FABIANA MARIA COIMBRA DE CARVALHO
ESTUDO DO EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO
DE SEMENTES DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) EM
ALTERAÇÕES METABÓLICAS E MOLECULARES INDUZIDA
POR DIETA EM RATOS WISTAR.
NATAL
2019
ESTUDO DO EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO
DE SEMENTES DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) EM
ALTERAÇÕES METABÓLICAS E MOLECULARES INDUZIDA
POR DIETA EM RATOS WISTAR.
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica.
Orientadora: Prof. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais
Co-orientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos
NATAL
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson – Centro de Biociências - CB
Carvalho, Fabiana Maria Coimbra de. Estudo do efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.) em alterações metabólicas e moleculares induzida por dieta em ratos Wistar / Fabiana Maria Coimbra de Carvalho. - Natal, 2020.
90 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Orientadora: Profa. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais. Coorientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos.
1. Tamarindus indica L. - Tese. 2. Perfil lipídico - Tese. 3. Glicemia - Tese. 4. PPAR-gama - Tese. 5. TNF-alfa - Tese. I. Morais, Ana Heloneida de Araújo. II. Santos, Elizeu Antunes dos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 634.46
Dedico esta obra
À Deus, aos meus pais Fred e Sandra, ao meu esposo Daniel, pelo apoio incondicional e constante incentivo e a minha orientadora, Professora Drª. Ana Heloneida, pela confiança,
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela sabedoria e discernimento que Ele me concedeu ao longo do curso de Nutrição para que eu fizesse a escolha certa por ter optado pela área da pesquisa para atuar, a qual eu me identifiquei muito, me dando força para que eu pudesse continuar trilhando e lutando cada vez mais ao longo dessa jornada. Posso afirmar que Ele foi, é, e sempre será o meu refúgio e fortaleza, socorro presente nas minhas angústias, se não fosse a Sua mão e o Seu poder seobre a minha vida, eu não teria conseguido chegar até aqui. Hoje com o título de mestre em Nutrição, já exercendo a docência e agora preparada para receber o
título de doutora em Bioquímica.
Agradeço também aos meus pais, Sandra e Fred, por estarem sempre ao meu lado, me apoiando, me incentivando pra que eu sempre lutasse pelos meus sonhos e objetivos.
Obrigada por serem exemplos em minha vida, exemplos de superação, honestidade, determinação, perseverança, responsabilidade, dedicação, coragem e fé. Obrigada por todo
amor e carinho. Podem ter certeza que tudo isso foi fundamental para que eu chegasse até aqui. Muito obrigada por todo investimento, por tudo o que vocês fizeram buscando sempre o
melhor para mim. Sou eternamente grata a vocês! Amo muito vocês! Agradeço ao meu esposo, Daniel, que sempre esteve ao meu lado, me apoiando e incentivando para seguir o caminho que eu sonho. Muito obrigada, meu amor, por toda paciência, compreensão, amor, carinho, lealdade, cuidado que tiveste comigo até hoje, sempre
compreendendo as minhas renúncias e apoiando para que o objetivo principal fosse alcançado. Obrigada também pelo apoio nos experimentos, na tabulação de dados, não só na
pesquisa, mas na docência também, em todas as áreas da minha vida sei que sempre tive e sempre terei seu apoio. Juntos somos mais fortes e a nossa cumplicidade, amizade, respeito,
confiança e amor nos une até hoje. Te amo muito!
Também gostaria de agradecer o amor e carinho da minha irmã Flávia e meu cunhado Gustavo que sempre compreenderam essa minha jornada e sempre me deram força, torcendo
por mim e pelo meu sucesso. Também agradeço por ter me dado a honra de ser tia e “paparicar” bem muito minha sobrinha, pode ter certeza, que Fernanda foi meu refúgio no momento de muito “estresse”, titia ama muito essa pequena. Saibam que vocês são especiais,
amo vocês!
Agradeço também ao meu cunhado, Raphael Serquiz, por todo apoio, auxílio, disponibilidade em me ajudar e por todo carinho que sempre teve comigo. Pode ter certeza que é recíproco,
você é muito especial e sou grata por tudo que fizeste por mim! Amo você, Raphinha! Também agrdeço a madrinha do meu esposo, Rosângela, que considero como minha madrinha, a nossa “Dinda”, e a minha sogra Rejane, por toda torcida, por todo apoio e carinho, mesmo que distante, mas sempre curtindo cada degrau conquistado. Obrigada por
tudo sempre! Amo vocês!
Agradeço aos meus amigos Karlinha, Vanessinha, Rayonara, Elayne, Rafael Cardoso, Gustavo Martins, Thiago (“China”), em especial Amandinha e Ágnes por sempre estarem ao meu lado, me apoiando, incentivando, acreditando e torcendo por mim. Saibam que os nossos
encontros foram fundamentais para aliviar os “estresses” dessa longa jornada. Vocês são especiais, amo vocês!
Também agradeço a toda minha equipe de rabalho da Universidade Potiguar (UnP) por todo apoio nessa longa jornada, por todas as conversas e “desabafos” quando necessário, em especial a minha gestora e amiga professora Msc. Lidiane Fernandes por toda compreensão,
todo apoio e todo incentivo, por entender o momento da reta final e me ajudar a conciliar a docência e o doutorado de uma forma mais leve. Também agradeço em especial as amigas e parceiras de trabalho professora Drª Larissa Praça e professora Msc. Mabelle Lima por todo
apoio, todo “fardo” dividido, toda parceria para que tudo se tornasse mais leve. Muito obrigada a todos vocês!
Além disso, quero agradecer especialmente a umas das responsáveis por hoje eu estar aqui realizando esse sonho, que é a minha orientadora professora Drª Ana Heloneida, pois já estamos juntas há um tempo e pode ter certeza que todo seu incentivo e orientação foram fundamentais para que eu desse continuidade no caminho da pesquisa. Muito obrigada, por ter
acreditado em mim, por ser minha orientadora desde a iniciação científica, a senhora é um exemplo de mestre para mim, com a senhora aprendi como se faz ciência. Obrigada por me
ajudar a concretizar o sonho de ser mestre, de ser pesquisadora, por todo carinho, apoio e amizade que sempre tive da senhora. Obrigada por tudo!
Agradeço também, ao meu co-orientador, professor Drº Eliseu Santos, pela colaboração e acolhida no laboratório (LQFPB). Sempre preocupado em saber como estavam os experimentos e sempre que possível me auxiliando. Obrigada por todos os ensinamentos e apoio, pode ter certeza que tudo isso foi fundamental para a realização desse trabalho. Muito
obrigada!
Agradeço a todo grupo de pesquisa da nutrição, NutriSBioativoS, por ter feito parte desse projeto, contribuindo de alguma forma para a realização do mesmo. Quero agradecer em especial, a Amanda e Izael, que juntos iniciamos essa jornada, desde a iniciação científica até
o doutorado e sempre estivemos ao lado um do outro, sempre nos apoiando e incentivando para que seguíssemos em frente, muito obrigada por todo apoio, carinho, amizade e companheirismo, estaremos sempre juntos. Agradeço também em especial a Bia, por toda
parceria, todos os “desabafos”, todo carinho e amizade, estaremos sempre juntas. Agradeço ao professor e amigo Alexandre Serquiz, por toda disponibilidade para a realização
desse trabalho. Muito obrigada, por todo apoio, paciência e compreensão ao longo dessa jornada, principalmente para a realização dos experimentos. Pode ter certeza que sua participação foi fundamental para que tudo pudesse acontecer da melhor forma possível. Aproveito e agradeço também a toda equipe do biotério da UNP, em especial seu Manoel e
Tarcísio para a realização dos experimentos. Obrigada pela ajuda!
Agradeço também a professora e amiga Drª Maíra Lima pela colaboração e contribuição para a realização desse trabalho, muito obrigada por todo auxílio e disponibilidade para que todos os experimentos ocorressem da melhor forma possível. Aproveito e já agradeço por toda a contribuição realizada na minha banca de qualificação e por ter aceitado fazer parte da minha
banca de defesa, pelo cuidado com que analisou meu trabalho e pela grandiosa contribuição que fez. Muito obrigada por todo apoio sempre.
