecular

HPLC – cromatografia líquida de alta resolução (abreviatura de “High Performance Liquid Chromatography or High pressure liquid chromatography”)

kDa – kilodalton LD – limite de detecção LQ – limite de quantificação

LMW – subunidades de gluteninas de baixo peso molecular

MALD-TOF – desorção/ ionização lazer asistida por matriz acoplada detector de iões (abreviatura de “Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight”)

MS – espectrometria de massa (abreviatura de “Mass Spectrometry”) MWs – massas moleculares

OMS – Organização Mundial de Saúde

PAGE – eletroforese em gel poliacrilaida (abreviatura de “polyacrylamide gel electrophoresis”)

PCR - reacção em cadeia da polimerase (abreviatura de “Polymerase chain reaction”) RT-PCR – reacção em cadeia da polimerase em tempo real (abreviatura de “Real-time polymerase chain reaction”)

SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (abreviatura de “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”).

_____________________________________________________________________________________ 1

C

APÍTULO

1

I

NTRODUÇÃO

1.1.

I

1.2.

P

1.3.

D

1.4.

L

1.5.

M

1.6.

S

-

1.7.

O

_____________________________________________________________________________________ 2

O trigo é uma das mais importantes culturas de cereais a nível mundial, em termos de produção e utilização na alimentação humana. É uma importante fonte de energia, proteína e fibra. O trigo é consumido em muitas formas diferentes, principalmente no pão, massas, bolachas, bolos, pizzas, entre outros. A capacidade da farinha de trigo ser transformado em diferentes alimentos é amplamente determinada pelas proteínas do glúten. Os grãos de trigo contêm 8% a 20% de proteínas. As proteínas do glúten constituem 80% a 85% do total das proteínas da farinha, e conferem propriedades de elasticidade e extensibilidade que são essenciais para a funcionalidade da farinha de trigo [1].

1.1.

I

A importância do glúten na indústria alimentar deve-se essencialmente às propriedades das suas proteínas. Estas desempenham um papel fundamental na determinação da qualidade do trigo, especialmente no cozimento ao conferir capacidade de absorção da água, retenção de gás, coesividade, viscosidade e elasticidade à massa [2-5]. As proteínas presentes no glúten podem ser divididas em duas fracções principais de acordo com a sua solubilidade numa solução de etanol e água: gliadinas caso sejam solúveis e gluteninas caso sejam insolúveis. Ambas as fracções apresentam elevados conteúdos em glutamina e prolina [5].

Por exemplo, as propriedades reológicas das massas são condicionadas pelo teor em gliadinas e gluteninas. As gliadinas quando hidratadas têm pouca elasticidade e são menos coesas que as gluteninas; contribuem principalmente para a viscosidade e extensibilidade da massa. Em contraste, as gluteninas quando hidratadas são coesas e elásticas e são responsáveis pela força e elasticidade da massa [4-7].

A ausência de glúten resulta frequentemente numa massa líquida em lugar de uma massa pré-cozedura e pode resultar num pão cozido com uma textura esmigalhada, cor pobre e outros defeitos na qualidade da pós-cozedura. A remoção do glúten das farinhas pode conduzir a graves problemas para a indústria da panificação e, actualmente, muitos produtos sem glúten disponíveis no mercado são de baixa qualidade, exibindo características sensoriais em geral pouco apetecíveis para os consumidores [4].

As proteínas do glúten estão entre as proteínas mais complexas da natureza devido ao seu grande número de componentes e tamanhos diferentes, devido à variabilidade

_____________________________________________________________________________________ 3

causada pelo genótipo, condições culturais e processos tecnológicos. Elas influenciam as propriedades reológicas da massa e apresentam uma influência muito significativa na qualidade de panificação do trigo [5].

1.2.

P

Glúten de trigo é um termo geral para as proteínas da farinha de trigo pouco solúveis em água [8]. De um ponto de vista bioquímico, o glúten é uma mistura de quatro tipos de proteínas: albuminas, globulinas, gliadinas e gluteninas. As albuminas e globulinas são aproximadamente 15% das proteínas. Os restantes 85% correspondem às proteínas monomérica e polimérica, denominadas gliadina e glutenina, dos quais 40% são gliadinas. As gliadinas e gluteninas encontram-se em quantidades aproximadamente idênticas no glúten de trigo, e podem ser diferenciadas tendo-se em conta a solubilidade de cada fracção em etanol: as gliadinas são solúveis numa solução aquosa de etanol (por exemplo 60%) enquanto as gluteninas são insolúveis nesta mesma solução. Estas duas fracções são caracterizadas por elevadas quantidades de glutamina e prolina e por baixas quantidades de aminoácidos com grupos laterais carregados [5].

As gluteninas (solúveis em ácido) são polímeros podendo ser divididas em subunidades de gluteninas de alto (HMW) e baixo (LMW) peso molecular. As gliadinas (solúveis em álcool) são proteínas monoméricas apresentando as fracções α-, β-, γ- e ω-, cuja classificação depende da mobilidade [9].

A cisteína é um aminoácido das proteínas do glúten cuja quantidade apesar de reduzida (aproximadamente 2%), é extremamente importante para a estrutura e funcionalidade deste, pois é a responsável pelas ligações dissulfeto entre uma mesma cadeia de proteína (ligação intramolecular) ou entre as proteínas (ligação intermolecular) [5].

A maioria das gliadinas, estão presentes como monómeros e apresentam massas molares (MWs) compreendidas entre 28.000 a 50.000 g mol

-1

. Podem ser agrupadas em quatro diferentes tipos com base na sua mobilidade a pH baixo (α-, β-, γ-, ω-gliadinas, em ordem decrescente de mobilidade) [5]. Estudos posteriores em aminoácidos, no entanto, têm demonstrado que a mobilidade electroforética nem sempre reflecte as relações das proteínas e que a α-gliadina e β-gliadina ficam num grupo (α/β-tipo). Os

_____________________________________________________________________________________ 4

métodos analíticos, como a electroforese bidimensional ou cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa permitem a separação da fracção de gliadina em mais de cem componentes. Com base na análise completa ou parcial das sequências dos aminoácidos, composição em aminoácidos e MWs, estas fracções podem ser agrupadas em quatro tipos diferentes: ω5-, ω1,2-, α/β- e γ-gliadinas, como indicado na Tabela 1 [5].

