CITOTOXICIDADE DA ZIRCÔNIA ESTABILIZADA COM ÍTRIA OBTIDA VIA GÉIS DE AMIDO DE MILHO.
E. M. B. Santos, J.K.M.F. Daguano, S. Ribeiro
Polo Urbo Industrial, Gleba AI6, CP 116, 12600-970, Lorena, SP E – mail: esoly@ppgem.faenquil.br
Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP) Departamento de Materiais (DEMAR)
RESUMO
Cerâmicas a base de zircônia têm sido obtidas por vários métodos dentre eles a técnica sol-gel. Tais cerâmicas além de outras aplicações tem sido empregadas em odontologia e isso se deve as suas características como, boa resistência à corrosão e ao desgaste e resistência à fratura e biocompatibilidade. Além disso, suas propriedades ópticas permitem reproduzir as características estéticas dos dentes naturais. Com a utilização de novos materiais em aplicações biomédicas torna-se necessário a realização de testes para avaliar a biocompatibilidade. Um dos testes preliminares para a determinação da biocompatibiidade é o teste de citotoxicidade “in vitro”. Este trabalho tem o objetivo de determinar a citotoxicidade de cerâmicas de zircônia estabilizada com ítria obtidas pelo método sol-gel utilizando amido de milho como agente de gelificação.
Palavras- chaves: Zircônia, sol-gel, biocompatibilidade, citotoxicidade.
INTRODUÇÃO
Dentre os materiais cerâmicos de alto desempenho, os que apresentam o maior potencial de aplicação são aqueles à base de zircônia. Isso decorre em função da combinação das propriedades térmicas, mecânicas, químicas, elétricas e ópticas e do bom conhecimento das transformações de fases e do desenvolvimento da microestrutura desses materiais (1) (2).
Para produção da cerâmica de zircônia de elevada resistência à flexão, alta tenacidade à fratura, bem como resistência ao desgaste, esses materiais devem apresentar granulometria fina e uniforme, integralmente na estrutura tetragonal. (3)
Um dos processo utilizados na fabricação de cerâmicas ZrO2-Y2O3 com estas características é a técnica sol-gel, um processo químico que oferece uma versatilidade de acesso a materiais avançados. O uso de alcóxidos como precursores no processo sol-gel permite o projeto molecular das cerâmicas precursoras resultando em uma significativa melhora nas propriedades e estruturas da cerâmica final.(4)
Nos últimos anos, as cerâmicas oxidas á base de zircônia (ZrO2) vem sendo estudadas com o objetivo de aplicações em próteses ortopédicas, devido a suas características mecânicas, além de sua biocompatibilidade e estética.(5)
O ensaio de citotoxicidade “in vitro” é o primeiro teste para avaliar a biocompatibilidade e depois de comprovada a sua não toxicidade é que o estudo da biocompatibilidade do produto pode ter continuidade realizando-se os ensaios necessários em animais de laboratório. (6)
Para ser aprovado no teste de citotoxicidade “in vitro”, um material não deve causar a morte das células nem afetar suas funções celulares. Assim sendo, com o uso de técnicas de cultura de células, os testes podem detectar se ocorre a lise (quebra) das células, a inibição do crescimento celular e outros efeitos que possam ser causados nas células pelo material e/ou extrato oriundo do material. (7)
Existem dois tipos de testes in vitro: métodos de contato direto em que as células são colocadas em contato com o material em teste, sendo normalmente semeadas na forma de uma suspensão celular sobre o material. Já o método de contato indireto pode ser dividido em dois tipos: aqueles em que o material a ser testado é separado das células por uma barreira de difusão (ágar ou agarose) e o segundo tipo no qual substâncias são extraídas do material a ser testado, através de um solvente e colocada em contato com as células. (7)
Normalmente utilizam-se nestes testes células de linhagens estabelecidas, devido à facilidade de obtenção e manutenção em laboratório. Existem diferentes protocolos padrões já estabelecidos para os testes de citotoxicidade, dentre os quais podem ser citados: ASTM F-813-83, ASTM F-895-84, ISO 10993-5. (7)
Todos os protocolos padrões prevêem a utilização e especificam materiais a serem utilizados como controles positivo e negativo. Controle positivo é uma