Agradeço a professora Drª Adriana Rezende por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, é uma honra tê-la na minha banca. Quando fui decidir os nomes para compor a mesma, elenquei logo o nome da senhora, já que tenho uma admiração pelo seu trabalho e já
seriedade das suas argumentações, muito obrigada pelo cuidado com que olhaste meu trabalho e pela valiosa contribuição que fizeste. Muito obrigada por tudo!
Agradeço a professora Drª Lucia de Fatima Campos Pedroza por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, é uma honra tê-la na minha banca. Tenho uma admiração pelo seu
trabalho e por toda sua carreira na Nutrição. És um exemplo de mestre e profissional para mim. Tenho orgulho de ser egressa da primeira turma do programa pós-graduação em nutrição, por saber o quanto que a senhora lutou para que esse projeto fosse concretizado, e,
assim, concretizar o sonho de muitas pessoas, como, por exemplo, o meu, de ter o título de mestre em Nutrição. Muito obrigada pelo cuidado com que olhaste meu trabalho e pela
valiosa contribuição que fizeste. Muito obrigada por tudo!
Também agradeço a professora e amiga Drª Paula Ivani por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, é uma honra tê-la na minha banca. Sou grata por ter aceitado meu convite, pois me acompanhaste desde a iniciação científica até aqui, obrigada pelo cuidado com que avaliaste meu trabalho e pela grandiosa contribuição que fizeste. Muito obrigada por tudo, por
todas as conversas e por todo carinho de sempre!
Agradeço ao pessoal do LQFPB, por nos acolher no laboratório e sempre estarem disponíveis para nos ajudar. Muito obrigada.
Não poderia deixar de agradecer a minha turma de doutorado, que sempre estava junta, unida, torcendo uns pelos outros, nos apoiando para que todos pudessem chegar ao objetivo comum: a defesa do doutrado. Obrigada a todos pelos momentos de angústias compartilhados a cada disciplina que se passava, bem como os momentos de descontração, alegria, risadas e acima
de tudo pelo apoio.
Também agradeço a todos os professores do PPGBIOQ. Pode ter certeza que todos vocês contribuíram para o aprimoramento e aperfeiçoamento dos meus conhecimentos para que eu pudesse trilhar esse longo caminho. Vocês são essenciais para a concretização do meu sonho.
Agradeço também a Samara, secretária do PPGBIOQ, por toda disponibilidade que sempre teve em me ajudar nas burocracias exigidas pelo programa. Muito obrigada por tudo! A todos os funcionários e professores do departamento de Bioquímica e Nutrição da UFRN. Ao programa de Pós-Graduação em Bioquímica. A PPG Capes pelo financiamento – código
001, em um período desse doutorado.
Às pessoas que direta ou indiretamente auxiliaram o desenvolvimento e conclusão desse trabalho.
“...Às vezes a felicidade demora a chegar Aí é que a gente não pode deixar de sonhar Guerreiro não foge da luta e não pode correr Ninguém vai poder atrasar quem nasceu pra vencer...” Alexandre Assis / Carlos Rodrigues / Gilson Bernini
Estudo do efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo (tamarindus indica l.) em alterações metabólicas e moleculares induzida por dieta em ratos Wistar.
RESUMO
A crescente prevalência da obesidade e de todas as morbidades associadas tem aumentado a busca por novos métodos de tratamento. Torna-se essencial investigar o efeito das vias de atuação das dietas desequilibradas, nutricionalmente, sobre marcadores e/ou parâmetros metabólicos/bioquímicos, inflamatórios e moleculares, e identificar moléculas que possam atuar prevenindo esse quadro. Neste estudo, foi avaliada uma dieta experimental rica em alimentos ultraprocessados e, posteriormente, o efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo em modelo experimental sobre parâmetros bioquímicos e moleculares. Foi produzida uma dieta experimental e analisada a sua composição centesimal, índice glicêmico e carga glicêmica. Para essas duas últimas análises, foram utilizados dois grupos de ratos Wistar (n=5). Ainda foi avaliado o efeito dessa dieta e do inibidor de tripsina de sementes de tamarindo purificado (ITTp) em alterações metabólicas, induzidas pela dieta experimental em ratos Wistar. Os experimentos foram conduzidos em duas fases: 1) 17 semanas, nesse foram utilizados dois grupos de ratos Wistar (n=5), um dos grupos de animais foram alimentados com a dieta experimental, enquanto o outro grupo com a dieta padrão (Labina®). Ao final dessa fase, os animais tiveram analisados: o estado nutricional, marcadores e parâmetros bioquímicos, inflamatórios, hormonais e moleculares; 2) Neste, foram utilizados quatro grupos de ratos Wistar (n=5); desses, três grupos de animais foram, inicialmente, alimentados por 17 semanas com dieta experimental e se apresentaram com obesidade e então dois desses grupos foram tratados por 10 dias, da seguinte forma: a) dieta padrão b) ITTp (730 µg/kg). O terceiro grupo de ratos Wistar com obesidade não recebeu tratamento (controle negativo) e mais um grupo de ratos Wistar, eutróficos alimentados com dieta padrão foi adicionado ao experimento como controle positivo. No 11º dia de experimento foram avaliados: medidas zoométricas; consumo e ganho de peso; marcadores e parâmetros bioquímicos e moleculares. A dieta experimental apresentou alto índice glicêmico (77,6) e alta carga glicêmica (38,8). Houve diferença significativa (p < 0,0001) na diferença cumulativa semanal dos valores do Índice de Lee, evidenciando um aumento, nas 17 semanas de estudo, no grupo que recebeu a dieta experimental. Os animais que receberam a dieta experimental apresentaram glicemia de jejum aumentada (p=0,008) comparado aos animais que receberam a dieta padrão. Também houve diferença estatística significativa em relação ao VLDL-c (p=0,016) e TG (p=0,016), sendo maior no grupo de animais que recebeu a dieta experimental. Foi visto que os ratos do grupo da dieta experimental apresentaram expressão relativa de mRNA de PPARy significativamente maior nos tecidos gonadal e retroperitoneal (p=0,0121 e p=0,0024, respectivamente). O grupo tratado com ITTp apresentou as medianas significativamente mais baixas, do que as do grupo da dieta da experimental (p=0,0065). O grupo de ratos Wistar com obesidade tratados com ITTp apresentou as concentrações de TG e VLDL-c mais baixas (p=0,0108) comparada aos demais grupos. Ainda assim, o grupo de animais tratados com ITTp apresentou a expressão relativa de mRNA de TNF-α significativamente (p=0,025) menor comparadas aos outros grupos, independente da expressão de mRNA de PPAR- γ. O presente estudo apresenta o ITTp, como uma molécula bioativa que atua na modulação das alterações metabólicas e moleculares, provocadas por uma dieta experimental de alto indice glicêmico. Portanto, é de grande interesse biotecnológico, principalmente para o desenvolvimento de biofármacos com potencial de aplicação com função anti-TNF-α.
Evaluation of the effect of purified tamarind seed trypsin inhibitor on metabolic changes induced by experimental diet in a wistar rat model.
