Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761
Análise do perfil microbiológico de agentes causadores de mastite bovina e sua
relação com a qualidade do leite em uma fazenda do Sul de Minas Gerais
Analysis of the microbiological profile of causative agents of bovine mastitis and
their relationship with milk quality in a south farm of Minas Gerais
DOI:10.34117/bjdv6n11-522
Recebimento dos originais:08/10/2020 Aceitação para publicação:24/11/2020
Vanessa Souza Damasceno
Bacharel em Biomedicina
Instituição: Centro Universitário do Sul de Minas (UNIS/MG) Endereço: Av. Alzira Gazzola, 650 - Aeroporto, Varginha - MG
E-mail: vanessadamascenos@hotmail.com
Fábio Mambelli Silva
Pesquisador Pós-Doutoral
Instituição: Instituto de Ciências Biológicas da UFMG – ICB - UFMG Endereço: Av. Pres. Antônio Carlos, 6627 - Pampulha, Belo Horizonte - MG
E-mail: fabio_mambelli@yahoo.com.br
Hadassa Cristhina de Azevedo Soares dos Santos
Doutorado em ciências - Universidade de São Paulo Instituição: Centro Universitário do Sul de Minas (UNIS/MG) Endereço: Av. Alzira Gazzola, 650 - Aeroporto, Varginha - MG
E-mail: hadassa.cass@gmail.com
RESUMO
A mastite é caracterizada pela inflamação de glândulas mamárias causada principalmente por bactérias e tendo como principal isolado o coco Gram positivo Staphylococcus aureus. Neste trabalho, a prevalência de mastite foi avaliada quanto à interferência na qualidade e na composição do leite em uma pequena fazenda no município de Campos Gerais – MG. Amostras de leite de 27 animais em lactação (saudáveis e positivos para mastite em suas formas clínica e subclínica) foram analisadas quanto à composição (teores de gordura, de proteína, de lactose e de sólidos totais), contagem de células somáticas e caracterização microbiológica com posterior avaliação de perfil de sensibilidade a diversos antibióticos. Observamos diferença significativa entre os grupos quanto ao teor de lactose, mas o número de animais analisados não apresentou correlação estatística entre patologia e composição. Nos animais positivos para mastite foram isolados Staphylococcus aureus (37,5%),
Escherichia coli (25,0%), Streptococcus sp. (12,5%) e leveduras (25,0%); sendo os microrganismos
sensíveis à maioria dos antimicrobianos testados. Também foi avaliada a capacidade de formação de biofilme por isolados de S. aureus em que observamos a formação de biofilme em 66,66% dos isolados. Estes dados chamam a atenção para a necessidade de uma correta identificação do agente causador da mastite para um tratamento direcionado da mesma, visando estratégias de controle mais eficientes e, consequentemente, auxiliando na melhora da qualidade do leite, propiciando assim com que os consumidores possam adquirir produtos lácteos com maior qualidade e segurança.
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761
ABSTRACT
The mastitis is characterized by the mammary glands inflammation caused mainly by bacteria. Its main isolated pathogen is the Gram-positive coccus Staphylococcus aureus. In this study, the prevalence of mastitis was assessed for interference on milk quality and composition in a small farm in the city of Campos Gerais - MG. Milk samples from 27 lactating animals (healthy and positive for mastitis in clinical and subclinical forms) were analyzed for composition, somatic cell counts and microbiological characterization with subsequent assessment of the sensitivity profile of several antibiotics. We observed significant difference between the groups regarding to lactose content, but the number of animals analyzed did not present statistical correlation between pathology and composition. The isolated from mastitis animals’ samples Staphylococcus aureus (37.5%),
Escherichia coli (25.0%), Streptococcus sp. (12.5%) and yeasts (25.0%) were sensitive to the majority
of antimicrobials tested. We also assessed biofilm formation from S. aureus isolates. We observed biofilm formation in 66.66% of the isolates. These data highlight the need for the correct identification of the mastitis infectious agent for its targeted treatment, aiming the application of more efficient control strategies and, consequently, helping to improve milk quality, thus enabling consumers to acquire dairy products with higher quality and safety.