Tabela 1: Diferentes tipos de proteínas do glúten (adaptado de H.Wieser [5]) Tipo MW x 10-3

(g/ mol)

Proporções a (%)

Composição parcial de aminoácidos (%)

Gln Pro Phe Tyr Gly

ω5-Gliadinas 49-55 3-6 56 20 9 1 1 ω1,2-Gliadinas 39-44 4-7 44 26 8 1 1 α/β-Gliadinas 28-35 28-33 37 16 4 3 2 γ-Gliadinas 31-35 23-31 35 17 5 1 3 x-HMW-GS 83-88 4-9 37 13 0 6 19 y-HMW-GS 67-74 3-4 36 11 0 5 18 LMW-GS 32-39 19-25 38 13 4 1 3

a _{De acordo com as proteínas totais de glúten.}

As ω-gliadinas apresentam maior quantidade de glutamina, prolina e fenilalanina, representando 80% da composição total. A maioria das ω-gliadinas não contém cisteína, portanto não existe a possibilidade de ligações dissulfeto. As α/β- e γ-gliadinas, principais constituintes da gliadina, tem proporções de glutamina e prolina muito menores que as ω-gliadinas, e diferem significativamente na quantidade de alguns poucos aminoácidos como a tirosina. Estes dois tipos de gliadinas apresentam os domínios N- e C-terminal diferentes. O domínio N-terminal consiste principalmente de sequências repetitivas ricas em glutamina, prolina, fenilalanina e tirosina e é único para cada tipo de gliadina. Quanto ao domínio C-terminal, as α/β- e γ-gliadinas são homólogas, apresentando sequências não repetitivas que contêm menos glutamina e prolina que o domínio N-terminal. Com algumas excepções, as α/β-gliadinas contêm seis e as γ-gliadinas oito cisteínas localizadas no domínio C-terminal e formam três e quatro ligações cruzadas intramoleculares, respectivamente [5].

A fracção das gluteninas compreende proteínas agregadas ligadas por ligações dissulfeto intermoleculares; têm tamanhos variáveis, desde 500.000 g mol

-1

até valores superiores a 10 milhões. Após a redução das ligações dissulfeto, as subunidades de

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glutenina resultantes apresentam uma solubilidade em solução alcoólica semelhante às gliadinas, e são divididas em subunidades de gluteninas de baixo peso molar (LMW) e de alto peso molar (HMW). O tipo predominante de proteína são as subunidades de glutenina LMW, que estão relacionadas com as α/β- e γ-gliadinas em massa molar e composição de aminoácidos. As gluteninas LMW contêm dois domínios diferentes: o domínio N-terminal, que consiste de unidades repetitivas ricas em glutamina e prolina, e o domínio C-terminal, que é homólogo ao das α/β- e γ-gliadinas. As gliadinas LMW contêm oito cisteínas; seis resíduos estão em posições homólogas às α/β- e γ-gliadinas, e portanto, propõe-se que estão ligadas por ligações dissulfeto intramoleculares [5].

As subunidades de glutenina HMW têm as maiores massas molares de todas as proteínas do glúten, com sequências ricas nos aminoácidos prolina, glutamina e glicina [10]. A glutenina HMW consiste de três domínios estruturais: um domínio não-repetitivo N-terminal (A), um domínio central não-repetitivo (B) e um domínio C-terminal (C). Os domínios A e C são caracterizados pela presença da maioria ou de todas as cisteínas [11]. Observa-se, portanto, que as ligações dissulfeto têm um papel importante na determinação da estrutura e propriedades das proteínas de glúten, visto que as α/β- e

γ-gliadinas apresentam três e quatro ligações dissulfeto intramoleculares,

respectivamente, enquanto as gluteninas LMW e HMW incluem tanto ligações dissulfeto intramoleculares quanto ligações intermoleculares [12].

Na Figura 1 apresenta-se esquematicamente a estrutura do glúten, onde as subunidades de glutenina HMW se ligam através de ligações dissulfeto intermoleculares formado um esqueleto, que forma a base para as ramificações da subunidade de glutenina LMW (também ligadas por ligações dissulfeto). As gliadinas também podem interagir com os polímeros de glutenina por interacções não-covalentes [10].

_____________________________________________________________________________________ 6

Figura 1: Modelo estrutural sugerido para o glúten de trigo (retirado de P.R. Shewry [10]).

As proteínas da farinha de trigo são elicitores das alergias alimentares se estiverem presentes na dieta de indivíduos com alergia, mesmo em baixas concentrações. Após sua ingestão podem causar reacções de hipersensibilidade aguda nos indivíduos com predisposição genética [13].

1.3.

D

A doença celíaca, também conhecida como enteropatia sensível ao glúten, é uma doença intestinal inflamatória crónica, auto-imune permanente, que se manifesta em indivíduos com predisposição genética através da ingestão de prolaminas [14]. É causada por uma intolerância permanente ao glúten, composto proteico presente em cereais como o trigo, o centeio, a cevada e a aveia [15]. A fracção tóxica do glúten e a gliadina, sendo esta a responsável pelas manifestações clínicas da doença. As gliadinas dividem-se nas fracções α-, β-, γ- e ω-, sendo todas tóxicas para pacientes com doença celíaca, embora a fracção mais tóxica pareça ser a α-gliadina [16].

A toxicidade está relacionada com a inactivação inadequada das células-T intestinais, que reconhecem os péptidos de gliadinas modificados pela enzima transglutaminase tesidular (tTG ou TG2) nos indivíduos que apresentam moléculas celulares HLA-DQ2/DQ8 activadas pelos péptidos da gliadina do trigo e prolaminas relacionadas da cevada e centeio [17].

_____________________________________________________________________________________ 7

Após a ingestão de glúten, os indivíduos que padecem de doença celíaca sofrem de uma inflamação crónica da mucosa duodenal que conduz a uma fraca absorção dos nutrientes essenciais, incluindo ferro, ácido fólico, cálcio e vitaminas liposolúveis [17-31]. De facto, as gliadinas impulsionam o sistema imunitário para a produção de auto-anticorpos. Para além de anticorpos anti-gliadina, são também gerados no organismo anticorpos contra a transglutaminase tecidular. Estes dois auto-anticorpos são responsáveis pelos danos causados no intestino delgado [18]. Além disso, os pacientes com doença celíaca tendem a sofrer de outras doenças crónicas nas quais o sistema imunitário ataca as suas próprias células e tecidos, incluindo diabetes de tipo 1, doença auto-imune da tiróide, doença auto-imune do fígado, artrite reumatóide, doença de Addison e síndrome de Sjögren, bem como cancro intestinal, osteoporose, infertilidade feminina, perturbações neurológicas e psiquiátricas, entre outras [20,22,30-32]. Segundo estudos de base populacional, chegou-se à conclusão que a prevalência da doença celíaca se encontra numa escala de 0,5 a 1,0 % na Europa e nos Estados Unidos [20,22,31,33-35].