ABSTRACT
The increasing prevalence of obesity and all associated noncommunicable chronic diseases (NCDs) has increased the search for new methods to combat them. To investigate the effect of the nutritional pathways of nutritionally unbalanced diets on markers and/or parameters metabolic/biochemical, inflammatory and molecular, and look for molecules that can act by reverse this situation is essential. In this study, an experimental diet rich in ultra-processed foods was evaluated and, subsequently, the effect of purified tamarind seed trypsin inhibitor in an experimental model on biochemical and molecular parameters. An experimental diet was produced and its centesimal composition, glycemic index and glycemic load were analyzed. For glycemic index and glycemic load analyzes two groups of Wistar rats were used. It was also evaluated the metabolic changes induced by either this experimental diet and the tamarind seed purified trypsin inhibitor (ITTp). The experiments were conducted in two phases: 1) 17 weeks, in which two groups of Wistar rats (n = 5) were used, one group of animals were fed with the experimental diet, while the other group with the standard diet (Labina®). At the end of this phase, were analyzed: nutritional status, and biochemical, inflammatory, hormonal and molecular parameters and markers. 2) four groups of Wistar rats (n = 5) were used. Of these, three groups of animals were initially fed for 17 weeks with an experimental diet and presented obesity and then two of these groups were treated for 10 days with a) standard diet or b) ITTp (730 µg / kg). The third group of obese Wistar rats received no treatment (negative control) and one more group of eutrophic Wistar rats were added to the experiment as a positive control. On the 11th day of the experiment were evaluated: zoomometric measurements; consumption and weight gain; and biochemical and molecular parameters and markers. The experimental diet showed high glycemic index (77.6) and high glycemic load (38.8). There was a statistically significant difference (p <0.0001) in the cumulative weekly difference in Lee Index values, evidencing an increase in the 17 weeks of study in the group that received the experimental diet. The animals that received the experimental diet presented significantly increased fasting glucose (p = 0.008) when compared to the animals fed by standard diet. There were also statistically significant difference in relation to VLDL-c (p = 0.016) and TG (p = 0.016), being higher in the group of animals that received the experimental diet. Rats from the experimental diet group had significantly higher PPARγ mRNA relative expression in the gonadal and retroperitoneal tissues (p = 0.0121 and p = 0.0024, respectively). The pTTI-treated group showed significantly lower medians than the experimental diet group (p = 0.0065).The group of obese Wistar rats treated with ITTp had the lowest TG and VLDL-c concentrations (p = 0.0108) compared to the other groups. In addition, the group of animals treated with ITTp had significantly lower TNF-α mRNA relative expression (p = 0.025) compared to the other groups, regardless of PPAR-γ mRNA relative expression. This present study presents the ITTp as a bioactive molecule that acts on the modulation of metabolic changes caused by a high glycemic index experimental diet. Therefore, ITTp is a molecule with great biotechnological potential, especially for the development of biopharmaceuticals with anti-TNF-α function. Keywords: Tamarindus indica L .. Lipid profile. Blood glucose. PPAR- γ. TNF-α.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Curva glicêmica da dieta experimental e glicose ...30 FIGURA 2 Índice de Lee em ratos Wistar recebendo (A) dieta padrão (B) dieta experimental. (C) Diferenças cumulativas no índice de Lee e (D) Perímetros da Cintura (PC) de animais recebendo dieta padrão e dieta experimental durante o experimento...31 FIGURA 3 Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo em ratos Wistar recebendo dieta padrão ou experimental em (A) tecido adiposo retroperitoneal e (B) tecido adiposo gonadal...33 FIGURA 4 Eletroforese (SDS-PAGE) das proteínas de sementes de tamarindo...48 FIGURA 5 Consumo alimentar e ganho de peso em ratos Wistar após 10 dias de tratamento...49 FIGURA 6 Glicemia de jejum em ratos Wistar após 10 dias de tratamento...50 FIGURA 7 Perfil lipídico de ratos Wistar após 10 dias de tratamento...51 FIGURA 8 Expressão relativa do mRNA de TNF-α no tecido adiposo perirrenal em ratos
Wistar após 10 dias de
tratamento...52 FIGURA 9 Imunocoloração de TNF-α no tecido adiposo de ratos Wistar após 10 dias de tratamento...53 FIGURA 10 Expressão relativa do mRNA do PPAR-γ no tecido adiposo perirrenal em ratos
Wistar após 10 dias de
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Rótulo nutricional (g / Kg) da dieta Labina®...24 TABELA 2 Composição centesimal (g/100 g) das dietas experimental e padrão...29 TABELA 3 Média dos incrementos sob a curva glicêmica obtidos dos animais do grupo da
dieta experimental e do grupo que recebeu a
glicose...30 TABELA 4 Parâmetros bioquímicos dos animais da dieta experimental e padrão durante as 17 semanas...32 TABELA 5 Composição centesimal (g/100 g) das dietas experimental e padrão. ...44 TABELA 6 Efeito do ITTp no TNF-α plasmático em ratos Wistar submetidos a diferentes
tratamentos por 10 dias.
...51 TABELA 7 Escore da imuno-histoquímica de TNF-α em tecido adipose de ratos wistar
submetidos a difefentes tratamentos durante 17
semanas...54 TABELA 8 Resultado da busca de estudos sobre inibidores enzimáticos (inibidores de tripsina, elastase e Inibidor de quimiotripsina) de Tamarindus indica L. e sua aplicação na saúde
de modo direto e
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BApNA N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida
CCK Colecistocinina
CG Carga glicêmica
CHO Carboidrato
ChREBP Proteína de ligação ativada como elemento responsivo a carboidratos
DAB Diaminobenzidina
DCNT Doenças Crônicas Não Transmissíveis
DIO Diet-induced obesity
DMARDs Drogas modificadoras da doença DM 2 Diabetes mellitus tipo 2
dNTPs Desoxirribonucleotídeos Fosfatados dUTP 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato
EB Extrato Bruto
ENH Elastase de Neutrófilo Humano
ESI-MS Espectrometria de massa com fonte de ionização eletrospray EVTI Inibidor de Tripsina de Sementes de Erythrina veluntina fMLP N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
GAPDH Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato
GGT Gama Glutamil Transpeptidase
GLUT4 Transportadores de Glicose 4 HDL-C Lipoproteínas de Alta Densidade
HGLI Dieta de alto índice glicêmico e de alta carga glicêmica HMG-CoA 3- hidróxi-3-metil-glutaril-coenzima A
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
IG Índice Glicêmico
IL-1β Interleucina-1 beta
IL-6 Interleucina-6
IL-13 Interleucina-13
IMC Índice de Massa Corpórea
IRS-1 Substrato-1 do Receptor de Insulina
LDL-C Lipoproteínas de Baixa Densidade
LPL Lipoproteína Lipase
MALDI-TOF-MS spectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por matriz
MCP-1 Proteína quimioatraente 1 de macrófagos
NF-Κb Fator Nuclear kappa B
NutriSBioativoS Nutrição e substâncias bioativas para saúde
OMS Organização Mundial de Saúde
PAF Fator de agregação plaquetária
PAI-1 Inibidor do Ativador de Plasminogênio-1
PC Perímetro da cintura
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PPARγ Receptores ativados por proliferador de peroxissoma gama
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Gel de Poliacrilamida Descontínuo e Desnaturante
SM Síndrome Metabólica
SREBP Proteínas de ligação reguladora de esteróis
TG Triglicerídeos
TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica
TLR-4 Receptor do Tipo Toll
TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa
TZDs Tiazolidinedionas
UI Unidade de Inibição
16 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...19 2. CAPÍTULOS ...20 2.1 CAPÍTULO 1 ...20 2.1.1. Introdução ...21 2.2.2 Material e métodos ...23
2.2.2.1 Tipo de estudo e material biológico ...23
2.2.2.2 Produção e análise da composição centesimal da Dieta Experimental ...24
2.2.2.3 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental ...25
2.2.2.4 Determinação do efeito da dieta experimental sobre parâmetros antropométricos, bioquímicos e moleculares. ...26
2.2.2.5 A avaliação zoométrica e diagnóstico do estado nutricional de obesidade ...27
2.2.2.6 Parâmetros Bioquímicos ...27
2.2.2.7 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ em tecido adiposo ...28
2.2.2.8 Análise Estatística ...28
2.2.3 Resultados ...29
2.2.3.1 Composição Centesimal da Dieta Experimental...29
2.2.3.2 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental com pellets ...30
2.2.3.3 Avaliação do estado nutricional ...30
2.2.3.4 Avaliação bioquímica ...31
2.2.2.5 Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo ...32
2.2.4 Discussão ...33
2.2.5 Conclusão ...38
2.2 CAPÍTULO 2 ...38
2.2.2 Materiais e métodos ...42
2.2.2.1 Tipo de Estudo e Material Biológico ...42
2.2.2.2 Experimento In Vitro ...42
2.2.2.3 Experimento In Vivo ...43
2.2.2.4 Animais...44
2.2.2.5 Dietas ...44
2.2.2.6 Evolução da ingestão de alimentos e ganho de peso...45
2.2.2.7 Parâmetros bioquímicos ...45
2.2.2.8 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ e TNF-α no tecido adiposo ...45
2.2.2.9 Imuno-histoquímica do TNF-α ...46
2.2.2.10 Análise Estatística ...47
2.2.3. Resultados...47
2.2.3.1 ITTp ...47
2.2.3.2 Consumo alimentar e ganho de peso ...48
2.2.3.3 Glicose ...49 2.2.3.4 Perfil lipídico ...50 2.2.3.5 TNF-α ...51 2.2.3.6 Imuno-histoquímica deTNF-α ...53 2.2.3.7 PPAR-γ ...54 2.2.4. Discussão ...55 2.2.5. Conclusões ...61 2.3 CAPÍTULO 3 ...61 2.3.1 Introdução ...62 2.3.2 Metodologia ...63
2.3.3 Tamarindo (Tamarindus indica L. ) uma fruta tropical ...64
2.3.4 Inibidores enzimáticos ...66
2.3.6 Perspectivas de aplicação para saúde dos Inibidores enzimáticos de tamarindo ....76 2.3.7 Conclusões ...78 3. CONCLUSÃO ...78 4. TRAJETÓRIA ACADÊMICA ...79 REFERÊNCIAS...81
1. INTRODUÇÃO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a obesidade é definida como um acúmulo anormal ou excessivo de gordura, decorrente do desequilíbrio energético, drogas, predisposição genética ou mesmo fatores ambientais. Essa epidemia poderá favorecer o surgimento e desenvolvimento de doenças crônicas não-transmissíveis (DCNTs), contribuindo para o aumento de risco de desenvolvimento das doenças cardiovasculares, aumento do risco de diabetes mellitus tipo 2(DM2), dislipidemia, aterosclerose, além de ser causa incidente da síndrome metabólica (SM) (CAVALCANTI et al., 2009; GUIMARÃES et al., 2016; AGUILERA et al., 2019; JAACKS et al., 2019).