Keywords: Dairy cattle, Lactose, Staphylococcus aureus, Biofilm.
1 INTRODUÇÃO
A mastite é um problema que afeta as fazendas de gado leiteiro independentemente do perfil de produção (ASSIS et al., 2017, p. 285). É caracterizada pela inflamação de glândulas mamárias causadas por bactérias, fungos, parasitos e lesões traumáticas, sendo as bactérias as principais causadoras desta condição (BHAT et al., 2017). Pode se apresentar de forma clínica, com a presença de sinais visíveis seguidos de alterações evidentes no aspecto do leite (MARTINS et al., 2010); e também na forma subclínica, em que suas alterações são microscópicas, químicas e teciduais, levando ao aumento das células somáticas, sendo este o principal indicador para seu diagnóstico (SHARMA et al., 2011). Os fatores de riscos mais associados à mastite incluem o histórico da ocorrência, a carência de sanitização, os problemas relacionados com ordenha e os tratamentos não seletivos (BHAT et al., 2017).
No entanto, ainda é um problema que afeta economicamente as indústrias e as fazendas leiteiras por diminuir a produção do leite, além de gerar descarte de leite contaminado, descarte e morte precoce de vacas e também elevados gastos com tratamentos. Tudo isto contribui para o declive na qualidade do leite e para a redução do rendimento na fabricação de seus derivados (ASHRAF et al., 2017; DEMEU, 2015, p. 170).
Um dos principais patógenos isolados na mastite é o coco Gram positivo Staphylococcus
aureus. Este espalha-se com facilidade entre os bovinos pelo contato (vaca-vaca) ou por meio dos
equipamentos de ordenha e das mãos do produtor no momento da ordenha (MARTINS et al., 2010; ZIMERMANN; ARAÚJO, 2017, p. 2). Algumas cepas também possuem a capacidade de formação
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 de biofilme, o que pode favorecer a resistência à antibioticoterapia na mastite, dificultando seu tratamento, proporcionando resistência e cronificação desta condição (ASHRAF et al., 2017).
Neste trabalho investigamos a prevalência da mastite e sua interferência na qualidade do leite
in naturaem uma pequena fazenda no município de Campos Gerais – MG.O perfil de prevalência de
casos clínicos e subclínicos de mastite nos animais em estudo foi avaliado e análises estatísticas de correlação foram realizadas comparando variáveis referentes à qualidade e à composição do leite. Isolados de amostras positivas para mastite foram caracterizadas por testes bioquímicos, microbiológicos, e testados para a capacidade de formação de biofilme. Os agentes causadores foram relacionados à prevalência de casos clínicos e subclínicos. Estudos como este auxiliam a implementação de medida importantes no combate consciente da mastite na bovinocultura leiteira e também nas melhorias de conforto e saúde animal e qualidade do leite.
2 MATERIAL E METÓDOS Amostragem
Vinte e sete vacas de uma fazenda em estudo foram selecionadas para análises. Os critérios de amostragem empregados selecionaram vacas em lactação com perfil de produção de em média 22 litros ao dia.Os animais foram acompanhados por um mês e animais que evoluíram para processos patológicos distintos, que foram selecionados para abate ou pararam de lactar (vacas secas) não foram considerados para o trabalho. Amostras de leite foram coletadas em volume de 30 mL pelo produtor responsável segundo critérios de higienização adequados, evitando maus tratos e contaminação das amostras. As amostras foram devidamente acondicionadas e processadas no Laboratório de Microbiologia do Centro Universitário do Sul de Minas (UNIS-MG). Como rotina, amostras de leite da fazenda são periodicamente avaliadas quanto à composição e à qualidade por uma empresa terceirizada. Os resultados destas análises referentes ao mês em estudo (Abril de 2018) nos foram cedidos para análisesde composição avaliadas neste trabalho.