O glúten é uma fracção proteica do cereal predominante que se pode encontrar, por exemplo, no trigo, espelta, cevada, centeio e os seus híbridos [18-20,36]. As proteínas: gliadina (trigo), secalina (centeio), hordeína (cevada) e possivelmente as aveninas (aveias) são descritas como activadoras [4,36-38]. Muitos autores consideram que a aveia não é tóxica para o doente celíaco e que ele poderá tolerar pequenas porções deste cereal, porque o conteúdo em prolamina é cinco vezes menor do que no trigo, centeio ou cevada. Contudo, esta matéria é ainda um pouco discutível, não sendo consensualmente aceite por parte dos investigadores responsáveis pelos diferentes ensaios clínicos em doentes celíacos [39,40].

Os distúrbios revertem, parcial ou totalmente, quando estabelecida uma dieta permanente e rigorosa isenta de glúten, sendo este o único tratamento disponível até ao momento, permitindo quer a recuperação da mucosa intestinal quer a prevenção de outras condições complicadas [4,18,19,21,34,41]. Os pacientes têm de efectuar uma dieta à base de alimentos naturalmente isentos de glúten, como o amido, arroz, painço e trigo mourisco ou em produtos cuja base seja o trigo ou o amido de cevada que são modificados de forma a serem isentos de glúten [28,30].

_____________________________________________________________________________________ 8

1.4.

L

A legislação europeia exige uma rotulagem obrigatória da indicação das substâncias potencialmente alergéneas no rótulo dos géneros alimentícios através da Directiva 2003/89/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho de 10 de Novembro, transposta para a ordem jurídica interna pelo Decreto-Lei n.º 126/2005 de 5 de Agosto e este por sua vez aditou o anexo III do Decreto-Lei nº. 560/99 de 18 de Dezembro, que estabelece as regras a que deve obedecer a rotulagem, apresentação e publicidade dos géneros alimentícios. O Decreto-Lei nº. 126/2005, relativo à indicação dos ingredientes presentes nos géneros alimentícios, estabelece a obrigatoriedade de fazer uma referência clara no rótulo ao nome de qualquer ingrediente que continue presente no produto acabado quando se trata de “cereais que contêm glúten, nomeadamente trigo, cevada, centeio, cevada, aveia, espelta, Kamut ou as suas estirpes híbridas. Ou seja produtos à base de cereais, têm de ser rotulados, a fim de proteger os consumidores contra as reacções adversas [23,36,42].

A norma do Codex para alimentos isentos de glúten foi aprovada em 1976 pela Comissão do Codex Alimentarius. Em 1981 e em 2000 procedeu-se à revisão do projecto de normas e os denominados alimentos sem glúten são descritos como: (a) constituídos por, ou elaborados apenas a partir de ingredientes que não contêm qualquer prolaminas de trigo ou de todas as espécies de Triticum, tais como espelta, kamut ou trigo duro, centeio, cevada, aveia ou as suas variedades híbridas com um nível glúten que não exceda os 20 ppm, ou (b), elaborado com ingredientes a partir de trigo, centeio, cevada, aveia, espelta ou suas variedades híbridas, que foram tornadas sem glúten; glúten com um nível não superior a 200 ppm, ou (c) qualquer mistura dos dois ingredientes, no (a) e (b) mencionados, com um nível não superior a 200 ppm [4,25,27,31,32,35,38,43].

A quantidade máxima permitida de gliadinas nos alimentos para estes serem considerados isentos de glúten de acordo com a Comissão do Codex Alimentarius é de 100 ppm (10 mg gliadinas/100 g de alimento) o que equivale a 200 ppm de glúten. Contudo alguns investigadores consideram este nível elevado para proteger a população susceptível. Segundo a Comissão do Codex, a ingestão de 10 mg gliadina/dia não deve ser ultrapassada por grupos susceptíveis [44].

_____________________________________________________________________________________ 9

O desenvolvimento da legislação sobre os níveis de glúten admissível em alimentos rotulados como “sem glúten” tem sido dificultado pela falta de um adequado método de análise. O que torna a legislação nesta matéria inespecífica e susceptível de controversa [45].

Recentemente, a Comissão do Codex Alimentarius (2008), aprovou novas normas para os alimentos sem glúten. Segundo esta norma, o glúten é definido como “ fracção proteica do trigo, cevada, centeio e aveia, suas variedades cruzadas e derivados, a que algumas pessoas são intolerantes e que é insolúvel em água e numa solução de 0,5 M de cloreto de sódio”. Um alimento “sem glúten” é definido como “um produto que contém menos de 20 mg de glúten /kg de alimento e 100 mg de glúten / kg de alimento no caso de alimentos especialmente produzidos para reduzir o teor de glúten para um nível compreendido entre 20 e 100 mg/kg” [36,42,45].

Segundo o Regulamento (CE) n.º 41/2009 da Comissão de 20 de Janeiro de 2009 relativo à composição e rotulagem dos géneros alimentícios destinados a pessoas com intolerância ao glúten, os alimentos com um teor glúten inferior a 20 mg/kg de alimento podem ostentar a menção “isento de glúten”; os alimentos com um teor de glúten compreendido entre 20 e 100 mg/kg no alimento ostentam a menção de “teor muito baixo de glúten”. As menções «teor muito baixo de glúten» ou «isento de glúten» devem figurar próximo da denominação de venda do alimento. Este regulamento é aplicável em todos os Estados-Membros a partir de 1 de Janeiro de 2012 [46].

1.5.

M

O glúten pode estar presente em muitos produtos, elaborados a partir de farinhas de trigo, centeio, cevada e aveia, como no pão, massas, bolachas, papás, cereais, mas também pode ser adicionado a um produto como ingrediente, aditivo ou devido a razões tecnológicas do processo de fabricação. Os métodos para a análise de glúten confrontam-se com diferentes problemas, tais como a natureza heterogénea dos alimentos, composição variável do glúten e dificuldade de quantificar produtos processados aquecidos ou quando o glúten estiver parcialmente hidrolisado [29].