substância que apresenta efeito citotóxico de maneira reprodutível e controle negativo é o material ou substância que não produza efeito citotóxico. (7)
A determinação da citotoxicidade pode ser através de avaliação qualitativa realizada pelo exame microscópico das células para verificação de mudanças na morfologia geral, vacuolização, destacamento, lise celular ou de membrana e o resultado é relatado como atóxica, leve, moderada ou severa citotoxicidade. Ou através da avaliação quantitativa que mede a morte celular, proliferação celular ou formação de colônias celulares. O número de células, quantidades de proteínas, liberação de enzimas, liberação ou redução de corante vital ou outro parâmetro de medida pode ser quantificado por meios objetivos. (6)
Este trabalho tem como objetivo verificar a não toxicidade de cerâmicas ZrO2 -Y2O3 obtidas pelo método sol-gel utilizando amido de milho como agente de gelificação.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a obtenção do pó de zircônia estabilizada com ítria soluções contendo os íons de Zr4+ e íons Y3+ foram misturadas sendo obedecida a relação de 97% em mol de ZrO2 e 3% em mol de Y2O3 e foi utilizado o processo sol gel com amido de milho como agente de gelificação. Foi utilizada a técnica de Brunnauer, Emmet e Teller (BET) para medida da superfície específica. As fases cristalinas dos pós sintetizados e das amostras sinterizadas foram analisadas por difração de raios X, A compactação do pó foi realizado por prensagem uniaxial a 30 MPa seguida de prensagem isostática a 300 MPa em seguida foi sinterizado a 1550°C por 60 min.
Análise Biológica
Foi realizado o teste de citotoxicidade indireto, foram utilizados extratos do material que foram colocados em contato com uma cultura de células de mamíferos, em microplacas para cultura celular e utilizado o método de incorporação de um corante para distinguir as células vivas e mortas pela medida da intensidade de cor final. A avaliação da citotoxicidade do material foi realizada por incorporação do corante Vermelho Neutro. A leitura de densidade óptica do material realizado no leitor Elisa, foi comparada com a média celular, considerada 100% de viabilidade celular no ensaio. Foram utilizados controles negativos e positivos para verificar a eficácia do ensaio. O controle negativo deve ser um material que não cause dano
nas células em cultura, já o controle positivo deve ser um material que cause dano. Com controle positivo foi utilizado foi uma solução fenol enquanto para controle positivo que foi utilizado alumina.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Rendimento do processo e massa específica do pó obtido
Os resultados da massa específica e rendimento do processo foram 5,180 g/cm3 e 89,4% respactivamente. O valor de massa específica obtido é próximo ao valor econtrado na literatura 5,64 g/cm3. O rendimento foi de 89,4% ou seja, apenas 10.6 % de material e perdido durante o processamento, esta perda ocorreu durante o processo de secagem devido a dificuldade de retirar totalmente o xerogel do “pirex” após a secagem. O rendimento do processo pode ser otimizado melhorando o manuseio do produto nesta etapa.
Morfologia da Zircônia obtida
A imagem do pó de zircônia estabilizada com ítriaobtida por microscopia eletrônica de varredura está demonstrada na Figura. 1.
Formação de pescoço
Figura1. Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura, modo elétrons secundários com ampliação de 20.000 vezes.
De acordo com a Figura 1 as partículas apresentam desde morfologia esférica até irregular. Os tamanhos variam desde finas partículas da ordem de 0,5 μm até
partículas maiores da ordem de 3 μm. A presença de partículas com esta faixa de tamanhos pode ser motivada por uma possível pré-sinterização durante a calcinação final. As reações de sinterização via fase sólida são termicamente ativada, além disso, o tamanho das partículas e a área de contato entre elas também influenciam o processo. Como é possível observar a presença do crescimento de um pescoço que caracteriza o início da sinterização via fase sólida.
O tamanho médio de partícula obtido foi 2,5 μm.