Nos dias atuais, junto à globalização, vem sendo modificado o estilo de vida dos indivíduos, conhecido como estilo de vida ocidental e com isso, está ocorrendo uma mudança no padrão alimentar. Essa alteração está resultando no aumento da alimentação consumida fora de casa, em estabelecimentos onde o preparo e o consumo são rápidos e os alimentos possuem alta palatabilidade. Esse padrão alimentar é composto por alimentos industrializados com alto valor calórico, apresentando um elevado teor de carboidratos, principalmente, carboidratos simples, provenientes do uso de cereais refinados; além de grandes quantidades de gordura, principalmente gorduras saturadas ou trans e baixo teor de proteínas, fibras alimentares e micronutrientes, também reconhecidos como alimentos ultraprocessados (CASTRO et al., 2015; SAKURAI et al., 2016; GIBNEY et al., 2018)
Para Sartorelli e Cardoso (2006) a dieta hiperglicídica está combinada com fatores de risco para a dislipidemia, assim como ocorre em dietas ricas em lipídeos. Possivelmente, essa relação é atribuída ao estímulo mais elevado à lipogênese hepática, especialmente na síntese de triglicerídeos e consequentemente as lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-c), por meio de uma maior oferta de glicose plasmática. As dietas desequilibradas nutricionalmente, comumente provocam aumento do tecido adiposo, condicionado pelo aumento da expressão do receptor proliferador de peroxissoma gama (PPARγ), mais especificamente o PPARγ2 que é mais expresso no tecido adiposo. Ainda, dentre os mecanismos moleculares associados no desenvolvimento da resposta inflamatória induzida pelo tecido adiposo, destaca-se, a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB), o qual aumenta a expressão de vários genes que codificam para proteínas relacionadas a resposta inflamatória e, consequentemente, está ligado à patogênese de diferentes DCNTs (OUCHI et al., 2011; KRINNINGER et al., 2011; KANNEGANTI; DIXIT, 2012; WEISBERG et al., 2013).
Para o tratamento das DCNTs envolvendo o processo inflamatório, existem vários medicamentos que são utilizados, como os fibratos e tiazolidinedionas (TZDs) que agem ativando os receptores nucleares, tais como os PPARγ. As TZDs aumentam a expressão dos transportadores de glicose no músculo e no tecido adiposo (GLUT4), da Lipase lipoprotéica (LPL) e reduzem a expressão da leptina e do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α)(BROWN; PLUTZKY 2007; SHAH; MEHTA; REILLY, 2008). No entanto, as ações maléficas e os efeitos indesejáveis (hepatotoxicidade) provocados pelos fibratos e TZDs têm fortalecido e contribuído para o aumento em pesquisas com foco em substâncias com propriedades mais seletivas e menos tóxicas (BROWN; PLUTZKY 2007; SHAH; MEHTA; REILLY, 2008). Dessa forma, a busca por moléculas bioativas, com base em plantas tem sido bastante intensificada, visando à formulação de novos biofármacos.
As bioatividades de inibidores de tripsina em sementes, entre elas as de tamarindo, têm sido demonstrados em alguns estudos. Em estudos recentes, realizados pelo grupo de pesquisa NutriSBioativoS (Nutrição e substâncias bioativas para saúde), um inibidor de tripsina de semente de tamarindo (ITT) foi purificado e caracterizado (MEDEIROS et al., 2018) e tem apresentado diversas propriedades bioativas (MEDEIROS et al., 2018; CARVALHO et al., 2019). Ribeiro et al. (2015) mostraram que o ITT isolado apresenta, um efeito sacietogênico, reduzindo, em ratos eutróficos, o ganho de peso associado ao aumento plasmático de colecistoquinina (CCK). Carvalhoet al. (2016) mostraram que o ITT apresenta, além da redução do consumo alimentar em animais com obesidade e SM, a redução de TNF-α plasmático e da média da glicemia de jejum, entretanto sem diferença estatística entre os grupos estudados. Ressalta-se que o ITT não apresentou hepatotoxicidade nos dois últimos estudos citados acima(RIBEIRO et al., 2015; CARVALHO et al., 2016).
Em face da propriedade sacietogênica e anti-inflamatória do ITT e a relação entre dietas nutricionalmente inadequadas e alteração metabólicas, torna-se relevante investigar o seu potencial efeito na redução dos parâmetros bioquímicos e moleculares, alterados por dietas desequilibradas. Desse modo, neste estudo, foi avaliada uma dieta experimental rica em alimentos ultraprocessados e, posteriormente, o efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo em modelo experimental sobre parâmetros bioquímicos e moleculares. 2. CAPÍTULOS
2.1 CAPÍTULO 1
Os resultados estão sob revisão no periódico International Food Research Journal. Carvalho, F.M.C.; Costa, I.S.; Santos, J.P.S.O.; Oliveira, G.S.; Santos, J.; Silva, F.K.B.; Bortolin, R.H.; Silbiger,
V.N.; Neves, R.A.M.; Maciel, B.L.L.; Santos, E.A.; Morais, A.H.A. Directly measured and calculated glycemic index and glycemic load in an experimental pellet-diet for obesity induction and its metabolic effects in Wistar rats.
Cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica em uma dieta experimental e seus efeitos na obesidade e nas alterações metabólicas em ratos Wistar.
RESUMO
As doenças relacionadas à obesidade no mundo aumentaram como resultado de distúrbios metabólicos induzidos por dietas de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica. Foi avaliada a composição centesimal, medido e calculado diretamente o índice glicêmico e os valores da carga glicêmica de uma dieta utilizada para induzir obesidade e alterações metabólicas. Dois grupos de ratos Wistar machos adultos (n = 5) foram alimentados com dieta padrão e experimental por 17 semanas. A dieta experimental, composta majoriatiriamente por carboidratos, com índice glicêmico de 77,6 e carga glicêmica de 38,8. Essa dieta aumentou os níveis de glicemia de jejum, triglicerídeos, VLDL-C e de mRNA de PPARγ no tecido adiposo. O índice glicêmico e a carga glicêmica foram diretamente medidos e calculados destacando informações essenciais para a caracterização da dieta. Além disso, a dieta induziu a obesidade e seus distúrbios. Sugere-se que essa metodologia possa ser utilizada em outros estudos com o objetivo de avaliar o efeito metabólico de dietas ricas em carboidratos.