Assegurar que um alimento é livre de glúten é de extrema importância para os doentes celíacos sendo imperativa a necessidade de novos métodos analíticos de glúten com sensibilidade, selectividade, fiabilidade, baixo custo, rápidos e validados [19]. A

_____________________________________________________________________________________ 10

disponibilidade de produtos alimentares isentos ou com baixo teor de glúten (abaixo de 4 mg de glúten/100 g de alimento, 40 ppm) é fulcral para a qualidade de vida dos pacientes que sofrem de doença celíaca. No entanto, os produtos alimentares comerciais declarados, frequentemente, como isentos de glúten podem ser frequentemente contaminados por glúten (numa escala de 20-200 ppm) [19,47].

As técnicas seguintes são frequentemente utilizadas para detectar, fraccionar e/ou quantificar proteínas de trigo: eletroforese em géis de poliacrilamida (A-PAGE e SDS-PAGE) [7,19,37,48-50], cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (RP-HPLC) e exclusão de tamanho (SE-(RP-HPLC) [6,7,13,26,32,34,37,38,44,48-56], eletroforese capilar (CE) [32,48,52], ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) [14,17,21,24,26,27,29,31,32,34,36-38,43,44,55,57], ensaios de imunofluorescência competitivos homogéneos para a determinação da gliadina utilizando gliadina marcada como térbio [32], espectroscopia de correlação de fluorescência [21], espectroscopia de massas MALDI-TOF [26,31,32,41,43,55,58], métodos baseados em ADN tais como, reacção em cadeia da polimerase (PCR e RT-PCR) [25,28,32,36,55], citometria de fluxo acoplada a um fluxo de anticorpos de rato contra a um péptido de 16-resíduos da gliadina [35].

Os tratamentos térmicos, aplicados na transformação de alimentos, não afectam a toxicidade da prolamina mas podem afectar a sua quantificação. Os efeitos do tratamento térmico dependem das condições aplicadas de tempo e temperatura do tratamento, bem como as características da matriz do produto alimentar e do método utilizado [19]. Não obstante, os métodos imunoquímicos são as ferramentas mais utilizadas [19,34]. Presentemente, a técnica de ELISA que utiliza o anticorpo monoclonal para ω-gliadina, que são estáveis ao calor [59], é considerada, o método oficialmente aceite pela Association of Official Analytical Chemistry (AOAC). O limite detecção é de 160 ppm de gliadina, possui baixa sensibilidade para a aveia e cevada e não detecta as prolaminas do arroz e milho [57,60]. Um novo método para a análise de glúten, ELISA tipo sanduíche que utiliza o anticorpo monoclonal R5 contra o pentaptídeo tóxico GGPFP e sequências homólogas repetitivas no glúten, foi desenvolvido. Este método denominado de R5-ELISA, é capaz de identificar gliadinas, hordeinas e secalinas com sensibilidades de 0,78, 0,39 e 0,39 ng/ml, respectivamente. Os limites detecção foram 1,5 ng gliadinas/ml (1,56 ppm gliadinas, 3,2 ppm de glúten).

_____________________________________________________________________________________ 11

Também foi capaz de detectar gliadinas e hordeinas, em produtos a base de trigo e cevada transformados e não transformados pelo calor [57,62,63].

No entanto, os “kits” actualmente disponíveis para a medição de glúten são: (i) ensaios ELISA tipo sanduíche; (ii) não detectam de modo equivalente o glúten nos diversos cereais; (iii) não são específicos para a gliadina tóxica da doença celíaca; (iv) não detectam as formas hidrolisadas da gliadina; (v) são destruídos pelos agentes redutores comummente utilizados para extrair o glúten dos alimentos (os quais desnaturam os anticorpos e as marcações enzimáticas) [27].

Recentemente relatou-se o uso da citometria de fluxo na detecção de níveis de gliadinas abaixo dos 10 pg/ml [35], bem como um ensaio de espectroscopia de fluorescência de correlação, relatando um limite de detecção de 0,006 ppm de glúten inferior a 3,2 ppm recentemente relatado para R5-ELISA [21].

Também se encontra documentado na literatura, a detecção de glúten pela PCR, em amostras de farinha de cereais e em produtos de panificação sem glúten, com limites de detecção de 0,1% (w/w), um valor aproximadamente equivalente ao limite de 10 mg por 100g de glúten proposto pelo Codex Alimentarius [25]. O método de PCR selectivo para a amplificando um fragmento de 135 pb do gene para detectar ADN de glutenina trigo numa infinidade de matérias-primas e alimentos processados termicamente O limite de detecção foi de 21,5 pg de ADN. A ausência de amplificação nos cereais como a aveia, centeio, cevada e milho torna este método exclusivo para a detecção de trigo [24]. Ensaios de PCR em tempo real, usando as sondas TaqMan®, foram aplicados para a detecção de glúten em diferentes cereais, obtendo sensibilidades de 2,5 mg/kg e 5 mg/kg de trigo, em matrizes à base de produtos vegetais e a base de carne, respectivamente [36].

O método de análise por HPLC permite quantificar os diferentes tipos de proteinas do glúten. Em diferentes farinhas de diferentes espécies de trigo a percentagem de gliadinas totais está compreendida entre 64,5-86,8%. As α-gliadinas são as que apresentam maiores proporções (28-45,3%), seguidas das γ-gliadinas (21-31,3%) e as ω-gliadinas encontram-se em menor quantidade (6,4-14,8%) [64].

Sendo também considerado um método preciso para a determinação quantitativa de gliadinas e gluteninas em farinhas de trigo em produtos processados termicamente, permitindo excelentes recuperações de gliadina. Portanto, pode ser usado como um eficiente método de controlo para os ensaios imunoquímicos [38]. Após a adaptação do

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método para amostras pobres em glúten, o limite de detecção pode ser cerca de 20 µ g de proteína glúten por grama de farinha de glúten, que é consideravelmente inferior ao valor máximo proposto pela norma do Codex para alimentos sem glúten. [38]

A análise de glúten é desafiadora porque o glúten é uma mistura de proteínas insolúveis em água, derivado dos grãos de trigo, cevada ou centeio, que em alimentos comerciais, está envolvido numa gama de diversas matrizes e é modificado pelo calor e processamento [29]. Neste sentido, é de extrema importância desenvolver métodos analíticos de fácil utilização, económicos, simples e sensíveis para detectar proteínas em produtos alimentares, nomeadamente as gliadinas, que são responsáveis pela doença celíaca.