20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 120 T M T T M T M T Y T M T T T M M Y M Y T T In te nsida de (%) 2 θ (°) ZrO2 Tetragonal (T) ZrO2 Monoclínica(M) Y2O3(Y)
Figura 2. Difratograma de raiosx do pó obtido via sol-gel
De acordo com o difratograma de raios X obtido, apresentado na Figura 2 é possível observar as fases presentes no material. As reflexões indicados pela letra T representam a fase da ZrO2 tetragonal, M, ZrO2 monoclínica e Y, Y2O3. Como o esperado ocorre a predominância da fase tetragonal que é uma das condições para que ocorra a tenacificação e a presença da fase monoclínica residual.
Análise Biológica
Através da placa utilizada nesse ensaio, pôde-se verificar que onde ocorreu a maior morte celular, controle positivo, a coloração se torna transparente, pois não há a captura do corante; caso contrário, micropoços onde há células vivas, a coloração é rosada.
Projetando-se a média da porcentagem de sobrevida das células em função da concentração de extrato (%), obtem-se uma curva que fornece o índice de citotoxicidade. Existe um índice limite, que significa uma sobrevida de 50 %(IC50%) Acima deste limite o material é considerado não tóxico e abaixo deste índice o material apresenta toxicidade.
A amostra Figura 3 se encontra acima do IC50% e apresentou o comportamento semelhante ao controle negativo, ou seja, não apresenta toxicidade. Desta forma pode-se afirmar que cerâmicas de zircônia estabilizada com ítria obtidas pelo método sol-gel utilizando amido de milho como agente de geleficação não causam prejuízo ou morte á população celular desta forma pode-se caracterizar esta material como promissor para aplicação em próteses
0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 controle negativo controle positivo ZrO2-3Y2O3 IC50% % Viabilidade Celular Concentração de extrato (%)
Figura 3. Resultados dos testes de citotoxicidade das amostra de Zr2O3- Y2O3
sinterizadas a 1550°C por 60 min. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos até o momento indicam a viabilidade da produção de
ZrO2-Y2O3. Obtendo se um pó com tamanho de partículas de aproximadamente 2,5
Cerâmicas de zircônia estabilizada com ítria obtidas pelo método sol-gel utilizando amido de milho não causam prejuízo ou morte da população celular sendo considerado um material promissor para a aplicação em próteses.
AGRADECIMENTOS
À Fapesp pelo apoio financeiro através do processo 05/57385-5.e ao IPEN pelos testes de citotoxicidade especialmente a Sizue O. Rogero
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. SANTOS, C., TEIXEIRA, L. H. P., SUDO, D. M. B., STRECKER, K., ELIAS C. N., Anais do 49° Congresso de Cerâmica, São Pedro, SP. , de 2005. p 1-3.
2. CHUNG, T.J.. Journal American Ceramic Society.80,10(1997) 2607-2612. 3. LI, W., GAO, L., GUO, J. K., NanoStrutured Materials.10(1998)1043-1049.
4. EGGER, P., SORARÚ, G. D., DIRÉ, Journal of the European Ceramic Society. 24( 2004)1371-1374.
5. XU, T., VLEUGELS, J., VAN DER BIEST, O., KAN, Y., WANG, P., Journal of the European Ceramic Society. 26(2006)1205-1211.
6. ROGERO, S. O., LUGÃO, A. B., IKEDA, T. I., CRUZ, A. S., Materials Research. 6(2003)317-320.
7. MALMONGE, S. M., ZAVAGLIA, C. A. C., SANTOS Jr, A. R., WADA, M. L. F. Revista brasileira de engenharia biomédica. 15(1999)49-54.
CYTOTOXIC OF YTTRIA STABILIZED ZIRCONIA OBTAINED VIA GELS OF CORN STARCH
ABSTRACT
Zirconia based ceramics have been obtained for several methods such as sol gel process. These ceramics beyond other applications have been used in dentistry due their good corrosion resistance, high wear resistance, fracture toughness and excellent biocompability. Moreover, its optic properties allow reproducing esthetic characteristics of natural teeth. Due to use of new materials in biomedics applications
is necessary to test the biocompatibility. The preliminary biological test of biocompatibility is the test of cytotoxicity “in vitro” This work intends to determine the cytotoxic potential of ceramics yttria stabilized zirconia obtained by sol gel process using corn starch as gelatinization agent.