Triagem e diagnósticode mastite
No momento da ordenha,jatos de leite de cada animal foram coletados individualmente e submetidos aos testes de diagnóstico para mastite. Jatos de leite foram analisadas em canecas de fundo escuro (teste aqui denominado Teste da caneca de fundo escuro) e em uma raquete com quatro cavidades, seguindo em simetria os quartos mamários do animal (CaliforniaMastitis Test– CMT), como previamente descrito (OLIVEIRA et al., 2011). Brevemente: a presença ou ausência de mudanças no aspecto do leite foi avaliada e categorizada quanto à visualização de grumos e quanto às alterações do aspecto do leite no teste da caneca de fundo escuro. Para o teste de CMT, foram adicionados às alíquotas 2 mL de reagente de CMT (Tadabras, SP) com agitação da raquete durante um minuto para lise das células somáticas e análise de presença ou ausência de viscosidade.Em caráter
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 de triagem, amostras positivasem ambos os testes foram submetidas a posteriores caracterizações microbiológicas e bioquímicas.
As amostras de leite dos animais em estudo são rotineiramente submetidos a controle de qualidade terceirizado (Laboratório Clínica do Leite – ESALQ/USP–Piracicaba – SP). Dados referente às amostras analisadas no mês de Abril de 2018 foram disponibilizados pelo proprietário da fazenda em estudo e analisados quanto aos valores de CCS. Foram considerados animais sadios aqueles que apresentaram CCS abaixo de 190.000 cel/mL de leite, não apresentavam sinais clínicos e apresentaram teste CMT negativo. Animais que apresentaram valores de CCS acima de 190.000 cel/mL de leite foram considerados com mastite, sendo categorizados com mastite clínica quando apresentaram CMT positivo e presença de sinais clínicos e com mastite subclínica quando apresentaram CMT positivo e ausência de sinais clínicos.
Análise da composição do leite
A composição do leite foi analisada por empresa terceirizada (Laboratório Clínica do Leite - ESALQ/USP-Piracicaba - SP). As análises da qualidade do leite neste estudo envolverambteores de gordura, de proteína, de lactose e de sólidos totais. Estes valores foram categorizados e correlacionadosou não estatisticamente quantoà saúde do animal e presença/ausência de diagnóstico de mastite.
Análises estatísticas
Todas as análises foram feitas utilizando os softwares Microsoft Office Excel 2013 (Redmond, WA) ou GraphPadPrism 6 (La Jolla, CA). As distribuições foram testadas para normalidade utilizando teste de Kolmogorov-Smirnov.
Para os valores de composição do leite foram feitos testes de correlação de Pearson para os dados com distribuição normal e de Spearmanpara os dados com distribuição não normal. As médias dos grupos foram comparadas por teste t de Student para duas médias independentes não supondo igualdade de variância com correção de Welch’s para amostras de distribuição normal e teste t não paramétrico para amostras de distribuição não normal. Os valores de p foram considerados significativos quando menores que 0.05.
Análises bioquímicas e microbiológicas
Amostras positivas na triagem para mastite foram estriadas em placas de Petri contendo Ágar Sangue ou Ágar MacConkey e em seguida incubadas a 37ºC por 24 h. As unidades formadoras de colônias (UFC) foram quantificadas e identificadas por meio de aspectos macromorfológicos e coloração de Gram. Os isolados foram identificados por meio de testes bioquímicos de catalase, coagulase e TSI (Triple Sugar Iron) conforme Manual de Microbiologia Clínica para o controle de
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 infecção relacionada à assistência à saúde (2014). Isolados de Staphylococcus aureus provenientes dos casos de mastite foram submetidos ao antibiograma seguindo a metodologia e análise dos resultados preconizados pela ClinicalandLaboratory Standards Institute(CLSI) (2017) seguindo a técnica de difusão em disco sendo utilizados os seguintes antibióticos (Laborclin, CECON, CEFOR, Sensifar):amoxicilina,ácidoclavulânico, amplicilina, sulbactam, bacitracina, cefepima, cefotaxime, estreptomicina, gentamicina, nitrofurantoína, norfloxacina,oxalacina, penicilina, sulfazotrim e vancomicina.Os halos formados foram aferidos quanto a seus diâmetros para análise do perfil de sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos testados.