Relativamente ao diagnóstico da DC podemos mencionar alguns trabalhos, tais como, o desenvolvimento de um “imunosensor impedimétrico” para a detecção de anticorpos anti-gliadinas [18], um biosensor de fibras ópticas para a detecção de anticorpos anti-gliadinas [65] e sobre a implementação de um imunosensor electroquímico para diagnosticar a doença celíaca, tendo por base a detecção de anticorpos de transglutaminase tecidular em soro humano [20]. No que diz respeito, ao desenvolvimento de sensores para análise de glúten em alimentos pode-se consultar na literatura dois trabalhos [41,66], que mostraram o desenvolvimento e aplicação de um microsensor óptico de proteína interferométrica, tendo por base uma superfície nanoestruturada de silicone poroso modificada quimicamente que ligam covalentemente proteína de ligação da glutamina (GlnBP) da Escherichia coli, para a detecção de vestígios de gliadina e outras prolaminas nos alimentos. A resposta do sensor para a concentração de proteína foi medida numa gama de 2,0-40 µg/L e a sensibilidade do método foi 45%.

O crescente interesse em relação à aplicação do sistema multi-sensor na área alimentar pode ser, em parte, atribuído aos baixos custos de calibração, à precisão satisfatória para tamanhos relativamente pequenos do conjunto de dados da calibração e a fácil adaptabilidade a diferentes condições de trabalho, quando comparado com outras metodologias analíticas [67].

Nassef et al. (2008) desenvolveram um imunosensor electroquímico para a detecção de gliadinas em alimentos. Foram estudadas duas superfícies químicas para a captura e estabilidade do anticorpo monoclonal anti-gliadina. Os limites de detecção obtidos para as superfícies químicas 1 e 2 foram de 5,5 e 11,6 ng/mL, respectivamente.

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Este imunosensor quando aplicado às análise de produtos alimentares sem glúten e com glúten apresenta correlações excelentes, em comparação com o teste de ELISA. O imunosensor desenvolvido é muito sensível, detecta baixos níveis de gliadinas (ppb), quantitativos fiáveis e a detecção do conteúdo de gliadina pode ser atingido dentro de 90 minutos, com um mínimo de exigência de manipulação do operador [45].

Na literatura, encontram-se descritos várias metodologias para extrair e fraccionar as proteínas do glúten. Na extracção da gliadinas usualmente utilizam-se soluções aquosas de etanol a 60-70% (v/v) [14,21,22,33,35,38,43,68,69], ou soluções a 40% etanol (v/v) [28,17,31,37] ou com 50% 1-propanol [49,52]. As gluteninas, proteínas insolúveis em soluções de etanol a 60-70%, sendo normalmente extraídas em solução aquosa de 50% (v/v) 1-propanol contendo Tris-HCl (0,05 mol/L, pH 7,5), ureia (2 mol/L) e (1%) DTT a 60ºC ou 2-mercaptoetanol [70].

O método de extracção de gliadinas, proposto por Bietz e colaboradores (1984), foi utilizado neste trabalho devido à sua simplicidade, reduzido custo, rapidez (sem tempos longos de incubação das amostras) e resultados aceitáveis na análise por RP-HPLC. Este método foi utilizado, para diferenciar gliadinas extraídas de grão de trigo ou de amostras de farinha, permitindo a identificação das variedades de trigo [68].

A maior parte dos produtos alimentares comerciais podem conter proteínas modificadas, como consequência de tratamentos térmicos, alterações no pH, química e hidrólise enzimática e de alta pressão durante os processos de fabricação. No caso dos alimentos que contêm glúten, a interacção das prolaminas entre si, ou com outros componentes da matriz alimentar, que ocorrem por interacções covalentes (pontes disulfeto) e não-covalentes estabelecidas durante a formação da massa, pode provocar uma redução substancial das proteínas e sua recuperação nas amostras, representando uma desvantagem adicional na análise de alimentos sem glúten. [34]

1.6.

S

-

Na indústria alimentar a caracterização de amostras complexas é realizada com a aplicação de diversas técnicas analíticas baseadas principalmente na separação eficiente de compostos, por exemplo, HPLC, espectroscopia, GC [76,78]. Contudo estas técnicas são demoradas, caras, requerem equipamento especializado e o pré-tratamento da amostra [78].

_____________________________________________________________________________________ 14

Os sensores químicos dos sistemas analíticos de multisensores podem ser aplicados nos mais modernos sistemas analíticos, em geral, não necessitam de pré-tratamento da amostra, permitindo não só a discriminação das propriedades das características das amostras de alimentos mas também e avaliar a qualidade global dos alimentos [76,78]. No entanto, requerem sofisticados métodos quimiométricos para analisar os dados ou perfis de sinais medidos pelo sistema de multi-sensores, tais como ferramentas de reconhecimento de padrões: análise de componentes principais (PCA) [73,77]; análise discriminante linear (ADL) [76]; redes neurais artificiais (ANN) [76,77], regressão parcial dos mínimos quadrados (PLS), modelação independente por analogia de classes (SIMCA) [75,78].

Nos sistemas de multi-sensores podem ser utilizados diferentes sensores com vários princípios de funcionamento, sendo os mais frequentes os potenciométricos [71,77], amperométricos [77] e voltamétricos [71]. Estes sistemas podem ser preparados com diferentes materiais, como por exemplo, eléctrodos de vidro de calcogênio [64,67,74], óxidos e membranas cristalinas [77], membranas à base de polímeros orgânicos plastificados contendo diferentes substâncias activas [77], membranas sensíveis a catião ou anião [64], fios de metais preciosos e raros como Au, Ir, Pd, Pt, Re, Rh [71] e filmes poliméricos [72,73].

O número de sensores utilizados num sistema de multi-sensores depende da função analítica e de quantos materiais diferentes estão disponíveis. O número de sensores pode variar de 4 a 40. Tipicamente, um sistema de multi-sensor contém número elevado de unidades de sensores, o que permite a sua aplicação a diferentes funções analíticas [77].

1.7.

O

O glúten é uma mistura de proteínas presentes em diversos cereais e derivados (trigo, centeio, cevada, aveia, entre outros) e podem ser classificadas em dois grupos, as prolaminas e as glutelinas. As prolaminas responsáveis pela intolerância dos pacientes celíacos são: as gliadinas do trigo, as secalinas do centeio, as hordeínas da cevada e as aveninas da aveia.