Palavras-chave: Dieta experimental; Glicemia de jejum; Triglicerídeos; VLDL-C; PPARγ. ABSTRACT
Worldwide, the obesity-related diseases have increased as a result of metabolic disorders induced by diets with high glycemic index and glycemic loads. We evaluated the centesimal composition and directly measured and calculated glycemic index and glycemic load values of a pellet-diet used to induce obesity and metabolic alterations. Two groups of adult male Wistar rats (n = 5) were fed with a standard or experimental diet for 17 weeks. The experimental diet was rich in carbohydrates and the glycemic index was of 77.6 and the glycemic load was of 38.8. This pellet-diet increased fasting glycemia, triglycerides, VLDL-C and PPARγ mRNA expression in adipose tissue. Directly measured and calculated values of glycemic index and glycemic load highlighted essential information for the characterization of our diet. Moreover, the diet induced obesity and its disorders. We suggest this direct methodology could be used in other studies aiming to evaluate the metabolic effect of high carbohydrate diets.
Keywords: Experimental diet; Fasting blood glucose; Triglycerides; VLDL-C; PPARγ.
2.1.1. Introdução
Os hábitos alimentares da sociedade moderna têm impactado no aumento da incidência das doenças crônicas não transmissíveis (DCNTs) (WHO, 2016). Contudo, mesmo com a diversidade nutricional apresentada nesses hábitos, quando se relacionam os padrões de consumo alimentar com os distúrbios metabólicos, a sua maioria é considerada obesogênica (ROSSINI; SILVA; MORAES, 2012; NAKANISHI; SERIKAWA; KURAMOTO, 2015;
MYRTILLE; HEUVEL; FLEUR, 2016). Desse modo, as DCNTs têm sido estudadas, preferencialmente, induzidas por dietas que refletem essa variedade de alimentos altamente energéticos e palatáveis (geralmente produtos industrializados e ultraprocessados) (BUETTNER; SCHÖLMERICH; BOLLHEIMER, 2007). Essas dietas apresentam altos índices (IG) e/ou cargas glicêmicas (CG), por se assemelharem ao padrão alimentar atual, as que melhor refletem as causas dietéticas para essas desordens metabólicas (WHO, 2016; BORTOLIN et al., 2018).
Tais dietas inadequadas, sejam desequilibradas qualitativa ou quatitativamente, na sua maioria, provocam aumento do tecido adiposo, sendo esse efeito demonstrado nos estudos, frequentemente, condicionado pelo aumento da expressão do proliferador de peroxissoma gama (PPARγ), mais especificamente o PPARγ2 (TONTONOZ; HU; SPIEGELMAN, 1994; SCHOONJANS; STAELS; AUWERX, 1996; REN et al., 2002; LIOU et al., 2011; LIANG et al., 2016; CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017). Nos adipócitos, o PPARγ2 regula a expressão de numerosos genes, envolvidos no metabolismo de glicídios e lipídeos, incluindo Adipocyte protein 2 (LIANG et al., 2016), acil-CoA sintetase(TONTONOZ; HU; SPIEGELMAN, 1994) e lipoproteína lipase (SCHOONJANS; STAELS; AUWERX, 1996). Controla a expressão da proteína transportadora de ácidos graxos 1 e cluster of differentiation 36, ambos envolvidos na captação de lipídeos pelos adipócitos (REN et al., 2002; LIOU et al., 2011; CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017).
Os distúrbios hormonais provocados por dietas obesogênicas têm sido também uma alternativa na busca por explicações pelo aumento da ingestão alimentar (hiperfagia) e da eficiência energética que acabam por influenciar no aumento das DCNTs (LI et al., 2008; DEKKER et al., 2010). Ainda, evidências de pesquisas experimentais mostram que esse aumento no consumo alimentar, frequentemente, está atrelado aos distúrbios no metabolismo hormonal e na resposta desses ao consumo oral e à presença dos nutrientes no sistema digestivo (INSTITUTO ADOLFO LUTZ , 1985; NADERALI et al., 2001; BRASIL, 2005; LI et al., 2008; DEKKER et al., 2010).
Adicionalmente, fatores como a composição da dieta, a duração do tratamento dietético e alguns nutrientes isolados, têm demonstrado ser importantes no desenvolvimento de distúrbios metabólicos (INSTITUTO ADOLFO LUTZ , 1985; NADERALI et al., 2001; FOSTER-POWELL; HOLT; BRAND-MILLER, 2002; BRASIL, 2005; MONRO; SHAW, 2008; GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS, 2011; THE UNIVERSITY OF SYDNEY, 2015). Sendo assim é de grande importância o estudo da composição centesimal dessas dietas que induzem obesidade (DIO - Diet-induced obesity) e
consequentemente sua informação nutricional. Dentre os nutrientes em estudos que analisam consequências metabólicas e bioquímicas das dietas, o alto teor de frutose tem sido apontado (NOVELLI et al., 2007; AUGUSTIN et al., 2015) em detrimento da presençade gordura na dieta (REEVES, 1997; BLEICHER et al., 2001).
Dessa maneira, a busca por explicações relacionadas aos efeitos de certos nutrientes presentes nessas dietas ou mesmo das suas inadequações quantitativas sobre a hiperfagia e, consequentemente, a obesidade e as suas consequências, ainda são insuficientes. Além disso, existem as limitações éticas e impedimentos legais que revestem esses estudos com DIO e seus efeitos deletérios no organismo em seres humanos (ORDÓÑEZ, 2005; SHUKLA et al., 2015). Assim, são comuns estudos experimentais, sendo recomendadas as pesquisas com animais, especialmente ratos, dada a similaridade existente entre o seu genoma com o dos humanos (PINTO JÚNIOR; SERAPHIM, 2012), mas que possuam modificações específicas, susceptibilidade genéticas ou apresentando doenças induzidas por vias que não são as mesmas que acometem os humanos (ISKEN et al., 2009). Estudos que avaliem dietas que representem o padrão alimentar da atualidade, que sejam realizados em linhagens de animais que representem a diversidade daquela população e que promovam impactos significativos no metabolismo, nos mais diversos níveis, são menos comuns.
Adicionalmente, a busca por informações sobre os mecanismos envolvidos nessa relação de causa efeito, entre dieta e doença, vem sendo exaustivamente pesquisada. Para isso, alguns modelos têm sido apresentados na literatura, visando fornecer meios para se avaliar e responder as mais diversas perguntas acerca dessa relação.
O presente estudo traz a perspectiva de um modelo de indução de distúrbios metabólicos avaliados em diversos níveis, sejam antropométricos, plasmáticos e molecular, por meio da utilização de uma nova dieta experimental, também analisada quanto à sua composição centesimal, índice e carga glicêmica.
2.2.2 Material e métodos
2.2.2.1 Tipo de estudo e material biológico
Esse é um estudo experimental composto por dois experimentos in vivo diferentes realizados no Biotério da Universidade Potiguar - UnP. O primeiro experimento analisou o índice glicêmico e a carga glicêmica da dieta experimental durante quatro semanas. O segundo experimento investigou o efeito da mesma dieta experimental nos parâmetros antropométricos,
bioquímicos e moleculares por dezessete semanas. Os experimentos ocorreram com dois grupos de animais, de acordo com a metodologia descrita abaixo.
A dieta Labina® (Paulínia, SP, Brasil) e os alimentos industrializados, ultraprocessados, utilizados na dieta experimental foram obtidos, comercialmente, na cidade de Natal, RN. Para a análise da composição centesimal, todos os reagentes utilizados foram de grau analítico e obtidos da Sigma (St. Louis, EUA), VETEC Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, Brasil) e Merck (Rio de Janeiro, Brasil).
Tabela 1.Rótulo nutricional (g / kg) da dieta Labina®.
Dieta Labina® Umidade (g/Kg) 130,00 Cinzas (g/Kg) 100,00 Proteína (g/Kg) 230,00 Lipídios (g/Kg) 40,00 Fibra Bruta (g/Kg) 50,00
2.2.2.2 Produção e análise da composição centesimal da Dieta Experimental
A dieta experimental foi produzida, utilizando, em sua composição, água, ração Labina®, sendo acrescentados alimentos fontes de carboidratos simples, ultraprocessado, ricos em sacarose, em proporções recomendadas por Naderali et al. (2001). Assim, para a produção da dieta experimental foram utilizados: 100 g de ração, 100 mL de leite condensado e 21,2 g de açúcar refinado.