Análise da formação de biofilme por isolados de Staphylococcus aureus
Colônias de S. aureus isoladas de amostras de leite de casos positivos para mastite foram inoculadas em 10 mL de caldo TSB (TrypticaseSoyBroth) suplementado (1% glicose, 3% NaCl) e incubados a 37 ºC por 48 h com posterior lavagem com solução salina e secagem à temperatura ambiente. A formação de biofilme foi avaliada por meio da coloração com cristal violeta 0,1% por 15 min, posteriormente sendo lavados com água bidestilada.
3 RESULTADO E DISCUSSÃO
Prevalência de mastite e sua relação com a composição do leite
As amostras de leite referentes aos animais deste estudo foram avaliadas pelos testes da caneca e CMT, conforme descrito em material e métodos, como uma triagem para positivos e negativos para mastite. Estas amostras foram relacionadas a dados de avaliação clínica do estado de saúde dos animais e também de contagem de células somáticas (CCS),ambos dados importantes na investigação da saúde do úbere dos bovinos. A combinação destes dados nos levou a categorizar os animais em três grupos para análises, conforme critérios estabelecidos em material e métodos. A distribuição da amostra é retratada na Tabela 1.
Tabela 1 - Distribuição de amostras de acordo com o escore CCS em animais sadios e com mastite subclínica e clínica.
Intervalos de CCS (cel/mL de leite)
Sadios Mastite subclínica Mastite clínica
0 a 190.000 09 (33,34%) 00 (00,00%) 00 (00,00%) 190.001 a 400.000 00 (00,00%) 03 (11,12%) 01 (03,70%) 400.001 a 700.000 00 (00,00%) 02 (07,41%) 02 (07,41%) 700.001 a 1.000.000 00 (00,00%) 01 (03,70%) 00 (00,00%) 1.000.001 a 3.000.000 00 (00,00%) 00 (00,00%) 04 (14,81%) >3.000.001 00 (00,00%) 01 (03,70%) 04 (14,81%)
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 Com base nos resultados obtidos por meio dos Testes da Caneca de Fundo Escura, CMT e CCS, neste estudo foi observada prevalência de 66,67% de animais apresentando mastite, valores condizentes com a literatura recente, um valor que estes variam entre 38,7% e 87,5% (BANDEIRA et al., 2013; SILVA et al., 2017; CUNHA et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2020). Também foram identificados sete animais (25,93%) apresentando mastite subclínica sem presença de sinais clínicos e 11 (40,74%) apresentando mastite clínica com presença de sinais clínicos como alterações no aspecto do leite, febre e edema de úbere.
Fatores ambientais e práticas inadequadas no manejo dos animais podem favorecer o desenvolvimento de novos casos de mastite, consequentemente trazendo consigo um aumento da CCS destes animais (BHAT et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2011). Como consequência, o aumento de CCS pode proporcionar interferências nas atividades sintéticas do tecido mamário, podendo ocasionar em uma diminuição nos teores de lactose, proteína, gordura, cálcio e fósforo; e aumento nos teores de sódio e cloro no leite produzido (SHARMA et al., 2011). Em outras palavras, o aumento da CCS impacta os produtores com prejuízos econômicos correspondentes ao declive da produção e de maiores gastos com o tratamento do rebanho; enquanto impacta as indústrias com a diminuição da qualidade do leite e menor rendimento para fabricação de derivados (ASHRAF et al., 2017; DEMEU, 2015, p. 170).
Deste modo, para verificar a qualidade do leite, sua composição foi avaliada no que tange aos níveis de gordura, proteína, lactose e sólidos totais em amostras de leite dos animais utilizados para este estudo com o intuito de verificar possíveis alterações na composição do leite em relação ao aumento de CCS (Tabela 2).