Assegurar que um alimento está livre de glúten é de vital importância para o doente celíaco, sendo imperativo o desenvolvimento de métodos analíticos robustos

_____________________________________________________________________________________ 15

para a sua detecção e quantificação. Neste trabalho utilizou-se um sistema de multi-sensores contendo membranas poliméricas de sensibilidade cruzada a constituintes, para analisar a presença ou ausência de gliadinas em produtos alimentares. Paralelamente foi implementado e validado um método de cromatografia líquida de alta resolução, que permitiu corroborar a presença ou não de gliadinas na composição dos alimentos analisados e estabelecer regras de classificação entre os alimentos com o novo sistema de multi-sensores.

Assim sendo, como objectivos específicos pretendeu-se:

− Optimizar um método de cromatografia líquida (HPLC) para a detecção/quantificação de gliadina em alimentos;

− Aplicar uma sistema de multi-sensores na discriminação de alimentos “com” e “sem glúten”, através da presença ou ausência de gliadinas;

− Estudar a sensibilidade do sistema de multi-sensores a diferentes concentrações de gliadinas adicionadas a um alimento.

_____________________________________________________________________________________ 16

C

APÍTULO

2

M

ATERIAIS E

M

ÉTODOS

2.1.

A

2.2.

M

HPLC

2.3.

M

_____________________________________________________________________________________ 17

Neste capítulo apresenta-se a descrição da amostragem efectuada, bem como, os reagentes, o equipamento, os procedimentos e as condições experimentais usadas nos métodos aplicados na análise das gliadinas.

2.1.

A

As amostras dos alimentos foram adquiridas em supermercados, tendo em conta a informação presente nos rótulos. Foram estudados 15 alimentos no total: 8 alimentos com glúten (farinha 1, farinha 2, papa 1, papa 2, pão 1, bolacha “Maria” 1, bolacha 1, cereal de pequeno-almoço 1) e 7 alimentos sem glúten (papa 3, papa 4, farinha 3, cereal de pequeno-almoço 2, bolacha “Maria” 2, bolacha 2, pão 2).

2.2.

M

HPLC

Descrevem-se, a seguir, o equipamento, reagentes e solventes, os padrões, o modo de preparação de soluções e extractos, bem como, as condições cromatográficas usadas.

2.2.1. Equipamento

As análises foram realizadas num sistema cromatográfico constituído por um cromatógrafo marca ProStar, equipado com uma bomba Varian Prostar 220 e um injector manual Rheodyne modelo 7725i provido de loop de 10 µL. A detecção foi feita com um detector Varian ProStar 330 Photodiode Array. Na aquisição e tratamento dos dados utilizou-se o Software Star Chromatography Workstation, versão 4,5.

A separação cromatográfica foi conseguida usando uma coluna cromatográfica PLRP-S, da marca Poymer Laboratiries, constituída por um polímero de poliestireno divinilbenzeno (tamanho de partículas 8 µm, de poro 300 Å, 150×4,6 mm d.i.). A coluna foi colocada no interior de um forno marca Jones Chromatography, modelo 7981. Na desgasificação dos eluentes e preparação das amostras utilizou-se um banho de ultra-sons, marca Elma e modelo Transsonic 460/H.

_____________________________________________________________________________________ 18

2.2.2. Reagentes e Padrões

O padrão de gliadina utilizado foi a “Gliadin from wheat” da Sigma-Aldrich. Na preparação dos eluentes utilizaram-se reagentes de qualidade analítica sem terem sido submetidos a qualquer purificação adicional. O acetonitrilo (Labscan), foi adquirido à Merck, com uma pureza superior a 99,8%. O ácido trifluoracético (TFA) de pureza mínima de 99%, foi adquirido à Acros Organics. A água desionizada foi obtida através de um sistema de desionização TGI Pure Water Systems. O solvente etanol absoluto utilizado foi adquirido à Panreac.

Todos os solventes foram filtrados usando membranas de nylon de porosidade 0,20 µm e diâmetro 47 mm da Millipore. Todas as amostras e padrões injectados foram previamente filtrados com filtro de nylon de porosidade 0,2 µm e diâmetro 25 mm, Puradisc 25 NYL da Whatman.

2.2.3. Quantificação das soluções padrão de gliadina

Na quantificação das soluções padrão utilizou-se um agitador de microplacas da marca StatFax-2100. A leitura das microplacas realizou-se num leitor de microplacas da BioTek Instrument, modelo ELx800 e o registo dos valores das absorvâncias medidas a um comprimento de onda de 595 nm, foi efectuado com o programa Gene5.

Utilizou-se o “Kit” da Pierce, Coomassie Plus – The Better BradfordTM Assay Kit para a quantificação das soluções padrão de albumina (soluções diluídas a partir da solução concentrada fornecida no kit) de acordo com as instruções do fornecedor (anexo A).

2.2.4. Preparação de soluções e extractos

A seguir, descreve-se o modo de preparação das soluções padrão de gliadina, da quantificação das soluções padrão de gliadina e dos eluentes para HPLC.

Preparação das soluções padrão de gliadina. As soluções padrão de gliadina foram preparadas com diferentes massas de padrão de gliadina (o sólido foi pulverizado antes

_____________________________________________________________________________________ 19

de ser usado) e extraídas com uma solução aquosa de etanol a 70% (v/v). As misturas foram homogeneizadas num vortex durante 15 minutos e centrifugadas durante 10 minutos a 5000 rpm.

Preparação das amostras dos alimentos. As amostras de farinha e papas foram extraídas directamente, as restantes foram trituradas num triturador até ficarem em pó. O procedimento de extracção das gliadinas dos alimentos encontra-se descrito no ponto 2.3.3 (capitulo 2, secção Material e Métodos). As amostras analisadas por HPLC foram as mesmas analisadas no sistema multi-sensores. Para a análise no HPLC, alíquotas de 1 mL foram filtradas com um filtro de nylon de porosidade 0,2 µm e diâmetro 25 mm (marca Whatman) e guardadas a 4ºC. As condições de análise encontram-se descritas no ponto 2.2.5 (capitulo 2, secção Material e Métodos).

Quantificação das soluções padrão de gliadina por “kit”. Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante contidas no Kit da Pierce, Coomassie Plus – The Better BradfordTM Assay Kit. O procedimento encontra-se no Anexo A. A leitura da absorvância a 595 nm foi realizada num leitor de microplacas BioTek Instruments, modelo ELx800.