Assim, a ração Labina® sólida, em forma de cilindros, foi triturada com auxílio de moinho e/ou cutler. Posteriormente, os ingredientes foram adicionados e misturados, manualmente; em seguida, foram modelados em forma de cilindros e assados em forno pré-aquecido a 180 ºC, por, aproximadamente, 40 minutos, até se apresentarem secos e dourados. A dieta experimental foi avaliada quanto à sua composição centesimal e para isso, inicialmente, triturada e analisada quanto ao teor de umidade, por meio de secagem em estufa a 105 °C até massa constante. Após esse procedimento foi seca para que as demais análises fossem realizadas em base seca e em triplicata. A análise de lipídeos foi realizada pelo método de Soxhlet, que consiste em um processo de extração contínuo, onde se utilizou hexano como solvente. Os teores de cinzas foram determinados por incineração em mufla, a 550 °C, até obtenção de massa constante e o conteúdo de proteínas foi efetuado pelo método de Kjeldahl. Todas as análises foram realizadas usando os métodos padronizados pelo Instituto Adolfo Lutz
(BRASIL, 2005). A análise de fibra bruta foi feita segundo o método Ba 6ª-05 daAssociação de comunidades analíticas (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985).
Após as análises todos os resultados foram convertidos para base úmida. Os carboidratos foram determinados por diferença (100 g do alimento - soma total dos valores encontrados para umidade, lipídeos, cinzas, proteínas e fibras).
2.2.2.3 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental Esse primeiro experimento in vivo foi realizado com dois grupos de animais por 4 semanas para avaliar o índice glicêmico e a carga glicêmica da dieta experimental. Os animais foram avaliados semanalmente e calculados os valores médios de glicemia (MONRO; SHAW, 2008). Ratos Wistar adultos (16 semanas), machos, foram distribuídos individualmente em gaiolas de polipropileno, formando 2 grupos de 5 animais. Os animais foram mantidos em condições de luz padrão (12/12 h claro / escuro) e temperatura (23-25 ° C), sendo água e alimento ad libitum. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (20). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA-UnP) sob protocolo nº 012/2015.
Para a avaliação do índice glicêmico e carga glicêmica, a glicose foi dada a um grupo de animais (n = 5) como padrão e a dieta experimental para o outro grupo de animais (n = 5). Foram administrados por gavagem aos animais em jejum 5 mL da dieta experimental contendo 0,1 g / mL de carboidratos ou solução padrão de glicose (0,1 g / mL) (MONRO; SHAW, 2008). A glicemia foi medida aos 0, 5, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a gavagem e a curva glicêmica foi construída. Alíquotas de sangue foram obtidas da veia caudal dos ratos e colocadas em fita glicêmica e analisadas em medidor de glicose (ADVANTAGE®, Boehringer Mannheim, EUA).
Para determinação teórica do IG, seguiu-se o protocolo proposto pela Food and Agriculture Organization/World Health Organization (FAO, 1998), levando a efeito as seguintes etapas:
a) identificação do total de carboidrato glicêmico (em gramas) de cada alimento da refeição; b) determinação da proporção de carboidrato glicêmico de cada alimento em relação ao total de carboidrato glicêmico de cada refeição;
c) localização do IG de cada alimento (utilizando-se a glicose como referência) em tabela específica (FOSTER-POWELL; HOLT; BRAND-MILLER, 2002);
d) determinação da contribuição de cada alimento ao IG da refeição (IG do alimento pela proporção de seu carboidrato glicêmico, em relação ao carboidrato glicêmico da refeição); e) determinação do IG de cada refeição, pela soma dos valores obtidos no item anterior.
Para o cálculo do IG, foi realizado, obedecendo à seguinte equação: IG = área sob a curva glicêmica do alimento teste dividida pela área sob a curva glicêmica da glicose X 100. Para o cálculo da área da curva glicêmica, foi utilizada a soma dos incrementos da curva, como segue: Área= (A + B + C + D) t + (D + E) T + E²T 2 2 2 (E+F) Quando: A, B, C, D, E e F representam os incrementos sobre a curva glicêmica e T e t representam o tempo depois da administração das dietas (WOLEVER et al., 1991).
Determinado o IG, foi caracterizada como baixo, médio ou alto (≤55; 56 a 69 e ≥70, respectivamente), considerando IG moderado e alto como inadequado e baixo como adequado, conforme proposto na literatura(AUGUSTIN et al., 2015).
A CG da refeição foi determinada por meio da multiplicação do carboidrato do alimento, em gramas, pelo seu IG, dividido por 100 (Equação: CG = IG x teor CHO disponível na porção). A classificação pode ser baixa, média ou alta (≤10; 11 a 19 e ≥20, respectivamente), considerando CG moderada e alta como inadequada e baixa como adequada (AUGUSTIN et al., 2015).
2.2.2.4 Determinação do efeito da dieta experimental sobre parâmetros antropométricos, bioquímicos e moleculares.
Para a determinação do efeito da dieta experimental nos parâmetros antropométricos, bioquímicos e moleculares foram avaliados dois grupos de ratos Wistar machos (com 6 semanas):
Grupo dieta experimental (n = 5): os animais receberam a dieta experimental, caracterizada acima, como grupo teste.
Grupo dieta padrão (n = 5): os animais receberam a dieta Labina®, como grupo controle. O segundo experimento foi realizado por 17 semanas, que foi o tempo necessário para induzir a obesidade em todos os animais tratados com a dieta experimental. No último dia do experimento, os animais ficaram em jejum por 8 horas e o sangue foi coletado para a análise dos parâmetros bioquímicos.
Os ratos foram anestesiados com xilazina a 2% e cetamina a 5% e as amostras de sangue foram coletadas pela veia porta. Em seguida os animais foram sacrificados em uma câmara de CO2. As gorduras dos tecidos gonadal e retroperitoneal foram isoladas e utilizadas
para a avaliação da expressão de mRNA de PPARγ. Os animais foram mantidos em condições de padrão de luz (12/12 h claro / escuro) e temperatura (23 – 25 ° C), água e comida ad libitum. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA-UnP) sob nº 012/2015.
2.2.2.5 A avaliação zoométrica e diagnóstico do estado nutricional de obesidade
Os animais foram tratados com as dietas descritas acima, oferecidas durante 17 semanas e semanalmente foi realizada a avaliação zoométrica. Sendo assim, foi possível calcular o Índice de Lee (raiz cúbica do peso corporal(g)/Comprimento naso-anal x 1000). O diagnóstico de obesidade baseado no Índice de Lee (semelhante ao Índice de Massa Corpórea – IMC - utilizado para seres humanos), se apresenta quando, a partir dos cálculos, se obtêm valores acima de 0.300, pois valores inferiores a esse, indicam eutrofia (NOVELLI et al., 2007), ou seja, estado nutricional de normalidade.
Os animais também tiveram os seus Perímetros da Cintura (PC) aferidos no final do experimento. Para mensurar o PC, foi realizada a pega do animal com luva e pano com objetivo de contenção, de acordo com as recomendações (GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS, 2011), de forma que os mesmos ficaram posicionados verticalmente, sendo assim possível a determinação do PC, localizado imediatamente anterior a pata traseira do animal, com auxílio de fita antropométrica (Vanosan®).
Todas as medidas foram conduzidas por pessoas treinadas, visando a atender aos critérios de autenticidade científica, em conformidade com Novelli et al. (2007).
2.2.2.6 Parâmetros Bioquímicos
Ao final do segundo experimento, no último dia das 17 semanas, os animais foram submetidos por 8 h – 12 h em jejum. Assim, o sanguefoi coletado pela veia porta e o soro utilizado para a determinação da glicemia de jejum, triglicerídeo (TG), Lipoproteínas de Alta Densidade (HDL-c), Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL-c), colesterol total, Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO), Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP) e Gama Glutamil Transpeptidase (GGT), após a sua realização, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2. O método empregado para as dosagens dos parâmetros bioquímicos foi o enzimático-colorimétrico (Kit CELM®, São Paulo, Brasil).
2.2.2.7 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ em tecido adiposo
Após a coleta de sangue para dosagem dos parâmetros bioquímicos, no segundo experimento in vivo, as gorduras da região retroperitoneal e gonadal foram retiradas por meio de um corte longitudinal (com auxílio de tesoura, da base do abdômen até todo o segmento do externo, mostrando toda a cavidade abdominal e torácica), para a análise da expressão relativa de mRNA de PPAR-γ, sendo realizada conforme descrito a seguir.