Os animais aqui estudados foram divididos em grupos conforme critérios de inclusão já mencionados e a distribuição dos dados foi testada para normalidade e correlação com a CCS. Não foi observada correlação estatística entre os valores de CCS com os componentes analisados no leite. Também não foi observada diferença estatística significativa desses componentes quando comparados os grupos de animais com mastite (clínica ou subclínica) com o grupo de animais sadios (valor de p
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 >0,05 - (data notshown), com exceção para lactose (Figura 1), em que a diferença entre animais sadios e com mastite clínica apresentou valor de p = 0,0309 e a diferença entre animais sadios e com mastite subclínica apresentou valor de p = 0,0026.
Figura 1 - Teor de lactose nos animais sadios, com mastite clínica e mastite subclínica.
Os valores de lactose foram menores que o desejável nos grupos com mastite em relação ao grupo de animais sadios, apresentando diferença significativa (p < 0,05), o que pode ser causado pela influência da mastite. Apesar de não ter sido observada correlação estatística, a redução da lactose pode estar relacionada a outros elementos indiretos à fisiopatologia da mastite no animal, uma vez que outros trabalhos já mostraram uma relação de aumento de CCS com redução de teores de lactose sem correlação estatística (MONTAHINI et al., 2013; VARGAS et al., 2014).
Como um todo, a qualidade e composição do leite in natura podem ser influenciadas pela presença de mastite, pelas condições sanitárias, pelo manejo, pela nutrição, pela genética do rebanho, pelo resfriamento e pelo armazenamento do leite. O desenvolvimento de estratégias como a implementação de boas práticas de sanitização e nutrição têm sido efetivas, melhorando a qualidade e a composição do leite, e proporcionando benefícios ao produtor, às indústrias lácteas e ao consumidor (FIGUEIREDO et al., 2012, p. 35-41).
Caracterização microbiológica da mastite
As amostras de leite dos animais que apresentaram mastites clínica e subclínica (n= 18) foram submetidas às análises microbiológicas em que foi observado o crescimento de diferentes grupos de
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 microrganismos em oito (44,44%) amostras. Após provas bioquímicas, os isolados foram identificados como Staphylococcus aureus (37,5%), Escherichia coli (25,0%), Streptococcus sp. (12,5%) e leveduras (25,0%) (Tabela 3).
Dentre os microrganismos encontrados, o mais prevalente foi o S. aureus, um dos principais agentes causadores de mastite bovina (MARTINS et al., 2010; ZIMERMANN; ARAÚJO, 2017, p. 3). Este dado reflete valores alarmantes apresentados na literatura recente em pequenas fazendas no estado de Minas Gerais (26,04%-45,20%) (COSTA et al., 2013; CHAGAS et al., 2012, p. 1009; CUNHA et al., 2015). A alta prevalência de S. aureus nas amostras de leite apontam para a importância do acompanhamento e tratamento consciente dos animais, uma vez que suas enterotoxinastermorresistentes persistem ativas nas amostras de leite mesmo após pasteurização, o que pode levar a intoxicação alimentar e outros problemas sérios a saúde humana (FAGUNDES; OLIVEIRA, 2004, p. 1318).
A alta prevalência de mastite nas fazendas leiteiras é uma das principais responsáveis pelo uso indiscriminado de antimicrobianos neste cenário. A grande preocupação deste uso abusivo está vinculada ao aumento dos efeitos de resistência e de multirresistência bacteriana. Possíveis resíduos de antimicrobianos no leite podem retardar ou inibir o crescimento de bactérias fermentadoras, sendo prejudicial à fabricação de queijos e outros derivados e até mesmo, proporcionar reações alérgicas em indivíduos hipersensíveis (NOBREGA et al., 2018). O acompanhamento criterioso da relação antibiótico-microrganismo é de suma importância, visando não apenas o controle genético da resistência antimicrobiana como as consequências advindas da presença desses elementos no produto final que é destinado ao consumo humano.
Portanto, para análise do perfil de resistência a antimicrobianos, os isolados de S.
aureusprovenientes das amostras deste estudo foram avaliados para diversos antibióticos conforme
descrito em material e métodos e todos os isolados foram sensíveis aos antibióticos testados (data
notshown).