Uma vez que o grau de pureza do padrão comercial de gliadina não ser indicado pela marca procedeu-se à extracção do mesmo e posterior quantificação das soluções de forma a confirmar a concentração final das mesmas.

Preparação de eluentes para cromatografia líquida. A separação das gliadinas foi efectuada após a injecção de 10 µl de amostra usando como eluentes 99% de água desionizada, 1% de acetronitrilo e 0,01% TFA (v/v) (solvente A) e 99% acetronitrilo, 1% água desionizada e 0,01% TFA (v/v) (solvente B).

Os eluentes foram filtrados com membrana de nylon 0,2 µm num sistema de filtração de eluentes. Todos os eluentes foram desgaseificados em banho de ultra-sons durante, pelo menos, 15 minutos.

_____________________________________________________________________________________ 20

2.2.5. Condições cromatográficas para análise de gliadinas

A melhor resolução cromatográfica das gliadinas, após terem sido experimentados diferentes gradientes, foi obtida utilizando o gradiente 20%-80% de solvente B durante 30 minutos. A eluição foi realizada a um fluxo constante de 0,6 ml/min, à temperatura de 40±0,1ºC e a detecção foi feita a 210 nm.

2.2.6. Identificação dos picos referentes às gliadinas nos cromatogramas das amostras de alimentos

Os picos referentes às gliadinas presentes nos espectros UV das amostras de alimentos analisadas foram identificados por comparação dos tempos de retenção registados para as soluções padrão de gliadinas e por análise do espectro UV associado a cada pico.

Os espectros UV foram registados na gama de comprimento de onda de 190-400 nm, tendo-se verificado que o espectro lido a 210 nm permitia uma maior sensibilidade.

2.2.7. Parâmetros analíticos avaliados no método de HPLC

Limite de detecção e quantificação. O limite de detecção (LD) pode ser definido como a menor concentração de uma substância que pode ser detectada, utilizando um dado procedimento experimental. A menor concentração de uma substância que pode ser quantificada, utilizando um procedimento experimental, denomina-se de limite de quantificação (LQ) [83,84].

Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados através de parâmetros da curva analítica. Os LD e LQ foram determinados usando as equações 1 e 2, respectivamente: LD =       × m s 3 , 3 (1)

_____________________________________________________________________________________ 21 LQ =       × m s 10 (2)

onde: s é o desvio padrão da resposta, que pode ser o desvio padrão do branco, da ordenada da origem da equação da recta ou da equação da recta da regressão linear; m é o declive ou coeficiente angular da curva analítica.

Precisão. A precisão avalia a dispersão de resultados de uma série de medições repetidas a uma mesma amostra, a amostras semelhantes ou a uma solução padrão, em condições definidas. É normalmente avaliada usando o valor do desvio padrão relativo (DPR%, também conhecido como coeficiente de variação, CV%), em circunstâncias específicas de medição, como a repetitividade, e a precisão intermédia.

Normalmente, métodos que determinam substâncias em macro quantidades requerem um CV% de 1 a 5%. Em métodos de análise de quantidades residuais, aceitam-se CV% até 20%, dependendo da complexidade da amostra (Ribani et al.,

2004). Os critérios experimentais usados na avaliação da precisão são a seguir referidos para: a) repetibilidade; b) precisão intermédia.

a) Repetibilidade avalia a dispersão dos resultados de medições sucessivas usando o mesmo método sob as mesmas condições de medição, ou seja, usando o mesmo procedimento, com o mesmo técnico e equipamento analítico e usando as mesmas condições experimentais do mesmo laboratório. As repetições devem ser realizadas num curto intervalo de tempo. Para o estudo da repetibilidade, o Instituto Nacional de Metrologia e Qualidade Industrial do Brasil (INMETRO) recomenda sete ou mais repetições para o cálculo da estimativa do desvio padrão, enquanto a “International Conference on Harmonisation” (ICH) e ANVISA sugerem que a repetibilidade seja verificada a partir de um mínimo de nove determinações para três níveis de concentrações (três repetições cada) ou a partir de um mínimo de seis determinações a uma concentração próxima do valor esperado [83,85].

b) Precisão intermédia é reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados num laboratório. Avalia o efeito das variações dentro do laboratório associadas a medições em diferentes dias ou com diferentes analistas ou com diferentes equipamentos ou com uma combinação destes factores. Para determinar a precisão intermédia de um método, efectuam-se “n” medições de uma solução amostra e padrões, de vários níveis de concentração, em vários dias (de acordo com o número de

_____________________________________________________________________________________ 22

ensaios descritos na medição da repetibilidade). A precisão intermédia é também avaliada através do valor do desvio padrão relativo ou coeficiente de variação (CV%) dos resultados das análises repetidas nas condições acima referidas [83,85].

2.3.

A

-

A seguir descrevem-se os equipamentos, reagentes e a preparação das soluções e extractos usados na análise de gliadinas em amostras de alimentos com o sistema de multi-sensores potenciométricos.

2.3.1. Equipamento

Todas as pesagens das amostras dos alimentos analisados bem como do padrão de gliadina foram efectuadas numa balança analítica da marca KERN, modelo ASS 220-4, com precisão de ±0,1 mg.

Nas extracções de gliadinas das amostras dos alimentos estudados e do padrão de gliadina utilizou-se um Vortex, modelo VM2 CAT 230V e uma placa magnética VELP Scientifica. Nas etapas de centrifugação utilizou-se uma centrífuga refrigerada Centurion K2R Series.

2.3.2. Reagentes e Solventes

Todos os reagentes e os solventes utilizados nos ensaios realizados foram de grau analítico e utilizados como fornecidos. O solvente etanol absoluto utilizado foi adquirido à Panreac.

Todas as soluções foram preparadas usando água desionizada, obtida a partir de um sistema de desionização TGI Pure Water Systems.

O padrão de gliadina utilizado foi a “Gliadin from wheat” da Sigma-Aldrich. As 36 membranas poliméricas, utilizadas na construção do sistema multi-sensor, foram preparadas com aproximadamente 31,9-32,3% de PVC, 64,7-65,2% de

_____________________________________________________________________________________ 23

compostos plastificantes e 2,8-3,2% de compostos aditivos. Na Tabela 2 indicam-se os compostos aditivos e plastificantes utilizados.