Desse modo, o RNAm das gorduras foi extraído com o uso do reagente TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), sendo utilizados 100 mg de tecido fresco macerado em cadinhos com nitrogênio líquido. A quantificação dos RNAm foi realizada utilizando o kit de ensaio de RNA (Invitrogen Life Technologies). Para avaliar a expressão de RNAm de PPAR-γ no tecido adiposo, o cDNA foi preparado por transcrição reversa do RNA total. O cDNA foi utilizado para a reação em cadeia da polimerase (PCR) contendo TaqMan Universal PCR Master Mix para Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR-γ, Rn0044094), da Thermo Fisher Scientific (Wilmington, DE, USA). A expressão relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCT, e os resultados são apresentados como mudanças em comparação com os valores médios do grupo controle (grupo eutrófico), normalizados para GAPDH, de acordo com Livak e Schmittgen (2001).
2.2.2.8 Análise Estatística
O tamanho da amostra foi calculado de acordo com o coeficiente de variação e a diferença entre os tratamentos considerados significativos. Presumiu-se que existisse uma diferença de resposta fisiologicamente significativa dos parâmetros avaliados quando o tratamento (dieta experimental) exerceu efeito de 25% ou mais em relação ao grupo que não recebeu a dieta. Assim, adotou-se o coeficiente de variação antecipado de 10%, com probabilidade de erro inferior a 5% e potência de 90%.
Todos os dados foram testados quanto à normalidade usando o teste Shapiro-Wilk e são apresentados como média (desvios padrão). Os ganhos acumulados no Índice de Lee foram calculados, considerando as diferenças do Índice de Lee no final de cada semana até o dia 1 do experimento. O teste two-way ANOVA foi usado para avaliar as diferenças acumuladas no Índice de Lee e na evolução da circunferência abdominal entre os grupos de estudo durante as 17 semanas de experimento, uma vez que essas variáveis apresentaram distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk, p> 0,05). O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar
parâmetros bioquímicos entre os grupos de estudo, uma vez que essas variáveis não apresentaram distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk, p <0,05). O teste T de Student foi usado para comparar aumentos de vezes na expressão do mRNA de PPARγ, uma vez que o teste de Shapiro-Wilk mostrou que os dados tinham distribuição normal (p> 0,05). Diferenças significativas foram aceitas quando o valor de p foi menor que 0,05. Os dados foram analisados utilizando o Graph Pad Prism, versão 5.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA).
2.2.3 Resultados
2.2.3.1 Composição Centesimal da Dieta Experimental
A Tabela 2 apresenta a composição centesimal da dieta experimental. Demostrando que para a dieta experimental o componente majoritário foi o carboidrato (48%).
Tabela 2. Composição centesimal (g/100 g) da dieta experimental. Dieta experimental média (sd) (%) Energia (Kcal) 315,26 (19,27) 100 Umidade (g/100 g) 4,54 (0,04) 5 Cinza (g/100 g) 9,22 (0,09) 9 Proteína (g/100 g) 20,72 (1,08) 21 Lipídio (g/100 g) 4,34 (0,17) 4 Carboidratos* (g/100 g) 48,33 (5,38) 48 Fibra Bruta (g/100 g) 12,85 (4,68) 13
Dieta Experimental: Mistura composta de ração Labina®, leite condensado e açúcar (1:1:0.21).* Calculado pela diferença (100 g da dieta - Soma total dos valores encontrados para umidade, lipídios, cinzas, proteínas e fibras).
2.2.3.2 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental com pellets
A Figura 1 mostra a curva glicêmica da dieta experimental, comparada com a curva padrão de glicose. A dieta experimental possui alto índice glicêmico (77,6) e alta carga glicêmica (38,8). (Tabela 3).
Figura 1. Curva glicêmica da dieta experimental e glicose. Dieta experimental: os animais receberam 5 mL de dieta experimental (0,1 g / mL de carboidratos), composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). Glicose: os animais receberam 5 mL de glicose (0,1 g / mL) como padrão. p = 0,4931, anova bidirecional.
Tabela 3. Média dos incrementos sob a curva glicêmica obtidos dos animais do grupo da dieta experimental e do grupo que recebeu a glicose.
Tempo (min) Dieta Experimental Glicose
0 – 30 21,15* 39,70*
30 – 60 41,85* 63,00*
60 – 90 36,45 34,50
90 – 120 23,40 21,15
Soma das áreas do gráfico (AUC) 122,85* 158,35*
Dieta experimental: os animais receberam 5 mL de dieta experimental (0,1 g / mL de carboidratos), composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). Glicose: os animais receberam 5 mL de glicose (0,1 g / mL) como padrão. A área sob a curva do gráfico, correspondente a cada período de medição de glicose no sangue, 0-30 min, 30-60 min, 60-90 min, 90-120 min, respectivamente. AUC = soma de todas as áreas do gráfico que corresponde ao valor do índice glicêmico. Two-way ANOVA, p <0,0001.
2.2.3.3 Avaliação do estado nutricional
A avaliação do estado nutricional foi realizada usando o índice de Lee nas 17 semanas de experimento. As figuras 2A e 2B mostram a evolução do índice de Lee para animais no
grupo de dieta padrão e experimental. O índice de Lee começou a aumentar (> 0,300) em animais que receberam a dieta experimental a partir da 6ª semana do experimento. A partir dessa semana, o número de animais com obesidade aumentou até 100% apresentarem obesidade na última semana de experimento. Por outro lado, os animais que receberam a dieta padrão mantiveram o Índice de Lee abaixo de 0,300 durante as 17 semanas. Além disso, baseado nos cálculos das diferenças cumulativas nos ganhos do índice de Lee a cada semana do experimento, observou-se um ganho significativo nos animais alimentados com a dieta experimental quando comparados aos que receberam a dieta padrão, indicando um aumento crescente no grupo que recebeu a dieta experimental (Figura 2C).
O PC foi constante em ratos que receberam dieta padrão. Isso não foi observado no grupo da dieta experimental, que mostrou um aumento no PC durante o experimento, de 15,4 cm para 17 cm na última semana (Figura 2D).
Figura 2. Índice de Lee em ratos Wistar recebendo (A) dieta padrão (B) dieta experimental. (C) Diferenças cumulativas no índice de Lee e (D) Perímetros da Cintura (PC)de animais recebendo dieta padrão e dieta experimental durante o experimento. Índice de Lee = raiz cúbica do peso corporal (g) / comprimento naso-anal x 1000. As diferenças cumulativas consideram os valores do dia 1 do experimento e os valores no final de cada semana. Valores do índice Lee acima de 0,300 indicam obesidade. Dieta padrão: Labina®. *Two-way ANOVA P <0,0001 (A, B e C), P <0,001 (D). Dieta padrão: Labina®. Dieta experimental: Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21).
A tabela 4 mostra os parâmetros bioquímicos dos animais nos grupos estudados. Os animais do grupo da dieta experimental apresentaram valores maiores de glicemia de jejum, VLDL-c e TG quando comparados aos que receberam a dieta padrão.
Tabela 4. Parâmetros bioquímicos dos animais da dieta experimental e padrão após as 17 semanas.
Parâmetros Dieta experimental média (sd) Dieta padrão média (sd)
Teste Mann-Whitney, p valor Glicose em jejum (mg/dL) 185,80 (112,58) 88,40 (17,19) 0,020 Colesterol total (mg/dL) 104,40 (30,94) 112,40 (53,95) 0,168 HDL-C (mg/dL) 24,60 (4,87) 25,20 (6,26) 0,186 LDL-C (mg/dL) 52,96 (30,33) 75,08 (52,48) 0,827 VLDL-C (mg/dL) 31,80 (3,76) 12,12 (2,46) 0,011 TG (mg/dL) 159,00 (18,78) 60,60 (12,28) 0,011 TGO (mg/dL) 19,20 (5,31) 17,00 (8,68) 0,321 TGP (mg/dL) 40,80 (21,28) 27,60 (16,23) 0,430 GGT (mg/dL) 18,40 (4,88) 18,80 (5,45) 0,586
Grupos estudados com n = 5 ratos. HDL-C: lipoproteína de alta densidade. LDL-C: lipoproteína de baixa densidade. VLDL-C: lipoproteína de densidade muito baixa. TG: triglicerídeos. TGO: transaminase oxaloacética. TGP: transaminase glutâmica pirúvica. GGT: gama-glutamil transpeptidase. Dieta padrão: Labina®. Dieta experimental: Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21).