Durante a infecção por algumas cepas de S. aureus, este coco Gram positivo pode invadir neutrófilos e células epiteliais mamárias formando microabscessos que posteriormente podem promover a formação de biofilme, as tornando mais resistentes a diversos tratamentos, especialmente
Tabela 3 - Prevalência de isolados de microrganismos em amostras provenientes de animais com mastite
Microrganismos Mastite Clínica Mastite Subclínica
Staphylococcus aureus 02 (25,0%) 01 (12,5%)
Escherichia coli 01 (12,5%) 01 (12,5%)
Streptococcus sp. 00(00,0%) 01 (12,5%)
Leveduras 02 (25,0%) 00(00,0%)
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 aos antimicrobianos e prejudicando o tratamento (TIWARI et al., 2017). Para avaliação da capacidade de formação de biofilme, os isolados de S. aureus neste trabalho foram submetidos à ensaios in vitro. Foi possível observar a capacidade sugestiva de formação de biofilme por dois (66,66%) dos isolados testados (Figura 2).
Os isolados que formaram biofilme no presente estudo foram provenientes de vacas com mastite clínica recorrente (segundo dados de mastite analisados rotineiramente na fazenda).Apesar de terem apresentado sensibilidade a todos os antimicrobianos testados, a formação de biofilme como um fator de virulência permanece uma questão a ser investigada com maior atenção, uma vez que pode contribuir para o agravamento do tratamento.
Figura 2 - Representação de formação de biofilme na parede do tubo pelos isolados de S. aureus.
Os microrganismos formadores de biofilme nos casos de mastite são cada vez mais vistos como objeto de estudos na literatura recente (GOMES et al., 2016, p. 2).Uma vez que estes microrganismos permanecem dentro da glândula mamária, ele proporciona lesões ao epitélio mamário levando à diminuição da síntese dos componentes do leite, além de também produzir toxinas nocivas ao animal que poderão agravar o processo inflamatório. O quadro como um todo, com a incorreta identificação dos microrganismos causadores da mastite, pode culminar em uma antibioticoterapia não efetiva em que doses cada vez mais elevadas de antimicrobianos sejam utilizados, aumentando as chances de resíduos destes no leite. A soma de todos esses fatores contribui para o declive na qualidade do leite e coloca em risco o bem-estar do consumidor final.
4 CONCLUSÃO
A mastite permanece com alta prevalência no Brasil, apesar dos grandes avanços em equipamentos de ordenhas, em práticas de manejoe no aumento do conforto animal. A forma clínica é de fácil identificação e seu volume de leite na maioria das vezes é descartado, porém, devido à
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 dificuldade no diagnóstico da forma subclínica, o risco da não identificação da infecção e conseguinte comercialização do leite permanece. Apenas o método de avaliação das amostras de leite do tanquepode não mostrar a real situação da qualidade e da composição do leite, sendo necessárias análises mais detalhadas de amostras individuais.
S. aureus é o patógeno de maior prevalência nos casos de mastite e apresenta facilidade em se
espalhar entre os animais instaurando formas clínicas e subclínicas de mastite. A cronificação dos casos pode ocorrer principalmente por sua capacidade de formar biofilme e por isso, a preocupação com o uso consciente de antibióticos permanece de suma importância, visto que resíduos de antibióticos no leite podem proporcionar riscos à saúde humana pelo seu consumo. Portanto, a correta identificação do agente é crucial par ao correto direcionamento do tratamento e do controle da mastite, auxiliando a melhora da qualidade do leite para os consumidores.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Fundação de Ensino e Pesquisa do Sul de Minas (FEPESMIG) pelo apoio financeiro e agradecemos também ao produtor pela disponibilidade dos dados da fazenda em estudo.
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 11, p.91409-91421 nov. 2020. ISSN 2525-8761 ASHRAF, Shoaib. et al.Clumping factor A of Staphylococcus aureus interacts with AnnexinA2 on mammary epithelial cells. Scientific Reports, v.7, p.1-9, 2017. https://dx.doi.org/10.1038%2Fsrep40608.
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