Tabela 2. Aditivos e plastificantes usados na preparação das membranas poliméricas. Composto aditivo Identificação do composto aditivo Composto plastificante Identificação do composto plastificante

Octadecilamina 1 Fatalato de Bis

(2-ethil-hexilo) A

Fosfato de Bis

(2-ethil-hexilo) 2

Adipato de Bis

(1-butil-pentilo) B

Álcool oleílico 3 Fosfato de Tris

(2-etil-hexilo) C Cloreto de metil-trioctil-amónio 4 Sebacato de dibutilo D Cloreto de tridodecil-metil-amónio 5 2-Nitrofenil-octil-éter E

Ácido oleico 6 Fosfato de

dioctil-fenilo F

2.3.3. Preparação de soluções e extractos

Neste trabalho utilizou-se uma solução aquosa de etanol a 70% (v/v) como solução de extracção das gliadinas presentes nos alimentos. A referida solução foi preparada, diluindo 70 mL de etanol absoluto até um volume final de 100 mL com água desionizada.

Neste trabalho experimental, fizeram-se duas experiencias que envolvem procedimento de extracção de gliadinas dos 15 alimentos adquiridos ou de 1 alimento sem glúten, ao qual foi adicionado concentrações diferentes de padrão de gliadinas.

Na experiência 1, pretendeu-se quantificar gliadinas nos produtos alimentares (com e sem glúten) em estudo e verificar se a informação contida no rótulo era a correcta utilizando o método HPLC-RP e discriminar os alimentos com e sem glúten através da presença ou ausência de gliadinas, utilizando o sistema de multi-sensores. Na

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experiência 2, pretendeu-se estudar a sensibilidade do sistema multi-sensor e se podia ser usado para diferenciar matrizes alimentares com diferentes concentrações de gliadinas adicionadas de modo semi-quantitativo.

Experiência 1: Neste ensaio utilizaram-se as 15 amostras de alimentos (com e sem glúten). Para tal, foram extraídas gliadinas de 12 g de cada alimento com 60 mL de solução aquosa de etanol a 70% (método de Bietz e colaboradores (1984), com algumas modificações) durante 30 minutos com agitação constante numa placa magnética à temperatura ambiente. A mistura resultante foi decantada e posteriormente centrifugada a 5000 rpm à temperatura ambiente durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido e posteriormente analisado.

Nesta experiência todas as amostras de alimento foram extraídas em triplicado e analisadas no sistema de sensores e por HPLC. Para a análise no sistema multi-sensores utilizaram-se 35 mL do sobrenadante obtido para cada amostra.

Experiência 2: Neste ensaio utilizou-se apenas um alimento sem glúten (confirmado por análise por HPLC), tendo-se escolhido a papa de arroz para crianças. O ensaio consistiu na preparação de várias misturas desta papa com padrão de gliadina. Misturou-se amostra com padrão de gliadinas (m/m) de modo a obter amostras do alimento sem glúten contaminadas com teores pré-estabelecidos de gliadinas: 10 ppm (2 mg de gliadinas em 200 g de papa 4), 20 ppm (4 mg de gliadinas em 200 g de papa 4), 50 ppm (5 mg de gliadinas em 100 g de papa 4), 100 ppm (10 mg de gliadinas em 100 g de papa 4) e 200 ppm (20 mg de gliadinas em 100 g de papa 4). Como controlo negativo utilizou-se uma amostra da papa 4 sem glúten à qual não foi adicionada qualquer quantidade de gliadina.

Adicionaram-se 4 g de cada mistura a 40 mL solução aquosa de etanol a 70% (v/v) e misturou-se num vortex durante 15 minutos. Prepararam-se 10 amostras de papa sem adição de gliadinas e das restantes misturas, 5 amostras de cada uma, respectivamente, obtendo-se no total 35 amostras. As amostras foram guardadas a 4ºC durante a noite e analisadas no dia seguinte no sistema multi-sensores. Antes de cada análise a amostra foi agitada num vortex durante alguns segundos.

_____________________________________________________________________________________

2.3.4. Análise com o sistema de multi

As medições foram efectuadas com um sistema de multi de referência de Ag/AgCl de dupla

um sistema de aquisição de dados, da marca Agilent, sinais registados por cada sensor

BenchLink Data Logger” controlado por um computador.

analisados e visualizados recorrendo ao software “Excel”. As experiências foram efectuadas a 25ºC, numa célula

cm3. O aquecimento do interior da célula de vidro, onde cada amostra a analisar era colocada, foi efectuado por circulação de água quente na camisa exterior, proveniente de um banho termostatiza

cabeça de aquecimento (Selecta Tectron Bio) com circu

A cabeça de aquecimento permite uma estabilidade de ±0,01ºC, permitindo manter a temperatura da água de aquecimento d

Figura 2 pode observar-se o equipamento experimental

Figura 2. Esquema da instalação experimental na análise recorrendo ao multi-sensores.

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.4. Análise com o sistema de multi-sensores

As medições foram efectuadas com um sistema de multi-sensores e um eléctrodo de referência de Ag/AgCl de dupla junção (solução externa de KCl3 mol/L) acoplados a

sistema de aquisição de dados, da marca Agilent, modelo 34970A. A aquisição registados por cada sensor foi efectuada recorrendo ao software “Agilent

r” controlado por um computador. Os dados obtidos foram analisados e visualizados recorrendo ao software “Excel”. As experiências foram célula de vidro de parede dupla com uma capacidade de 50 O aquecimento do interior da célula de vidro, onde cada amostra a analisar era colocada, foi efectuado por circulação de água quente na camisa exterior, proveniente de um banho termostatizado. O banho termostatizado encontra-se munido de uma cabeça de aquecimento (Selecta Tectron Bio) com circulação interna e externa de água. A cabeça de aquecimento permite uma estabilidade de ±0,01ºC, permitindo manter a temperatura da água de aquecimento da célula de vidro com um rigor de ±0,1ºC.

se o equipamento experimental utilizado.

Esquema da instalação experimental na análise recorrendo ao

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sensores e um eléctrodo mol/L) acoplados a modelo 34970A. A aquisição dos software “Agilent Os dados obtidos foram analisados e visualizados recorrendo ao software “Excel”. As experiências foram dupla com uma capacidade de 50 O aquecimento do interior da célula de vidro, onde cada amostra a analisar era colocada, foi efectuado por circulação de água quente na camisa exterior, proveniente se munido de uma lação interna e externa de água. A cabeça de aquecimento permite uma estabilidade de ±0,01ºC, permitindo manter a a célula de vidro com um rigor de ±0,1ºC. Na