2.2.2.5 Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo
A expressão relativa de mRNA de PPARγ, em tecido adiposo foi avaliada em tecido gonadal e retroperitoneal, representando tecidos adiposos viscerais e subcutâneos, respectivamente (Figura 3A e B). Os ratos do grupo da dieta experimental apresentaram maior expressão relativa de mRNA do PPARγ em ambos nos tecidos quando comparados aos animais do grupo da dieta padrão.
Figura 3. Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo em ratos Wistar recebendo dieta padrão
ou experimental em (A) tecido adiposo retroperitoneal e (B) tecido adiposo gonadal. Teste T, p <0,05. Todos os grupos representam experimentos com n = 05 animais. Dieta padrão: Labina®. Dieta experimental: Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). GAPDH: Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato.
2.2.4 Discussão
A maioria das dietas criadas para induzir a obesidade em modelos animais é rica em alimentos palatáveis comuns às dietas humanas e está associada à indução persistente de hiperfagia e consequente consumo excessivo de energia. Portanto, essas dietas têm sido, preferencialmente, utilizadas em pesquisas relacionadas à obesidade e aos distúrbios metabólicos (ROSSINI; SILVA; MORAES, 2012). Para isso, ratos Wistar têm sido utilizados para induzir desequilíbrios fisiológicos e metabólicos pela dieta e são considerados eficazes no estudo da obesidade e distúrbios relacionados à obesidade, mas apresentam variações individuais e diferentes respostas às dietas (CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017).
Assim, o estudo da composição centesimal dessas dietas é relevante para permitir comparações entre seus efeitos e diferentes constituintes. Neste estudo, foram produzidos e analisados a composição centesimal, o índice glicêmico e a carga glicêmica de uma dieta experimental, testando seu efeito na obesidade e nos distúrbios metabólicos relacionados à obesidade.
A dieta experimental apresentou alto teor de carboidratos (62%) quando comparada à dieta padrão, nutricionalmente equilibrada que obedeceu às recomendações da AINN-93G, com 50% de carboidratos (REEVES, 1997). Um grande conteúdo dos carboidratos da dieta experimental era simples (49%) e apenas 13% eram complexos (fibra), refletindo os produtos utilizados para a sua formulação. É importante ressaltar que poucos estudos com análise de fibras em dietas para induzir a obesidade foram realizados, embora esse seja um nutriente
importante para determinar a resposta glicêmica (SHUKLA et al., 2015).
Além da ração comercial, o açúcar e leite condensado, ambos ricos em sacarose, foram utilizados como ingredientes na dieta experimental. Para a preparação de leite condensado, um alimento ultra-processado, no Brasil, 40% ou mais de açúcar são adicionados ao leite, dependendo da quantidade de extrato de leite seco utilizado (ORDÓÑEZ et al., 2005). Isso indica alto teor de carboidratos simples na dieta experimental, na qual carboidratos complexos vieram apenas da dieta comercial padrão.
Esta composição é consistente com a observação de um alto índice glicêmico e uma alta carga glicêmica na dieta experimental. Sendo assim, neste estudo foi oferecida uma dieta de alto índice glicêmico e de alta carga glicêmica (HGLI) por 17 semanas a ratos Wistar. Ao final do experimento, todos os animais que receberam essa dieta HGLI apresentaram obesidade e um aumento significativo no PC, quando comparados aos animais do grupo da dieta padrão. Esse efeito é possível devido ao alto consumo de energia, justamente relacionado ao excesso de sacarose na dieta HGLI, o qual está diretamente associado ao ganho de peso e aumento no PC (CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017).
No estudo de Pinto Junior e Seraphim (2012), em seus estudos, descobriram que a administração de uma dieta de cafeteria por um período de 14 semanas alterou o índice de Lee a partir da segunda semana de tratamento. Resultados semelhantes também foram observados nos estudos de Novelli et al. (2007), nos quais o PC foi significativamente maior em animais que receberam dietas de cafeteria, reconhecidas como dietas nutricionalmente inadequadas, como a HGLI produzida e analisada neste estudo.
Entretanto, em nenhum desses estudos, o índice glicêmico, a carga glicêmica ou mesmo a composição centesimal foram avaliados. Isso não permitiu a identificação clara de quais nutrientes ou características das dietas experimentais utilizadas estavam influenciando principalmente as alterações encontradas. Quando traduzido para a prática clínica, esse conhecimento seria importante, uma vez que orientações e estratégias nutricionais nos tratamentos da obesidade precisam se concentrar nos componentes da dieta, o que pode impactar na qualidade da dieta e no sucesso do tratamento (WHO, 2016).
Considerando que na avaliação do estado nutricional e dos distúrbios metabólicos, as alterações bioquímicas, condicionadas a hábitos de vida pouco saudáveis, podem preceder modificações antropométricas; neste estudo, foi avaliado também, o efeito da dieta experimental em marcadores plasmáticos e moleculares relacionados à obesidade.
Sabe-se que o principal determinante da glicose pós-prandial é a quantidade total de carboidratos ingerida, embora a qualidade dos carboidratos também influencie a glicemia
(SHUKLA et al., 2015). Devido ao fato de o corpo não digerir e absorver todos os carboidratos na mesma velocidade, o IGfoi desenvolvido para avaliar o efeito dos carboidratos na glicemia. Assim, o IG é um indicador qualitativo da capacidade de um carboidrato ingerido para aumentar os níveis de glicose no sangue. Esse método é usado para classificar os diferentes tipos de carboidratos da dieta por sua capacidade de aumentar a glicose no sangue quando comparado a um alimento de referência (MONRO; SHAW, 2008; AUGUSTIN et al., 2015).
Entretanto, na maioria dos estudos com dietas experimentais, o IG de diferentes alimentos é determinado levando-se em consideração, apenas, o tipo de amido, ou seja, a quantidade de amilose e amilopectina que constitui o amido de um determinado alimento (ISKEN et al., 2009; KLECKNER; WONG; CORKEY, 2015). Por outro lado, sabe-se que não apenas o tipo de amido, mas também vários fatores podem afetar o IG, incluindo viscosidade da fibra, matriz alimentar, cozimento, processamento e composição dos macronutrientes (SHUKLA et al., 2015).
Já a carga glicêmica, de acordo com Augustin et al. (2015), é definida como resultado do IG e a quantidade de carboidrato presente na porção de alimento consumida, em comparação com o alimento padrão. Portanto, o objetivo da carga glicêmica é avaliar a quantidade e a qualidade dos carboidratos, considerando o efeito do consumo de uma porção usual de um alimento na glicemia.
A quantidade e a qualidade dos carboidratos são consideradas importantes há muitos anos no contexto da obesidade. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que, tanto a quantidade quanto a qualidade dos carboidratos, possuem um papel preponderante como preditores de saúde e doença, associados, principalmente, à dislipidemia, doenças cardiovasculares e diabetes (ALESSA et al., 2015).
A maioria dos estudos com as chamadas dietas de alto índice glicêmico, em modelos animais, não analisa ou apresenta o índice glicêmico e a carga glicêmica de suas dietas. Esses efeitos são comumente avaliados apenas considerando a contribuição quantitativa dos diferentes carboidratos nas dietas, ou considerando o aumento da glicemia em estudos in vivo sem considerar a quantidade ingerida de carboidratos (CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017). Isso ainda é comum, embora a importância dessas informações seja consolidada e consensual no que se refere ao consumo de carboidratos na dieta (AUGUSTIN et al., 2015). Neste estudo, a dieta HGLI foi analisada quanto ao seu índice glicêmico e carga glicêmica, utilizando metodologias estabelecidas para a avaliação de dietas humanas. Para nosso conhecimento, esse foi o primeiro modelo experimental de DIO que realizou a medida direta da carga glicêmica da dieta utilizada.
